DE2651388A1

DE2651388A1 - Verfahren zur ermittlung einer antigen-antikoerper-reaktion oder protein/protein-reaktion

Info

Publication number: DE2651388A1
Application number: DE19762651388
Authority: DE
Inventors: Egidijus Edward Uzgiris
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1975-11-13
Filing date: 1976-11-11
Publication date: 1977-05-26
Also published as: FR2331793A1; JPS5270018A; GB1542493A; US3984533A; FR2331793B1

Description

1 River Road
Schenectady, N.Y./U.S.A.

Verfahren zur Ermittlung einer Antigen-Antikörper-Reaktion oder Protein/Protein-Reaktion

Die Erfindung betrifft die Ermittlung von Proteinen und insbesondere ein Verfahren zur raschen Ermittlung spezifischer Antikörper in Lösungen.

In der DT-OS 24 33 246 werden ein verbessertes Verfahren und eine verbesserte Vorrichtung zur Ermittlung und Reinigung von Proteinen und Antikörpern beschrieben. Nach dieser DT-OS sind immunologische Reaktionen hoch spezifische biochemische Reaktionen, bei denen sich ein erstes Protein, das als Antigen bezeichnet wird, mit einem zweiten für das Antigen spezifischen Protein vereinigt, das als Antikörper bezeichnet wird, wobei ein immunologisch komplexes Protein gebildet wird. Immunologische Reaktionen in Organismen, z. B. von Tieren, sind für die Tiere bei der Bekämpfung von Krankheiten wesentlich. Nach einem Verfahren, das nicht ganz bekannt ist, bewirkt das Eindringen eines fremden Proteins, d. h. des Antigens, daß der Organismus ein Antikörper-Protein produziert, das spezifisch für das Antigen ist. Die Antikörper-Proteinmoleküle besitzen reaktionsfähige chemische ßindungsstellen, die denen des Antigenmoleküls ent-

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sprechen, so daß sich Antigen und Antikörper chemisch unter Bildung eines immunologisch komplexen Proteins vereinigen.

In dieser DT-OS wird ausgeführt, daß das Sammeln und Reinigen von immunologisch aktiven Proteinen in der Vergangenheit von den Fällungs- oder Agglutiniereigenschaften der Proteine abhing, die von der immunologischen Komplexbildungsreaktion resultierten. Ein Beispiel für eine derartige Reaktion ist der HCG-Proteinschwangerschaftstest. Dieser Test wird so durchgeführt, daß man eine bestimmte Menge eines HCG-Antiserums in eine Urinprobe mischt. Es wird eine Anzahl von Polystyrolkugeln, die mit HGG-Protein überzogen worden sind, danach in die zuvor hergestellte Urinprobe eingeführt. Die Polystyrolkugeln agglutinieren nur dann, wenn HCG-Protein in der Urinprobe fehlt, da das HCG-Protein auf den Polystyrolkugeln mit dem HCG-Antiserum einen Komplex bildet, das zuvor in die Probe eingeführt wurde. Wenn jedoch HCG-Protein in der Urinprobe vorliegt, bildet das Protein mit dem zuvor eingeführten HCG-Antiserum einen Komplex, so daß sich ein Niederschlag bildet, so daß kein Antiserum für eine Komplexbildung mit dem HCG-Protein auf den Kugeln zur Verfügung steht, um ein Agglutinieren der Kugeln zu bewirken.

In dieser DT-OS wird festgestellt, daß man den HCG-Pro-

teinschwangerschaftstest dadurch vereinfachen kann, daß man HCG-Antiserum auf Polystyrolkugeln aufträgt und unmittelbar eine Urinprobe testet. In einem derartigen Fall werden die Kugeln nur dann agglutinieren, wenn HCG-Protein in der Probe vorliegt. In dieser DT-OS heißt es jedoch, daß diese Arbeitsweise offensichtlich deshalb nicht angewendet wurde, da die verfügbaren HCG-Antiseren komplexe Mischungen darstellen, die einen großen Anteil an anderen Bestandteilen als HCG-Antikörper aus den Antiseren enthalten. In dieser DT-OS wird ferner als weiterer Nachteil der Agglutiniertests festgestellt,daß die Teilchen aus einer Reihe von Gründen agglomerieren können, die nichte mit einem immunologischen Agglutinieren zu tun haben, wodurch die Verläßlichkeit der Testsvermindert wird.

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Eine Entdeckung, die in dieser DT-OS beschrieben wird, besteht darin, daß ein beliebiges Protein auf einem Substrat nur in einer monomolekularen Schicht adsorbiert wird und daß sich ein spezifischer Antikörper (bzw. Antigen) für ein derartiges beliebiges Protein mit dem Protein unter Bildung einer bimolekularen Proteinschicht auf dem Substrat verbindet. Insbesondere kann eine Scheibe bzw. Oblate eines Substratmaterials in eine lösung eines ersten Proteins eingetaucht werden, so daß eine monomolekulare Schicht des ersten Proteins am Substrat haftet. Das auf diese Weise überzogene Substrat wird in eine zweite Lösung eingetaucht, die ein zweites Protein enthalten kann, das spezifisch mit dem ersten Protein reagiert. Das zweite Protein (jedoch nur dieses Protein) bildet beim Vorliegen in der zweiten Lösung eine monomolekulare Schicht auf der monomolekularen Schicht des ersten Proteins auf dem Substrat. Das überzogene Substrat wird nach dem Eintauchen in die zweite Lösung elektrisch oder optisch untersucht, um festzustellen, ob eine bimolekulare oder monomolekulare Schicht aus Protein anhaftet, wodurch angezeigt wird, ob die zweite Lösung tatsächlich das zweite Protein enthält oder nicht.

Gemäß der Erfindung wird ein erstes Protein bzw. ein Antigen auf mikroskopischen [Teilchen aufgetragen. Derartige Teilchen, die auf die angegebene W_eise überzogen wurden, zeigen eine bestimmte elektrophoretische Beweglichkeit. Wenn ein Protein, das spezifisch mit dem ersten Protein reagiert, z.B. ein Antikörper, danach mit dem ersten Protein in einer verdünnten Lösung des Antikörpers kombiniert wird, fällt die elektrophoretische Beweglichkeit.der Teilchen auf einen viel kleineren Wert ab, da die Antikörpermoleküle eine viel kleinere Beweglichkeit als die meisten anderen Proteine beim normalen pH-Wert der Lösung besitzen. Durch geeignetes Einstellen des pH-Wertes erhält man einen wesentlichen Beweglichkeitsunterschied zwischen den Antigenfilmen, die als monomolekulare Schicht auf einigen Teilchen vorliegen, und den Antigen/Antikörper-Filmen, die als bimolekulare Schicht auf anderen Teilchen vorliegen. Dieser Versuch zum

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Ermitteln einer Komplexbildung eignet sich zum Erzielen einer hohenEmpfÜndlLchkeit, da das Mischen der Lösung mit einem G-ehalt an Teilchen und Antikörpern ein viel wirksamerer Weg zur Herstellung eines Kontakts als das Inberührungbringen einer Proteinlösung mit einer ebenen makroskopischen Fläche ist. Auch vermeidet die Ermittlung einer Molekülschichtbildung auf mikroskopischen Flächen die Unempfindlichkeit und andere Probleme, die mit dem Ermitteln des Agglutinierens verbunden sind. Als weiterer Vorteil kann ein wesentliches Überziehen der Teilchenflächen in 10 bis 20 min bei Proteinkonzentrationen im Bereich von ng/cm erreicht werden, während bei makroskopischen ebenen Flächen die Zeitspanne zum Erzielen eines vergleichbaren Überzugs bei derselben verdünnten Proteinkonzentration etwa 10 h beträgt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sieht eine Methode zum Ermitteln einer Antigen/Antikörper-Reaktion als Stufen das A_uftragen eines Antigens auf vielen mikroskopischen Teilchen und die Bildung einer verdünnten Suspension der Teilchen in einer Lösung vor, die auf das Vorliegen von Antikörpern geprüft werden soll, die für das Antigen auf den Teilchen spezifisch sind. Die Suspension wird gerührt und die elektrophoretisch^ Beweglichkeit der Teilchen wird danach gemessen.

Nachstehend wird die Erfindung näher erläutert, wobei Figur 1 eine isometrische Ansicht einer Vorrichtung darstellt, die bei der Durchführung der Methode gemäß der Erfindung verwendet werden kann.

Zu Vorbedingungen für dieEnpfindlichkeit der Ermittlungsmethode gemäß der Erfindung gehören die Auswahl mikroskopischer Teilchen, die mit einer monomolekularen Proteinschicht überzogen werden, die Teilchenkonzentration in der Lösung und die Mischarbeitsweise. Teilchen, die Polystyrolkugeln mit einem Durchmesser von 0,31 um darstellen und zum Entfernen von oberflächenaktiven Stoffen und-anderen Verunreinigungen dialysiert worden sind, sind erfolgreich verwendet worden.

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Jedoch ist die Erfindung nicht auf Polystyrolteilchen beschränkt, da andere Teilchen, die Proteine adsorbieren, wie SiIiciumdioxidteilchen, gleichfalls brauchbar sind. Es können die meisten kolloidalen Teilchen grundsätzlich brauchbar sein, da keine Einschränkung hinsichtlich der Porm oder der Gleichmäßigkeit der Größe besteht, vorausgesetzt, daß das spezifische Gewicht der Teilchen so gewählt wird, daß die Teilchen in Suspension mindestens einige Minuten lang verbleiben, so daß die optischen Streumessungen ausreichend lange durchgeführt werden können. I¹Ur eine ausreichendeEmpfindlichkeit müssen die Testteilchenlösungen recht verdünnt sein, da der Gesamtteilchenoberflächenbereich klein gehalten werden muß (z.B. viel kleiner als 1 cm ). Konzentrationen von 10 bis 10 Teilchen/cm , wobei die Teilchen einen Durchmesser von 0,81yum besitzen, sind als befriedigend ermittelt worden.

Eine hoheEnpÖndlidikeit muß nicht unbedingt vorteilhaft sein, wenn sie von nicht-spezifischen Effekten begleitet ist, die im allgemeinen in konzentrierten Seren- oder Proteinlösungen auftreten. In diesem 3?all reicht das Waschen der mikroskopischen Teilchen durch Zentrifugieren aus, um nicht-spezifische Beweglichkeitsveränderungen zu vermeiden, die sonst durch das Einwirken derartiger konzentrierter lösungen auf die Teilchen auftreten wurden. Das Vorliegen der zweiten Proteinschicht kann danach mit maximaler Enpfirrflichkeit ermittelt werden, wenn sich die Kugeln in einer 0,005 η Natriumchloridlösung beobachtet werden.

Das Mischen wurde unter Verwendung eines üblichen Magnetin tens ivr uhr er s in einem Becher und durch elektrophoretisches Rühren in einer optischen Zelle durchgeführt. Das elektrophoretische Rühren ist besonders brauchbar, da es zu einer Bewegung der mikroskopischen Teilchen in bezug auf die unmittelbar umgebende Flüssigkeit führt. Zum optimalen Mischen kann es am günstigsten sein, turbulente und elektrophoretische Bewegung zu kombinieren, wobei die elektro-

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phoretische Bewegung ein ausreichend hohes elektrisches Feld erfordert, um die elektrophoretisch^ Bewegung zu erzielen.

Die Technik zum Ermitteln einer Antigen/Antikörper-Kombination auf einer mikroskopischen Oberfläche hängt von der Veränderung der elektrophoretischen Beweglichkeit der Teilchen ab, die mit Protein beladen sind. Eine bestimmte elektrophoretisch^ Beweglichkeit hängt von einer Fläche ab, die von einem Antigen auf einem Teilchen gebildet wird. Wenn man danach ein Antikörpermolekül mit dem Protein kombiniert, fällt die Beweglichkeit des Teilchensauf einen viel kleineren Wert ab, da die Antikörpermoleküle eine viel geringere Beweglichkeit als die meisten anderen Proteine beim normalen pH-Wert besitzen. Zusätzlich kann der pH-Wert im Bereich von etwa 4-,O bis 8,0 eingestellt werden, so daß eine wesentliche Beweglichkeitsdifferenz zwischen den Antigenund Antigen/Antikörper-Filmen eingehalten wird. Die Beweglichkeit der mit Antigen überzogenen Teilchen ändert sich um den Faktor 2 oder 3, wenn man Antikörpermoleküle mit dem Antigen kombiniert.

Die elektrophoretische Beweglichkeit wird durch die Messung von Laserlicht gemessen, das von den Teilchen gestreut wird. Das gestreute Licht zeigt - infolge des Doppler-Effekts und der elektrophoretischen Bewegung der Teilchen - eine Frequenzverschiebung, wenn ein elektrisches Feld an die Teilchenlösung angelegt wird. Diese Art der Messung, axe von E. E. Uzgiris in "Electrophoresis of Particles and Biological Cells Measured by the Doppler Shift of Scattered Laser Light", Optics Communications 6 (September 1972) 55, beschrieben wurde, ermöglicht es, daß selbst eine teilweise Bedeckung der Teilchenoberfläche mit Antikörpermolekülen leicht beobachtet werden kann. Es kann eine wesentliche Teilchenoberflächenbedeckung nach 10 bis 20 min bei Proteinkonzentrationen im Bereich von ng/cnr erhalten werden.

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Ein optisches Doppler-Elektrophoresemeßsystem zum Ermitteln von Beweglichkeitsveränderungen, wie sie in der vorstehenden Veröffentlichung beschrieben werden, wird anhand der Figur erläutert. Das System umfaßt eine Elektrophoresezelle 10 mit einem Fluidbehälter 11 aus einem lichtdurchlässigen, fluidundurchlässigen Material, beispielsweise Glas oder Kunststoff. Ein Paar Elektroden 12 und 13 ist in der Zelle 10 eng nebeneinander angeordnet. Diese Elektroden weisen vorzugsweise eine rechteckige Form auf und besitzen jeweils sich parallel gegenüberliegende Flächen, die einen Spalt zwischen den Elektroden begrenzen, dessen Breite nicht 1 mm überschreitet.

Der Behälter 11 ist mit einer verdünnten kolloidalen Suspension gefüllt, die mikroskopische Teilchen mit einer Schicht aus darauf adsorbiertem Protein enthält; es wird ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden 12 und 13 durch die Stromversorgung 14 angelegt. Der Spalt zwischen den Elektroden 12 und 13 wird durch kohärente optische Energie eines Lasers 15 erleuchtet. Ein Teil dieser Energie wird durch die mikroskopischen Teilchen im Spalt zwischen den Elektroden 12 und 13 gestreut und zeigt infolge der Bewegung der streuenden Teilchen im elektrischen Feld - eine Doppler-Frequenzverschiebung. Die in einem vorgegebenen Winkel gestreute Energie wird von einem optischen Anzeigegerät 16 empfangen, vorzugsweise einem Photoverstärkerrohr; es kann sich jedoch um irgendeinen geeigneten quadratischen Gleichrichter handeln.

Die Anzeigevorrichtung 16 empfängt infolge des Doppier-Effekts verschobene Energie, die von den Teilchen in der Suspension im Fluidium im Innern des Behälters 11 gestreut wird, und ferner nicht verschobene Energie , die von festen streuenden Objekten gestreut wird, z.B. der Wandung des Behälters 11.Da die Anzeigevorrichtung 16 sowohl infolge des Doppler-Effekts verschobene als auch unverschobene Energie aufnimmt und ein quadratischer Gleichrichter ist, ist ihr abgegebenes Signal ein Maß für das überlagsrungs-

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Produkt der beiden empfangenen Frequenzen; es kann daher nach üblichen Arbeitsweisen zur Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit der Teilchen in der Zelle 10 zu zwei verschiedenen Zeitpunkten analysiert werden, um eine Verminderung der Beweglichkeit zu ermitteln, die zwischen diesen beiden Zeitpunkten eingetreten sein kann.

Vorstehend wird eine Methode zum raschen Ermitteln eines spezifischen Proteins in einer Lösung beschrieben. Die Methode ist sowohl einfach als auch hoch empfindlich und läßt die Ermittlung der Bildung diskreter Molekülschichten von Proteinen zu. Es können spezifische Immunreaktionen sensitiv nach dieser Methode ermittelt werden.

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Claims

Pat entansprüche

1. Verfahren zum Ermitteln einer Reaktion zwischen einem ersten Protein bzw. einem Antigen und einem zweiten Protein bzw. einem Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß man das erste Protein bzw. das Antigen auf vielen mikroskopischen Teilchen aufträgt, eine verdünnte Suspension der Teilchen in einer Lösung bildet, die auf das Vorliegen des zweiten Proteins bzw. des für das Antigen spezifischen Antikörpers getestet werden soll, die Suspension rührt und die elektrophoretische Beweglichkeit bzw. deren Verminderung der Teilchen ermittelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,

daß man die Lösung durch elektrophoretische Bewegung mischt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lösung turbulent und durch elektrophoretische Bewegung mischt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Beweglichkeit der Teilchen mißt, indem man die Beweglichkeit der Teilchen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten vergleicht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Vergleich der Beweglichkeiten der Teilchen zu zwei verschiedenen Zeitpunkten unter einem vorgegebenen Streuwinkel Laserlicht, das von den Teilchen und von einem festen Lichtstreugegenstand gestreut wird, zu jedem der beiden verschiedenen Zeitpunkte auffängt, das Überlagerungs-Produkt der Frequenzen analysiert, die zu jedem der beiden verschiedenen Zeitpunkte ermittelt wurden, und die analysierten Überlagerungs-Produktejvergleicht und ein Maß für die veränderte Beweglichkeit der Teilchen zwischen den beiden Zeitpunkten erhält.

ORIGINAL

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