KR20010040372A - 힘 판별 분석 - Google Patents

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Abstract

선택된 표적 종에 대한 감지기는 (1) 기질 변형제의 부착에 의해 화학적으로 변형된 기질, (2) 비드 변형제의 부착에 의해 화학적으로 변경된 하나 이상의 자기 활성 비드, (3) 상기 비드 상에 힘을 인가하기 위한 가변 자계를 생성하도록 조정되는 가변 자계 소스, 및 (4) 상기 기질에 결합되는 개별 비드를 관찰하기 위해 조정되는 이미징 시스템을 포함한다. 상기 비드 변형제는 표적 종이 존재하는 경우에는 상기 기질 변형제 결합에 대해 친화성을 가지며, 상기 표적 종이 없는 경우에는 상기 기질 변형제 결합에 대해 측정 가능한 다른 친화성을 갖는다. 바람직한 실시예에서, 본 발명은 비드 클러스터를 확인하고, 그러한 클러스터 효과를 표적 애널라이트 측정으로부터 제거하기 위한 시스템을 더 포함한다. 다른 분석과 마찬가지로, 감지기는 특이 표적 (애널라이트) 분자와 결합할 수 있는 일부 분자의 능력에 의존한다. 비드와 기질을 적절한 분자로 코팅함으로써 비드는 표적 분자가 존재하는 경우에 (또는 존재하지 않는 경우에) 기질에 특이 결합한다 (또는 결합하지 않는다). 자계가 기질에 인가될 때 자기 비드는 기질에서 떨어진다. 그러나 비드가 기질에 특이 결합될 때, 비드는 기판 상에 유보되어 표적 종의 존재 (또는 부존재)를 나타낸다.

Description

힘 판별 분석{Force discrimination assay}
결합 분석, 예를 들면 면역 분석은 식품, 의학 및 제약 업계에서 광범위한 표적 분자에 대한 진단 테스트로서 널리 이용되고 있다. 그 원리가 최초로 개발된 이후로 많은 결합 분석이 생산 및 판매되었다.
면역 분석은 전형적으로 항체의 결합 능력을 이용한다. 항체는 흔히 전염병과 싸우는 것으로 여겨지는 단백질 분자이다. 항체는 특이 방식으로 전염 물질과 결합하여, 즉 복합체를 형성하여 전염병과 싸운다. 이것은 유기체로 하여금 그러한 복합체를 거부하라는 신호이다. 열쇠가 자물쇠에 딱 맞는 것처럼, 항체는 또 광범위한 화합물에 특이 결합하도록 생성될 수 있다.
그러나 다른 분자를 인식하여 선택적으로 결합하는 다른 분자(예를 들면 킬레이트화제, 다중 핵산 스트랜드, 세포 수용체를 포함하는 수용체)가 다중핵산(DNA 또는 RNA), 폴리펩티드, 당지질, 호르몬, 폴리머, 금속 이온 및 다수의 불법 약제를 포함하는 특정 저분자량 유기종과 같은 광범위한 종을 검출하는데 이용될 수 있다. 분석에 이용되기 위해서, 이러한 인식 과정에서는 육안으로 관찰 가능한 신호를 생성해야 한다. 그러한 신호를 생성하는데 이용되는 방법은 다양한 유형의 면역 분석을 구별하는 한가지 방법이다.
처음 면역 분석을 실시할 때는 방사능이 이용되었다. 이 방사면역시험분석(RIA)은 꽤 민감하여 널리 사용되었지만, 방사능 물질 처리와 관련된 위험, 비용 및 제한 때문에 대체 면역 분석을 요구하게 되었다. 최근에는 효소 및 형광 분석이 방사 분석을 대신하고 있다.
몇몇 면역 분석에서는 자기 활성 라벨을 이용하여 화학적 화합물을 검출하고, 자계에서 이들 자기 라벨에 의해 인가된 힘을 당해 애널라이트(analyte)의 양과 연결시킨다. 1995년 8월 29일자 등록된 로어(Rohr)의 미국특허 제5,445,970호 및 제5,445,971호 참조.
로어의 특허에서는 자기 활성 비드들, 외부에서 인가된 자계 및 이들 비드에 의해 화학적으로 변형된 기질에 인가되는 힘을 모니터하기 위한 밸런스를 사용한다. 일반적인 실시(샌드위치 분석)에서 자기 활성 비드와 기질 양자는 그들의 표면에 결합된 애널라이트에 대한 항체를 갖도록 변형된다. 비드와 기질 사이의 항체-항체 상호작용은 일부 비특이 흡착이 일어날 수도 있지만 특이 결합 상호작용을 생성하지는 않는다. 외부 자계가 인가되면 비드가 기질에서 분리된다. 애널라이트는 시스템에 도입되면 비드와 기질에 샌드위치 구성으로 결합되어 특이 결합 상호작용을 통해 비드를 기질에 연결시킨다. 외부 자계가 이 시스템에 인가될 때 자계는 그 방향에 따라 비드를 밀거나 끌어당겨서 밸런스에 의해 측정되는 힘을 변경시켜서, 당해 애널라이트의 존재 및 (원칙적으로) 양을 나타낸다.
로어 연구의 단점 중 하나는 일련의 자기 조건을 경험하는 다수의 비드 행동과 관련된 통합 신호만을 측정한다는 것이다. 본 발명자들의 연구에서는 이 시스템의 비드들이 복잡하게 상호작용하는 것으로 나타났기 때문에 이는 특히 문제가 된다.
도1을 참조하면 로어 시스템에서는 비드들의 상당 부분이 모이는 경향이 있으며, 이들 모인 비드들의 행동은 쉽게 모델링할 수 없다. 도 1은 인가된 자계에서 기질 위의 상자성 비드를 도시하는데, 일반적인 광학 현미경을 통해 볼 수 있다. 도1에서 비드 일부가 스트링 및 클러스터로 결합되는 것을 볼 수 있다. 어떤 경우에는 비드 다이폴이 정렬되어 예상보다 더 큰 자기 모멘트를 생성할 수도 있다. 로어의 발명은 이러한 행동 어느 것도 고려하지 않았고, 따라서 감도가 낮다는 문제가 있다. 보다 신뢰할 만한 정성 정량 시스템이라면 개별 비드의 행동을 모니터하여 로어 시스템에서 오류의 원인이 될 수 있는 복잡한 상호작용의 효과를 교정하거나 취소할 수 있을 것이다. 더욱이, 각 비드가 관찰될 수 있기 때문에 그러한 시스템이라면 본래부터 더 정확할 것이다.
로어 연구의 두 번째 단점은 이 시스템에서 시간이 변수가 아니라는 알려진 바 없는 가정이다. 로어 특허에 개시된 분석 각각은 신호가 애널라이트의 농도하고만 연결되어 있음을 보여준다. 본 발명자의 연구에 의하면 인가된 자계에 있는 자기 비드가 시간과 온도의 함수로써 볼쯔만(Boltzmann) 분포 곡선을 따라 기질에서 분리된다.
개선된 결합 분석 감지기라면 단일 비드 레벨에서 복합 결합 상호작용의 판별을 가능케 할 것이다. 개선된 결합 분석 감지기는 또 결합 상호작용의 유무를 넘어, 특이 상호작용의 세기에 관한 정보 등의 추가 정보를 제공할 것이다. 그러한 추가 정보를 개발하는 일환으로, 표적 애널라이트에 대한 힘-결합 곡선을 개발하기 위한 방법이 있다면 좋을 것이다.
본 발명은 분석(assays)에 관한 것으로, 보다 자세하게는 항체/합텐 또는 DNA 상호작용과 같은 결합 분석에 관한 것으로, 이들 상호작용 사이의 힘의 차이 및 이들 상호작용과 비특이 결합 상호작용 사이의 힘의 차이를 이용하고, 자계에 감응하는 라벨을 이용한다.
후술하는 바람직한 실시예의 설명 및 첨부도면에 의해 본 발명을 보다 완벽히 이해하게 될 것이며, 다른 도면에서 같은 참조번호는 동일한 구조 또는 엘리먼트를 나타낸다.
도1은 기질에 분표된 균일한 자계에서의 상자성 비드를 도시한 도면,
도2는 비드에 작용하는 중요한 힘을 도시하는, 기질에 부착된 비드에 대한 개략도(랑그무어(Langmuir) 12, 2271-2282, 저작권(1996) 미국화학협회, K.-C. 장 등의 허가를 받아 사용),
도3은 비드에 대한 인장력과 수직력의 각도 의존성(angular dependence)에 대한 도표,
도4는 복수의 비드를 사용하는, 본 발명에 따라 샌드위치 분석 구성을 갖는 장치에 대한 개략도,
도5는 가상의 힘-비드 방출 곡선,
도6은 거리 대 하나의 NdFeB 자석 및 두 개의 NdFeB 자석에 의해 생성되는 자계에 대한 도표,
도7은 다양한 자계 초점 원추를 갖는 NdFeB 자석 대 거리에 의해 생성되는 자계에 대한 도표,
도8은 경합 비오틴 분석의 결과에 대한 도표, 및
도9는 오브알부민에 대한 직접 분석의 결과에 대한 도표를 도시한다.
따라서, 본 발명의 목적은 광범위한 표적 종을 높은 수준의 감도를 갖고 선택적으로 검출하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 종의 질량과는 상관없는 신호 전달 매커니즘을 이용하여 표적 종을 검출하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 결합 상호작용의 유무를 넘어 특이 상호작용의 세기에 관한 정보 등의 추가 정보를 얻는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 특이 결합 상호작용의 세기를 나타내는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 광범위한 애널라이트 종에 대하여 힘-결합 곡선을 개발하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분석에서 자기 활성 비드를 사용하여 단일 비드의 활성을 판별하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분석에서 자기 활성 비드를 사용하여 비드 클러스터 간의 복잡한 자기 작용의 효과를 분리하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분석에서 자기 활성 비드를 사용하여 기질에 결합된 비드 개체수에 대한 시간과 온도의 효과, 즉 볼쯔만 효과를 설명할 수 있는 것이다.
본 발명의 상기 목적 및 다른 목적은 후술하는 구성 및 과정에 의해 달성된다.
본 발명의 일 측면에 따른, 선택된 표적 종에 대한 감지기는 (a) 기질 변형제의 부착에 의해 화학적으로 변형된 기질, (b) 표적 종이 존재하는 경우에는 기질 변형제에 대해 결합 친화성을 가지며, 표적 종이 없는 경우에는 기질 변형제에 대해 결합 친화성을 가지는 비드 변형제의 부착에 의해 화학적으로 변형된 하나 이상의 자기 활성 비드, (c) 비드 상에 힘을 인가하기 위한 가변 자계 소스, 및 (d) 상기 기질에 결합되는 비드를 관찰 및 계수하기 위한 이미징 시스템을 포함한다.
바람직한 실시예에서, 본 발명은 비드 클러스터를 확인하고, 그러한 클러스터의 효과를 표적 애널라이트의 측정치로부터 제거하기 위한 시스템을 포함한다.
본 발명의 다른 측면에 따른, 선택된 표적 종의 존재를 감지하기 위한 방법은 (a) 기질 변형제를 부착하여 기질을 변형시키는 단계, (b) 표적 종이 존재하는 경우에는 기질 변형제에 대해 결합 친화성을 가지며, 표적 종이 없는 경우에는 기질 변형제에 대해 측정 가능한 다른 친화성을 가지는 비드 변형제의 부착에 의해 화학적으로 변형된 하나 이상의 자기 활성 비드를 변형시키는 단계, (c) 표적 분자를 포함하는 것으로 생각되는 용액에 비드 및/또는 기질을 증착하는 단계, (d) 특이 및 비특이 결합 상호작용을 모두 포함할 수 있는 경우에 비드가 기질과 상호작용하도록 허용하는 단계, (e) 비드를 기질에서 떼어내기 위하여 균일한 자계를 샘플 영역에, 바람직하게는 보통 기질에 대하여 적용하는 단계, 및 (f) 비드를 관찰하는 단계를 포함한다. 바람직한 실시예에서, 이 방법은 표적 애널라이트를 포함하는 것으로 생각되는 용액의 도입 후에, 그리고 바람직하게는 또 그 전에 기질에 결합될 것으로 관찰된 비드를 계수하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따른, 표적 종과 표적 종과의 특이 결합 작용을 겪는 종의 상호작용의 크기를 결정하는 방법은 (a) 기질 변형제를 부착하여 기질을 변형시키는 단계, (b) 표적 종이 존재하는 경우에는 기질 변형제에 대해 결합 친화성을 가지며, 표적 종이 없는 경우에는 기질 변형제에 대해 측정 가능한 다른 결합 친화성을 가지는 비드 변형제의 부착에 의해 화학적으로 변형된 하나 이상의 자기 활성 비드를 변형시키는 단계, (c) 표적 분자를 포함하는 용액에 비드와 기질을 증착하는 단계, (d) 비드가 기질과 상호작용하도록 허용하는 단계, (e) 비드를 기질에서 떼어내기 위하여 균일한 자계를 샘플 영역에, 바람직하게는 보통 기질에 대하여 적용하는 단계, (f) 비드가 기질에서 떨어질 때까지 이 자계의 크기를 변화시키는 단계, 및 (g) 비드를 관찰하는 단계를 포함한다.
본 발명에 따라 라벨이 붙은 비드를 기질에서 분리하는데 필요한 힘을 확인할 수 있을 것으로 기대된다. 고감도 및 일관된 결과를 보장하기 위해 비드에 작용하는 힘을 단순하게(즉, 쉽게 분석되도록) 유지하고 균일하게(즉, 샘플에 있는 모든 비드에 대하여 본질적으로 동일하게 연속적으로 재현 가능하게) 유지하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 측면에 따라서 표본 면적에 걸쳐 균일 각도로, 바람직하게는 기질에 대하여 90°로 비드 상에 힘이 작용하게 한다. 기질에 대하여 90°로 비드에 인가된 힘은 비드와 표면과의 접촉점으로 바로 전달된다. 접선력 효과는 단일점에서 표면에 부착된 구상 입자에 힘의 밸런스를 가하여 결정될 수 있다(도2). 랑그무어 12(9) 2271-82(1996)의 "고분자 결합된 입자를 표면에서 분리하는데 가해지는 힘의 방향 및 유형의 영향"에서 K.-C. 장 등은 그러한 시스템에 대한 접선력의 효과를 분석하였다. 접선력 Ft에 의해 특이 분자 작용에 가해지는 인장력 T는 특이 분자 상호작용의 방향을 향하는 힘의 성분이다.
여기서, 비드의 기울기 Φ는 시스템의 구조에 의해 결정된다.
여기서, L은 특이 분자 상호작용 복합체의 길이, h는 비드의 표면 거칠기, a는 비드의 반경이다. 일반 비드(a=1,250㎚이고 h=5㎚)와 복합체(L=10㎚)의 특성이 주어지면, 특이 분자 상호작용에 대한 접선력 효과는 대략 11의 계수만큼 증대된다. 인장력과 수직력의 각도 의존성을 나타내는 도3에 도시된 바와 같이 힘의 방향으로 작은 변화가 일어나는 극적인 효과를 볼 수 있다. 따라서 본 발명의 바람직한 특징은 외부의 힘을 수직으로 그리고 토크없이 비드에 가하는 것이다.
본 발명에 대한 샌드위치 분석 구성을 도시하는 도4를 참조하면, 하나 이상의 비드(10)와 기질(12)이 용액 속에 놓여있다. 비드(10)는 본 명세서에서 비드 변형제(22)로 불리는 분자에 의해 변형되며, 기질(12)은 본 명세서에서 기질 변형제(23)로 불리는 분자에 의해 변형된다. 이들 두 유형의 변형제는 항체, 합텐, 다중 핵산, 폴리펩티드, 당지질, 호르몬, 폴리머, 금속 이온 및 특정 저분자량 유기종을 비롯한 다른 분자를 인식하고 선택적으로 결합할 수 있는 분자들로부터 선택된다.
가변의 수직 자계를 비드(10)에 인가하기 위한 메커니즘은 가동 환상 자석(24)으로 도시되어 있다. 환상 자석은 밀리미터 크기의 면적에 걸쳐 그 축을 따라 향하고 있는 균일한 자계 Ｂ를 생성한다. 밀리미터 크기의 NdFeB 자석은 자석이 신중하게 중심이 맞추어지면 광학 현미경에 의한 이미징과 일치하게 표본 영역에 걸쳐 균일한 자계를 인가할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 수직 자계 Ｂ는 비드(10)에 작용하여 비드(10)에 대한 수직력(Ｆ)을 생성한다. 수직력(Ｆ)은 비드(10)와 기질(12) 사이의 결합부(14)에 대해 인장력으로 작용한다. 일반적으로 공유 결합은 특이 분자 상호작용(즉, 항체-합텐 상호작용)보다 훨씬 강력하기 때문에, 비드(10)와 기질(12) 사이의 결합부(14)의 세기는 이 특이 분자 상호작용의 세기로 한정된다.
환상 자석 외에도, 관찰되는 영역에서 자계 Ｂ가 원하는 특성을 갖고 있기만 하다면 원반형, 막대형 또는 기타 평판형 등의 다른 형상의 자석이 사용될 수 있다. 자석과 기질 사이에 위치한 높은 투과성을 갖는 초점 원추를 사용하여 자계가 더 높은 구배를 갖도록 자계를 변형시킬 수 있다. 상자성 비드에 대한 힘은 자계 구배와 관련되기 때문에 (후술) 이들 원추의 사용은 비드에 작용하는 힘을 증가시키는 경향이 있다.
자계의 세기가 변함에 따라 궁극적으로 비드가 기질로부터 분리되는 지점에 이르게 되는데, 이는 자계로부터의 힘이 비특이 또는 특이 분자 상호작용의 세기를 초과했다는 것을 나타낸다. 비드가 기질로부터 분리될 때를 관찰함으로써 이 포인트에 다다르는 때를 관찰할 수 있다. 본 발명자는 후술하는 바와 같이 이러한 분리점이 비드와 기질 사이의 결합부에 인가되는 힘에 따라 달라질 뿐만 아니라, 관찰 시간과 시스템 온도에 따라서도 달라지는 것을 관찰했다.
본 발명의 바람직한 실시예는 기질에 결합되었다 분리되는 비드를 이미징하기 위한 현미경, 구체적으로 광학 현미경(26)을 더 포함한다. 바람직하게 현미경(26)은 전자 연결장치(흔히 비디오 카메라 포함)를 통해 현미경으로부터 이미지를 분석하기 위한 컴퓨터(28) 또는 비디오 리코더에 연결시켜서 연결된다. 환상 자석(24)의 이점은 광학 현미경에서 투과되는 빛과 간섭하지 않는다는 것이다. 그러나 반사된 빛의 현미경 검사로 고체 형태의 자석을 사용하는 것이 가능해졌다.
바람직하게 본 발명에서는 단일 변형 비드보다는 오히려 변형 비드 집단이 사용되었다. 다수의 비드는 동시에 전체 센서 영역을 샘플링하여 검출기의 감도에 대한 확산 한계를 극복한다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, (집합체와 구별되는) 단일 비드들을 확인하고 비드를 신속히 정확하게 계산하고 기질 상에서 비드의 상대 위치를 결정하는 능력을 갖는 것이 중요하다. 이 위치 정보는 여러 이유로 유용하다. 예를 들면, 어떤 어플리케이션에서는 기질의 다른 영역에 다른 유형의 기질 변형제를 부착하여 기질을 패턴화하는데 유용할 수도 있다. 그러한 어플리케이션에서는 제시된 비드가 기질 상에서 어디에 결합되는지 확인하는 데도 유용할 것이다. 따라서 현미경(26), 컴퓨터(28)와 전자 연결장치(27)를 포함하는 본 발명의 이미징 시스템은 기질로부터 분리된 비드(또는 기질로부터 분리되지 않은 비드)를 계수할 수 있는 능력을 가져야 한다. 일반적으로, 이는 (직접 프레임 그래버를 이용하여 또는 비디오 리코더를 이용하여 간접적으로) 현미경으로부터 디지털 이미지를 획득하고 컴퓨터(28) 상의 이미지 분석 알고리듬을 이용하여 그것을 분석한다는 의미이다.
부가적으로, 기질을 장착하기 위한 이동 스테이지(40)를 제공하여, 현미경이 기질 상의 여러 영역을 반복적으로 이미징하도록 하는 것이 바람직하다. 나아가 형광 검출 능력을 갖는 현미경을 사용하는 것이 바람직하다. 이동 스테이지(40), 형광 검출 능력이 있는 현미경 및 기질의 다른 영역에서 다른 유형의 기질 변형제를 갖는 기질을 구비하면, 대단히 편리하게복수의 다른 표적 분자를 검출하는데 시스템이 이용될 수 있다(멀티 플렉싱).
부가적으로, 본 발명에 따른 이미징 시스템은 바람직하게 기질 상의 단일 비드들과 기질 상의 두 개 이상의 비드 클러스터를 크기에 근거하여 판별할 수 있는 능력을 갖는다. 분균일 표면의 화학물과 로어 특허가 교시한 구조의 자계는 다음과 같은 이상적이지 못한 행동을 하는 것으로 발견되었다.
브라운 운동에 의해 비드는 표면에서 이동한다. 비드가 "점착성"이 있을 때(즉, 비드가 일단 합쳐지면 그 자리에 머무르는 경향이 있을 때) 운동은 비드의 상당 부분이 이합체와 집합체를 형성되게 한다. 이들 집합체의 다중 상호작용으로 인해 자계 Ｂ가 인가될 때 클러스터의 자기화가 강화되며, 클러스터의 변위를 크게 가속화한다. 이미지 분석에 의해 집합의 레벨을 확인하고 그 효과에 대해 교정할 수 있다. 단량체 및 집합체로서의 비드 부분은 표면에 대한 애널라이트의 양 및 표면의 비특이 접착성과 크게 관련되므로, 애널라이트 농도와 표면 특성을 독자적으로 판단하는데 집합이 사용될 수 있다는 것에 유의한다.
더욱이, 거의 가장 이상적인 상황에서 비드의 일부(2-20%)는 심지어 큰 힘(〉2 pN) 하에서도 표면에 비특이 접착한다. 이들 비드는 용액 내에서 옆으로 이동하는 다른 비드를 포착하여, 스트링 형태의 집합체를 형성하는 것으로 관찰되었다. 이미지 분석으로 이러한 결합체를 확인하고 고려사항에서 제외시키는 것이 가능하다. 통합 신호를 측정하는 검출 기술로는 이러한 비드를 특이 결합 비드와 구별할 수 없다.
비드 간의 비특이 결합 및 비드와 기질 사이의 비특이 결합은 비드에 단백질이 로딩될 때 증가하는 것으로 나타나는데, 이는 단백질-단백질 상호작용이 이러한 결합의 기본 원인이라는 것을 시사한다.
시중에서 구입 가능한 현미경(뉴욕주 10594 쏜우드, 짜이스 드라이브 1, 칼 짜이스의 63×아크로플란 대물렌즈가 있는 액시오버트 100 현미경), 전자장치(인디애나주 미시간 시티, DAGE-MTI의 VE-1000 CCD72 흑백 비디오 시스템; 매사츄세츠주 01752-192, 말보로, 로케 드라이브 100, DT 3152 정밀 PCI 프레임 그래버, 데이터 번역), 이미지 분석 소프트웨어(메릴랜드주 20910 실버스프링 조오지아 애버뉴 8484, 미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics)의 이미지-프로 버전 2.0) 및 컴퓨터(1GB 하드 드라이브가 채용된 펜티엄 66MHz 컴퓨터)는 초상자성 2.6미크론 직경의 비드와 그 비드 클러스터를 신뢰성있게 확인해 주는 것으로 발견되었다. 클러스터는 일단 확인되면 무시된다. 즉 후속 분석에서 고려되지 않는다. 그러므로 비드 위치가 모니터될 때(즉, 비드가 기질과 결합되었는지 아닌지에 대하여 모니터될 때), 단일 비드만 분석되어 검출기의 정확도를 극적으로 향상시킨다.
그러한 현미경을 통해 이미지화된 비드는 그 이동에 대하여 모니터되고, 비결합 비드는 수초의 시간 동안 이동하는 것으로 밝혀졌고, 이에 따라 이들 비드가 비결합된 것으로 확인할 수 있으므로 마찬가지로 후속 분석에서 고려되지 않는다.
비드와 표면 사이의 접착력의 크기는 여러 인자, 즉 비특이 힘의 크기, 비드와 표면을 연결시키는 특이 분자 상호작용의 수 및 이들 상호작용에 응력이 가해지는 방식에 의해 결정된다.
대다수 비드에서 매우 낮은 비특이 접착력을 일관되게 생성하는 표면 변형 화학제(후술)가 개발되었다. 일반적으로 80-98%의 비드가 다이날사(Dynal)의 M280 비드의 경우에 그들의 부력 하중, 즉 약 40펨토뉴튼(fN)과 등가의 힘에서 표면으로부터 제거될 수 있다. 비드를 표면에 연결시키는 특이 분자 상호작용의 수는 비드와 표면의 리간드와 리셉터의 밀도와 유연성에 따라 다르다.
헤르쯔 접촉 기구를 사용하여, 물질의 탄성률이 1010Pa 라 가정할 때 40pN 로드 하에 2.6미크론 구체의 접촉 면적을 측정할 수 있다 (케이. 엘. 존슨, "접촉기구," 뉴욕주 뉴욕시 캠브리지대 출판사(1985)). 계산된 접촉 반경은 0.15㎚로, 전형적인 리간드나 리셉터의 크기보다 상당히 작아서 단일 분자간 작용을 가장 가능성있게 한다. 그러나 리간드와 리셉터가 중합체 링커를 통해 표면에 결합된다는 사실에서, 다중 분자간 상호작용이 일어날 수 있다.
실제로 완화시키는 조치가 취해지지 않으면, 평평한 표면과 예를 들면 2.6㎛ 직경의 구체 사이의 작은 접촉 면적에도 불구하고 비드와 기질 사이의 특이 결합 연결이 하나 이상이 되는 것으로 발견되었다. 이러한 발견은, 일반적으로 항체 기능을 하는 구체가 200pN 보다 훨씬 큰 힘으로 항원이 도포된 표면에 부착될 수 있다는 관찰에 기한 것이었다. 비오틴-스트렙타비딘 상호작용(자연에서 가장 강한 것 중의 하나)만이 약 250pN의 결합력 을 가졌다고 할 때, 이들 비드가 단일의 항체-항원 결합을 통해서 부착된다면 약 200pN 미만의 힘으로 부착되는 것을 예상할 수 있다.
이러한 효과를 완화하기 위해 당업자라면 결합 표면의 거칠기를 최소화활 것이다. 특히, 기질의 골부터 마루까지의 거칠기를 ≤ca.30㎚으로 유지하는 것이 바람직하다. 상호작용 표면의 거칠기 외에도 당업자가 비드와 기질 간의 분자 상호작용 수에 영향을 미치는 것으로 확인할 수 있는 다른 요인으로는 (a) 이들 비드와 기질 상의 항체와 항원의 표면 밀도, (b) 비드와 기질의 기계적 특성, 및 (c) 항체와 항원을 표면에 부착시키는데 사용되는 폴리머의 입체 이동성(유연성)이 있다.
항체/합텐 작용과 같은 특이 결합 상호작용을 포함하는, 비드와 기질 간의 결합은 볼쯔만의 확률 곡선(지. 유. 리 등(G. U. LEE, et al), 랑그무어 1994, 10, 페이지 354-357)에 의해 설명될 수 있는 수명을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이 수명은 다음 방정식으로 설명될 수 있다.
여기서, τ는 결합의 수명, τ0는 결합과 관련된 상수, Ｆ는 인가된 힘, Ｅ는 결합 에너지, d는 리간드 리셉터 상호작용과 관련된 거리, kT는 열 에너지이다. 결합력과 본드가 로딩된 시간 길이의 결합은 인가된 힘 하에서의 비드의 행동에 대하여 중요한 의미를 갖는다. 예를 들면, 분자간 상호작용의 결합 세기는 더 짧은 시간 프레임에 대해 더 강하게 나타난다. 로딩 속도가 너무 느리면 특이 파단 힘을 비특이 힘과 구별하는 것이 가능하지 않다.
샌드위치 분석의 실시예 외에도, 본 발명은 경합 분석 및 변위 분석의 실시예 등의 다른 면역 분석 구성에도 실시 가능하다.
본 발명에 따른 경합 분석에서, 기질은 표적 분자 또는 그 일부에 의해 변형되며, 비드는 표적 분자와 특히 결합할 수 있는 분자에 의해 변형된다. 자유 표적 분자는 비드 상의 결합 사이트를 놓고 기질에 결합된 표적 분자와 경합한다. 비드가 애널라이트 표적 분자와 함께 완전히 복합체로 되어 기질에 결합하기 위해 접근할 만한 사이트가 없어지면, 비드는 기질과 특이 결합하지 않는다. 이 실시예에서 비드 상의 결합 사이트의 수를 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 보다 바람직하게, 비드는 아주 작은 수(예를 들면 ≤10)의 결합 사이트를 가질 수 있다. 이러한 식으로 비드와 상호작용하는 소수의 자유 표적 분자로 비드가 기질과 복합체화하는 것을 막기에 충분하다.
본 발명에 따른 변위 분석에서, 기질은 표적 분자와 특이 결합할 수 있는 분자에 의해 변형되고, 비드는 표적 분자 또는 그 일부에 의해 변형된다. 비드가 기질과 복합체화하고, 표적 분자가 용액에 투입되면, 표적 분자는 기질 상에서 결합 비드를 이동시켜 비드를 인가된 자계에서 기질로부터 자유롭게 분리시킬 어느 정도의 가능성을 갖는다. 대안으로, 애널라이트는 변형된 비드와 미리 혼합되고, 비드와 애널라이트는 기질에 함께 첨가될 수 있다.
일반적으로 기질을 비특이 결합을 최소화하는 작용 물질로 코팅하여 비특이 흡착을 제한하는 것이 유리하다. 소혈청알부민(BSA)처럼 보통 사용되는 차단제는 본 발명에서 덜 유용한 것으로 판명되었다. 왜냐하면 물리적으로 흡착되는 BSA 분자가 표면에 공유 결합되지 않으며, 기질 결합에 대해 더 높은 친화성을 갖는 분자에 의해 변위될 수도 있고, 어떤 조건에서는 브리징 물질(bridging agent)로 작용할 수 있기 때문이다. 제한된 비특이 흡착의 이점을 얻기 위해서는 다른 방법이 사용되어야 한다.
폴리에틸렌 글리콜(PEG) 같은 특정의 화학흡착 폴리머가 강력한 척력을 생성하여 입자-기질의 비특이 결합력을 줄여주는 것으로 발견되었다. 척력의 출처에 대해서는 여전히 과학적 논쟁거리이지만, 화학흡착 폴리머를 압축하는데 필요한 바람직하지 않은 엔트로픽 에너지에서 나오는 것으로 믿어진다(샌디애고시, 아카데믹 출판사, "분자간 및 표면 힘," 1992, 제이. 이스라엘라시빌리 지음).
PEG는 비이온성 수용성의 폴리머로, 블록 코폴리머의 형성 또는 화학적 접합을 통해 접목될 수 있다. 본 발명자는 이질양기능성(heterobifunctional) PEG, 즉 양 단부에 두 개의 다른 화학군이 있고, 약 3400의 분자량을 가지며 분석을 위해 활성면에 바인더를 공유 결합 접목시키는 PEG를 사용하였다. PEG는 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 유리 및 플라스틱 표면에 접목되었다. PEI는 시중에서 입수할 수 있는 수용성 폴리머로 고밀도의 1차 및 2차 아민을 갖는다. 또 N-하이드록시 숙시니미드와 같은 크로스-링커를 사용하여 고도의 특이성과 고효율로 쉽게 변경된다. 이 화학작용은 단백질 흡착을 최소화하도록 표면을 변형시키기 위한 작업에 근거하고 있다(브링크 등의 미국특허 제5,240,994호 "친수성 바이오폴리머-방수 외층으로 도포된 고체 표면 및 그러한 표면을 만들기 위한 방법").
PEG 표면 변형을 위한 프로토콜:
1. 해당 기술의 숙련자에게 알려진 적절한 기술을 사용하여 우선 표면을 세척한다. 예를 들면 상당히 깨끗한 플라스틱 표면은 70:30의 에탄올:물의 혼합물에서 초음파 처리한다.
2. 폴리머 표면을 농축 황산에서 4% KMNO4를 사용하여 산화시킨다.
3. 표면을 50mM의 탄산염 버퍼 pH8.2의 3% PEI(뉴저지주 마운트 올리브, BASF, Polymm SNA) 용액에 2시간 동안 노출시키고 적어도 3회 물로 헹군다.
4. 탄산염 버퍼 pH8.2의 NHS-PEG-비오틴, 이질양기능성 PEG 또는 SPA-PEG(알라바마주 헌츠빌 스프링 브랜치 로드 230, 쉬어워터 폴리머스(Shearwater Polymers)) 10㎎/㎖ 용액을 최소 12시간 동안 표면에 배양한다.
5. 표면을 인산염 버퍼 식염수(PBS, 10mM 염화나트륨, 50mM 인산염)으로 헹구고 분석을 수행한다.
분석용으로 사용하는 외에도, 본 발명의 장치는 특이 결합 상호작용의 세기를 나타내는데, 즉 표적 종과 그 표적 종과 특이 결합 상호작용을 하는 종 사이의 상호작용의 성질을 판단하는데 이용될 수 있다. 예를 들면 기질은 항체, 다중 핵산, 폴리펩티드, 당지질, 호르몬, 폴리머, 금속 이온, 킬레이트 시약 및 호르몬으로 이루어진 군에서 선택된 기질 변형제에 의해변형되며, 하나 이상의 자기 활성 비드는 항체, 다중 핵산, 폴리펩티드, 당지질, 호르몬, 폴리머, 금속 이온, 킬레이트 시약 및 호르몬으로 이루어진 군에서 선택된 비드 변형제를 부착하여 변형될 수 있다. 여기에서 이들 비드 변형제는 표적 종이 존재하는 경우에는 기질 변형제와의 결합에 대해 친화성을 가지며, 표적 종이 없는 경우에는 기질 변형제와의 결합에 대해 측정 가능한 다른 친화성을 갖는다. 비드나 표면은 그 후 표적 분자를 포함하는 용액에 배치된다.
그 후 비드가 기질과 상호작용하는 것이 허용된다. 이들 상호작용은 일반적으로 특이 및 비특이 상호작용을 모두 포함한다. 비드를 기질에서 떼어내기 위하여 자계가 비드에 인가되며, 바람직하게는 기질에 대하여 수직으로 인가된다. 이 자계는 일반적으로 낮은 세기에서 시작하여, 비드 또는 비드의 소정 부분이 기질에서 분리될 때까지 세기가 점점 늘어난다.
도5는 최적 시간 및 온도에 대한 가상 힘 대 비드 방출 곡선이다. 도5에서 기질로부터 비드의 분리가 대략 2단계로 일어나는 것을 알 수 있다. 낮은 자계에서의 제1 단계는 비특이 결합 비드를 이탈시키고, 제2 단계는 특이 결합 비드를 이탈시킨다. 제2 단계는 제1 단계보다 더 높은 자계에서 일어나며, 힘이 비드에 인가되는 속도에 상당히 의존한다. 힘이 비드에 인가되는 속도를 변화시킴으로써 특이 분자 상호작용을 특징짓는데 필요한 3개의 중요한 변수 τ0, Ｅ와 d를 측정하는 것이 가능하다. 물론 비드-기질 상호작용이 더 복잡하면(즉, 두가지 이상 유형의 작용이라면), 분리 곡선은 3단계 이상을 도시할 수 있다.
본 발명에서는 여러 다른 유형의 비드를 사용하기에 적합하다.
상자성 물질은 인가된 외부 자계 Ｂ가 존재하는 경우에만 순 자기 μ를 갖는다. 비다공성(nonporous) 상자성 비드(대개 함침 폴리머로부터 만들어짐)는 비교적 저밀도와 잔여 자력이 없기 때문에 분자 생물학에서 자기 분리를 위해 사용된다. 이들 비드는 또한 리셉터(예를 들면, 스트렙타비딘, 항체 또는 DNA)를 공유 결합하여 고정시키는데 사용될 수 있는 표면 기능군(아민 또는 카르복실 등)을 가질 수 있다. 뉴욕주 11042 레이크 석세스 델라웨어 드라이브 5, 다이날사의 기술안내서; 룬드 브이, 슈미드 알, 리치우드 디, 혼즈 이 (1988) 16 (22) 10861-10880 참조. 자기 비드는 자계에서 비드의 분리가 뒤따르도록, 비드 상의 애널라이트 고정에 의해 복합 혼합물에서 애널라이트를 분리하는데 사용될 수 있다. 여러 특허 및 특허 출원에서 검출 응용을 위한 자기 비드의 사용에 대해 기재하고 있다.
불균일한 자계에서 작은 상자성 시편에 작용하는 힘은 다음 식으로 구해진다.
여기서, μ(=??B)는 시편의 자화(즉, 자기 쌍극자 모멘트)이고는 자계 구배이다.
상자성 비드는 외부 자계가 인가될 때만 자화를 갖기 때문에 본 발명의 실시예에 대해서 바람직하다. 비드는 엉기는 경향이 없으므로 표적 종과의 상호작용에 잠재적으로 간섭할 수 있다. 그러나 특별히 사전 주의만 취한다면 강자성 비드로 바꿀 수도 있다.
강자성 물질은 인가된 자계에서 자화된 후에 순 자화 μ를 갖는다. 이 자화는 보자계(coercive field)가 인가될 때까지 아니면 재료가 퀴리 온도 위로 올라갈 때까지 영구적이다. 비다공성 강자성 비드도 이용할 수 있다. 상자성 비드처럼, 리셉터를 공유 결합으로 고정하는데 사용되는 표면 기능군을 가질 수 있다. 사이언스 260, 1124-1127 왕, 엔., 버틀러, 제이. 피., 잉버, 디. 이.(1993) 참조.
그러나 강자성 비드가 사용되면 이들은 일반적으로 (1) 같은 장소에서 분석을 이행할 준비가 될 때까지 퀴리 온도 이상에서 유지되거나, (2) 또는 같은 장소에서 분석을 이행할 준비가 될 때까지 자화 필드에서 자화되지 않아야 한다.
약 0.2㎛와 약 200㎛ 사이의 직경을 갖는 시중에서 입수할 수 있는 비드는 본 발명의 목적에 일치하는 방법으로 고품질의 균일한 코팅을 적용하기에 충분한 크기의 표면적을 갖는다. 그러한 비드는 일반적으로 합당하게 인가된 자계 하에서 마찬가지로 본 발명의 목적에 일치하는 크기의 힘을 받는다. 운좋게도 그러한 비드는 또 본 발명의 바람직한 광학 현미경으로 볼 수 있다. 비드, 자계 및 바람직한 광학 현미경의 관측 메커니즘의 시너지 작용은 특히 유리하다.
다이날사의 두 가지 예시적인 상자성 비드의 물리적 성질은 아래와 같다. 이들 비드는 계수하기에 적당한, 크고 균일한 크기를 갖는다. 더욱이, 비드에 전달될 수 있는 전체 힘은 크다. 그러나 현재는 뱅(Bang)과 바이오맥(Biomag)(둘 다 고자기화를 갖는 더 작은 비드를 생산함)을 포함하여 적어도 12개의 회사가 생물학적 분리에 적합한 초상자성 비드를 판매한다.
다이날사의 두가지 유형의 비드의 물리적 성질
M280TMM450TM
평균 직경(㎛): 2.8 ±0.2 4.5 ±0.5
밀도(g/cm3): 1.34 1.55
질량/비드(pg): 17.2 71.4
자화1(emu/cm3): 14H/(257+H)+7×10-5H 7.8H/(238+H)+6.9×10-5H
주1: 자화는 SQUID 자력계를 사용하여 해군연구소에서 한 측정에 근거한 것이다.
도6은 거리 대 하나의 NdFeB 자석 및 두 개의 NdFeB 자석에 의해 생성되는 자계에 대한 도표이다. 자석은 짧은 축을 따라 자화된 소결 NdFeB로 만들어진 1″×1″×0.5″블록이다(캘리포니아주 컬버 시티 플라야 카운티 11248, 마젠트 세일즈 ＆ 매뉴팩춰링 컴퍼니(Magent Sales ＆ Mfg. Co.)). 한 개 자석과 두 개 자석에 대한 구배는 실질적으로 동일하며, 두 개의 자석은 한 개 자석보다 약간 더 높은 자계를 갖는다.
도7은 다양한 자계 초점 원추가 있는 NdFeB 자석 대 거리에 의해 생성되는 자계에 대한 도표이다. 특히 10㎜ 이하에서의 짧은 거리에서 자계 초점 원추가 있는 자석에 대한 구배는 자계 초점 원추가 없는 자석에 대한 구배보다 상당히 높다는 것을 알 수 있다. 원추가 뾰족할 수록 자계 구배가 커지지만, 또 자계에 대한 실질적인 측방 성분이 없는 영역을 줄여주는 것으로 관찰되었다. 그러므로 주어진 배율에 대하여 상당한 측방향 힘이 관찰되지 않으면서 사용될 수 있는 최대 뿔각이 있다. 그러나 더 높은 비드 계수를 제공하기 위하여 시야는 넓을수록 바람직하다.
이들 비드에 대하여 불균일 자계에서의 힘은 다음과 같다.
여기서, M은 전술한 표에서 H 함수로 기록된 체적 자화이며, d는 입자 직경이다. 당업자라면 자계 생성 시스템과 그리고 자계 생성 시스템 가까이 기질을 가져다 놓기 위한 어프로치 시스템을 최적화하여 본 발명의 감지기에 사용된 비드에 작용하는 힘을 최적화할 수 있을 것이다.
전술한 바에 따라, 다음의 실험예는 본 발명을 수행하는데 현재 알려진 가장 바람직한 모드를 포함하여, 본 발명의 특정 어플리케이션을 예시하기 위한 것이다.
이들 특정 실험 예제는 본 어플리케이션에서 기재된 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다.
실험예
실험예1:
경합 분석에서 비오틴 검출
먼저 FDA 원리가 모델 리간드 및 리셉터 시스템 스트렙타비딘과 비오틴을 갖고 증명되었다. 스트렙타비딘은 분자의 양측에 두 세트로 위치된 비오틴에 대한 4개의 리셉터 사이트를 갖는 단백질이다. 비오틴-스트렙타비딘 상호작용은 자연에서 일어나는 가장 강력한 작용, 즉, k=1015M-1이기 때 문에 선택되었다(피어스 케미칼 컴패니(Pierce Chemcial Co.)의 "아비딘-비오틴 케미스트리: 핸드북," 1992, 엠. 비. 새비지 지음).
비오틴은 비오티닐레이티드 소혈청알부민(BBSA), 즉 ~8 비오틴 분자가 제1 아민을 통해 공유 결합된 소혈청알부민의 형태로 검출되었다. BBSA가 비드와 표면의 비특이 결합을 최소화하기 때문에 비오틴 보다는 BBSA가 사용되었다. BBSA의 다양한 농도가 스트렙타비딘 기능성의 초상자성 비드(다이날, 뉴욕주 레이트 석세스)의 분리 약수(separate aliquot)로 배양되었고, 비드는 별도의 비오틴-PEG 현미경 슬라이드로 배양되었으며, 비디오 강화 광학 현미경(전술함)으로 상대 위치를 관찰하면서 비드에 힘을 인가하였다.
임계점에서 비드를 표면에서 잡아당기는 힘은 비특이 결합과 중력을 극복하고, 이에 의해 비특이 흡착된 비드는 표면에서 분리되었다. 표면에 특이 결합된 비드의 수는 비디오 현미경으로 측정되었으며, 분석 결과를 도8에 결합된 입자 비율로 나타내었다.
분석의 감도 한계는 10ng/㎖ BBSA이다. 이 감도 한계는 큰 표면적과 상용 비드의 스트렙타비딘 활성에 의해 부여된다. 이론적인 비드의 전체 커버리지는 350ng/㎖ BBSA에서 달성된다.
비오틴 분석에 사용된 상세한 절차는 다음과 같다.
1. 비드의 준비: 0.15㎖의 스트렙타비딘 기능성 비드(M-280, 다이날, 뉴욕주 레이크 석세스)를 PBS, 0.1% 소혈청알부민(BSA)으로 (PBS-BSA를 함께) 3회 헹구고 PBS-BSA에서 하룻밤 배양하였다. 비드를 PBS-BSA 용액에서 분리하여 0.4㎖의 PBS에 재부상시켰다(re-suspend). 0.05㎖의 용액(0.1875mg의 비드)을 PBS에서 0.4㎖의 다양한 농도의 BBSA로 2시간 동안 배양시켰다.
2. 분석 셀의 준비: 유리 현미경 슬라이드를 전술한 것과 유사한 절차를 이용하여 PEG-비오틴으로 기능화시켰다. 다만, PEI보다는 제1 아민으로 유리를 기능화시키기 위해 실란이 사용되었다(실란화는 당해기술의 숙련자에게 공지된 기술로, 엘. 에이. 크라이시 등(L.A. Chryisey, et al)의 "합성 DNA의 자기 조립 단층막에 대한 공유 결합," 핵산 연구 24, 1996, 3031-3039에서 상세히 기재되어 있다). 그 후 플라스틱 고리가 광에폭시(놀랜드 프러덕츠 인코오포레이티드(Norland Products Inc.), 뉴저지주 뉴 부른스윅)로 유리 슬라이드에 결합되었으며, 자외선 처리되었다. 표면은 적어도 1시간 동안 0.2㎖의 PBS-BSA로 차단되었며 PBS로 헹구었다.
3. 분석: 0.15㎖의 비드가 셀에 첨가되어, 30분 동안 배양되었다. 셀을 현미경에 놓고 일 영역의 비드 수를 CCD 카메라, 디지털 프레임 그래버 및 전술한 소프트웨어를 이용하여 계수하였다. 표면에 결합된 비드의 수는 고리 모양의 자석을 (전술한 대로) 셀 위에서 소정 높이까지 낮추고 비드의 수를 계수하여 결정된다. 대안으로, 비드를 이동시키는데 필요한 힘 및/또는 시간은 이미지를 얻으면서 자석을 표면에 접근시킴으로써 결정될 수 있다.
실험예 2
샌드위치 분석을 이용한 오브알부민의 직접 검출
FDA가 모델 단백질 애널라이트인 오브알부민을 검출하는데 사용되었다. 이는 본 분석이 스트렙타비딘-비오틴보다 약한 분자 인식 상호작용, 즉 항체-항원 상호작용과 함께 이용될 수 있다는 것을 입증한다. 분석의 감도는 현재 100 pg/㎖의 오브알부민으로, 표준 효소 결합 면역 흡착제 분석(ELISA)보다 10배 이상 양호하다.
이 분석에서, 오브알부민은 산양(로트 번호 210497-02, NMRI)과 토끼(로트 번호 210497-01, NMRI)에 있는 오브알부민에 대해 부양된 두 개의 IgG 항체 사이에 결합되었다. 이들 항체는 비중첩 에피토프(단백질 영역)를 결합시키며, 함께 사용되면 샌드위치 구조로 오브알부민과 결합한다. 산양의 IgG는 항체를 스트렙타비딘에 1차 접합시키고, 그 후 PEG-비오틴 표면에 고정시켜서 표면에 부착되었다(전술한 화학작용). 토끼의 항체는 토실 기능성(tosyl functionalized) 초상자성 비드에 공유 결합으로 접합되었다. 실험예1에서 설명된 비오틴 분석처럼, 특이 및 비특이 흡착 비드를 구별하기 위해 자력이 이용되었다. 표면에 특이 결합된 비드의 수는 비디오 현미경으로 측정되었고, 그 분석 결과를 도9에 결합된 입자 비율로 나타내었다.
오브알부민의 직접 검출에 사용된 상세한 절차는 다음과 같다.
1. 표면의 준비: 분석은 면역 분석에 널리 쓰이는 폴리스티렌 웰이 있는 마이크로티트레이션 접시에서 수행되었다. PEG-비오틴 기능성 마이크로티터 접시는 전술한 PEI 화학작용을 이용해서 준비되었다.
2. 비드의 준비: 토실 활성 M-280TM다이날사의 비드의 현탁액이 피페트를 사용하여 1분 동안 와동시킴으로써 균질화되었다. 0.25㎖의 비드가 자기 분리를 이용하여 저장 매체로부터 분리되었다. 비드는 pH7.5의 0.1M 인산염 버퍼 0.5㎖에서 재부상되었다. 비드는 자기 분리를 이용하여 인산염 버퍼에서 2회 헹구어졌다. 6×108비드당 300㎍ ( 107비드당 5㎍)의 항체 용액이 인산염 버퍼에 용해되었다. 항체는 비드를 와동시키고(와동 세팅을 4로 유지), 1분 동안 계속 와동시키는 동안에 비드에 첨가되었다. 실온에서 회전 믹서를 사용하여 나중에 혼합이 이루어졌다. 튜브는 혼합물과 함께 RT에서 하룻밤(16-24시간) 배양되었다.
배양 후에 튜브는 1-4분 동안 자석에 놓여졌고, 상징액이 제거되었다. 항체가 코팅된 비드는 4회 헹구어졌는데, 두 번은 0.1% BSA 버퍼를 가진 PBS에서 5분 동안, 한번은 0.1% BSA를 가진 0.2M 트리스 pH8.5에서 RT에서 4시간 동안, 한 번은 BSA가 있는 PBS에서 5분 동안 행해졌다. 비드는 PBS, 0.1% BSA에 저장되었다.
비드는 물리적으로 흡착된 항체를 제거하기 위해 트리톤 X-100TM으로 두 번 세척되었다. 비드는 1% BSA가 있는 0.01M PBS를 가지고 5분 동안 세척되었다. 비드는 1% 트리톤-X100으로 5분 세척되었고, 0.01M 인산염 버퍼로 두 번 세척되었다. 비드는 재부상되어 1% BSA가 있는 1㎖의 0.01M PBS에 저장되었다.
3. 분석: 마이크로티터 웰을 Q-수(Q-water)와 PBS로 세척하였다. PBS가 제거되었고 PBS 내의 200㎕ 1% BSA가 PEG-비오틴 웰에 첨가되었다. 웰은 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 비드는 PBST(0.025% Tween20TM이 있는 PBS)로 3회 세척되었다. 100㎕의 산양 항체가 1 마이크로그램/㎖의 농도에서 오브알부민-스트렙타비딘에 첨가되었으며, 실온에서 1시간 동안 부화되었다. 비드는 다음에 PBST로 3회 세척되었다. 100㎕의 다양한 오브알부민 희석액이 첨가되며, 비드는 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 비드는 PBST로 3회 세척되었다. 100㎖의 PBS가 웰에 첨가되었으며, 그리고 나서 5㎕의 토끼 항체가 비드에 첨가된다 (100,000 비드/웰, 1% PBS-BSA에서 1:5로 희석). 비드는 20분 동안 배양되었다. 비드는 자석에 노출되기 전에 그리고 노출 후에 계수되었다.
실험예 3
샌드위치 분석을 이용한 오브알부민의 간접 검출
이 분석은 토끼와 산양 항체가 오브알부민을 샌드위치시키는데 사용된 점에서 오브알부민에 사용된 직접 분석과 비슷하다. 중요한 차이는 산양의 반토끼(antirabbit) 항체가 오브알부민에 대한 항체보다는 오히려 비드에 직접 접합되는 것이다. 샌드위치는 오브알부민을 산양 반 오브알부민(goat antiovalbumin) 항체 기능성 표면에 첨가하고, 토끼 반 오브알부민(rabbit antiovalbumin) 항체를 표면에 첨가하고 그리고 나서 산양 반토끼 항체 기능성 비드를 표면에 첨가함으로써 구성되었다. 이 분석의 이점은 그 감도가 현재 ELISA보다 100배 이상 양호한 10pg/㎖의 오브알부민이라는 것이다.
오브알부민 간접 검출에 이용된 상세한 절차는 다음과 같다.
1. 표면의 준비: PEG-비오틴 기능성 마이크로티터 접시를 전술한 PEI 화학작용을 이용하여 준비하였다.
2. 비드의 준비: 산양 반토끼 IgG가 비드(정제된 반토끼 IgG(M+L) 친화성, 벡터 라보라토리즈 인코오포레이티드(Vector Laboratories, Inc.), 캘리포니아주 94010 벌린게임 잉골드 로드 30)에 접합되는 점만 빼고는 직접 오브알부민 분석과 관련한 설명과 같다 .
3. 분석: 마이크로티터 웰을 Q-수와 PBS로 한번 세척하였다. PBS가 제거되고 PBS 내의 200㎕ 1% BSA가 PEG-비오틴 웰에 첨가되었다. 웰은 실온에서 1시간 동안 배양되었고 PBST로 3회 세척되었다. 100㎕의 산양 항체가 1 마이크로그램/㎖의 농도에서 오브알부민-스트렙타비딘에 첨가되었으며, 실온에서 1시간 동안 배양되었다. 다음에 PBST로 3회 세척하였다. 100㎕의 다양한 오브알부민 희석액이 첨가되었으며, 웰은 실온에서 1시간 동안 배양되었고, 다시 PBST로 3회 세척되었다. 100㎖의 다양한 토끼 반 오브알부민 항체 희석액이 첨가되었고, 웰을 실온에서 1시간 동안 배양한 후, PBST로 3회 세척하였다. 100㎖의 PBS가 웰에 첨가되고, 그리고 나서 5㎕의 산양 반토끼 비드가 첨가되었다(100,000 비드/웰, PBS-BSA에서 1:5로 희석). 여러 번의 피페팅에 의해 비드는 잘 절단되었다. 웰은 20분 동안 배양되었다. 비드는 자석에 노출되기 전에 그리고 노출 후에 계수되었다.
분명히 상기 개시 내용에 비추어 본 발명의 다양한 변형 및 변경이 가능하다. 그러므로, 첨부된 발명의 범위 내에서 구체적으로 기술된 것이 아니더라도 실시할 수 있다는 것을 알 수 있다.

Claims (19)

  1. 선택된 표적 종에 대한 감지기에 있어서,
    선택적 결합 상호작용을 겪을 수 있는 기질 변형제의 부착에 의해 화학적으로 변형된 기질,
    선택적 결합 상호작용을 겪을 수 있는 비드 변형제의 부착에 의해 화학적으로 변형된 하나 이상의 자기 활성 비드,
    상기 비드 상에 힘을 인가하기 위한 가변 자계를 생성하도록 조정되는 가변 자계 소스, 및
    상기 기질에 결합되는 개별 비드를 관찰하기 위해 조정되는 이미징 시스템을 포함하며,
    상기 비드 변형제는 상기 표적 종이 존재하는 경우에 상기 기질 변형제에 대해 결합 친화성을 가지며, 상기 표적 종이 없는 경우에는 상기 기질 변형제에 대해 측정 가능한 다른 결합 친화성을 갖는 것을 특징으로 하는 감지기.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기질 변형제는 합텐, 항체, 핵산, 단백질, 킬레이트 시약 및 선택적 결합 폴리머로 이루어진 그룹에서 선택되며, 상기 비드 변형제는 합텐, 항체, 핵산, 폴리펩티드, 당지질, 호르몬, 킬레이트 시약, 금속 이온 및 선택적 결합 폴리머로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 감지기.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 기질 변형제가 셀에 부착되는 것을 특징으로 하는 감지기.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 이미징 시스템이 광학 현미경을 포함하는 것을 특징으로 하는 감지기.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 이미징 시스템이 디지털 이미지 포착 시스템을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 감지기.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 이미징 시스템은 비드 이미지를 확인하기 위한 디지털 이미지 처리 시스템을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 감지기.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 자기 활성 비드가 복수의 비드를 포함하는 것을 특징으로 하는 감지기.
  8. 제7항에 있어서,
    비드를 계산하도록 조정된 계수 시스템을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 감지기.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 복수의 비드는 약 0.2㎛와 약 200㎛ 사이의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는 감지기.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 가변 자계 소스는 상기 기질에 대해 실질적으로 수직인 자계를 상기 하나 이상의 자기 활성 비드에 인가하기 위해 조정되는 것을 특징으로 하는 감지기.
  11. 제10항에 있어서,
    실질적으로 수직 자계를 인가하기 위한 상기 가변 자계 소스는 축 대칭 자계 구배를 생성하도록 조정되는 자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 감지기.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 축 대칭 자계 구배는 소정의 자계 구배인 것을 특징으로 하는 감지기.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 가변 자계 소스는 상기 비드에서 실질적으로 토크가 없는 자계를 상기 하나 이상의 자기 활성 비드에 인가하기 위해 조정되며, 상기 비드는 상기 비드의 집합체를 생성할 수 있는 소정 비드 밀도 임계치 이하의 비드 밀도를 갖는 것을 특징으로 하는 감지기.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 기질은 상기 부착된 기질 변형제가 있는 제1 영역과 비특이 흡착에 저항하기 위해 조정되는 제2 영역을 갖는 것을 특징으로 하는 감지기.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 기질은 수용성 폴리머 코팅을 가지며, 상기 폴리머 코팅은 상기 수용성 폴리머에 상기 기질 변형제를 부착시켜 상기 제1 영역에서 변형되며, 상기 제2 영역에 있는 상기 수용성 폴리머 코팅은 비특이 흡착에 대해 고유한 저항을 가지는 것을 특징으로 하는 감지기.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 폴리머는 상기 기질에 대한 부착 및 상기 기질 변형제에 대한 부착을 위해 조정되는 폴리에틸렌 글리콜인 것인 것을 특징으로 하는 감지기.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 기질은 폴리머 코팅을 가지며, 상기 폴리머 코팅은 상기 기질 변형제를 상기 폴리머에 부착시켜 제1 영역에서 변형되며, 상기 제2 영역의 상기 폴리머 코팅은 비특이 흡착을 줄이기 위해 부착된 일부분(moieties)을 갖는 것을 특징으로 하는 감지기.
  18. 표적 물질이 상기 표적 물질에 대한 결합 사이트를 갖는 종과 특이 결합하는, 상기 표적 물질을 포함하는 것으로 생각되는 표본에서 상기 표적 물질의 존재 유무를 검출하기 위한 방법에 있어서,
    선택적 결합 상호작용을 겪을 수 있는 기질 변형제를 부착하여 기질을 변경시키는 단계,
    선택적 결합 상호작용을 겪을 수 있는 비드 변형제의 부착에 의해 하나 이상의 자기 활성 비드를 변형시키는 단계,
    상기 기질과의 상호작용을 위해 상기 비드를 상기 기질 가까이 가져오면서, 상기 표적 물질을 포함하는 것으로 생각되는 용액에 적어도 하나의 상기 비드와 상기 기질을 배치하는 단계,
    상기 기질로부터 떨어지는 방향으로 상기 비드 상에 힘을 인가하기 위해 가변 자계를 인가하는 단계, 및
    상기 비드를 관찰하는 단계를 포함하며,
    상기 비드 변형제는 상기 표적 종이 존재하는 경우에는 상기 기질 변형제에 대해 결합 친화성을 가지며, 상기 표적 종이 없는 경우에는 상기 기질 변형제에 대해 측정 가능한 다른 결합 친화성을 갖는 것을 특징으로 방법.
  19. 표적 종과 상기 표적 종과의 특이 결합 상호작용을 겪는 종 사이의 상호 작용의 세기를 결정하기 위한 방법에 있어서,
    선택적 결합 상호작용을 겪을 수 있는 기질 변형제를 부착하여 기질을 변형시키는 단계,
    선택적 결합 상호작용을 겪을 수 있는 비드 변형제의 부착에 의해 하나 이상의 자기 활성 비드를 변형시키는 단계,
    상기 기질과의 상호작용을 위해 상기 비드를 상기 기질 가까이 가져오면서, 상기 표적 물질을 포함하는 것으로 생각되는 용액에 적어도 하나의 상기 비드 중 하나와 상기 기질을 배치하는 단계,
    상기 기질로부터 떨어지는 방향으로 상기 비드 상에 힘을 인가하기 위하여 가변 자계를 인가하는 단계,
    상기 비드 중 적어도 일부가 상기 기질로부터 분리될 때까지 상기 자계의 크기를 변화시키는 단계, 및
    상기 비드를 관찰하는 단계를 포함하며,
    상기 비드 변형제는 상기 표적 종이 존재하는 경우에 상기 기질 변형제에 대해 결합 친화성을 가지며, 상기 표적 종이 없는 경우에는 상기 기질 변형제에 대해 측정 가능한 다른 결합 친화성을 갖는 것을 특징으로 방법.
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