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BEREICH DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis von Analyten in flüssigen Proben
durch die Bildung einer dünnen
Schicht von Aggregaten, die den Analyten umfassen, sowie die Analyse
der so gebildeten Aggregate, vorzugsweise durch Anwenden einer Bildanalyse.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Der
frühe Nachweis
einer aktiven Krankheit in einem Patienten ist ein wesentlicher
Faktor für
eine erfolgreiche Behandlung. Vorausgesetzt, es wird eine schnelle
und korrekte Diagnose gestellt, ist es möglich, den Fortschritt zu verlangsamen
und Patienten zuweilen von einer Krankheit zu heilen.
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Herkömmliche
Verfahren für
den Nachweis infektiöser
Krankheiten beinhalten Serologieassays, z.B. Komplementfixation
(CF), indirekter und direkter fluoreszierender Antikörper (jeweils
IFA und DFA), Enzymimmuntest (ELISA) und Latexagglutination; Kultivierungsassays,
bei denen der von einem Patienten während einer akuten Infektion
gewonnene infektiöse
Mikroorganismus kultiviert und dann identifiziert wird; und Assays, die
die Verwendung monoklonaler Antikörper speziell gegen das infektiöse Agens
einschließen.
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Eine
Durchflusszytometrieanalyse wird ebenfalls für den Krankheitsnachweis angewendet,
die das Messen bestimmter physikalischer und chemischer Charakteristiken
von Zellen oder Teilchen, einschließlich Zellgröße, Gestalt
und innerer Komplexität
oder irgendeiner anderen Zellkomponente, beinhaltet, die durch eine
fluoreszierende Verbindung nachgewiesen werden kann, während die
Zellen oder Teilchen in Suspension nacheinander einen Erkennungspunkt
passieren. Die Anwendung von Durchflusszytometrie für Nachweisverfahren
ist z.B. in der
WO 99/47933 beschrieben.
Diese Publikation beschreibt ein Verfahren zum Nachweisen von Oberflächenantigenen
durch Inkontaktbringen eines antikörpergekoppelten Kügelchens
(Bead) mit einer Testprobe, wobei, wenn das Zielantigen in der Probe
vorliegt, so ein Bead-Antikörper-Antigen-Komplex
gebildet und per Durchflusszytometrie nachgewiesen wird.
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Die
US 6,159,748 beschreibt
einen Kit zum Nachweisen von Antikörpern in Serumproben unter
Verwendung eines Durchflusszytometers. Der Kit ist insbesondere
mit Beads ausgestattet, die mit einer Reihe von Antigenen beschichtet
sind und jeweils eine unterschiedliche Bead-Größe haben und unterschiedliche
Antigene tragen. Die Beads werden zum Nachweisen unterschiedlicher
Antikörper,
einschließlich
Autoantikörper, verwendet.
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Wie
die Fachperson verstehen wird, müssen
bei der Verwendung eines Durchflusszytometrieinstruments die Zellprobenpräparation,
Datenerfassung und Datenanalyse von einem speziell geschulten Techniker durchgeführt werden.
Das Durchflusszytometrieinstrument umfasst einen Laser und ein komplexes
optisches System, einen Hochleistungscomputer sowie elektrische
und fluidische Systeme. Die Komponentensysteme des Durchflusszytometrieinstruments
müssen
regelmäßig und
häufig
sachgemäß gewartet
und kalibriert werden. Die hohen Kosten des Instruments und die
Fachkenntnisse, die für
einen korrekten Betrieb eines solchen Instruments erforderlich sind,
machen den Nachweis per Durchflusszytometrie kompliziert und teuer.
Offensichtlich gilt diese Erkenntnis auch für viele andere Tests und Instrumente,
wie unter anderem für
den Enzymimmuntest (ELISA).
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Die
WO 01/33215 und die
WO 02/79749 beschreiben
Systeme zum Erzeugen eines Profils partikulärer Komponenten einer Körperflüssigkeitsprobe.
Die Systeme beinhalten im Allgemeinen eine Vorrichtung zum Bewirken
eines kontrollierten Flusses der Körperflüssigkeitsprobe auf einem Substrat,
wobei der kontrollierte Fluss der Körperflüssigkeitsprobe zu einer differentiellen
Verteilung der partikulären
Komponente auf dem Substrat führt,
sowie eine Vergrößerungsvorrichtung
zum Bereitstellen eines vergrößerten Bildes
von differentiell verteilten partikulären Komponenten auf dem Substrat.
Das vergrößerte Bild
repräsentiert
ein Profil der partikulären
Komponenten der Körperflüssigkeitsprobe.
Die beschriebenen Systeme können
ferner einen Bildanalysator zum Analysieren des Profils der partikulären Komponente
in der Körperflüssigkeitsprobe
umfassen.
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Die
US-Patentspezifikation Nr.
US-A-5,541,417 offenbart
Verfahren zum Analysieren einer Reaktion, wie einer Agglutinationsreaktion,
bei der ein Agglutinationsmuster entsteht. In einem Verfahren wird
ein Bild des Agglutinationsmusters erfasst. Das erfasste Bild wird
digitalisiert, um ein Pixel umfassendes digitales Bild zu bilden.
Die Rauheit, die die lokale Pixelumgebung reflektiert, wird an jedem
Pixel gemessen, das in einer Region von Interesse des digitalen
Bildes des Agglutinationsmusters liegt. Anhand der gemessenen Rauheit wird
eine Klassifizierung und/oder Quantifizierung des erfassten Bildes
des Agglutinationsmusters durchgeführt.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Ziel
der vorliegenden Erfindung ist es, ein schnelles, empfindliches
und leicht durchzuführendes
Verfahren für
den In-vitro-Nachweis von Analyten in einer flüssigen Probe unter Verwendung
eines optischen Bildanalysators bereitzustellen. Das erfindungsgemäße Verfahren
ist vorzugsweise für
die therapeutische Diagnose vorgesehen, kann aber auch für andere
Anwendungsbereiche geeignet sein, wie z.B. ökologische, umwelttechnische
usw.
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Gemäß einem
ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren
zum Nachweisen eines Analyten in einer flüssigen Probe bereit, das Folgendes
umfasst:
- (a) Mischen von genannter flüssiger Probe
mit einem Reagenz, das ein Einfangmittel umfasst, das ein erster
Teil eines Bindungspaars ist, der zu einem Analyten binden kann,
wobei der Analyt ein zweiter Teil des Bindungspaars ist, so dass
beim Vorliegen des Analyten in der flüssigen Probe Partikel des Bindungspaars gebildet
werden;
- (b) Behandeln von genannter Mischung, um auf einem festen Substrat
eine Monoschicht von genannten Partikeln zu bilden, falls sie infolge
von genanntem Mischen gebildet werden;
- (c) Erhalten eines optischen Bilds der Monoschicht; und
- (d) Analysieren von genanntem Bild, um davon die Gegenwart oder
Abwesenheit von Partikeln, die infolge der Verbindung zwischen dem
Bindungspaar gebildet wurden, zu bestimmen, wobei die Gegenwart
von Partikeln in der Probe die Gegenwart von genanntem Analyten
in der Probe anzeigt; oder um davon mindestens einen Parameter von
genannten Partikeln zu bestimmen.
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Ein
Parameter kann erfindungsgemäß unter
anderem Folgendes sein: Größe von Partikeln
oder Größenverteilung
der Partikel, die infolge der Verbindung zwischen dem Bindungspaar
gebildet werden; Partikelzahl; Partikelform und/oder die räumliche
Verteilung der gebildeten Partikel.
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Es
wird ein System zur Durchführung
des erfindungsgemäßen Verfahrens
offenbart, wobei das System Folgendes umfasst:
- (a)
ein Haltemittel zum Halten eines festen Substrats, das eine dünne Schicht
aus Partikeln trägt;
- (b) eine optische Bildsammelvorrichtung zum Erfassen eines Bildes
der dünnen
Schicht auf dem festen Substrat;
- (c) eine Bildanalysevorrichtung, gekoppelt mit der genannten
Bildsammelvorrichtung und zum Analysieren eines durch die Bildsammelvorrichtung
erhaltenen Bildes.
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Das
System umfasst optional eine Vergrößerungsvorrichtung.
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Ferner
wird ein Kit zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren offenbart, wobei
der Kit Folgendes umfasst:
- (a) wenigstens ein
Reagenz, das ein Einfangmittel umfasst, das ein erster Teil eines
Bindungspaares ist und wenigstens zwei Einfangeinheiten umfasst,
an die sich ein Analyt bindet, wenn er in einer flüssigen Probe
vorliegt, wobei der Analyt ein zweiter Teil des Bindungspaares ist;
und
- (b) ein festes Substrat zum Tragen einer dünnen Schicht aus Partikeln.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Damit
die Erfindung und ihre Umsetzung in die Praxis nachvollzogen werden
können,
werden nun einige Ausgestaltungen nur anhand von nicht begrenzenden
Beispielen unter Bezugnahme auf die Begleitfiguren beschrieben.
Dabei zeigt:
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1A–1C Lichtmikroskopbilder
von Plasmaproben, die mit Mikrobeads inkubiert wurden, die mit mehreren
Kopien eines gegen D-Dimer gerichteten Antikörpers beschichtet waren. Die
Plasmaproben enthalten einen sehr geringen Anteil von D-Dimer (1A),
einen mittleren Anteil von D-Dimer (1B) oder
einen hohen Anteil von D-Dimer (1C);
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2A–2C Säulendarstellungen
der Größenverteilung
von Partikeln, die infolge der Bindung eines D-Dimers an Mikrobeads,
die mit gegen D-Dimer gerichteten Antikörpern beschichtet waren, gebildet
wurden. Mikrobeads, die mit mehreren Kopien von gegen D-Dimer gerichteten
Antikörpern
beschichtet waren, wurden mit Proben inkubiert, die geringe Anteile
von D-Dimer (2A), mittlere Anteile von D-Dimer
(2B) oder hohe Anteile von D-Dimer (2C)
enthielten;
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3 die
durchschnittliche Größe von Partikeln,
die infolge einer Titration von Plasmaproben erhalten wurden, die
verschiedene D-Dimer-Konzentrationen enthielten;
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4 die
durchschnittliche Größe von Partikeln,
die mit Heparin-induzierten Thrombozytopenie-(HIT)-Proben, negative
Proben (n = 4) sowie positive Proben (n = 10), durch die Verwendung
des Diamed-Kits;
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5A–5B Lichtmikroskopbilder
von EDTA-antikoagulierten Typ-A-Blutproben,
vermischt mit einem Verdünnungspuffer
(0,9 % NaCl und 2 % Rinderalbumin), um eine 100fache Endverdünnung zu
erhalten, und Anti-Blutgruppe-A-(5A)
oder Anti-Blutgruppe-B-(5B)-Antikörper werden
auf eine Endkonzentration von 0,1 bis 0,25 mg/ml zugegeben, anschließend wird
das Gemisch 1 min lang unter vorsichtigem Mischen inkubiert und
dann mit dem Lichtmikroskop untersucht; 5B zeigt
ein Bild einer negativen Reaktion, wohingegen 5A ein
Bild einer positiven Reaktion zeigt;
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6 ein
Diagramm, das die durchschnittliche Größe von Blutaggregaten der Blutgruppen
0, A und AB darstellt, mit Antikörpern
gegen Gruppe A oder B inkubiert, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhalten und bestimmt wurden.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein schnelles und einfaches In-vitro-Verfahren zum Nachweisen
eines Analyten vorzugsweise in einer von einem Patienten gewonnenen
biologischen flüssigen
Probe bereit, ohne dass komplizierte Geräte oder Fachkenntnisse zum
Analysieren der Probe erforderlich sind. Ferner ist das erfindungsgemäße Verfahren
empfindlich und ermöglicht
den Nachweis in einem frühen
Krankheitsstadium und liefert ein Mittel zum Überwachen eines Patienten vom
Ausbruch bis zur Genesung von einer spezifischen Krankheit und zum
Beobachten der Wirksamkeit einer ausgewählten Behandlung gegen eine
Krankheit. Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens rührt von
der Bildung einer dünnen
Schicht der die in der analysierten Probe gebildeten Partikel (nach
dem Mischen mit einem geeigneten Reagenz) her, wenn der Analyt in
der Probe vorliegt. Die Bildung einer dünnen Schicht ermöglicht eine
genaue Bildanalyse der Partikel, so dass eine qualitative sowie
quantitative Bestimmung im Hinblick auf den Analyten erlangt wird.
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Es
ist zu verstehen, dass sowohl die vorangehende allgemeine Beschreibung
als auch die folgende Beschreibung einiger spezifischer Ausgestaltungen
der Erfindung lediglich Erläuterungszwecken
dienen und keineswegs als die beanspruchte vorliegende Erfindung
begrenzend aufzufassen sind.
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Gemäß einem
Aspekt der Erfindung wird somit ein Verfahren zum Nachweisen eines
Analyten in einer flüssigen
Probe bereitgestellt, das Folgendes umfasst:
- (a)
Mischen von genannter flüssiger
Probe mit einem Reagenz, das ein Einfangmittel umfasst, das ein
erster Teil eines Bindungspaars ist, der zu einem Analyten binden
kann, wobei der Analyt ein zweiter Teil des Bindungspaars ist, so
dass beim Vorliegen des Analyten in der flüssigen Probe Partikel des Bindungspaars gebildet
werden;
- (b) Behandeln von genannter Mischung, um auf einem festen Substrat
eine Monoschicht von genannten Partikeln zu bilden, falls sie infolge
von genanntem Mischen gebildet werden;
- (c) Erhalten eines optischen Bilds der Monoschicht; und
- (d) Analysieren von genanntem optischem Bild, um davon die Gegenwart
oder Abwesenheit von Partikeln, die infolge der Verbindung zwischen
dem Bindungspaar gebildet wurden, zu bestimmen, wobei die Gegenwart
von Partikeln in der Probe die Gegenwart von genanntem Analyten
in der Probe anzeigt; oder um aus dem genannten Bild mindestens
einen Parameter von genannten Partikeln zu bestimmen.
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Die
hierin verwendeten Begriffe „nachweisen" und „Nachweis" beziehen sich kollektiv
auf eine qualitative sowie quantitative Bestimmung der Gegenwart
eines Analyten in einer Probe.
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Folglich
liefert das erfindungsgemäße Verfabren
außerdem
einen analytischen (quantitativen) Nachweis eines Zielanalyten in
der flüssigen
Probe. Gemäß dieser
Ausgestaltung (d.h. der quantitative Nachweis) werden ein oder mehrere
Parameter bestimmt, die die infolge der Verbindung des Bindungspaares
gebildeten Partikel charakterisieren. Solche Parameter können von
einer Fachperson ohne weiteres definiert werden und schließen zum
Beispiel die Bestimmung der Größe der infolge
der Verbindung zwischen dem ersten und dem zweiten Teil des Bindungspaares
gebildeten Partikel, der Größenverteilung
der Partikel, der Anzahl gebildeter Partikel (Partikelzahl), des
Verteilungsmusters usw. ein. Für
die analytische Bestimmung der obigen Parameter ist es wichtig,
dass eine dünne
Schicht aus flüssiger
Probe und Reagenz gebildet wird, wie im Folgenden erläutert.
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Gemäß der Erfindung
führt die
Verbindung (Bindung oder Komplexierung) zwischen einem Analyten und
einem entsprechenden Einfangmittel zur Entstehung eines Komplexes.
Einfangmittel und Analyt bilden zusammen ein Bindungspaar. Das Bindungspaar
kann zum Beispiel eines der Paare sein, die ausgewählt sind aus
der Gruppe bestehend aus Rezeptor-Ligand, Zucker-Lektin, Antikörper-Antigen
(der Begriff „Antikörper" ist so zu verstehen,
dass er sich auf einen polyklonalen oder einen monoklonalen Antikörper, auf
eine Fraktion eines Antikörpers,
umfassend den variablen, Antigen-Biotin-bindenden Abschnitt usw.
bezieht).
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Der
Begriff „Analyt" bezieht sich gemäß einem
ersten Aspekt der Erfindung auf eine Zell- oder Mikroorganismuskomponente
wie Proteine (z.B. Antikörper,
Cytokine, Rezeptoren), Glykoproteine, Peptide, Verbindungen geringer
relativer Molekülmasse,
deren Nachweis in einer von einem Patienten gewonnenen Probe anzeigt,
ob der Patient eine spezifische Krankheit oder Störung hat.
Der Begriff „Analyt" kann sich auch auf eine
synthetische oder natürliche
Chemikalie oder auf eine Droge oder ein Toxin beziehen. Der Analyt
enthält gemäß diesem
Aspekt der Erfindung wenigstens zwei Bindungsstellen (Erkennungsstellen),
an die sich zwei individuelle und separate Einfangmittel binden
können.
Die Ergebnisse der Bindung an die jeweiligen Bindungsstellen des
Analyten an ein individuelles Einfangmittel resultiert folglich
in der Entstehung von Aggregaten von Bindungspaaren (hierin auch
als „Partikel" bezeichnet).
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Gemäß einer
anderen Ausgestaltung bezieht sich Analyt auf Teilchen, die auf
ihrer Oberfläche
wenigstens zwei Eindungs-(Erkennungs)-Stellen präsentieren. Der Analyt kann
zum Beispiel Antigen-präsentierende Teilchen
beinhalten, z.B. Antigen-präsentierende
Zellen, Viren oder andere infektiöse Mikroorganismen, die auf
ihrer Oberfläche
mehr als eine Kopie eines spezifischen Antigens präsentieren,
an die sich das Einfangmittel bindet.
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Der
Begriff „Einfangmittel" bezieht sich gemäß der Erfindung
auf jedes beliebige bi- oder multifunktionelle Mittel, das sich
vorzugsweise mit Spezifität
an zwei oder mehr Analyten in einer Probe binden kann, so dass Aggregate
von Bindungspaaren entstehen. Demzufolge beinhaltet das Einfangmittel
dimere, trimere oder multimere Moleküle, die jeweils zwei, drei
oder mehrere Einfangstellen präsentieren,
die sich unabhängig
an einen Analyten in der flüssigen
Probe binden können.
Das Mittel kann zum Beispiel ein Dipeptid oder Diprotein, überbrückt durch
einen Linker, sein. Gemäß einer
bevorzugten Ausgestaltung sind die Einfangmittel Mikrobeads, die
mit spezifischen Einfangeinheiten beschichtet sind. Das Einfangmittel
umfasst eine „Einfangeinheit", die im Prinzip
eine Bindungsstelle ist, zu der der Analyt eine Affinität hat, und
die Verbindung zwischen den beiden ist das Ergebnis einer Verbindung
zwischen der genannten Einfangeinheit (Stelle) des Einfangmittels und
der Erkennungsstelle des Analyten. Die Bedeutung der obigen Begriffe
ist anhand der folgenden nicht begrenzenden Beispiele weiter nachvollziehbar.
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Gemäß einer
Ausgestaltung der Erfindung ist das Einfangmittel ein Teilchen,
das wenigstens zwei Epitope umfasst, und der Analyt ist ein Antikörper (umfassend
zwei Bindungsstellen), an den sich die antigenen Epitope verschiedener
Einfangmittel binden, oder, umgekehrt, das Mittel ist ein Antikörper (umfassend
zwei Erkennungsstellen) und der Analyt ist ein Antigen, das wenigstens
zwei antigene Epitope umfasst, oder ein Teilchen, das auf seiner
Oberfläche
wenigstens zwei antigene Epitope präsentiert, an die sich zwei
oder mehr Antikörper
binden können.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der erfindungsgemäßen Verfahren
sind die Einfangmittel Mikrobeads, die mit Einfangeinheiten beschichtet
sind. Die Mikrobeads können
auf ihrer erkennenden Grenzfläche
einen einzigen Einfangmitteltyp oder mehrere Einfangmitteltypen
umfassen, so dass die beschichteten Mikrobeads in unterschiedlichen
Nachweisassays verwendet werden können. Der Begriff „erkennende
Grenzfläche" bezieht sich vorzugsweise
auf die Außenfläche der
Beads, die mit dem/den Einfangmittel(n) beschichtet ist, um die
Bildung der resultierenden Partikel zu ermöglichen.
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Die
erfindungsgemäß verwendeten
Mikrobeads können
aus Polymer wie Polystyrol, Latex usw. bestehen und werden mit dem
Einfangmittel entweder durch einfache Adsorption, mithilfe von Vernetzungsmitteln oder
mit einem beliebigen anderen Verfahren zum Konjugieren des Einfangmittels
mit den Mikrobeads beschichtet, das der Fachperson bekannt ist.
Die Mikrobeads können
gemäß der Erfindung
auch als Affinitätsbeads
bezeichnet werden und gemäß einer
Ausgestaltung sind die Mikrobeads Immunobeads.
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Die
Probe ist gemäß der Erfindung
vorzugsweise eine flüssige
biologische Probe und bevorzugter jede beliebige Körperflüssigkeit,
einschließlich
Blut (Plasma und Serum), Speichel, Urin oder Zelleinheiten, die
von Körperflüssigkeiten
(z.B. Blutzellen) abstammen, oder Zellkomponenten, die von Gewebe
oder von Körperhohlräumen gewonnen
werden können
und anschließend
in einem geeigneten Medium für
den Nachweis durch das erfindungsgemäße Verfahren suspendiert werden.
Trotzdem kann die Probe gemäß der Erfindung auch
von anderen Quellen stammen, z.B. zum Nachweisen von Analyten in
Abwasser, Wasserreservoirs, chemischen Lösungen usw.. Die folgenden
Beispiele beziehen sich zwar auf biologische Proben, doch ist die
Erfindung daher so aufzufassen, dass sie auch für den Nachweis von Analyten
in nicht biologischen Proben wie Chemikalien gilt.
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Das
erlangte optische Bild kann ein vergrößertes Bild der dünnen Schicht
der Probe sein und die Vergrößerung kann
mittels eines Lichtmikroskopobjektivs erzielt werden.
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Das
Lichtmikroskopobjektiv kann innerhalb einer Lichtmikroskopvorrichtung
oder innerhalb eines beliebigen anderen technischen Mittels konstruiert
sein, das in der Technik für
die optische Betrachtung eines Mikrobildes innerhalb einer Probe
bekannt ist. Das Lichtmikroskopobjektiv kann mit einer optischen
Bildsammelvorrichtung gekoppelt werden.
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Der
hierin in Verbindung mit dem Einfangmittel und der Erkennungsstelle
auf dem Analyten (zur Bildung des Bindungspaares) verwendete Begriff „verbinden" bzw. „Verbindung" bezieht sich auf
jede beliebige Form der Kombination zwischen dem ersten und dem
zweiten Teil des Bindungspaares, die in der Bildung der optisch
nachweisbaren partikulären
Materie resultiert, die das Bindungspaar umfasst. Der Begriff „verbinden" beinhaltet daher
jede Art der chemischen Bindung, wie z.B. eine ionische Bindung,
kovalente Bindung, metallische Bindung, Wasserstoffbindung, Van-der-Waals-Bindung und elektrische
Dipole. Folglich kann die Verbindung zwischen dem Bindungspaar eine
starke Verbindung (z.B. im Falle einer kovalenten Bindung) oder
eine schwache Verbindung (z.B. Wasserstoffbindung) sein, und in
jedem Fall ist die Verbindung stabil genug, um die Abbildung des
gebildeten Partikels zu ermöglichen.
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Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfabren
ist es wichtig, dass eine Monoschicht der partikulären Materie,
die anhand des Gemischs aus Analyt in der flüssigen Probe und Reagenz erhalten
wird, auf einem festen Substrat gebildet wird, um die optische Abbildung
und Analyse von innerhalb der flüssigen
Probe gebildeter partikulärer
Materie zu ermöglichen,
wenn der Analyt in der genannten Probe vorliegt.
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Der
Begriff „dünne Schicht" bezieht sich auf
eine im Wesentlichen gleichmäßige Schicht
aus Aggregaten/Partikeln von Bindungspaaren, die infolge der Verbindung
zwischen dem Einfangmittel (erster Teil des Bindungspaares) und
dem Analyten (zweiter Teil des Bindungspaares) gebildet wurden.
Eine im Wesentlichen gleichmäßige Schicht
bedeutet, dass es im Wesentlichen keine Überlagerung von einem Bindungspaar
(oder Bindungspaare umfassenden Partikel) auf einem anderen Bindungspaar
(oder Bindungspaare umfassenden Partikel) gibt und dass im Wesentlichen
nur ein (einzelner/s) Partikel/Objekt/Aggregat in der vertikalen
Dimension der Schicht vorliegt. Erfindungsgemäß ist eine dünne Schicht
eine Monoschicht.
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Es
gibt verschiedene Verfahren zum Erlangen einer im Wesentlichen gleichmäßigen Schicht
oder Monoschicht von Partikeln, wie die gemäß der vorliegenden Erfindung
gebildeten. Eine dünne
Schicht von Partikeln kann zum Beispiel durch Fixieren der Partikel
an dem festen Substrat erhalten werden, z.B. durch Sättigen des
festen Substrats, das das Proben-Reagenz-Gemisch trägt, mit
einem Sprühfixierungsmittel
oder durch Eintauchen des Gemischs in eine geeignete Fixierungslösung; durch
die Verwendung von am festen Substrat immobilisierten Einfangmitteln;
durch die Verwendung von Einfangmitteln mit hoher spezifischer Dichte
(z.B. mit Einfangeinheiten beschichtete Beads mit hoher spezifischer
Dichte, die sich durch Schwerkraft am Boden der Testkammer absetzen);
durch die Verwendung von magnetischen Einfangmitteln (z.B. magnetische
Beads, die mit Einfangeinheiten beschichtet sind); durch das Aufbringen
von mechanischem Druck auf das Proben-Einfangmittel-Gemisch (z.B. durch Aufbringen
einer festen Abdeckung); durch die Anwendung einer Cytospin-Technik
unter Nutzung von Zentrifugalkraft zum Trennen und Abscheiden einer
Monoschicht einer Substanz, typischerweise Zellen, auf Objektträger, während gleichzeitig
die Integrität
der Substanz beibehalten wird; usw.
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In
solchen Fällen,
in denen ein Bindungspaar gebildet und eine dünne Schicht der Bindungspaar-Partikelmaterie
erzeugt wird, kann das erfindungsgemäße Verfahren den zusätzlichen
Schritt des Trennens der dünnen
Schicht von dem flüssigen
Träger
beinhalten. Verfahren zum Trennen dünner Schichten von flüssigen Trägern wurden
z.B. von LaMina, Inc. (Arlington, VA, z.B. im
US-Patent Nr. 6,423,237 ;
6,106,483 ;
6,091,483 und anderen) entwickelt.
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Es
wird ein System zum Durchführen
des erfindungsgemäßen Verfahrens
offenbart, wobei das System Folgendes umfasst:
- (a)
ein Haltemittel zum Halten eines festen Substrats, das eine dünne Partikelschicht
trägt;
- (b) eine optische Bildsammelvorrichtung zum Erfassen eines Bildes
der dünnen
Schicht auf dem festen Substrat;
- (c) eine Bildanalysevorrichtung, gekoppelt mit der genannten
Bildsammelvorrichtung und zum Analysieren eines durch die Bildsammelvorrichtung
erhaltenen Bildes.
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Das
System kann ferner eine Vergrößerungsvorrichtung
umfassen. Gemäß einer
bevorzugten Ausgestaltung umfasst die Vergrößerungsvorrichtung Lichtmikroskopobjektive
und gemäß einer
bevorzugteren Ausgestaltung ist die Vergrößerungsvorrichtung ein Lichtmikroskop.
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Die
optische Bildsammelvorrichtung kann jede beliebige auf dem Gebiet
der optischen Bilderzeugung bekannte Vorrichtung sein, ist jedoch
bevorzugt eine Kamera. Die Bildsammelvorrichtung ist mit der genannten Vergrößerungsvorrichtung
gekoppelt, sofern Letztere vorhanden ist.
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Gemäß einer
Ausgestaltung beinhaltet die Analyse des Bildes die Bestimmung von
einem oder mehreren Parametern, die die Gegenwart und Konzentration
des Analyten in der Probe anzeigen, wobei der Parameter ausgewählt werden
kann aus: der Größenverteilung
von Partikeln, die infolge einer Interaktion zwischen dem Analyten
in der Probe und dem Einfangmittel gebildet wurden; die Anzahl von
Partikeln, die infolge der genannten Interaktion gebildet wurden;
die Form der genannten Partikel; und/oder die räumliche Verteilung der gebildeten
Partikel.
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Das
System ist optional mit einem festen Substrat ausgestattet. Das
feste Substrat kann gemäß der Erfindung
einen beliebigen Träger
zum Tragen der Probe, die Gegenstand des Nachweises ist, beinhalten,
auf dem die Verbindung zwischen dem das Einfangmittel umfassenden
Reagenz und dem Analyten, sofern in der Probe vorhanden, stattfinden
kann. Das feste Substrat ist so gestaltet, dass eine dünne Schicht
aus Partikeln des Bindungspaares darauf gebildet werden kann. Das
feste Substrat kann daher unter anderem ein Mikroskopobjektträger oder
eine Testkammer sein. Dabei ist zu verstehen, dass das Mischen der
flüssigen
Probe und des Reagenz in einem anderen Träger durchgeführt und
eine gebildete dünne
Schicht aus Partikeln dann zur Analyse zum festen Substrat übertragen
werden kann.
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Alternativ
kann das feste Substrat ein Behälter
sein, an dessen Boden sich die Partikel in Form einer dünnen Schicht
ansammeln.
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Optische
Bildsammelvorrichtungen (Abbildungssensoren) sind in der Technik
allgemein bekannt und brauchen daher nicht ausführlich beschrieben zu werden.
Ein Beispiel für
eine Vorrichtung beinhaltet Videokameras (z.B. CCD- oder CMOS- Kamera), die an dem
Mikroskop montiert werden können.
Die erhaltenen Bilder können
zu einer Datenverarbeitungseinheit geschickt und durch jede beliebige
bekannte Bildanalysesoftware (z.B. eine von Galai, Belt-Haemek,
Israel, entwickelte Bildanalysesoftware oder eine speziell entworfene
Software) analysiert werden, um die Anzahl der Aggregate und die
Verteilung der Partikelgrößen zu bestimmen, die
infolge der Aggregation entstanden sind. Die Verteilung der Partikelgröße korreliert
mit der Konzentration des Analyten in dem getesteten Prüfling und
mit der Anzahl der zwischen Einfangmitteln und Analyten infolge der
Inkubation gebildeten Komplexe.
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Es
wird ein Kit zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren offenbart, der
Folgendes umfasst:
- (a) wenigstens ein Reagenz,
das ein Einfangmittel umfasst, das ein erster Teil eines Bindungspaares
ist und wenigstens zwei Einfangeinheiten umfasst, an die sich ein
Analyt bindet, wenn er in einer getesteten flüssigen Probe vorliegt, wobei
der Analyt ein zweiter Teil des Bindungspaares ist; und
- (b) ein festes Substrat zum Tragen einer dünnen Schicht aus Partikeln.
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Der
Kit kann ferner Mittel zur Bildung einer dünnen Schicht des Gemischs aus
der flüssigen
Probe und dem Einfangmittel umfassen. Diese Mittel sind von der
Art des verwendeten festen Substrats und/oder Einfangreagenz abhängig. Dient
zum Beispiel ein Mikroskopobjektträger oder eine Testkammer als
festes Substrat, dann kann die dünne
Schicht durch Auflegen einer Abdeckplatte auf das Proben-Reagenz-Gemisch erzeugt werden.
Der auf die flüssige
Probe aufgebrachte Druck veranlasst folglich die Bildung einer dünnen Schicht von
Letzterer. Alternativ kann der Kit Fixierungsreagenzien zum Fixieren/Immobilisieren
des Einfangmittels auf dem festen Substrat in einer Dünnschichtstruktur
umfassen. Ferner kann im dem Fall, dass das Einfangmittel aus einer
magnetischen Substanz besteht, eine Anordnung in einer dünnen Schicht
durch die Verwendung von Magnetkräften erfolgen.
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Die
Erfindung wird nun anhand der folgenden nicht begrenzenden Beispiele
unter Bezugnahme auf die beigefügten
Figuren veranschaulicht.
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SPEZIFISCHE BEISPIELE
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1. Beispiel
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Die
folgenden Beispiele wurden mit Latex-Mikrobeads durchgeführt, die
mit einem gegen D-Dimer gerichteten Antikörper beschichtet waren (Biopool
International, Umea Schweden, Kat. Nr. 150709, Beispiel 1.1), oder
mit Polymerbeads, die mit Heparin/PF4-Komplexen beschichtet waren
(DiaMed-ID PaGIA [Particle Gel Immuno Assay], Kat. Nr. 050051, DiaMed
AG, 1785 Cressier s/Morat, Schweiz, Beispiel 1.2).
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Im
Allgemeinen wurden Plasmaproben mit Mikrobeads, die mit den spezifischen
Einfangmitteln beschichtet waren, über einen vorbestimmten Zeitraum
inkubiert. Nach der Inkubation wurde jede Probe abgedeckt, um eine
dünne Schicht
des Gemischs zu bilden, und auf einen Lichtmikroskopobjektträger gegeben
und mit einem Lichtmikroskop untersucht. Bilder der resultierenden
dünnen
Schicht der Proben wurden mit einer auf dem Mikroskop montierten
Videokamera (CCD-Kamera) erfasst. Die so erhaltenen Bilder wurden
mit einer Bildanalysesoftware (Galai, Beit-Haemek, Israel) analysiert,
um die Anzahl der Aggregate und die Verteilung der Partikelgrößen zu bestimmen,
die infolge der Aggregation entstanden sind. Die Verteilung der
Partikelgröße korrelierte
mit der Konzentration des Analyten in dem getesteten Prüfling und
mit der Anzahl von Komplexen, die zwischen Einfangmitteln und Analyten
infolge der Inkubation gebildet wurden.
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Beispiel 1.1
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Ein
D-Dimer-Kit (Dade Behring Inc.) wurde zur Bestimmung der Gegenwart
von D-Dimer in Plasmaproben verwendet und gemäß den Anweisungen des Herstellers
bedient. In diesem spezifischen Assay wurden drei Plasmaproben,
(i) mit einem sehr geringen Anteil von D-Dimer, (ii) mit einem mittleren
Anteil von D-Dimer oder (iii) mit einem hohen Anteil von D-Dimer,
im Hinblick auf die Gegenwart von D-Dimer durch die Verwendung von Mikrobeads
getestet, die mit gegen D-Dimer gerichteten Antikörpern beschichtet
waren. Die Mikrobeads wurden mit jeder Probe 1 Minute lang inkubiert,
woraufhin die Proben mit einer Abdeckplatte abgedeckt (um eine dünne Schicht
des Gemischs zu bilden) und zu Mikroskopplatten übertragen und wie oben beschrieben
analysiert wurden.
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Die 1A–1C und 2A–2C zeigen
die erzielten Ergebnisse. Insbesondere bildete ein Mikroskopprüfling von
Probe (i) nach der Inkubation mit den Mikrobeads keine wesentlichen
Partikel, wie per Mikroskop beobachtet wurde (1A).
Darüber
hinaus zeigte die Analyse des von diesem Prüfling erhaltenen Bildes, dass
die durchschnittliche Größe der durch
Komplexierung zwischen D-Dimer und Mikrobeads gebildeten Partikel
bei 21,6 ± 1,8 μm2 liegt (2A).
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Ein
Mikroskopprüfling
von Probe (ii) mit mittleren Anteilen von D-Dimer brachte Aggregate
hervor, die mit dem Mikroskop erkennbar waren (1B).
Darüber
hinaus zeigte die Analyse des von diesem Prüfling erhaltenen Bildes eine
Veränderung
bei der Partikelgrößenverteilung
auf, mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 48,3 ± 27,2 μm2 (2B).
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Schließlich brachte
ein Prüfling
der Probe (iii) mit hohen Anteilen von D-Dimer Aggregate hervor, die ebenfalls
mit dem Mikroskop erkennbar waren (1C), und
die Analyse des von diesem Prüfling
erhaltenen Bildes zeigte eine weitere Veränderung bei der Partikelgrößenverteilung
(verglichen mit 2B) auf, mit einer durchschnittlichen
Partikelgröße von 156 ± 155 μm2 (2C).
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Diese
durch den Nachweis der Aggregatgrößenverteilung erhaltenen Ergebnisse
korrelieren mit den D-Dimer-Anteilen in den getesteten Proben.
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Außerdem wurde
eine Titrationskurve von D-Dimer-Konzentrationen in Plasmaproben
ermittelt. Insbesondere wurden Plasmaproben mit verschiedenen Konzentrationen
von D-Dimer mit Anti-D-Dimer-Antikörper-beschichteten Beads 1
Minute lang inkubiert, woraufhin Prüflinge der verschiedenen Proben
mit einem Lichtmikroskop analysiert wurden. 3 präsentiert
die Titrationskurve, die unmittelbar nach dem Ende des Inkubationszeitraums
erhalten wurde, und zeigt, dass es einen direkten Zusammenhang zwischen
der D-Dimer-Konzentration in den Proben und der durchschnittlichen
Größe der Aggegrate
gibt, die infolge der Komplexierung zwischen D-Dimer-Molekülen in der
Probe und den Mikrobeads gebildet wurden, mit denen die Probe inkubiert
wurde. Diese Ergebnisse legen die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens
nicht nur für die
qualitative Bestimmung, sondern auch als ein analytisches Werkzeug
für quantitative
Bestimmungen nahe.
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Beispiel 1.2
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Das
HIT-Syndrom ergibt sich bei einigen Patienten, während sie mit Heparin behandelt
werden, aus einer Immunreaktion auf den Komplex von Heparin und
Blutplättchenfaktor
4 (PF-4), der sich auf der Oberfläche der Blutplättchenmembran
befindet. Das Ergebnis dieser Reaktion ist eine immunvermittelte
Thrombozytopenie oder, seltener, auch eine Thrombose der Haut oder
anderer Organe. Im folgenden Assay werden Beads verwendet, die mit
Heparin und PF-4 beschichtet sind und die mit dem Plasma eines Patienten
interagieren. Im Falle einer positiven Reaktion werden Aggregate
von Beads eingefangen.
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Zu
diesem Zweck wurde ein HIT-Kit von Diamed (DiaMed, Cressier, Schweiz)
in diesem Assay verwendet und gemäß den Anweisungen des Herstellers
bedient, um positive und negative Proben zu bestimmen. Im Allgemeinen
wurden Plasmaproben mit ID-PaGIA-Polymerpartikeln in einem Verhältnis von
5:1 vermischt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Prüflinge von
jeder Probe wurden zur weiteren Analyse wie oben beschrieben erhalten.
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Es
wurden vierzehn Plasmaproben getestet, von denen 4 gemäß dem Diamed-Kit
negativ und 10 positiv waren. Die mit dem Bildanalysator erhaltene
durchschnittliche Größe der Partikel
ist in 4 dargestellt, die zeigt, dass die durchschnittliche
Größe der Partikel
in der negativen Kontrollgruppe 11,6 ± 1,2 μm2 und
in der positiven Gruppe 39,7 ± 4,4 μm2 betrug. Eine ungepaarte Student-t-Testanalyse
der Daten zeigte eine bedeutende Differenz zwischen der negativen
Kontrollgruppe und der positiven Gruppe von p < 0,002 auf.
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Beispiel 2
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
wurde außerdem
zur Typisierung von Blutgruppen angewendet. Demzufolge wurden Blutproben
von Blutspendern (mit unbekannter Blutgruppe) genommen. Die Blutproben wurden
mit einem Antikoagulationsmittel (EDTA) behandelt und in einem Blutverdünnungspuffer
(0,9 % NaCl und 2 % Rinderalbumin) verdünnt (100fach). Tropfen (10 μl) des verdünnten Blutes
wurden auf zuvor mit einem Antikörper
beschichtete Objektträger
gegeben. Die Beschichtung wurde durch Platzieren eines Anti-Gruppe-A- oder
Anti-Gruppe-B-Antikörpers auf
den Objektträger
(10 μl Antikörper bei
einer Konzentration von 0,2 bis 0,5 mg/ml) und Trocknenlassen des
Objektträgers
an der Luft erreicht.
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In
einem alternativen Verfahren wurden die Blutproben mit einem Antikoagulationsmittel
(EDTA) behandelt und in einem Blutverdünnungspuffer verdünnt (50fach);
die verdünnten
Blutproben (5 μl)
wurden dann mit Anti-Gruppe-A- oder Anti-Gruppe-B-Antikörpern (5 μl; 0,2 bis 0,5 mg/ml) gemischt
und jeder Tropfen der gemischten Probe wurde auf einen Objektträger gegeben.
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In
jedem Fall wurde eine dünne
Schicht des getesteten Gemischs vor der Analyse gebildet.
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Als
Kontrolle wurden antikoagulierte Blutproben auf einen unbeschichteten
Objektträger
gegeben, ohne die Anwesenheit von Anti-Gruppe-A- oder Anti-Gruppe-B-Antikörper. Als
eine weitere Kontrolle wurden Blutproben einer bekannten Blutgruppe
mit Antikörpern
gegen andere Blutgruppen gemischt (z.B. Blutgruppe A wurde mit Antikörpern gegen
Blutgruppe B gemischt).
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Die
Blutproben (entweder die Kontrolle oder mit den Antikörpern gemischte
Proben) wurden 15 Sekunden lang inkubiert und anschließend wurde
ein Deckglas auf den Probentropfen gelegt, um eine dünne Schicht
der Probe zu bilden (ohne direkten Kontakt mit dem Objektträger, z.B.
in einem Abstand von 0,5–1,0 mm
vom Objektträger).
Die abgedeckten Proben wurden dann zehn leichten Drücken ausgesetzt,
die auf das Zentrum des Bluttropfens gerichtet wurden, und ein optisches
Bild wurde mit einer CCD-Kamera gemacht, die mit einem Bildanalysator
(Galai) verbunden war.
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5A zeigt
ein optisches Bild einer negativen Reaktion, und in diesem speziellen
Fall ist eine Reaktion zwischen Blutgruppe A und Anti-B-Antikörpern dargestellt. 5B zeigt
eine Reaktion zwischen Blutgruppe A und Anti-A-Antikörpern, ein
Bild einer positiven Reaktion, die durch die Bildung sichtbarer
Partikel (Aggregate) infolge der Verbindung zwischen dem Antikörper, der
zwei Einfangmittel trägt,
und der Blutzelle, die mehrere Kopien des entsprechenden Antigens
trägt,
aufgezeigt wird.
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Außerdem wurden
die durchschnittliche Größe und Oberflächenabdeckung
der Aggregate auf dem Objektträger
bestimmt. Tabelle 1 und
6 präsentieren die Ergebnisse, von
denen die Blutgruppe abgeleitet wurde. Tabelle
1: Bildanalyse von Blutgruppen
| Antiserum | Durchschn.
Größe | Oberflächenabdeckung | Blutgruppe |
| | (μm2) | (%) | |
| A | 64,9 | 4,1 | |
| | | | A |
| B | 22,7 | 1,9 | |
| A | 19,2 | 1,7 | |
| | | | B |
| B | 83,9 | 4,6 | |
| A | 68,5 | 5,4 | |
| | | | AB |
| B | 87,9 | 8,1 | |
| A | 17,1 | 1,2 | |
| | | | O |
| B | 16,7 | 2,3 | |