DE2635347A1

DE2635347A1 - Messanordnung und -verfahren

Info

Publication number: DE2635347A1
Application number: DE19762635347
Authority: DE
Inventors: Robert J Oliveira
Original assignee: Minnesota Mining and Manufacturing Co
Current assignee: 3M Co
Priority date: 1975-08-04
Filing date: 1976-08-03
Publication date: 1977-02-24
Also published as: FR2320546B3; JPS6134092B2; GB1559000A; US4099886A; JPS5245398A; US4099874A; US3992096A; FR2320546A1

Description

1 BERLIN 33 8 MÜNCHEN

Augu*te-Viktorla-Stra8e65 _n DIIC^Ul/C B DADTMCD PienzermuerstraB·2

Pat.-Anw. Dr. Ing. Ruschke Ur. KU O O Π i\fc & ΓAK I IN tK _{paJ Anw D}, ,.

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088 / O 49 20 UO

Telegramm-Adresse: O £> O P O / ·"» Quadratur Berlin £ D O O O 4 / ^T»'»e™nm-A<lr»sM: T E L E X: 1 83 78« Quadratur München

TELEX: 522787

j NACHGEREICHT [

M 37 τ 2

Minnesota Eining and Manufacturing Uompany, Saint Paul, Minnesota 55I0I, V. St. v. A,

Keßanordnung und - verfahren

Die .Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen der Bildung oder des Vorhandenseins von auf Licht einwirkenden Bereichen, die von einem Medium getragen werden. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum wachweisen von Teilchen oder Teilchenklumpen in einem Trägermedium· Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Kachweisen des Zusammenklebens von Antigenen und ihrer entsprechenden Antikörper bei herkömmlichen immunologischen Diagnosetestverfahren, wobei ein Beobachtungsgerät und eine Testkarte zur praktischen Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens einbezogen sind.

Eine Anzahl pathologischer Zustände ebenso wie bestimmte nichtpathologische Zustände, wie z_eB_o eine Schwangerschaft, werden routinemäßig unter Anwendung bekannter Grundsätze der Immunologie diagnostizierte Wenn der menschliche oder tierische Körper fremdem Protein (Antigen) ausgesetzt wird, wird der natürliche Ab?

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-Z-

wehrmechanismus des Körpers ausgelöst, um einen Antikörper entsprechend deiii eingedrungenen Antigen zu erzeugen. 7/erin ein Antigen und sein entsprechender Antikörper unter geeigneten Bedingungen miteinander in Berührung kommen, treten ein Zusammenkleben sowie eine Agglomeration auf und es wird ein komplexes Gebilde gebildet, das im allgemeinen weniger lösbar als entweder das Antigen oder der Antikörper ist„ Diese Antigen-Antikörper-Reaktion ist die Basis der meisten immunologischen Diagnosetests» Bei den meisten Tests wird ein Reagens, das ein bekanntes Antigen oder einen bekannten Antikörper enthält, einem Versuchsmedium zugefügt, das ein Serum oder eine andere Körperflüssigkeit des Patienten enthältο Falls ein Zusammenkleben beobachtet wird, können Rückschlüsse hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit des entsprechenden Antigens oder Antikörpers in dem Versuchsmedium ge-

' macht werden,,

Um für ein effektives Diagnoseverfahren zu sorgen, muß das Vorhandensein oder das Nichtauftreten eines Zusammenkleben in dem Versuchsmedium leicht unterscheidbar sein«. Das war bislang ein . Problem bei vielen Antigen-Antikörperanordnungen, bei denen ein j Zusammenkleben langsam vor sich ging oder die Teilchengröße der Agglomeration zu klein war, um mit bloßem Auge beobachtet zu werden,, Dieses Problem wurde ein wenig durch das Zufügen "eines Trägermaterials, wie z_oB_e Polystyrol-Latex zu dem Antigen oder Antikörper bei der Bildung des bekannten Reagens behoben« Bei einem Testverfahren hatte die Verwendung eines Latex-Protein-Reagenses die Bildung von Agglomerationen zur Folge, die größer und leichter zu beobachten waren. Aber die visuelle Beobachtung eines Zusam-

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menklebens in dem Testmedium ist häufig selbst dann schwierig, wenn ein Trägermaterial vorhanden ist«, Infolge davon hängt die

^: Genauigkeit vieler immunologischer Diagnoseverfahren in großem ·' Maße von der individuellen Erfahrenheit der den Versuch ausfüh- ; rend en Person ab«,

ι Es ist eine Anzahl an Vorrichtungen zum Nachweisen der Bildung i oder des Vorhandenseins von Teilchen in einem Trägermedium ent-

'■■ wickelt wordene Einige dieser Vorrichtungen haben insbesondere

J im Bereich immunologischer Diagnoseverfahren Anwendung gefunden, jedoch leiden die meisten dieser bekannten Vorrichtungen unter bestimmten Nachteilen insofern, daß sie entweder komplizierte oder teure optische und elektronische Instrumente erfordern oder eine Auswertung der Ergebnisse schwierig und/oder zeitraubend

Die Anordnung gemäß der Erfindung bewältigt viele Unzulänglichkeiten herkömmlicher Anordnungen und sorgt für eine bequeme, effektive, leicht verwendbare und preiswerte Einrichtung zum Nachweisen von auf Licht einwirkender Bereiche in einem Trägermedium_o

Der Begriff "auf das licht einwirkende Bereiche" bezieht sich auf diskrete Flächen oder Gebilde, die andere lichtdurchlässige Eigenschaften als das Trägermedium aufweisen. Im allgemeinen werden die mit dem Licht in Wechselwirkung stehenden Bereiche von Teilchen oder Teilchenklumpen gebildete Sie können jedoch auch von nicht teilchenartigen Faktoren, wie z.B. Unterbrechungen oder Unregelmäßigkeiten in einer diskontinuierlichen Monoschient oder in einem Film, gebildet werden oder sie können diskrete

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Tröpfchen einer in'einem Medium dispergierten Substanz sein, die z.B₀ in einer Emulsion bestehen kann. Der Begriff "von einem Medium getragen" beinhaltet, daß die besonderen auf das Licht einwirkenden Bereiche in dem Medium enthalten sein können, z.B_o als Partikel in einer Flüssigkeit oder einem Gel oder auf der Oberfläche eines Substrats abgelagert, z.B. als Film.

Die erfindungsgemäße Anordnung arbeitet mit dem Phänomen der Szintillation, um die von einem Medium getragenen Bereiche, die auf das Licht einwirken, zu beobachten. Szintillation ist ein Elimmer- oder Flackereffekt, der erzeugt wird, wenn einzelne Lichtstrahlen in einem vielpunktigen Lichtfeld wahllos aufflakkernd erscheinen.

Die Erfindung sorgt für ein Verfahren zum Kachweisen auf Licht einwirkender Bereiche vorbestimmter Größe, die von einem Medium getragen werden, wobei das Medium zwischen einer Quelle einer vielstufigen Belichtung und einer die Szintillation nachweisenden Einrichtung angeordnet wird, das Medium mit einer Eenge diskreter lichtstrahlen, die durch das Medium hindurch zur die Szintillation nachweisenden Einrichtung gerichtet sind, belichtet wird, und eine Relativbewegung zwischen den Lichtstrahlen und dem , Medium hervorgerufen wird₀ Wenn die Quelle der vielpunktigen Be-. lichtung und das Medium von einander' im Abstand angeordnet sind, ! kann die Einrichtung zum Nachweisen der Scintillation alternativ relativ zu den Lichtstrahlen, dem Medium oder zu beiden bewegt ^! werden. Wenn auf das Licht einwirkende Bereiche in dem Trägerme- '' dium vorhanden sind, werden die Lichtstrahlen wahllos flackern ■' j

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INSPESH»

oder szintillieron, wenn sic mit diesen Eereichen in 7echselwirkang stehen.

Das Verfahren sorgt für eine bequeme Einrichtung zum Beobachten winziger, auf das Licht einwirkender Bereiche, die sonst ohne Vergrößerung unsichtbar sind« Das Verfahren ist insbesondere zui Verwendung auf dem Gebiet der medizinischen Diagnostik zum Bestimmen des Vorhandenseins von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen bei herkömmlichen immunologischen Tests geeignet» Es ist auch geeignet zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen roten blutkörperchen bei Blutkreuzanpassungsversuehen zum Nachweis γόη Bakterien sowie auch für andere Zwecke. Das Verfahren findet auch viel außerhalb des medizinischen Bereichs auf Gebieten Verwendung, bei denen es erwünscht ist, das Vorhandensein von Teilchen oder Inhomogenitäten in einem Medium zu bestimmten, die für eine visuelle Beobachtbarkeit zu klein sind. ■.

Dieses Verfahren ist besonders zum Nachweis von auf Licht einwirkende Bereiche in der Größenordnung von ungefähr o,5 bis 25o Mikron, vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 8o Mikron hinsichtlich ihrer breitesten Abmessungen geeignet. Sind Teilchen oder Teilch en klump en nachzuweisen, die kleiner als ungefähr o,5 iiikron ; sind, so hat das eher eine Lichtstreuung als eine Szintillation zur Folge, während solche Teilchen, die größer als 25o Mikron sind, leicht ohne die Notwendigkeit einer optischen Vergrößerung beobachtbar sind. Wenn nicht teilchenartige, auf das Licht einwirkende Bereiche nachgewiesen werden sollen, wie z.B_e Unterbrechungen in einem diskontinuierlichen, monomolekularen Film, wei-

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sen die Teilchen im allgemeinen solche G-rößenanordnuug, wie oben angeführt, auf_o Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Bestimmung der scheinbaren Größe sowie des Vorhandenseins von auf Licht einwirkender Bereiche in einem besonderen Trägermedium ^: verwendet werden,,

Die entscheidenden Elemente der erfindungsgemäßen Anordnung sind • (1) eine Quelle vielpunktiger Belichtung, (2) eine Einrichtung ^: zum Anordnen des fragermediums zwischen der Quelle vielpunktiger Belichtung und der Einrichtung zum Nachweis der Szintillation I und (3) eine Einrichtung- üur Erzeugung einer Relativbewegung zwischen den Lichtstrahlen und dem Trägermedium₀ !

Quellen vielpunktiger Beleuchtung werden bei der praktischen j

Ausführung der Erfindung vorzugsweise von lichtdurchlässigen oder j

reflektierenden Oberflächen gebildet, die Licht von einer einzigen Quelle, wie Z₀B₀ einer G-lühlampe, erhalten und es in eine | Anzahl diskreter Lichtstrahlen aufteilen. Die diskreten Licht- ; strahlen können durch eine geeignete retroreflektive Oberfläche, die von oben beleuchtet wird, oder durch eine lichtundurchlässige Fläche erzeugt werden, die winzige Öffnungen oder transparente Bereiche aufweist, die von unten beleuchtet werden.

Eine besonders verwendbare Quelle einer vielpunktigen Beleuchtung ist eine retroreflektive Oberfläche, die aus einer Mono schicht von darin unbeweglichen Glasperlen, z.B, in einem schwarz pigmen-

I tiertem Harz, zusammengesetzt ist. Eine derartige Oberfläche kann j

von oben durch eine einzige Lichtquelle beleuchtet werden, und ' jede Glasperle wird einen reflektierten Lichtstrahl erzeugen,,

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Die Größe der Glasperlen und der iirechungsgrad des Harzes werden die scheinbaren Durchmesser der reflektierten Lichtstrahlen bestimmen. Retroreflektive Oberflächen dieser Art werden von der

'"Firma 3M Company, St. Paul, Minnesota, USA hergestellt.

i
Andere retroreflektive Oberflächen, die verwendet werden können,

sind Flüssigkeitsfilme mit darin suspendierten retroreflektiven ; Perlen. Ein Beispiel einer solchen Fläche wixd von einem Fuji,

gebildet, der sog. Codit reflektive Perlen aufweist (3M Company, ■ St.Paul, Minnesota, USA).

Zur Durchführung der Erfindung kann eine Vielfalt anderer Ober-. flächen zum Teilen gerichteten Lichtes in eine Anzahl diskreter j Lichtstrahlen verwendet werden. Jede Oberfläche mit geeigneten : kleinen diskreten öffnungen oder mit transparenten Eereichen zum Durchlassen von Licht kann verwendet werden. Als besonders geeig- .

net haben sich Bildraster erwiesen, wie sie für gewöhnlich in !

ι ;

' der Fotografie verwendet werden. Auch Oberflächen, die von einem

Querschnitt eines Bündels einer Faseroptik gebildet werden, sind

verwendbar. Geprägtes Mattglas oder andere Oberflächen, die Licht j in diskreten Bereichen durchlassen, sind geeignet.Es ist nicht j

I notwendig, daß die von einer Lichtquelle einer vielpunktigen Be- ί leuchtung erzeugten Lichtstrahlen gleichförmig und im regelmäßi- ; gen Abstand von einander angeordnet sindo

Die scheinbaren Durchmesser der einzelnen Lichtstrahlen, die das Trägermedium beleuchten, hängen von dem Durchmesser der lichtdurchlässigen Teile auf der Oberfläche oder, im Fall retroreflektiver Oberflächen, von dem Durchmesser der einzelnen retroreflek-

BADORIOINAL

tiven Teile, Z₀B₀ der Glasperlen, ab„ Die scheinbaren Durchmesser

der Lichtstrahlen können leicht durch mikrofotogrfische Verfahren gemessen werden, Eeim Auswählen einer Oberfläche zum Erzeugen einer vielpunktigen Beleuchtung bei einem ieilchen-Testverfahren müssen Überlegungen hinsichtlich der Größe der auf das Licht einwirkenden Bereiche, die nachgewiesen werden sollen, gemacht i werden,,

i Um teilchenartige oder nichtteilchenartige, auf Licht einwirkende I Bereiche einer Größenordnung von ungefähr o,5 bis 25o Kikron ! durch das Szintillationsverfahren nachzuweisen, wird das Srägermedium vorzugsweise durch eine vielpunktige Beleuchtung beleuchtet, wobei das Verhältnis des scheinbaren Durchmessers der einzelnen Lichtstrahlen bei mikrofotografischer Messung zu dem scheinbaren Durchmesser der Bereiche ungefähr 5o/1 bis 1/1 ο ist. Das genaue Verhältnis stellt innerhalb weiter Grenzen kein Problem dar und optimale Bedingungen werden sich von Versuch zu Versuch in Abhängigkeit von solchen Faktoren wie der Entfernung zwischen dem Trägermedium und der vielpunktigen Beleuchtungsfläche, der Verschiebungsgeschwindigkeit und den Lichtdurchlässigkeitseigenschaften der Bereiche verändern_e In den meisten Fällen, werden lichtstrahlenerzeugende Flächen mit einem Durchmesser zwischen 1o und 1oo Mikron verwendet.

Um, wie oben ausgeführt wurde, für eine Szintillation zu sorgen, : muß eine Relativbewegung zwischen den einzelnen Lichtstrahlen· ■ und dem Trägermedium oder alternativ zwischen der die Szintillaj tion nachweisenden Einrichtung und dem Testmedium oder dem Licht-

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strahl vorhanden sein, wenn letztere im Abstand von einander angeordnet sind. Diese Bewegung kann bequem durch eine Bewegung * des Trägerniediums quer oder auf und ab relativ zu einer ortsfesten, mehrstufigen Oberfläche ausgeführt v/erden. Die Verschiebung sge se hwiiidigkei t kann in großem Maße in Abhängigkeit von der Größe der auf das Licht einwirkenden Bereiche sowie der Größe der Lichtstrahlen variieren. Im Fall sehr kleiner Teilchen, z.B. einer Größe von 0,8 Fikron, die in einem flüssigen Medium suspendiert sind, ist keine von außen erzeugte Bewegung erforderlich, um eine Szintillation zu erzeugen. Dies ist offensichtlich eine Folge der zufälligen Eigenbewegung (Brown-sehe Bewegung) der l Teilchen in der Flüssigkeit. Bei größeren Bereichen, z,B₀ einer

Größenordnung von 5,o Hikron und größer, wird die Verschiebungs- -. geschwindigkeit im allgemeinen im Bereich von 1 bis 3o cm/min₀ ¹ liegen. In jedem Fall wird die optimale VerSchiebungsgeschwindig- [ ! keit leicht empirisch durch eine beobachtende Person bestim.ut, ; indem das Trägermedium von Hand in verschiedene Richtungen rela- : tiv zur Lichtquelle bewegt wird.

; j

_: Der Szintillationseffekt kann für gewöhnlich sehr leicht beob- j ; achtet werden,, Es können jedoch auch andere Einrichtungen zum j

ϊ I

I i

j Nachweis der Szintillation entsprechend dem Stand der Technik in

i geeigneter Weise in der Anordnung verwendet werden, wie ζ,B₀

j einen festen Zustand abtastende Anordnung, wie z.B. eine Ladungskopplungsvorrichtung, ein einen wandernden Lichtpunkt abtasten- '

, des Gerät oder ein Bilddetektor, die jeweils mit einer Speichex-Vorrichtung gekoppelt sind» Aufeinanderfolgende Fotografien kön-

i nen auch verwendet werden, um Szintillationsinformationen zu sam-

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- 1ο -

mein,,

-Das 'i'rägermediura ist vorzugsweise als dünne ochicht oder als film zwischen der vielpunktigen Beleuchtungsfläche und der einrichtung zum Nachweisen der Szintillation angeordnet. Das ist von großer Wichtigkeit, wenn das Trägermedium eine Flüssigkeit mit darin nachzuweisenden '^Teilchen ist, in welchem .trail eine dünne Schicht der flüssigkeit die Wahrscheinlichkeit verringern wird, daß sich teilchen einander von oben oder unten abdecken werden. Der Verdeckungseffekt läßt die Seilchen größer erscheinen und kann eine Verzerrung zur Folge haben. .Folglich ist eine flüssiges Trägermedium im allgemeinen als ein Tropfen oder in Form mehrerer Tropfen direkt auf der vielpunktigen Beleuehtungsfläche oder im

Abstand von der Oberfläche auf einer ebenen, transparenten fläche, wie z.B. einem Kunststoffilm oder einem Glasdiapositiv angeordnet.i Das Trägermedium kann auch von einem trockenen film gebildet ' werden, der auf der Oberfläche eines transparenten üchichtträgers j durch Verdampfung einer i'lüssigkeit, die Seilchen enthält, oder idurch Abscheidung der Teilchen aus der Luft aufgebracht ist„

j Es ist auch erwünscht, daß die Konzentration der von dem Medium j getragenen, auf das Licht einwirkenden Bereiche verhältnismäßig j gering gehalten wird. Eine hohe Konzentration kann auch eine zu große Wechselwirkung der Lichtstrahlen bewirken, wodurch die Anzahl der Lichtstrahlen verringert wird, die in jedem gegebenen Augenblick aufleuchten» Die optimale Konzentration wird etwas in Abhängigkeit von der Art des durchgeführten Versuches abhängen,

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jedoch sollte im allgemeinen die Konzentration der auf das Licht einwirkenden Bereiche in dem Trägermedium geringer als 1o-% des Volumen sein, wenn das Medium flüssig ist» Wenn als ftedium ein trockener Film verwendet wird, ist die Konzentration der Teilchen in der Flüssigkeit vor der Verdampfung der Flüssigkeit vorzugsweise geringer als 1o % des Volumens·

Die Erfindung erweist sich in großem Maße als nützlich beim Nachweis des Vorhandenseins von auf Licht einwirkenden Bereichen in einem Trägermedium· Insbesondere erweist es sich nützlich aufdem medizinischen Gebiet beim Nachweis von Teilchenklumpen bildenden Reaktionen, die biologisches Material einschließen· Der ', \ Begriff "biologisches Material" bezieht sich auf jede Substanz, : ' die sich im lebenden Organismus findet oder als Teil des letz- I ,teren vorliegt_e Bei den Teilchenklumpen bildenen Reaktionen wird ι

' ί

ein Reagens im allgemeinen verwendet, das bekanntermaßen mit spezifischem biologischen Material, das nachgewiesen werden soll, reagiert und eine Klumpenbildung bewirkt« Herkömmliche, auf diese Weise nachgewiesene Materialien sind Zellen, z_oB. Blutkörperchen oder mikrobische Zellen, und verschiedene Arten von Antigenen und Antikörpern, Typische Teilchenklumpen bildene Reaktion schließen Agglutinationsversuche ein, wie z.B. zum Nachweis von Schwangerschaften, rheumatischen Faktoren, infektiöse Mononukleose, Zehrrose, Gonorrhöe, bakteriellen Infektionen uswe Diese Versuche werden im allgemeinen direkt oder indirekt ausgeführt. Zusammenballungen zeigen bei einem direkten lest eine positive Reaktion und bei einem indirekten Versuch eine

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negative Reaktion an. Bei unmittelbaren Zusammenballungsversuchen wird typischerweise ein Trägerteilchen-, Z₀B₀ Polystyrol-Latex-, verwendet,, das auf eine Substanz aufgebracht wird«, die mit dem

; zu bestimmenden biologischen Material in Wechselwirkung zu treten vermagο Bei indirekten Agglutinationstests werden ein erstes

j Reagensp das eine mit dem bestimmten biologischen Material über= zogenes Träger teilch en ist-, soi/ie ein zweites Reagens verwendet^ das ein zusammenklebendes Medium ist₀ Herkömmliche Agglutinations™ versuche werden in einem flüssigen Hedium ausgeführt und die Yei> suehsprobe ist im allgemeinen eine Körperflüssigkeit wie Blut_§ Urin uswo Das nicht zusammengeklebte Latex-Reagens ist normaler» weise aus Teilchen gebildet,, deren Durchmesser kleiner als 1 Mi= krön ist, und es weist ein milchiges Erscheinungsbild auf_Q Eine Zusammenklebereaktion wird im allgemeinen durch eine makroskopisch beobachtbare Klumpenbildung angezeigt;, bei der latexteil=

; chen mit einem Durchmesser von 5x1 ο ' bis 2x1 ο cm sich mit ,

j 1

(Teilchen mit einem Durchmesser von hunder ten von E-Ii kr ο η verein!-» ι

gene j

Sei Einsatz -des Verfahrens sowie einem Beobachtungsgerät gemäß > der Erfindung kann das Vorhandensein einer Agglutination aachge= ' wiesen werden,, bevor die !Peilchenklumpen so _üroß geworden siaä₀ j

daß sie mit dem bloßen Λι%? sichtbar siado Es kann iolglich eine " Verbesserung der Genauigkeit ersiehlt v;erden_o Peraer wird, die

Ablesemöglichkeit beträchtlich verbessert^ weil alls Seuchen» : \ klumpen ohne Rücksicht auf ihre groüae Form oder Gestalt ein beob« J ; achtbares Phänomen-, die Szintilation zur I'olge haben_o Dies ent-=· ·'

■ ί

spricht nicht der herkömmlichen Auslegung makroskopisch beobach- ;

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ι teter Klumpen, bei der die Beschreibung variiert, ζ „Bo nach Klurn- ; ! pen, Flecken, Granulaten usw. bei unterschiedlichen Versuchen ; ι und Beobachtern,, Ein anderer Vorteil der Verwendung der Szintillation zur Sichtbarmachung von Teilchenklumpenreaktionen besteht

darin, daß man die Probe in ihrer Gesamtheit mit einem Auflösei
vermögen von einigen Mikron beobachtet. Da das bloße Auge nur Teilchen bis zu einer Größe von annähernd 5o Mikron im Durchmesser von einander zu trennen vermag, muß man eine Vergrößerung vornehmen, um eine ähnliche Auflösung wie bei herkömmlichen Ver-

j fahren zu erzielen. Bei einer solchen Vorgehensweise ist das

^; Sehfeld in direktem Verhältnis zur Vergrößerung beschränkt.

j Die Erfindung schafft auch ein bequemes Verfahren zum Untersuchen in V/echselwirkung stehender Teilchen in trockenem Zustand. Kreuzanpassungsversuche bei Blut, Fieberantigenversuche, "£akteriennachweise usw_e werden vorzugsweise auf diese V/eise ausgeführt, . Für diese Versuche ist es erwünscht, eine Testlösung oder eine Suspension einer vorbestimmten Konzentration von Teilchen, Z₀B,

j von Blutkörperchen, auf einer durchsichtigen Fläche anzuordnen

und der Flüssigkeit zu ermöglichen, zu verdampfen. Die Konzentration und der Oberflächenbereich sind so gewählt, daß keine Wechselwirkung zwischen den teilchen auftritt, wenn eine im wesentlichen kontinuierliche Monoschicht oder ein PiIm auf der Oberfläche abgelagert ist«, Die kontinuierliche Monoschicht wird das liciit gleichmäßig durchlassen, und es wird keine üzintillation beobachtet, wenn der Film mit dem erfindungsgernäßen Verfahren untersucht wird. Selbst wenn eine geringe Wechselwirkung zwischen den Teilchen vorhanden ist, wird eine diskontinuierliche Mono*·

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schicht mit Unterbrechungen, die als Folge einer Teilchen-Sieilchen-Wechselwirkung auftreten, abgelagert. Bei Belichtung durch eine vielpunktige Beleuchtung werden diese Unterbrechungen eine Szintillation hervorrufen.

Es können auch bestimmte Reaktionen, bei denen die feilchen grös-, senmäßig verringert werden (z.B. bei einer Zellenlysis) mit der , erfindungsgemäßen Anordnung beobachtet werden. Bei einem flüssi-ί gen Medium hat eine Teilchenspaltung ein Verschwinden der Szin- ; tillation zur Folge, wenn die Teilchengröße sich unter den für die Szintillation kritischen Wert verringert. Im trockenen Zustand kann eine sorgfältige Auswahl der Konzentration der Suspensionen, die auf einem vorbestimmten Flächenbereich getrocknet · ', werden sollen, Filme erzeugen, die bei Hichtvorhandensein von

^eilenenSpaltungen vor dem Austrocknen szintillieren und die j nicht szintillieren, wenn eine Seiichenspaltung von der vollständigen Austrocknung auftritt.

j Weiterhin ist es möglich, mit dem Szintillationsverfahren die Größe der verschiedenen auf licht einwirkenden Bereiche zu bestimmen. Dies wird dux-cn Auswählen einer vielpunktigen Beleuchtungsfläche ausgeführt, die Lichtstrahlen bekannter G-röße erzeugt, wobei nur auf Licht einwirkende Bereiche oberhalb der bekannten kritischen Größe eine Szintillation hervorrufen werden₀ Bei Durchführung dieses Verfahrens ist die sorgfältige Steuerung der Verschiebungsgeschwindigkeit von Bedeutung» Das Verhältnis zwischen der Größe der Lichtstrahlen, der Teilchengröße und der Verschiebungsgeschwindigkeit ist unten im Beispiel 5 dargelegt,,

Auf Gebieten außerhalb des medizinischen Bereichs kann die Erfindung zum Nachweisen des Vorhandenseins von Verseuchungsstoffen einer kritischen Größe in einem gasförmigen oder flüssigen Medium verwedet werden«, Das Verfahren kann ferner zur Bestimmung des Endpunktes einer Phäsentltration_s des Vorhandenseins feiner U ie« derschläge bei verschiedenen analytischen Versuchen wie auch für viele andere Anwendungen benutzt werden^ bei denen Kenntnis über das Vorhandensein von mit Licht in Wechselwirkung stehender Be= reiche In einem Medium erwünscht ist_o

Die Erfindung wird nunmehr an Hand der Zeichnungen im Einzelnen j erläutert« In letzterer sind!

' Figo 1 eine prospektartige Ansicht ₈ die das Vorder- sowie Ober« ; teil und eine Seite des erfindungsgemäß aufgebauten Beobachtung^= ι gerätes zeigt,

FIg₀ 2 die Ansicht eines Querschnitts entlang der Linie 2~2 der

Figo 5 eine Grundrißansicht einer Sestkarte mit einer Oberfläche

zur Erzeugung einer vielpunktartigen_s in dem Beobachtungsgerät j
zu verwendenen Beleuchtung^

' Figo 4 die Ansicht eines Querschnitts einer anderen Ausführungs= form des erfindungsgemäßen Beobachttmgsgerätes und Figo 5 eine Mikrofotografie einer vielpunktarti&enj, retroreflek« tiven Beieuchtungsflach.ee

Figo 1 zeigt das A'ußere eines Beobachtungsgerätes 1o mit einem ^: Okular 12 mit einem Fenster 14_S durch das ein Beobachter zur V/ahrnehmung einer Szintillation schauen kann. Ein Gehäuse 16 um«

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gibt das Sehfeld des Beobachters und verhindert eine Blendwirkung der Raumbeleuchtung. Der untere Teil des Gehäuses 16 ist an einem Rahmen 18 tragend befestigt. Eine Beobachtungsplattform 2o ist an dem Rahmen 18 befestigt und so angeordnet, daß ihre obere Fläche durch das Okular 14 sehbar ist« Die Beobachtungsplattform 2o trägt die Probe des Versuchsmediums während des Versuchs, ist vorzugsweise schwarz oder von dunkler Farbe, um eine Blendwirkung von auf ihr auftreffendem Licht zu verhindern, drehbar an.dem Rahmen 18 gelagert und über einen vertikalen Bogen beweglich. Ein Handgriff 22, der sich von der Beobachtungsplattform 2o aus erstreckt und mit ihr kontinuierlich ausgebildet ist, ermöglicht dem Betrachter, die Bewegung der Beobachtungsplattform 2o von Hand zu steuern. Bei dieser Ausführungsform ist eine retroreflektive Fläche, z.B. ein Blech mit darin festgelegten Glasperlen, auf der Beobachtungsplattform 2o angeordnet. Das zu untersuchende Versuchsmedium wird unmittelbar auf deriretroreflektiven Oberfläj ehe oder alternativ auf einer dünnen optischen Platte oder auf einem Film abgeschieden, der über der retroreflektiven Fläche angeordnet ist.

^! Fig. 2 zeigt die Ansicht eines Querschnitts des Beobachtungsgerätes 1o, wobei das Gehäuse 16 eine Lampe 24, eine Sammellinse 26 und einen Strahlenteiler 28 trägt und umschließt. Die Lampe 24

i
ist zentrisch an der Rückseite des Gehäuses 16 gelagert und weist einen Glühfaden25 auf, der die Lichtquelle in dem Beobachtungsgerät bildet. Die Lampe 24 ist am Oberteil des Rahmens 18 gelagert, um die längste Abmessung des Glühfadens 25 parallel zur Länge der Beobachtungsplattform 2o anzuordnen. Die Lampe 24 kann

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Licht jeder sichtbaren Wellenlänge oder einer Vielzahl von Wellen- ! längen erzeugen. Die Lampe 24 ist bei einer bevorzugten Ausfüh-■ rungsform eine 4o Watt-Glühlampe.

' Die Sammellinse 26 ist im Abstand vor der Lampe 24 angeordnet, j wobei ihre Achse horizontal durch die Mitte des Glühfadens 25 der

Lampe 24 verläuft, um Licht von der Lampe 24 aufzufangen und in parallelen Strahlen auszusenden. Die dargestellte Sammellinse ι ist eine Fresnel-Linse.

j Der Strahlungsteiler 28 wird von dem Gehäuse 16 in der Bahn der ' von der Sammellinse 26 ausgesendeten parallelen Lichtstrahlen unter einem Winkel zur optischen Achse der Linse und der Lampe J getragen, um einen Teil des Lichtes von der Sammellinse auf die Beobachtungsplattform 2o zu reflektieren» Wenn eine retroreflektive Oberfläche auf der Beobachtungsplattform 2o angeordnet ist, wird ein Teil des von dem Strahlenteiler 28 reflektierten Lichtes von der Oberfläche direkt zurück durch den Strahlenteiler 28 und durch das Fenster 14, durch das der Betrachter schaut, retroreflektierte Bei der dargestellten Ausführungsform ist der Strahlenteiler 28 ein halbversilberter Spiegel, der auf der der Sammellinse 26 zugewandten Seite versilbert ist.

Die Beobachtungsplattform 2o ist so aufgebaut, daß sie durch den Betrachter bewegbar ist. Bei der dargestellten Ausführungsform ist die Beobachtungsplattform 2o an einer Drehwelle 3o tragend befestigt, die der Beobachtungsplattform 2o ermöglicht, sich vertikal über einen Bogen von ungefähr 25° zu bewegen« Ein I'ederelement 32 ist an der Beobachtungsplattform 2o befestigt und rei-

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bungsmäßig gegen die Drehwelle 3o angepaßt, um die Bewegung der Beobachtungsplattform zu regulieren,,

Fig₀ 3 zeigt eine Grundrißansicht der oberen Fläche einer Testkarte, die bei dem Beobachtungsgerät gemäß der Erfindung zum Ausführen herkömmlicher immunologischer Teste verwendet wird. Die Testkarte 34 weist einen flachen, im wesentlichen rechteckigen Schichtträger 36 mit mindestens- einem begrenzten Testgebiet 38 auf der Fläche auf, das eine trockene Ablagerung des herkömmlichen immunologischen Versuchreagenses enthalte Der Teil des Schichtträgers 36 in dem Testbereich 38 muß eine vielpunktige

'. Beleuchtung erzeugen können_s wenn er auf der Beobachtungsplattform angeordnet und von einer Lichtquelle beleuchtet wird. Vorzugsweise weist der Schichtträger eine retroreflektierende Oberfläche mit darin eingebetteten Glasperlen auf, die bei einer Be-

■ leuchturig von oben eine vielpunktartige Beleuchtung erzeugen. Alternativ kann der Schichtträger aus einem Material mit winzigen Löchern oder transparenten Flächen, wie z„B_e einem Bildraster hergestellt sein, der bei einer Beleuchtung von unten eine vielpunktartige Beleuchtung erzeugen wird_e Das getrocknete, immunologische Versuchsreagens kann unmittelbar auf der Oberfläche des Schichtträgers oder auf einem transparenten Film oder auf einer über dem Schichtträger angeordneten und daran befestigten Platte getrocknet worden sein_e Die immunologischen Reagensien, die auf der Testkarte angeordnet werden können, ihre Herstellungsverfahren und das Verfahren ihrer Wiederherstellung und Mischung mit ·- den Körperflüssigkeiten sind z_aB_e aus den ÜS-PS'n 3 666 421 und 3 77o 38 3 bekannt«

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Wenn die immunologischen Testreagensien wiederhergestellt und mit einer geeigneten Körperflüssigkeit gemischt werden, werden die Testkarte auf der Beobachtungsplattform angeordnet und letz-"tere langsam durch die beobachtende Person bewegt. Wenn eine Szintillation beobachtet wird, kann daraus geschlossen werden,

daß eine Agglutination-öder Bildung von Teilehenklumpen stattgef

funden haben, die mit dem licht in Wechselwirkung stehende Bereiche kritischer Größe herstellen. Eine Vielzahl vonCTestflachen kann auf der Testkarte vorhanden sein. Als geeignet haben sich drei Testflächen herausgestellt, so daß eine unbekannte Probe gleichzeitig mit einer positiven und einer negativen Eontrollfläche verglichen werden kann.

Fig. 4 zeigt eine alternative Ausführun_ösform des Beobachtungsgerätes 4o gemäß der Erfindung, das eine Beobachtungsplattform 42 ! aufweist, die eine Vielpunktartige Beleuchtung zu erzeugen vermag, wenn sie von unten von einer Lampe 44 beleuchtet wird. Die Beobachtungsplattform 42 kann alternativ transparent sein und \

i

eine Oberfläche darauf angeordnet aufweisen, die eine vielpunkt- j

ι ι

artige Beleuchtung zu erzeugen vermag, wenn sie von unten beleuch~

^: tet wird. Bei der dargestellten Ausführungsform wird die lampe 44 von einer Leuchtstoffröhre gebildet. Im Betrieb kann eine zu untersuchende flüssige Probe unmittelbar auf der vielpunktartigen Beleuchtungsfläche oder auf einer optischen Platte, die über der Oberfläche angeordnet ist, abgesondert werden, ^lenn eine trockene Probe untersucht wird, ist letztere im allgemeinen auf einer optischen Platte über der vielpunktartigen Beleuchtungsfläche angeordnete Eine-Relativbewegung kann zwischen den einzelnen Licht-

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strahlen und den T-eilchen in der Probe durch Bewegen der optischen Platte quer über die Oberfläche erzeugt werden,,

Fig. 5 zeigt eine Mikrofotografie einer retroreflektiven Oberfläche mit eingebetteten Glasperlen, die von oben mit einer 4o-Watt-Glühlampe beleuchtet werden«, Die einzelnen Lichtquellen weisen typischerweise Durchmesser von 15 bis 8o Mikron auf. Venn eine visuelle Beobachtung durchgeführt wird, muß die Größe der Lichtquelle in Betracht gezogen werden, um eine Überbeanspruchung des Auges zu vermeiden,,

Das Beobachtungsgerät kann in beliebiger Form aufgebaut sein und die Elemente des letzteren müssen nicht im Gehäuse enthalten sein· Wenn bei einer Versuchsdurchführung der Raum ausreichend dunkel ist, kann eine Szintillation ohne ein Gehäuse beobachtet werden, wenn alle wesentlichen Elemente vorhanden sind. Wenn eine retroreflektive Oberfläche zur Erzeugung einer vielpunktartigen Beleuchtung verwendet wird, kann ein von Hand haltbares Beobachtungsgerät mit einer Lichtquelle und einer geeigneten Linsenanordnung verwendet werden, wie es z.B_e in der US-PS 3 832 o38 in Verbindung mit einer retroreflektiven Oberfläche zur Beobachtung einer Szintillation beschrieben wird·

Zur Erläuterung werden nachfolgend einige Beispiele beschrieben.

Beispiel 1 Unmittelbarer Latex-Agglutinations-Schwangerschaftstest

Ein herkömmliches Latex-Reagens wird aus den Teilchen von annähernd o,8 Mikron Durchmesser hergestellt, die mit einem antimensch-

lichen Choriongonadotropin (anti-HCG) überzogen sind, das von einem Wampole LAP Fruchtblasentest (Wampole Laboratorien, Stamford, Conn.,USA) erhalten worden ist. Zwei Proben menschlichen Urins wurden verwendet. Die erste Probe (Probe A) wurde von einer nicht schwangeren Person genommen und konnte keine meßbaren Beträge menschlicher Choriongonadotropin (HCG)-Aktivität aufweisen,, Die zweite Probe iProbe B) wurde von einer Schwangeren erhalten und enthielt HCG-Titer von 25,6 Internationalen Einheiten pro Milliliter (Iu/ml).

Ein Teil der Probe B wurde mit drei Teilen der Probe A gemischt und reihenmäßige Verdünnungen wurden vorgenommen, um Urinproben zu erzeugen, die in der HCG-Konzentration um den Faktor 4 differierten»

Fünfundzwanzig Mikroliter des Anti-HCG-Latex, das ungefähr 1o Minuten ultraschallmäßig behandelt worden war, sowie ohne Rest aufgehende fünfundzwanzig Mikroliter jeder Urinprobe wurden gemischte Die Mischungen ließ man mit einer Drehzahl von I2o Umdrehungen pro Minute (rpm's) zwei bis zwölf Minuten rotieren. Die Mischungen wurden hinsichtlich einer Agglutination durch das Wampole-Standard DAP-Verfahren überwacht, das im wesentlichen im Anordnen eines Tropfens der Reagens-Urin-Mischung auf der Oberfläche einer Testgleitfläche und im sachten Schwingen der letzteren für eine Minute besteht. Das Erscheinungsbild der Mischung wird mit dem Erscheinungsbild eines latex-Kontrolltropfens verglichen. Falls eine Agglutination in der Testmischung festgestellt worden ist, jedoch nicht in der Kontrollmischung, wird der Versuch als positiv

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angesehen.

Die Mischungen wurden auch hinsichtlich der Agglutination durch das Szintillationsverfahren gemäß der Erfindung überwacht. Einige Tropfen jeder Probe wurden einer Scotchlite retroreflektiven Oberfläche, die Glasperlen mit einem Durchmesser von 15 bis 8o Mikron enthielt, angeordnet. Die Oberfläche wurde mit einer 4o Watt-Glühlampe in einem Beobachtungsgerät ähnlich in Pig. 1 gezeigten beleuchtet. Die Flüssigkeit auf der Scotchlite Oberfläche wurde in einem Bogen bei einer Geschwindigkeit von 16 cm/ min bewegt, um eine Bewegung der Teilchen in der Probe zu erzeugen« Die Ergebnisse der Versuche gehen aus der nachfolgenden Tabelle hervor_β

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Probe	herkömmliches	Szintiliations-
(HCG Konzentration)	Verfahren	verfahren
Iu/ml	positiv	positiv
25,6	(Abscheidung nach	(starke Scintillation
(Probe B)

6,4

1,6

o,4

ο,ο

2 Minuten) nach 2 Minuten)

positiv positiv

(Abscheidung nach (starke Szintillation .2 Minuten) nach 2 Minuten)

fraglich positiv

(sehr schwache Reak- (starke Szintillation

tion, etwas Nieder- nach 2 Minuten) schlag nach 3 Minuten)

negativ

(keine Reaktion nach 12 Minuten)

negativ

(keine Reaktion nach 12 Minuten)

negativ

(keine Reaktion nach 12 Minuten)

negativ

(keine Szintillation

nach 12 Minuten)

negativ

(keine Szintillation

nach 12 Minuten)

negativ

(keine Szintillation

nach 12 Minuten)

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß das Szintillationsverfahren die Fähigkeit der unterscheidenen Wahrnehmung einer positiven Reaktion vom Erscheinen einer negativen Reaktion verbessert, und daß das erfindungsgemäße Verfahren gegenüber herkömmlichen Verfahren eine

Verbesserung darstellt.

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Beispiel 2 Latex Agglutinations-Test für die rheumatische Einflußgröße

Proben menschlicher Seren bekannter Art, die die Mengen einer rheumatischen Einflußgrößentiter verringern, wurden unter Verwendung des R, Rastertest von Wampole Laboratorien (Stamford, Conn., USA) untersucht. Bei Anwendung des herkömmlichen Verfahrens für den R^-Rastertest wurde eine Probe ausgewählt, mit der man zum negativen Kontrollergebnis unterschiedliche Ergebnisse erhielt.Bei diesem Verfahren werden ein Serum, eine Pufferlösung und ein Reagens zusammen in einem Reagensglas gemischt, letzteres über nacht stehen gelassen und gegen einen dunklen Hintergrund bei indirekter Beleuchtung beobachtet. Bei einer positiven Reaktion im Reagensglas setzt sich das zusammengeklebte Latex vollkommen am Boden des Reagensglases ab oder erscheint als makroskopisch sichtbare, grobstückige Klumpen in der Suspension. Eine negative Reaktion liegt in einem Reagensglas vor, in dem keine Agglutination stattgefunden hat, und die Suspension verbleibt gleichförmig milchig. Die ausgewählte Probe hatte einen Titer von 1/8o.

Diese Probe wurde dann unter Verwendung des erfindungsgemäßen Szintillationsverfahren getestet. Die R~-Testreagensien wurden verwendet (außer für die Substitution der Hylands Glycine-Salzreagenslösung). Das nachfolgende Verfahren bestand im Mischen eines Tropfens eines Serums und eines Tropfens einer Pufferlösung auf einer Scotchlite Oberfläche, in der Glasperlen mit einem Durchmesser von 15 - 8o Mikron eingebettet sind, im Hinzufügen ' zweier Tropfen eines Latexreagenees und im dreiminütigen Drehen ·

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- 2.0 -

der resultierenden Luppe.

Die Oberfläche wurde von einem handhaltbaren Beobaehxungsgerät (Sight-O-Light, Wisconsin Electronic sGorp., Racine, Wisconsin, UcS₀At,) "beleuchtet, wobei die Oberfläche gekippt wurde, so daß ein Gleiten der Flüssigkeit innerhalb der luppe auftrat und eine Bewegung der Teilchen erzeugt wurde.

Drei Personen hatten die Ergebnisse der Agglutinationsreaktionen abzulesen, die an einer Anzahl Probenpaare (eine negative für den rheumatischen Einflußfaktor und die andere schwach positiv mit einem Titer von 1/8o) mit dem herkömmlichen Verfahren und mit dem Szintillationsverfahren durchgeführt wurden,, Dieselben Reagensien und das Mischverfahren folgten in allen Fällen und die Proben wurden zufällig angeordnet» Jede Probe wurde verzeichnet, und mit einem Wert zwischen ο und 4 versehen, wobei 4 den höchsten Grad der Agglutination anzeigte_e Die mit jedem Verfahren erhaltenen Ergebnisse wurden verglichene

Vergleiche zwischen den negativen und schwach positiven, analysierten Proben jedes Versuchsverfahrens wurden mittels eines paarweisen "t" Tests vorgenommen. Die Ergebnisse ergaben, daß die schwach positiven Proben, die mit dem Szintillationsverfahren analysiert worden sind, eine wesentlich höhere Durchschnittspunktzahl als die negativen Proben aufwiesen, während die schwach positiven Proben, die mit dem herkömmlichen Verfahren analysiert worden sind, tatsächlich eine geringere Durchschnittspunktzahl als die negativen Proben aufwiesen. Aus diesen Ergebnissen geht \ die verbesserte Genauigkeit der erfindungsgemäßen Anordnung hervor,

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Beispiel 3

Dieses Beispiel demonstriert die Wahl der optimalen Konzentration einer Suspension von im wesentlichen nicht in Wechselwirkung stehender röter Blutkörperchen, die auf einem durchsichtigen Film aufzubringen und pro Flächeneinheit zu trocknen ist, um eine im wesentlichen kontinuierlich Monoschicht zu "bilden. Eine im wesentlichen kontinuierliche Monoschicht läßt eine gleichmäßige Beleuchtung durch und hat somit keine Szintillation zur Folge«

Eine Suspension von 25-Gewichts-% roter Blutkörperchen der Blutgruppe "0" wurde in einer Phosphatsalzpufferlösung aus Blutkörperchen hergestellt, die dreimal in letzterer gewaschen worden waren_o Verdünnungen dieser Lösung mit der Phosphatpufferlösung wurden hergestellt, die nach Aufbringen als gleichförmig aufgebrachter Überzug auf einen durchsichtigen Film ungefähr die Konzentration von Blutkörperchen/cm ergaben, die aus der nachfolgenden Tabelle hervorgeht,,

Jeder getrocknete Film wurde auf Szintillation unter Verwendung von Bildrastern verschiedener Größen untersucht, die von unten mit einer 15 Watt-Zwillingsleuchtstoffröhre als Quelle vielpunktartiger Beleuchtung beleuchtet worden waren. Die Ergebnisse gehen aus nachfolgender Tabelle hervor, wobei der Szintillationsgrad als ein Bereich von 0 bis +3 ausgedrückt ist. Der Wert 0 zeigt keine Szintillation an. Der Wert +1/3 zeigt meist keine Szintillation an, während Werte +1 und +2 eine schwache bzw. eine mäßige Szintillation anzeigen.

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Größe der vielpunktartigen Beleuchtung
(Mikron)

+ 1/3	+1/3	+1/3	+ 1	+2	+2
+1/3	+1/3	+1/3	+ 1	+2	+2
+1/3	+1/3	0	+ 1	+2	+ 2
+ 1/3	+ 1/3	0	+ 1	+ 1	+ 1

Relativer Betrag der Szintillation Annähernde Konzentration der roten Blutkörperchen/Einheiten des Oberflächenbe-

3,9 3,8 1,45 1,o2 o,37 ο,Η

9 9 9 9 O O

mg/cm mg/cm mg/cm mg/cm mg/cm mg/cm H
25
49
9o

Die Information dieses Beispiels, d.h. die Konzentration einer Suspension von im wesentlichen nicht in Wechselwirkung stehender Blutkörperchen, die eine kontinuierliche Monoschicht der Blutkörperchen zur Folge haben werden, ist beim Auswählen der Bedingungen zum Nachweisen einer geringen Wechselwirkung zwischen den Blutkörperchen nützlich«. Eine Konzentration einer Suspension der

ι nicht in Wechselwirkung stehenden roten Blutkörperchen und ein ■ Oberflächenbereich auf einem durchsichtigen PiIm werden gewählt,

! um die optimalen Bedingungen einer kontinuierlichen Monoschicht

• zu erhalten, wenn diese auf einem durchsichtigen PiIm getrocknet wirdeDie Blutkreuzanpassung wurde unter diesen Bedingungen beim unten angeführten Beispiel 4 ausgeführt«,

Die Information dieses Beispiels ist auch nützlich bei der Durchführung von Yersuchen zum Nachweis von Teilchenspaltung, wie z.B_e der Zellenlysiso Die optimale Konzentration der Blutkörperchen

ι und der Oberflächenbereich zum Ablagern und zum nachfolgenden

I
Trocknen werden bestimmt, die eine geringe nicht kontinuierliche

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Monoschicht der Blutkörperchen zur Folge haben werden_e Eine diskontinuierliche Monoschicht wird eine Szintillation bewirken, wenn sie &emäß dem erfindungsgeiuäßen Verfahren beobachtet wird. Bei Verwendung dieser Konzentration der Blutkörperchen pro Einheit des Flächenbereichs der Ablagerung kann man feststellen, ob eine Zellysis aufgetreten ist. Eine Lysis aufweisende Blutkörperchen werden nicht dieselbe diskontinuierliche Monoschicht wie gesunde Blutkörperchen einnehmen und eine Lysis aufweisende Blutkörperchen werden folglich keine Szintillation hervorrufen. Im Beispiel 5 wird der Versuch einer Zellysis beschrieben.

Beispiel 4 BIutkreuzanpasgungstest

Die folgenden Mischungen wurden hergestellt und unter Verwendung des Szintillationsverfahrens untersucht: (1) ein Tropfen einer Salzlösungssuspension roter Blutkörperchen der Gruppe A^ und zwei 'Tropfen von Antiseren in Bezug auf rote Blutkörperchen der Gruppe A und B; (2) ein Tropfen einer Salzlösungssuspension roter Blutkörperchen der Gruppe A_? und zwei Tropfen einer Verdünnung 1/8o von Antiseren roter Blutkörperchen der Gruppe A und B und (3) ein Tropfen einer Salzlösungssuspension roter Blutkörperchen der Gruppe 0 und zwei Tropfen von Antiseren für rote Blutkörperchen der Gruppe A und B. Die Salzlösungssuspensionen enthalten jeweils ungefähr 5 Gewichtsprozent roter Blutkörperchen, die drei-j mal gewaschen worden sind. Die Antiseren wurden von der Firma Ortho Diagnostics, Ortho Phasmaceutical Corp. gewählt.

Jede Mischung wurde als eine dünne Schicht auf einem transparen-

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ten Kunststoffilm aufgebracht, der über einem .dildraster mit Löchern von 5o Mikron .Durchmesser angeordnet war, wobei letztere gleichmäßig in einem Abstand von 2oo Mikron (.gemessen vom Mittelpunkt eines Loches zum Hittelpunkt des Benachbarten Loches) vorgesehen waren. Der Bildraster wurde von unten mittels einer 15-Watt-Zwillingsleuchtstoffröhre beleuchtet. -Der Kunststoffilm wurde langsam relativ zum Bildraster mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 1o bis 2o cm/min bewegt.

Die Mischung 1 zeigt eine unmittelbare Szintillation mit einem allmählichen Verschwinden letzterer, wenn die Teilchenklumpen größer werden. Die Mischung 2 zeigt eine leichte Szintillation im feuchten Zustand, aber eine intensive Szintillation, wenn sie nach Verdampfen des Wassers beobachtet wird.

Die Mischung 3 zeigt im wesentlichen sowohl im feuchten, als auch im trockenen Zustand keine Szintillation_o Weder die Mischung 2, noch die Mischung 3 zeigen irgendein Anzeichen einer Klumpenbildung, wenn sie mittels normaler, nichtmikroskopischer Einrichtungen beobachtet werden_o

Beispiel 5 Zellenlysistest

Zwei Versuchslösungen wurden hergestellt, um zu bestimmten, ob das Szintillationsverfahren zur Unterscheidung von eine Lysis aufweisenden Zellen von keine Lysis aufweisenden Zellen verwendet werden könnte. Die Lösung Nr₀ 1 enthielt 1,5 ml Streptolysin-O«. «Pufferlösung (von der Lederle Laboratorien) und o,5 ml roter

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- 3ο -

Blutkörperchen der Gruppe 0 bei 5%-Konzentration,, Die Lösung Nr₀2 enthielt 1,o ml Streptolysin-O-Pufferlösung (von den Lederle Laboratorien), o,5 ml Streptolysin O (von der Lederle Laboratorien), ein eine Zellysis bildendes Enzym und o,5 ml roter Blutkörperchen der Gruppe O bei 5% Konzentration

Durchsichtige Kunststoffilme, die entweder Tropfen der ersten Lösung oder Tropfen der zweiten Lösung aufweisen, die bei Luft getrocknet worden waren, wurden über eine Reihe Löcher eines Durchmessers von 14» 25, 49 -bzw« 8o Mikron aufweisenden Bildrastern angeordnet» Die Bildraster wurden von unten mittels einer 15 Watt-Zwillingsleuchtstoffröhre beleuchtet, und die durchsichtigen Filme wurden mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 1o bis 2o cm/min bewegte Vorhandensein oder Fehlen einer Szintillation wurde in jedem Fall bestimmt. Die Ergebnisse gehen aus naehfolgen-i

der Tabelle hervor,

i Lösung 2 j

(mit Lysis bildenen Enzym) \

Lochgröße	Lösung 1
(Mikron)	(Kontrolle)
H	starke Szintil
	lation
25	starke Szintil
	lation
49	schwache Szintil
	lation an der

schwache Szintillation

sehr schwache Szintillation

Peripherie keine Szintillation

8ο sehr schwache Szintillation um die
Peripherie herum keine Szintillation

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Der Bildraster mit Löchern von 25 Mikron Durchmesser erscheint am geeignetsten zum Unterscheiden von eine Lysis aufweisenden roten Blutkörperchen und keine Lysis aufweisenden roten Blutkör-' perchen bei den Bedingungen dieses Versuchs»

Beispiel 6

Dieses Beispiel verdeutlicht die Beziehung, die zwischen der Teilchengröße, der Größe der Durchmesser der einzelnen Lichtstrahlen und der Verschiebungsgeschwindigkeit bestehen sollte, um die Szintillation optimal zu gestalten_e Polystyrenteilchen von den ' Duke Laboratorien mit Durchmessern von 5,ο und 2o,o Mikron und

Teilchen mit einem Durchmesser von o,8 Mikron von der Polyscience Ineβ wurden als Normen verwendete Diese Teilchen wurden in Form

ι wässriger Dispensionen untersucht, wobei jeder einer Reihe von Bildrastern mit Durchmessern im Bereich von 14 bis 8o Mikron aufweisenden Löchern von unten belichtet wurde·

Für jede Teilchengröße sowie die Lochgröße jedes Bildrasters werden die Geschwindigkeit, bei der die Szintillation auftritt, und die Geschwindigkeit, bei der die Szintillation verschwindet, bestimmt« Die Ergebnisse sind in nachfolgender Tabelle zusammengefaßte Die erste Geschwindigkeit, die in jeder zweier Gruppe

, auftritt, ist die Geschwindigkeit, bei der die Szintillation erscheint; die zweite Geschwindigkeit ist diejenige, bei der die Szintillation verschwindet«.

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635347

Lochgröße eines Eildrasters (i'ikron)

Geschwindigkeiten, bei denen die bzintillation erscheint bzw_o verschwindet für jede Teilchengröße ^cm/min)

Teilchengröße

0,8 Mikron 5, ο M kr on

(o,o25 Gewo-% (o,o29 üew<, der Lösung) der Lösung;

2o i-.ikron

H 25 32 5o So

1.2 / 8,6

1.3 / 13,o
1,3 / 16,7

ο / 3,8 ο / 5,4 ο / 14,2 keine o

keine Szinfiliation

4,8 / 21

der Lösung) 1,3 / 13,1

2,1 / 18,4

3,8 / 13,4

Diese Paten zeigen an, dai> hohe Geschwindigkeiten erforderlich sind, Ui:i sowohl die Szintillation einzuleiten, als auch zu stoppen, wenn die Teilchengröße anwächst. Falls jedoch die Konzentration der Teilchen auf einen Wert ansteigt, bei dem die Teilchen sich wie eine Gruppe verhalten, dann kann der keine Teilchen aufweisende Raum den Effekt beherrschen, und die Geschwindigkeit kann herabgesetzt werden, um eine Szintillation hervorzurufen. Für jede gegebene Seilchengröße sind hohe Geschwindigkeiten zur Beobachtung der Szintillation erforderlich, wenn die Lochgröße der ßildraster (die Größe der einzelnen Lichtstranldurchmesser; ansteigt. Bei Teilchen einer Größe von o,8 Mikron ist keine von außen hervorgerufene Geschwindigkeit erforderlich, um eine Szintillation zu erzeugen. Eine Szintillation wird nicht beobachtet, wenn sehr kleine Teilchen (o,8 Mikron) mit Lichtstranlen vernältrnismäßig großen Durchmessers i>5o bis 8o Mikron; beleuchtet werden.

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Diese Daten zeigen ferner an, aaß die 3z in til la lion hinsichllicii der Qualität oder der otärke verändert werden kann und nicht ein unbedingt festgesetztes xhänomen ist.

Die bei diesem Versuch verwendeten Teilchen waren nicnt licntundurchlässig, sondern vielmehr halbtransparente Polystyren-Teilenen ähnlich den bei herkömmlichen immunologischen versuchen verwendeten Teilchen. Die .Ergebnisse können etwas variieren, wenn licntundurchlässige Teilchen verwendet werden.

Beispiel 7

Dieses Beispiel verdeutlicht die Anwendung von üzintillation, u.»i das Vorhandensein von uieilchen in Luft nachzuweisen und zu demonstrieren. Fünfzig Mikrograiiim Üabosil vein verdampftes Siliziurndioxid, Güte M-5, üabot Corp., Boston, Mass., USA) wurde dispergiert und in einem 27~üter Sack aufgehängt. Üin 2o χ 3o era großes Stück eines Polyesterfilms ('ioo,1b Mikrometer Länge eines grafisch beschichteten, fotografischen Films, 3M '^o., St.Paul, Minn., USA) wurde auf einer Seite vollkommen und auf der anderen Seite zur Hälfte mit entfernbarer Stücken des Schutzfilms beschichtet«, Dieser Polyesterfilm wurde in dem Sack 1,5 Minuten lang aufgehängt, der verdampfte Cabosil-öiliziumdioxid-Teilchen enthielte Nach dieser Aussetzungszeit wurden die Schutzfilme entfernt und der Polyesterfilm wurde sowohl auf den freiliegenden, als auch auf den geschützten Flächen auf Szintillation untersucht. Bildraster verschiedener Größe, die von unten mittels einer 15-Watt-Zwillingsleuchtstoffröhre beleuchtet wurden, wurden als quelle vielpunktartiger Beleuchtung verwendet. Die Ergebnisse

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gehen aus der nachfolgenden Tabelle hervor, wobei der urad der Szintillation durch einen Bereich von 0 bis +3 ausgedrückt wird_o Der Wert Null zeigt keine Szintillation an, während die Werte +1, +2 und +3 eine schwache, eine mäßige bzw. eine intensive Szintillation anzeigen.

Größe der vielpunkt- Szintillationsgrad

artigen Beleuchtung bestrahlte i'ilme / nicht bestrahlte iilme

H	+ 1	0
25	+ 1	0
49	• +2	0
8o	+2 bis +3	0

Die beste Szintillation wurde beobachtet, wenn der Film ungefähr o,5 cm von der vielpunktartigen lichtquelle sowie der Beobachter ungefähr 4o bis 45 cm von der vielpunktartigen Lichtquelle entfernt warenβ

Beispiel 8

Dieses Beispiel verdeutlicht die Verwendung der Szintillation, um den Endpunkt einer Phasentitration zu bestimmen«.

Eine Reihe Volumen-Volumen-Mischungen von Kohlenstofftetrachlorid/ Isopropanol wurden hergestellt und zehn ohne Rest aufgehende Milliliter wurden mit Wasser titriert zu einem Trübungsendpunkt nach dem herkömmlichen Verfahren nach Rogers und Ozsogomonyan (Talanta, 1963, VoI₀Io, Seiten 633 bis 639). Zehn ohne Rest aufgehende Milliliter wurden auch mit dem erfindungsgemäßen Verfahren titriert, wobei das Abklingen der Szintillation als Endpunkt verwendet wurde. Eine vielpunktartige Beleuchtung wurde mittels

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eines Löcher von 80 hikron aufweisenden Bildraster erzeugt, wobei der Abstand der Löcher von Mittelpunkt zu Mittelpunkt 2oo Mikron betrug, und der Bildraster von unten mittels eines Lichtkastens mit 15-Watt-Zwillingsleuchtstoffröhren beleuchtet wurde.

Herkömmliche Analyse

Kohlenstofftetrachlorid hls der 'Iritationslösung Isopropanol (H^O) zur Trübung (Endpunkt)

80/20 o,3o

70/30 o,4o

60/40 . 0,80

5o/5o o,82

40/60 1,59

30/70 2,6o

20/80 5,17

I0/90 ' 9,77

Szintillationsanalyse

Kohlenstofftetrachlorid his der Tritationslösung Isopropanol (HpO) zur Szintillation (Endpunkt)

80/20 0,15

7o/3o o,27

60/40 0,42

5o/5o o,55

4o/6o 1,18

• 3o/7o 2,46

20/80 5,25

I0/90 9,75

7 0 9 8 0 8/1052

Dieses Beispiel demonstriert eine weitere Verwendung der Szintil· lation in der Hinsicht, daß sie eine frühere und gleichmäßigere Ablesung der Phasentritrationsendpunkte als bei herkömmlichen Verfahren ermöglicht.

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Claims

^J [ NACHGEREICHT

Patentansprüche

Γ) Verfahren zum Nachweisen von mit Licht in Wechselwirkung stehender, von einem Medium getragener Bereiche vorgewählter Größenordnung, gekennzeichnet durch die Verfahrensschritte, daß das Medium zwischen eine Quelle vielpunktartiger Beleuchtung und eine Einrichtung zum Nachweisen einer Szintillation angeordnet wird, ^: daß das Medium mit einer Vielzahl diskreter, durch das Medium , gegen die Einrichtung zum Nachweisen der Szintillation gerichteter' Lichtstrahlen beleuchtet wird, und daß eine Relativbewegung zwischen den Lichtstrahlen und dem Medium, oder alternativ, wenn das ' Medium im Abstand von der Quelle vielpunktartiger Beleuchtung ; angeordnet ist, eine Relativbewegung zwischen der Einrichtung zum ' j Nachweisen einer Szintillation und den Lichtstrahlen, dem Medium | I oder beiden bewirkt wird, wobei darauf die Szintillation nachweis-| j bar ist, wenn die mit dem Licht in Wechselwirkung stehenden Bereiche vorgewählter Größenordnung in dem Medium vorhanden sind.

2. Verfahren zum Nachweisen von mit Licht in Wechselwirkung stehender, von einem Medium getragener Bereiche vorgewählter Größenordnung zwischen o,5 bis 25o Mikron, gekennzeichnet durch die Verfahrenssehritte, daß ein Medium zwischen einer Quelle vielpunktartiger Beleuchtung, die eine Vielzahl diskreter Lichtstrahlen bei einem Verhältnis der Durchmesser letzterer zu den mit dem Licht in Wechselwirkung stehender Bereiche von 1/5o bis 1o/i erzeugt, und einer Einrichtung zum Nachweisen der Szintillation (wie in der Anmeldung definiert) angeordnet wird, daß das Medium mit einer Vielfalt diskreter Lichtstrahlen, die durch das Medium zur Einrichtung zum Nachweis der Szintillation hin gerichtet sind;

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beleuchtet wird, und daß eine Relativbewegung zwischen den Lichtstrahlen und dem Medium oder alternativ, wenn das Medium von der Quelle der vielpunktartigen Beleuchtung im Abstand angeordnet ist, eine Relativbewegung zwischen der Einrichtung zum Nachweisen der Szintillation und den Lichtstrahlen, dem Medium oder beiden bewirkt wird, wobei die Szintillation nachweisbar ist, wenn die mit dem Licht in Wechselwirkung stehenden Bereiche vorgewählter Größenordnung in dem Medium vorhanden sind.

3. Terfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Quelle der vielpunktartigen Beleuchtung als eine retroreflektive, von oben beleuchtete Fläche gewählt wird.

!4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die re-

J troreflektive Fläche mit in letzterer festgelegten Glasperlen ι versehen wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die eingelegten Glasperlen mit einem Durchmesser zwischen 15 und 8o Mikron gewählt werden»

6 * Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Quelle der vielpunktartigen Beleuchtung eine von unten beleuchteter Bildraster gewählt wird.

7Q Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Bildraster mit lichtdurchlässigen Bereichen mit Durchmessern zwischen 1o und 1oo Mikron versehen wird«,

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als

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Medium eine lichtdurchlässige Flüssigkeit gewählt wird,,

9e Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem Licht in Wechselwirkung stehenden Bereiche von Teilchen gebildet werden»

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die mit! j dem Licht in Wechselwirkung stehenden Bereiche von Teilchenklumj pen gebildet werden_e

11. Verfahren nach Anspruch 1o, dadurch gekennzeichnet, daß die

, Teilchenklumpen durch die Wechselwirkung eines biologischen Materials mit einem auf letzteren bekanntermaßen einwirkenden Reagens gebildet wordene

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisches Material menschliches Choriongonadotropin gewählt wird β

13· Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisches Material eine rheumatische Einflußgröße gewählt wirdc

14· Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß als biologisches Material eine Zelle gewählt wirdo

15. Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, daß als Zelle eine mikrobische Zelle gewählt wirdo

16_e Verfahren nach Anspruch 14» dadurch gekennzeichnet, daß als Zelle ein .Blutkörperchen gewählt wird.

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- 4ο -

17· Verfahren nach' Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem licht in Wechselwirkung stehenden Bereiche als Tropfen in einer Emulsion dispergiert werden.

18. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem Licht in Wechselwirkung stehenden Bereiche von bei analytischen Versuchen gebildeten Niederschlagen gebildet werden.

19o Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit dem Licht in Wechselwirkung stehenden Bereiche von Unterbrechungen in einem PiIm gebildet werden.

2o» Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet, daß die Unterbrechungen von Teilchen gebildet werden.

21 ο Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterbrechungen von Zellen gebildet werden, die aus einer flüssigen Suspension auf einen transparenten Schichtträger abgeschieden werden,,

22e Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Unterbrechungen von Teilchenklumpen gebildet werden, die aus einer flüssigen Suspension auf einen transparenten Schichtträger abgeschieden werden.

23o Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die Teilchenklumpen durch Wechselwirkung eines biologischen Materials und eines mit letzterem bekanntermaßen in Wechselwirkung bringbaren Reagens gebildet werden.

24· Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß als

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biologisches Material eine Zelle gewählt wird₀

25ο Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß als Zelle eine rnikrobische Zelle gewählt wird_o

26. Verfahren nach Anspruch 24» dadurch gekennzeichnet, daß als Zelle ein Blutkörperchen gewählt wird.

27 β Beobachtungsgerät zum Nachweisen von mit Licht in V/echselwirkung stehender Bereiche vorgewählter Größe in einem Medium mit Hilfe eines Beobachters, gekennzeichnet durch ein Gehäuse mit einem Sichtfenster, durch eine im Gehäuse als Lichtquelle gelagerte Lampe, durch eine Beobachtungsplattforrn zum Tragen einer Fläche, die von der Lampe kommendes Licht in eine Vielfalt derart angeordneter Lichtstrahlen teilt, daß Licht von der Fläche unmittelbar zum Beobachter gerichtet wird, und durch eine Einrichtung zum Bewegen der Beobachtungsplattform in eine oder mehrere Richtungen«,

28_o Beobachtungsgerät nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die das Licht teilende Fläche eine retroreflektive Fläche ist.·

29. Beobachtungsgerät nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die retroreflektive Fläche eingebettete Glasperlen aufweist»

3oo Beobachtungsgerät nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Fläche ein Bildraster ist.

31. Beobachtungsgerät mit einer Testkarte zum Ausführen immunologischer Versuche, die einen ebenen Schichtträger aufweist, auf dem

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mindestens ein begrenztes Testfeld mit einem getrockneten immunologischen Versuchsreagens vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte Testfläche eine vielpunktartige Beleuchtung zu erzeugen vermag, wenn sie von einer einzelnen Lichtquelle beleuchtet wird.

32o Beobachtungsgerät nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte Fläche eine retroreflektive Fläche aufweiste

33o Eeobachtungsgerät nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß die retroreflektive Fläche eingebettete Glasperlen aufweist.

34o Beobachtungsgerät nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die begrenzte Fläche einen Bildraster aufweist«,

Ho / Se

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