ES2505440T3 - Composiciones que comprenden semaforinas para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la angiogénesis y los procedimientos de selección de las mismas - Google Patents

Abstract

Procedimiento ex vivo para la selección de una semaforina seleccionada del grupo que consiste en Sema3D, Sema3E y Sema3G, para el tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende la determinación de la expresión de un receptor de semaforinas en las células tumorales de una muestra de tumor de dicho sujeto, en donde una cantidad de dicho receptor de semaforinas indica qué semaforina es idónea para el tratamiento del cáncer del sujeto.

Description

Composiciones que comprenden semaforinas para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la angiogénesis y los procedimientos de selección de las mismas

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, hace referencia a composiciones para tratar enfermedades asociadas a la angiogénesis que se definen mediante las reivindicaciones, tales como el cáncer, y los procedimientos de selección de las mismas.

Los receptores neuropilina 1 (np1) y neuropilina 2 (np2) fueron caracterizados originalmente como receptores funcionales para factores orientadores de los axones que pertenecen a la familia de las semaforinas de clase 3 (sema3). Posteriormente se demostró que las neuropilinas se expresaban en las células endoteliales y en muchos tipos de células cancerosas. También se encontró que las neuropilinas funcionan además como receptores para varios factores angiogénicos que pertenecen a la familia del VEGF y como receptores del factor de crecimiento de los hepatocitos/factor de dispersión (HGF/SF), que es un factor de crecimiento inductor de angiogénesis/metástasis, y que funcionan como potentes estimuladores de su actividad proangiogénica.

La mayoría de las sema3, con la excepción de la sema3E que se fija a PlexD1, se fijan a uno de los dos receptores neuropilina o a ambos. Las neuropilinas forman complejos espontáneos con varios miembros de la familia de receptores plexina. En estos complejos, las sema3 se fijan a las neuropilinas mientras que las plexinas funcionan como elementos transductores de la señal. Las cuatro plexinas de tipo A (plexina A1 a plexina A4) así como la plexina D1 forman complejos con las neuropilinas y participan en la transducción de señales mediada por las neuropilinas.

Las semaforinas sema3B y sema3F también se caracterizaron por ser supresores tumorales cuya pérdida contribuye al desarrollo del cáncer de pulmón [Tomizawa, Y., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98. 13954-13959; Xiang, R., 2002. Cancer Res. 62: 2637-2643].

La identificación de las neuropilinas en las células endoteliales sugirió que las semaforinas de clase 3 pueden ser capaces de regular la angiogénesis. De hecho, la semaforina de clase 3 sema3F, un agonista de np2, funciona como repelente de las células endoteliales, induce la apoptosis de las células endoteliales tras una prolongada estimulación [Bielenberg, D. R. et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1260-1271; Guttmann-Raviv, N. et al., 2007, J. Biol. Chem., 282: 26294-26305] e inhibe la angiogénesis y la progresión tumoral in vivo [Bielenberg, D. R. et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1260-1271; Kessler, O. et al. 2004. Cancer Res. 64: 1008-1015]. También se demostró que la sema3A, agonista de np1, inhibe la angiogénesis in vitro e in vivo [Miao, H. Q,. 1999, J. Cell Biol. 146: 233-242. Bates, D., 2003, Dev. Biol. 255: 77-98; Acevedo, L. M., 2008. Blood. 111: 2674-2680]. También se demostró que la sema3E era un repelente que inhibía la invasión de los vasos sanguíneos que expresan PlexD1 en los metámeros durante el desarrollo embrionario [Gu, C. et al., 2005, Science, 307: 265-268].

En cambio, los datos existentes sugieren que la sema3C funciona como proneoplásico y proangiogénico [Herman, J.

G. et al., Int. J. Oncol. 2007; 30: 1231-1238; Banu, N., FASEB J. 2006; 20: 2150-2152].

El hecho de que las neuropilinas y las plexinas, tal como PlexD1, también se expresen en muchos tipos de células tumorales indica que las semaforinas también pueden influir directamente en el comportamiento de las células tumorales. De hecho, las sema3, tales como sema3F y sema3B, se ha observado que inhiben la adhesión, migración o la proliferación de las células tumorales que expresan los receptores de semaforinas adecuados [Tomizawa, Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 13954-13959; Xiang, R., 2002. Cancer Res. 62: 2637-2643; Bielenberg, D. R. et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1260-1271; Nassarre, 2006, Neoplasia. 7: 180-189]. Por el contrario, no obstante, el producto de la escisión de Sema3E se demostró que inducía la invasión tumoral y la metástasis tumoral [Christensen, C., 2005, Cancer Res. 65, 6167-6177].

Compendio de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se da a conocer un procedimiento ex vivo de selección de una semaforina para tratar el cáncer en un sujeto, en donde el procedimiento comprende la determinación de la expresión de un receptor de semaforinas en las células tumorales de una muestra tumoral del sujeto, en donde la cantidad de cada receptor de semaforinas indica qué semaforina es idónea para el tratamiento del cáncer del sujeto.

De acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se da a conocer un procedimiento para tratar el cáncer en un sujeto que lo necesita, en donde el procedimiento comprende:

(a) seleccionar una semaforina para tratar el cáncer del sujeto de acuerdo con el procedimiento de la presente invención, y

(b) poner en contacto las células cancerosas del sujeto con una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente capaz de inducir dicha semaforina, mediante lo cual se consigue el tratamiento del cáncer.

De acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se da a conocer un kit para tratar el cáncer, en donde el kit comprende al menos un agente capaz de identificar un subtipo de receptor de semaforinas y al menos una semaforina.

De acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se da a conocer un procedimiento para tratar una enfermedad asociada a la angiogénesis en un sujeto que lo necesita, en donde el procedimiento comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de una semaforina seleccionada del grupo que consiste en Sema3D, Sema3E y Sema3G, mediante lo cual se consigue el tratamiento de la enfermedad asociada a la angiogénesis.

De acuerdo con un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se da a conocer una semaforina seleccionada del grupo que consiste en Sema3D, Sema3E y Sema3G resistentes a las proproteína convertasas para el tratamiento de una enfermedad asociada a la angiogénesis, tal y como se define en las reivindicaciones.

De acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se da a conocer una composición farmacéutica que comprende como un ingrediente activo una semaforina seleccionada del grupo que consiste en Sema3D, Sema3E y Sema3G, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, cuando el receptor de semaforinas comprende NP1, la semaforina comprende Sema3D.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, cuando el receptor de semaforinas comprende NP2, la semaforina comprende Sema3G.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, cuando el receptor de semaforinas comprende PlexD1, la semaforina comprende Sema3E.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, el agente es un anticuerpo.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la determinación se efectúa con un anticuerpo.

De acuerdo con algún caso de la presente descripción que comprende la invención, la semaforina es una semaforina de clase 3.

De acuerdo con algún caso de la presente descripción que comprende la invención, la semaforina de clase 3 se selecciona del grupo que consiste en sema3A, sema3C, sema3D, sema3E y sema3G.

De acuerdo con una realización de la invención, el contacto se realiza ex vivo.

De acuerdo con algún caso de la presente descripción, el agente es un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica la semaforina.

De acuerdo con algún caso, el receptor de la semaforina se selecciona del grupo que consiste en Np1, Np2, PlexA14 y PlexD.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la semaforina es la sema3E.

De acuerdo con algunas realizaciones de la invención, la sema3E es una Sema3E resistente a las proproteína convertasas.

De acuerdo con la realización de la invención, la enfermedad asociada a la angiogénesis se selecciona del grupo que consiste en cáncer, artritis, artrosis, placas ateroescleróticas, neovascularización del injerto de córnea, cicatrices hipertróficas o queloides, retinopatía proliferativa, retinopatía diabética, degeneración macular, granulación, glaucoma neovascular y uveítis.

Breve descripción de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en la presente memoria, sólo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos acompañantes. Con respecto, específicamente ahora, a los dibujos en detalle, se insiste en que la información mostrada se ofrece a modo de ejemplo y con el propósito de ilustrar la explicación de casos o realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada con los dibujos deja muy claro a los expertos en la técnica cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

Las figuras 1A-C son fotografías que ilustran la expresión de los receptores de las sema3 en las líneas celulares procedentes de cáncer de mama. Figura 1A. Las células se hacen crecer hasta una confluencia del 80% y se lisan.

Se cargan cantidades iguales de proteínas, se separan en geles de SDS/PAGE y se transfieren a nitrocelulosa. Los análisis por transferencia Western de np1 y np2 se realizan tal y como está descrito. Figuras 1B-C. El análisis por PCR inversa de la expresión de plexA1-A4 y plexD1 se realizó de acuerdo con las instrucciones del kit PerfectPure con las parejas de cebadores específicas para las diferentes plexinas.

Las figuras 2A-L son gráficos y fotografías que ilustran el efecto de la expresión de diferentes sema3 sobre el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231. Las células MDA-MB-231 se implantaron en la almohadilla de grasa de la mama de ratonas balb/c nu/nu según está descrito. Figuras 2A, D, G, J. Análisis por transferencia Western de alícuotas del medio acondicionado procedente de las células que expresan las diferentes sema3. Al final del experimento, se extirparon los tumores y se fotografiaron. Figuras 2B, E, H, K. El volumen medio de los tumores en desarrollo se midió según está descrito. Figuras 2C, F, I, L. La masa media de los tumores al final del experimento se determinó según está descrito.

Las figuras 3A-I son gráficos y fotografías que ilustran el efecto de la expresión de las diferentes sema3 sobre el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-435. Las células MDA-MB-435 se implantaron en la almohadilla de grasa de la mama de ratonas balb/c nu/nu según está descrito. Figuras 3A, D, G. Análisis por transferencia Western de alícuotas del medio acondicionado procedente de las células que expresan las diferentes sema3. Figuras 3B, E, H. El volumen medio de los tumores en desarrollo se midió según está descrito. Figuras 3C, F,

I. La masa media de los tumores al final del experimento se determinó según está descrito.

Las figuras 4A-F son gráficos y fotografías que ilustran el efecto de la expresión de sema3A y sema3F sobre el desarrollo de tumores a partir de las células MCF-7 y MDA-MB-468. Las células MCF-7 y MDA-MB-468 se implantaron en la almohadilla de grasa de la mama de ratonas balb/c nu/nu según está descrito. Figuras 4A, D. Análisis por transferencia Western de alícuotas del medio acondicionado procedente de las células que expresan la sema3A o bien la sema3F. Figuras 4B, E. El volumen medio de los tumores en desarrollo se midió según está descrito. Figuras 4C, F. La masa media de los tumores al final del experimento se determinó según está descrito.

Las figuras 5A-E son gráficos y fotografías que ilustran que las diferentes sema3 repelen las células endoteliales in vitro y reducen la densidad de los vasos sanguíneos asociados a los tumores in vivo. Figura 5A. Las células HEK293 de control infectadas con un vector lentivírico vacío o las células HEK293 que expresan la sema3A, la sema3D o la sema3E fueron sembradas sobre una monocapa de células HUVEC según se describe en los procedimientos experimentales. Las células HEK293 se marcaron con un colorante vital fluorescente, Dlasp, antes de la inoculación. Se muestran fotos compuestas tomadas por microscopia fluorescente y de fase. Figura 5B. Las células HEK293 de control infectadas con un vector lentivírico vacío o las células HEK293 que expresan la sema3F, la sema3G fueron sembradas sobre una monocapa de células PAE que expresan np2 y plexAI según se describe en Materiales y métodos. Las células HEK293 se tiñeron con Dlasp y se fotografiaron según se describe más arriba en la presente memoria. Figura 5C. La media del área de vasos sanguíneos por campo al microscopio se determinó en los cortes procedentes de tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-231 de control o de células MDA-MB231 que expresan las diferentes sema3 según se describe en la presente memoria. Ya que los tumores que se desarrollaron de las células que expresan la sema3A eran muy pequeños, no se pudo determinar la densidad de los vasos sanguíneos en ellos. Figura 5D. La media del área de los vasos sanguíneos por campo al microscopio se determinó en los tumores procedentes de células MCF-7 de control o de células MCF-7 que expresan la sema3A o la sema3F según está descrito más arriba en la presente memoria. Figura 5E. La media del área de los vasos sanguíneos por campo al microscopio se determinó en los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDAMB-435 de control o de las células MDA-MB-435 que expresan diferentes sema3 según está descrito más arriba en la presente memoria. No se desarrollaron tumores a partir de las células que expresaban la sema3G.

Las figuras 6A-D son gráficos y fotografías que ilustran que las diferentes sema3 inhiben la formación de colonias en agar blando a partir de las células MDA-MB-231 o MDA-MB-435. Figura 6A. Las suspensiones unicelulares de células MDA-MB-231 de control o de células MDA-MB-231 que expresan diferentes sema3 se inocularon en agar blando según se describe en la presente memoria. Se dejó que se formaran colonias durante 21 días. A continuación, las colonias se tiñeron con violeta de genciana y se fotografiaron los campos al microscopio. El número medio/campo de colonias con una diámetro de más de 150 µm se determinó entonces según está descrito en los procedimientos experimentales. Figura 6B. Fotografías de campos representativos al microscopio que contienen colonias teñidas con violeta de genciana que se desarrollaron en agar blando a partir de las células MDAMB-231 de control o de las células MDA-MB 231 que expresan las sema3. Figura 6C. La formación de colonias en agar blando a partir de las células MDA-MB-435 o de las células MDA-MB-435 que expresan diferentes sema3 se determinó según está descrito más arriba en la presente memoria. Figura 6D. Fotografías de campos representativos al microscopio que contienen colonias teñidas con violeta de genciana que se desarrollaron en agar blando a partir de las células MDA-MB-435 de control o de las células MDA-MB-435 que expresan las sema3.

Las figuras 7A-D son gráficos y fotografías que ilustran que la expresión de np1 en las células MDA-MB-435 estimula el crecimiento de los tumores resultantes y que la sema3A anula el efecto estimulante. Figura 7A. En la parte superior se muestra un análisis por transferencia Western que compara la expresión de np1 en las células MDA-MB-435 infectadas con diferentes combinaciones que son un vector lentivírico de control, un vector lentivírico que contiene el ADNc de np1 y un vector lentivírico que contiene el ADNc de sema3A. El volumen tumoral medio se midió durante el experimento según está descrito y se muestra en la parte inferior del gráfico. Figura 7B. Fotografías

de tumores extirpados al final del experimento. Figura 7C. Se determinó la masa media de los tumores al final del experimento. Figura 7D. Se determinó la media del área de los vasos sanguíneos/campo en los cortes de tumores.

Descripción de realizaciones específicas de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, hace referencia a composiciones para tratar enfermedades asociadas a la angiogénesis que se definen mediante las reivindicaciones, tales como el cáncer, y los procedimientos de selección de las mismas.

Las semaforinas que pertenecen a la subfamilia de las semaforinas de clase 3 (sema3) funcionan como factores orientadores de axones durante el desarrollo embrionario. La mayoría de las semaforinas de clase 3, con la excepción de la sema3E, se fijan a uno de los dos receptores neuropilina, que a su vez forman complejos con varios miembros de la familia de receptores plexina. En estos complejos, las neuropilinas se fijan a las semaforinas, mientras las plexinas funcionan como los elementos transductores de la señal.

Las semaforinas sema3B y sema3F se han caracterizado como supresores tumorales, mientras que a las sema3F, sema3A y sema3E se les ha atribuido una función antiangiogénica.

Los presentes inventores han demostrado que sema3A, sema3D, sema3E y sema3G funcionan cada una como potentes antineoplásicos (figuras 2A-L; figuras 3A-I; figuras 4A-F). Específicamente, la inyección de células de cáncer de mama que expresan estas semaforinas en ratonas atímicas dio lugar a tumores más pequeños que los tumores que se deben a la inyección de células tumorales que no expresan estas semaforinas.

Los presentes inventores han demostrado que la inhibición, inducida por semaforinas, del desarrollo tumoral de tipos específicos de células de cáncer de mama está correlacionada con la expresión de los receptores de semaforinas adecuados en las células tumorales. Aunque la mayoría de las semaforinas analizadas también inhibieron la angiogénesis tumoral, los presentes inventores demostraron que no había ninguna correlación entre la inhibición de la angiogénesis tumoral y la inhibición del desarrollo tumoral. Estos resultados sugieren que la inhibición del desarrollo tumoral debida a las semaforinas depende de la expresión de los receptores de semaforinas adecuados en las células tumorales, y sugiere que la inhibición de la angiogénesis tiene menos importancia. También sugieren que los tumores que contienen células tumorales que expresan receptores de semaforinas se prestan a la inhibición mediante las sema3 adecuadas y abren el camino para procedimientos mejores de medicina personalizada para el tratamiento del cáncer.

Así pues, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se da a conocer un procedimiento para seleccionar una semaforina para tratar el cáncer en un sujeto. El procedimiento comprende la determinación de la expresión de un receptor de semaforinas en las células tumorales de una muestra de tumor del sujeto, en donde la cantidad de cada receptor de semaforinas indica qué semaforina es la adecuada para tratar el cáncer del sujeto.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «semaforina» hace referencia a un polipéptido de mamífero (p. ej., humano) que pertenece a la familia de las semaforinas (que incluye las semaforinas de las clases 3, 4, 5, 6 y 7). Las semaforinas funcionan típicamente como señales durante la orientación de los axones y comprenden un dominio sema.

De acuerdo con un caso, la semaforina pertenece a la subfamilia de semaforinas de clase 3. En consecuencia, la semaforina puede ser la semaforina 3A (número de acceso de GenBank NM_006080, SEQ ID n.º 26); la semaforina 3B (número de acceso de GenBank NM_001005914, SEQ ID n.º 27); la semaforina 3C (número de acceso de GenBank NM_006379, SEQ ID n.º 28); la semaforina 3D (número de acceso de GenBank NM_152754, SEQ ID n.º 29); la semaforina 3E (número de acceso de GenBank NM_012431, SEQ ID n.º 30); la semaforina 3F (número de acceso de GenBank NM_004186, SEQ ID n.º 31); o la semaforina 3G (número de acceso de GenBank NM_020163, SEQ ID n.º 32).

Una semaforina de la descripción también hace referencia a homólogos (p. ej., polipéptidos que tienen una homología de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 87%, al menos el 89%, al menos el 91%, al menos el 93%, al menos el 95% o más, digamos el 100%, con las secuencias de semaforina mostradas más arriba en la presente memoria, según se determinó con el programa informático BlastP del National Center of Biotechnology Information (NCBI) con los parámetros por defecto). El homólogo también podría hacer referencia a una deleción, inserción o variante de sustitución, que incluye la sustitución de aminoácidos, del mismo y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos del mismo.

La terminología «tratar» y «tratamiento», tal y como se utiliza en la presente memoria, incluye anular, inhibir sustancialmente, enlentecer o revertir la progresión del cáncer, mejorar sustancialmente los síntomas clínicos o estéticos del cáncer, o prevenir sustancialmente la aparición de los síntomas clínicos o estéticos del cáncer.

Típicamente, el sujeto para quien se selecciona la semaforina es un sujeto mamífero, p. ej., un humano.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «cáncer» hace referencia a la presencia de células que

poseen características típicas de las células que ocasionan el cáncer, por ejemplo, proliferación incontrolada, pérdida de las funciones especializadas, inmortalidad, potencial metastásico significativo, incremento significativo de la actividad antiapoptósica, crecimiento y velocidad de proliferación rápidos, y determinadas características morfológicas y ciertos marcadores celulares. Típicamente, las células cancerosas están formando un tumor, que existe localmente dentro de un animal, o que circula por el torrente circulatorio como células independientes, por ejemplo, células leucémicas.

Ejemplos específicos del cáncer para los cuales se pueden seleccionar las semaforinas de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen, pero sin limitarse a ellos, carcinoma corticosuprarrenal hereditario; cáncer de vejiga; cáncer de mama; cáncer de mama canalicular; cáncer de mama intracanalicular invasivo; cáncer de mama esporádico; propensión al cáncer de mama; cáncer de mama de tipo 4; cáncer de mama de tipo 4; cáncer de mama de tipo 1; cáncer de mama de tipo 3; cáncer de mama y ovario; linfoma de Burkitt; carcinoma de cuello de útero; adenoma colorrectal; cáncer colorrectal; cáncer colorrectal sin poliposis hereditario de tipo 1; cáncer colorrectal sin poliposis hereditario de tipo 2; cáncer colorrectal sin poliposis hereditario de tipo 3; cáncer colorrectal sin poliposis hereditario de tipo 6; cáncer colorrectal sin poliposis hereditario de tipo 7; dermatofibrosarcoma protuberante; carcinoma de endometrio; cáncer de esófago; cáncer de estómago, fibrosarcoma, glioblastoma multiforme; tumores glómicos múltiples; hepatoblastoma; cáncer hepatocelular; carcinoma hepatocelular; leucemia linfoblástica aguda; leucemia mieloide aguda; leucemia mieloide aguda con eosinofilia; leucemia no linfocítica aguda; leucemia mieloide crónica; síndrome del Li-Fraumeni; liposarcoma, cáncer de pulmón; cáncer de pulmón microcítico; linfoma no de Hodgkin; síndrome II familiar de cáncer de Linch; tumor de las células reproductoras masculinas; leucemia mastocítica; tiroideo medular; meduloblastoma; melanoma; meningioma; neoplasia endocrina múltiple; predisposición a la neoplasia maligna mieloide; mixosarcoma, neuroblastoma; osteosarcoma; cáncer de ovario; cáncer de ovario seroso; carcinoma de ovario; tumores de los cordones sexuales ováricos; cáncer de páncreas; tumores endocrinos pancreáticos; quimiodectoma familiar; pilomatricoma; tumor hipofisario invasivo; adenocarcinoma de próstata; cáncer de próstata; carcinoma renal papilar, familiar y esporádico; retinoblastoma; síndrome de predisposición rabdoide familiar; tumores rabdoides; rabdomiosarcoma; cáncer de pulmón microcítico; sarcoma de las partes blandas, carcinoma escamoso de cabeza y cuello; leucemia linfoblástica aguda de linfocitos T; síndrome de Turcot con glioblastoma; tilosis con cáncer de esófago; carcinoma de cuello de útero; tumor de Wilms de tipo 2; y tumor de Wilms de tipo 1, y similares.

De acuerdo con un ejemplo concreto de este aspecto de la presente invención, el cáncer es cáncer de mama.

Tal y como se menciona, el procedimiento de la presente invención se lleva a cabo mediante la determinación de la expresión de un receptor de semaforinas en las células tumorales de una muestra de tumor de un sujeto.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase «receptor de semaforinas» hace referencia a un polipéptido de la superficie celular que es capaz de fijarse a una semaforina y transducir una respuesta. Los ejemplos de receptores de semaforinas incluyen neuropilinas, plexinas e integrinas.

Así pues, por ejemplo, el receptor neuropilina puede ser un receptor neuropilina 1 (NP1; p. ej., NM_001024628; SEQ ID n.º 17) o un receptor neuropilina 2 (NP2; p. ej., NM_201279; SEQ ID n.º 18).

El receptor plexina puede ser un receptor plexinA1 (PlexA1; p. ej., NM_032242; SEQ ID n.º 19), un receptor plexinA2 (PlexA2, p. ej., NM_025179, SEQ ID n.º 20), un receptor plexinA3 (PlexA3; p. ej., NM_017514, SEQ ID n.º 21), un receptor plexinA4 (PlexA4, p. ej., NM_020911, SEQ ID n.º 22; NM_001105543, SEQ ID n.º 23; NM_181775, SEQ ID n.º 24) o un receptor plexinD (PlexD, p. ej., NM_015103, SEQ ID n.º 25).

Se conocen en la técnica los procedimientos para determinar la expresión de un receptor de semaforinas. Específicamente, la determinación de la expresión de los receptores de semaforinas se puede efectuar por la cantidad de ARN o por la cantidad de proteína, como se detalla a continuación.

Procedimientos para detectar la expresión de un receptor de semaforinas por la cantidad de ARN

Análisis por transferencia Northern: este procedimiento implica la detección de un ARN concreto, a saber, un ARN de receptor de semaforinas en una mezcla de ARN. Se desnaturaliza una muestra de ARN mediante el tratamiento con un agente (p. ej., formaldehído) que impide la formación de puentes de hidrógeno entre las pares de bases, lo que asegura que todas las moléculas de ARN tienen una conformación lineal desplegada. A continuación, cada una de las moléculas de ARN se separa de acuerdo con el tamaño por electroforesis en gel y se transfieren a una membrana de nitrocelulosa o de nilón a la cual se adhieren los ARN desnaturalizados. La membrana se expone entonces a las sondas de ADN marcadas. Las sondas se pueden marcar con radioisótopos o nucleótidos unidos a enzimas. Para la detección se puede utilizar la autorradiografía, la reacción colorimétrica o la quimioluminiscencia. Este procedimiento permite tanto cuantificar una cantidad de moléculas de ARN concretas como determinar su identidad mediante la posición relativa sobre la membrana, que es indicativa de la distancia que migró en el gel durante la electroforesis.

Análisis por RT-PCR: este procedimiento utiliza la amplificación por PCR de moléculas de ARN relativamente raras. Primero, las moléculas de ARN se purifican de las células y se convierten en ADN complementario (ADNc) con una enzima de tipo transcriptasa inversa (tal como la RT del MMLV) y cebadores tales como oligo-dT, hexámeros

aleatorios o cebadores específicos de gen. A continuación, con la aplicación de cebadores específicos de gen y la ADN polimerasa Taq, se lleva a cabo una reacción de amplificación por PCR en un termociclador. Los expertos en la técnica son capaces de seleccionar la longitud y la secuencia de los cebadores específicos de gen y las condiciones de la PCR (a saber, temperaturas de hibridación, número de ciclos y similares) que son adecuados para detectar moléculas de ARN específicas. Se apreciará que se puede emplear una reacción de RT-PCR semicuantitativa mediante el ajuste del número de ciclos de PCR y la comparación del producto de amplificación con controles conocidos. Los cebadores de ejemplo que se pueden utilizar para detectar los receptores NRP1 se presentan en las SEQ ID n.º 3 y 4. Los cebadores de ejemplo que se pueden utilizar para detectar los receptores NRP2 se presentan en las SEQ ID n.º 5 y 6. Los cebadores de ejemplo que se pueden utilizar para detectar los receptores PLXNA1 se presentan en las SEQ ID n.º 7 y 8. Los cebadores de ejemplo que se pueden utilizar para detectar los receptores PLXNA2 se presentan en las SEQ ID n.º 9 y 10. Los cebadores de ejemplo que se pueden utilizar para detectar los receptores PLXNA3 se presentan en las SEQ ID n.º 11 y 12. Los cebadores de ejemplo que se pueden utilizar para detectar los receptores PLXNA4 se presentan en las SEQ ID n.º 13 y 14. Los cebadores de ejemplo que se pueden utilizar para detectar los receptores PLXND1 se presentan en las SEQ ID n.º 15 y 16. Los cebadores de ejemplo que se pueden utilizar para detectar los receptores CDH2 se presentan en las SEQ ID n.º 1 y 2.

Tinción del ARN por hibridación in situ: en este procedimiento, las sondas de ADN o ARN se unen a las moléculas de ARN presentes en las células. Por lo general, las células primero se fijan a cortes para microscopia para preservar la estructura celular y para impedir que las moléculas de ARN se degraden, y a continuación se someten a un tampón de hibridación que contiene la sonda marcada. El tampón de hibridación incluye reactivos, tales como la formamida y sales (p. ej., cloruro de sodio y citrato de sodio), que permiten la hibridación específica in situ de las sondas de ADN o ARN a sus moléculas diana de ARNm a la vez que se impide la fijación inespecífica de la sonda. Los expertos en la técnica son capaces de ajustar las condiciones de hibridación (a saber, temperatura, concentración de sales y formamida, y similares) para cada sonda y tipo de células. Tras la hibridación, toda sonda sin fijar se elimina por lavado y el portaobjetos se somete a la emulsión fotográfica que revela las señales generadas por las sondas radiomarcadas, o bien a una reacción colorimétrica que revela las señales generadas por las sondas marcadas por unión a enzima.

Tinción por RT-PCR in situ: este procedimiento lo describen Nuovo, G. J. et al. [«Intracelular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA». Am. J. Surg. Pathol. 1993, 17: 683-90] y Komminoth,

P. et al. [«Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) and in situ RT-PCR». Pathol. Res. Pract. 1994, 190: 1017-25]. Brevemente, la reacción de RT-PCR se realiza en las células fijadas mediante la incorporación de nucleótidos marcados a la reacción de PCR. La reacción se lleva a cabo con un termociclador para in situ tal como el sistema PixCell I LCM de microdisección de captura con láser disponible de Arcturus Engineering (Mountainview, CA).

Micromatriz oligonucleotídica: en este procedimiento, las sondas oligonucleotídicas capaces de hibridarse específicamente a los polinucleótidos que codifican los receptores de semaforinas de la presente invención se fijan a una superficie sólida (p. ej., un portaobjetos de vidrio). Cada sonda oligonucleotídica tiene una longitud de aproximadamente 20-25 nucleótidos. Para detectar el perfil de expresión de los polinucleótidos de la presente invención en una determinada muestra de células (p. ej., células tumorales), se extrae el ARN de la muestra de células con los procedimientos conocidos en la técnica (con, p. ej., una solución de TRIZOL, Gibco BRL, EE.UU.). La hibridación puede tener lugar con sondas oligonucleotídicas marcadas (p. ej., sondas biotiniladas en 5') o fragmentos de ADN o de ARN complementarios (ADNc o ARNc, respectivamente) marcados. Brevemente, el ADNc bicatenario se prepara a partir del ARN mediante la transcriptasa inversa (RT) (p. ej., RT Superscript II), ADN ligasa y ADN polimerasa I, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen Life Technologies, Frederick, MD, EE.UU). Para preparar el ARNc marcado, el ADNc bicatenario se somete a una reacción de transcripción in vitro en presencia de nucleótidos biotinilados con, p. ej., el kit de marcación de transcritos de ARN de gran rendimiento BioArray (Enzo, Diagnostics, Affymetrix Santa Clara CA). Para la hibridación eficaz, el ARNc marcado se puede fragmentar mediante la incubación del ARN en 40 mM de Tris/acetato (pH 8,1), 100 mM de acetato de potasio y 30 mM de acetato de magnesio durante 35 minutos a 94 ºC. Tras la hibridación, se lava la micromatriz, y la señal de hibridación se barre con un escáner de fluorescencia de láser confocal que mide la intensidad de la fluorescencia emitida por el ARNc marcado unido a la matriz de sondas.

Por ejemplo, en la micromatriz de Affymetrix (Affymetrix®, Santa Clara, CA), cada gen de la matriz está representado por una serie de sondas oligonucleotídicas diferentes, de las cuales, cada pareja de sondas consiste en un oligonucleótido de concordancia perfecta y un oligonucleótido con discordancia. Mientras la sonda de concordancia perfecta tiene una secuencia exactamente complementaria al gen concreto, lo que permite así medir el nivel de expresión del gen concreto, la sonda con discordancia difiere de la sonda de concordancia perfecta por la sustitución de una única base en la posición de la base que está en el centro. La señal de hibridación se barre con el escáner de Agilent, y el programa informático Microarray Suite sustrae la señal inespecífica que se obtiene de la sonda con discordancia, de la señal que se obtiene de la sonda de concordancia perfecta.

Procedimientos para detectar los receptores de semaforinas por la cantidad de proteína

La determinación de la expresión de un receptor de semaforinas por la cantidad de proteína se lleva a cabo

típicamente con un anticuerpo capaz de fijarse específicamente a un receptor de semaforinas concreto.

Los anticuerpos de ejemplo capaces de interaccionar específicamente con NP1 y NP2 están ampliamente disponibles, p. ej., de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, n.º de catálogo sc-12122, sc-12123, sc-12125, sc12128 y sc-50408).

Los anticuerpos de ejemplo capaces de interaccionar específicamente con los receptores plexina están también disponibles ampliamente, p. ej., de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, n.º de catálogo sc-25639, sc-10138, sc10139, sc-10144, sc-25640, sc-10143, sc-25641, sc-10135, sc-10134, sc-28372, sc-10147, sc-25642, sc-10145, sc67034, sc-34504, sc-34506, sc-34507, sc-46240, sc-67144, sc-46241, sc-46242, sc-46243, sc-10152, sc-10149, sc46244, sc-46245, sc-67145, sc-46246 y sc-46247). Los anticuerpos también están disponibles de Abcam MA, EE.UU. (n.º de catálogo ab32960, ab23391, ab39350, ab39357, ab39008, ab41564 y ab39715).

Preferiblemente, el anticuerpo se fija específicamente a al menos un epítopo del receptor de semaforinas. Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «epítopo» hace referencia a cualquier determinante antigénico de un antígeno al cual se fija el parátopo de un anticuerpo.

Los determinantes epitópicos suelen consistir en agrupamientos de moléculas químicamente activos en la superficie, tales como cadenas laterales de aminoácidos o glúcidos, y suelen tener unas características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

La terminología «anticuerpo», tal y como se utiliza en esta invención, incluye moléculas intactas así como fragmentos funcionales de las mismas, tales como Fab, F(ab')2 y Fv, que son capaces de fijarse a los macrófagos. Estos fragmentos funcionales de anticuerpo se definen como sigue: (1) Fab es el fragmento que contiene un fragmento monovalente de fijación al antígeno de una molécula de anticuerpo, que se puede producir mediante la digestión del anticuerpo entero con la enzima papaína para producir una cadena ligera intacta y una porción de una cadena pesada; (2) Fab' es el fragmento de una molécula de anticuerpo que se puede obtener al tratar el anticuerpo entero con pepsina, seguido de reducción, para producir una cadena ligera intacta y una porción de la cadena pesada; se obtienen dos fragmentos de Fab' por molécula de anticuerpo; (3) (Fab')2 es el fragmento del anticuerpo que se puede obtener al tratar el anticuerpo entero con la enzima pepsina sin la posterior reducción; el F(ab')2 es un dímero de dos fragmentos Fab' que se mantienen juntos mediante dos puentes disulfuro; (4) Fv se define como un fragmento manipulado genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada expresada como dos cadenas; y (5) anticuerpo monocatenario («SCA» por su nombre en inglés) es una molécula manipulada genéticamente que contiene la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada, unidas por un conector polipeptídico adecuado como una molécula monocatenaria genéticamente fusionada.

Se conocen bien en la técnica los procedimientos para producir anticuerpos monoclonales y policlonales, así como los fragmentos de los mismos, que se fijan a los distintos receptores de semaforinas (véase, por ejemplo, Harlow y Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1988, incorporado en la presente memoria por referencia).

Los procedimientos para detectar receptores de semaforinas incluyen inmunoensayos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, sistemas de ensayo competitivos y acompetitivos que utilizan técnicas tales como transferencia de tipo Western, ELISA (inmunoensayo enzimático), inmunoensayo en «sandwich» y ensayos de inmunoprecipitación y ensayos inmunohistoquímicos, según se detalla más adelante en la presente memoria .

Inmunoensayo enzimático (ELISA): este procedimiento implica la fijación de una muestra (p. ej., células fijadas o una solución proteínica) que contiene un sustrato proteico unido a una superficie, tal como un pocillo de una placa de microtitulación. Se aplica un anticuerpo específico del sustrato conjugado a una enzima y se deja fijarse al sustrato. A continuación, se detecta la presencia del anticuerpo y se cuantifica mediante reacción colorimétrica con la enzima conjugada al anticuerpo. Las enzimas que se suelen emplear en este procedimiento incluyen la peroxidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina. Si se calibra bien y se encuentra dentro del intervalo lineal de respuesta, la cantidad de sustrato presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. Se suele emplear un sustrato estándar para mejorar la exactitud de la cuantificación.

Transferencia de tipo Western: este procedimiento implica separar un sustrato a partir de otra proteína por medio de un gel de acrilamida y luego transferir el sustrato a una membrana (p. ej., nilón o PVDF). A continuación, la presencia del sustrato se detecta con anticuerpos específicos contra el sustrato, que a su vez se detectan mediante reactivos que se fijan al anticuerpo. Los reactivos que se fijan al anticuerpo pueden ser, por ejemplo, proteína A u otros anticuerpos. Los reactivos que se fijan al anticuerpo pueden estar radiomarcados o conjugados a enzima como se describe más arriba en la presente memoria. La detección puede ser mediante autorradiografía, reacción colorimétrica o quimioluminiscencia. Este procedimiento permite cuantificar una cantidad de sustrato y determinar su identidad por la posición relativa sobre la membrana que indica la distancia de migración en el gel de acrilamida durante la electroforesis.

Radioinmunoensayo (RIA): en una versión, este procedimiento implica la precipitación de la proteína deseada (a saber, el sustrato) con un anticuerpo específico y la proteína que se fija al anticuerpo radiomarcada (p. ej., proteína

A marcada con I125) inmovilizada sobre un vehículo que se puede precipitar, tal como perlas de agarosa. El número de cuentas del sedimento precipitado es proporcional a la cantidad de sustrato.

En una versión alternativa del RIA, se emplean un sustrato marcado y una proteína de fijación al anticuerpo sin marcar. En distintas cantidades se le añade una muestra que contiene una cantidad desconocida de sustrato. La disminución en las cuentas precipitadas del sustrato marcado es proporcional a la cantidad de sustrato en la muestra añadida.

Clasificación de células activadas mediante fluorescencia (FACS, por su nombre en inglés): este procedimiento implica la detección in situ de un sustrato en las células mediante anticuerpos específicos contra el sustrato. Los anticuerpos específicos contra el sustrato están conjugados a fluoróforos. La detección es por medio de un equipo de clasificación de células que lee la longitud de onda de luz emitida de cada célula cuando pasa por un haz de luz. Este procedimiento puede emplear dos o más anticuerpos a la vez.

Análisis inmunohistoquímico: este procedimiento implica la detección in situ de un sustrato en las células fijadas mediante anticuerpos específicos contra el sustrato. Los anticuerpos específicos contra el sustrato pueden estar conjugados a enzimas o conjugados a fluoróforos. La detección es mediante microscopia y evaluación automática o subjetiva. Si se emplean anticuerpos conjugados a enzimas, podría necesitarse una reacción colorimétrica. Se apreciará que a la inmunohistoquímica le sigue a menudo la tinción complementaria de los núcleos celulares con, por ejemplo, tinción con hematoxilina o de Giemsa.

Ensayo de actividad in situ: de acuerdo con este procedimiento, se aplica un sustrato cromógeno sobre las células que contienen una enzima activa y la enzima catalizará una reacción en la cual el sustrato se descompone para producir un producto cromógeno visible al microscopio óptico o fluorescente.

Se apreciará que las células tumorales del sujeto se obtienen de una muestra tumoral, p. ej., durante una biopsia tumoral.

Tal y como se menciona, la cantidad de receptor de semaforinas indica qué semaforina es idónea para el tratamiento del cáncer del sujeto.

Se apreciará que la cantidad de receptor de semaforinas debe ser suficiente para transducir una respuesta biológica (a saber, inhibición tumoral). La cantidad de receptor que es suficiente para generar tal respuesta es típicamente dependiente de la afinidad de la semaforina por dicho receptor. Así pues, por ejemplo, si una semaforina tiene una afinidad alta por un receptor (p. ej., comprende una Km de aproximadamente 10–7 M, 10–8 M, 10–9 M, 10–10 M o incluso 10–11 M), la cantidad de receptor no tiene que ser tan grande como la cantidad de receptor para el cual la semaforina tiene un receptor de baja afinidad (p. ej., comprende una Km de aproximadamente 10–6 M, 10–5 M, 10–4 M, 10–3 M).

De acuerdo con una realización, la cantidad de receptor en las células tumorales es al menos el 20% del número total de receptores de semaforinas de las células tumorales. De acuerdo con otra realización, la cantidad de receptor en las células tumorales es al menos el 30% del número total de receptores de semaforinas de las células tumorales. De acuerdo con otra realización, la cantidad de receptor en las células tumorales es al menos el 40% del número total de receptores de semaforinas de las células tumorales. De acuerdo con otra realización, la cantidad de receptor en las células tumorales es al menos el 50% del número total de receptores de semaforinas de las células tumorales. De acuerdo con otra realización, la cantidad de receptor en las células tumorales es al menos el 60% del número total de receptores de semaforinas de las células tumorales. De acuerdo con otra realización, la cantidad de receptor en las células tumorales es al menos el 70% del número total de receptores de semaforinas de las células tumorales. De acuerdo con otra realización, la cantidad de receptor en las células tumorales es al menos el 80% del número total de receptores de semaforinas de las células tumorales.

En consecuencia, los presentes inventores han hallado que si en las células tumorales se localiza una cantidad suficiente de receptores NP1, la semaforina más preferible para el tratamiento comprende Sema3A o Sema3D. Si en las células tumorales se localiza una cantidad suficiente de receptores NP2, la semaforina más preferible para el tratamiento comprende Sema3G o Sema3F. Si en las células tumorales se localiza una cantidad suficiente de receptores PlexD1, la semaforina más preferible para el tratamiento comprende Sema3E.

Se apreciará que la selección de la semaforina no sólo se basa en la cantidad de un receptor, sino también en el perfil de expresión de muchos subtipos de receptores de semaforinas. Por ejemplo, se sabe que las neuropilinas forman complejos espontáneos con varios miembros de la familia de receptores plexina. En consecuencia, la selección de la semaforina también se puede llevar a cabo basándose en el perfil de expresión del receptor neuropilina y del receptor plexina.

Los presentes inventores también han hallado que hay otro procedimiento para seleccionar una semaforina para el tratamiento de un cáncer. Las semaforinas que se había visto que inhibían el crecimiento independiente de anclaje de una célula tumoral concreta también se vio que eran eficaces para inhibir la formación de tumores. Un procedimiento para medir el crecimiento independiente de anclaje de las células tumorales se describe en el apartado Materiales y métodos de los ejemplos que hay más adelante en la presente memoria, y que implican la

medición de colonias en agar blando.

Se apreciará que los agentes utilizados para detectar la expresión del receptor de semaforinas se pueden dar a conocer como un kit, tal como un kit autorizado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosis unitarias que contienen el agente activo (p. ej., anticuerpo o sonda capaz de interaccionar específicamente con un subtipo de semaforina). El kit también puede comprender otros agentes útiles para analizar la expresión del receptor de semaforinas (p. ej., tamponantes adecuados, anticuerpos de control o sondas). Además, el kit puede comprender agentes utilizados para medir colonias tumorales en agar blando.

El kit puede venir acompañado de instrucciones para la administración. El kit puede también venir acompañado de una advertencia en una forma prescrita por un organismo público que regule la fabricación, uso o venta de sustancias farmacéuticas, en donde dicha advertencia refleje la autorización del organismo para la forma de las composiciones para la administración humana o veterinaria. Tal advertencia, por ejemplo, puede incluir el etiquetado autorizado por la Agencia del Medicamento de los EE.UU (FDA por su nombre en inglés).

Tras la selección, el tratamiento del cáncer se puede iniciar al poner en contacto (bien in vivo o ex vivo) las células cancerosas con un agente capaz de inducir la semaforina adecuada.

Por consiguiente, la presente descripción que comprende la invención contempla la administración de cantidades terapéuticamente eficaces de las propias semaforinas, o la administración de polinucleótidos que codifican las semaforinas (a saber, genoterapia) a sujetos que lo necesitan para tratarles el cáncer.

Los polipéptidos de las semaforinas pueden comprender la secuencia completa de los presentados en las SEQ ID n.º 26-32. Otra posibilidad es que las semaforinas puedan ser homólogos (p. ej., polipéptidos que tienen una homología de al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 87%, al menos el 89%, al menos el 91%, al menos el 93%, al menos el 95% o más, digamos el 100%, con las secuencias de semaforina recogidas más arriba en la presente memoria según se determinó con el programa informático BlastP del National Center of Biotechnology Information (NCBI) con los parámetros de defecto) que comprendan actividad semaforina. El homólogo también podría hacer referencia a una deleción, inserción o variante de sustitución, que incluye una sustitución de aminoácidos, del mismo y fragmentos de polipéptidos biológicamente activos del mismo.

La terminología «polipéptido», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a un polímero de aminoácidos naturales o sintéticos, que abarcan péptidos nativos (bien productos de degradación, polipéptidos sintéticamente sintetizados o polipéptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, péptidos sintéticamente sintetizados), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de polipéptido que pueden tener, por ejemplo, modificaciones que hacen a los péptidos incluso más estables mientras están en un organismo, o más capaces de penetrar en las células.

Tales modificaciones incluyen, pero sin limitarse a ellas, la modificación del extremo amino, la modificación del extremo carboxilo, la modificación del enlace polipeptídico, que incluye, pero sin limitarse a ellos, CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH o CF=CH, modificaciones del esqueleto y modificación de restos. Los procedimientos para preparar los compuestos peptidomiméticos se conocen bien en la técnica y se especifican, por ejemplo, en Quantitative Drug Design, C.A. Ramsden Gd., capítulo 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992), que se incorpora por referencia como si se presentase completamente en la presente memoria. A continuación se ofrecen más detalles a este respecto.

Los enlaces polipeptídicos (-CO-NH-) dentro del polipéptido se pueden sustituir, por ejemplo, por enlaces Nmetilados (-N(CH3)-CO-), enlaces éster (-C(R)H-C-O-O-C-(R)-N), enlaces cetometileno (-CO-CH2), enlaces α-aza (-NH-N(R)-CO-), en donde R es cualquier alquilo, p. ej., metilo, enlaces carba (-CH2-NH-), enlaces hidroxietileno (-CH(OH)-CH2), enlaces tioamida (-CS-NH-), enlaces dobles olefínicos (-CH=CH-), enlaces retroamida (-NH-CO-), derivados polipeptídicos (-N(R)-CH2-CO-), en donde R es la cadena lateral «normal», que aparece en la forma natural sobre el átomo de carbono.

Estas modificaciones se pueden producir en cualquiera de los enlaces a lo largo de la cadena polipeptídica e incluso en varias (2 o 3) al mismo tiempo.

Los aminoácidos aromáticos naturales, Trp, Tyr y Phe, se pueden sustituir por el ácido no natural sintético, tal como fenilglicina, TIC, naftilalanina (NoI), derivados metilados en el anillo de Phe, derivados halogenados de Phe o ometil-Tyr.

Además de lo anterior, los polipéptidos de la presente invención también pueden incluir uno o más aminoácidos modificados o uno o más monómeros no aminoacídicos (p. ej., ácidos grasos, glúcidos complejos, etc).

Tal y como se utiliza en la presente memoria en la especificación y en el apartado de las reivindicaciones que viene más adelante, la terminología «aminoácido» o «aminoácidos» se sabe que incluye los 20 aminoácidos que aparecen en la naturaleza; los aminoácidos que a menudo se modifican postraduccionalmente in vivo, e incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos infrecuentes que incluyen, pero sin limitarse a ellos, el

ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. Además, la terminología «aminoácido» incluye tanto los aminoácidos D como los L (estereoisómeros).

Las tablas 1 y 2 que vienen a continuación recogen los aminoácidos que aparecen en la naturaleza (tabla 1) y los aminoácidos no convencionales o modificados (tabla 2) que se pueden utilizar con la presente invención.

Tabla 1

Aminoácido

Abreviatura de tres letras Símbolo de una letra

Alanina

Ala A

Arginina

Arg R

Asparagina

Asn N

Ácido aspártico

Asp D

Cisteína

Cys C

Glutamina

Gln Q

Ácido glutámico

Glu E

Glicina

Gly G

Histidina

His H

Isoleucina

Ile I

Leucina

Leu L

Lisina

Lys K

Metionina

Met M

Fenilalanina

Phe F

Prolina

Pro P

Serina

Ser S

Treonina

Thr T

Triptófano

Trp W

Tirosina

Tyr Y

Valina

Val V

Cualquier aminoácido de los anteriores

Xaa X

Tabla 2

Aminoácido no convencional

Código Aminoácido no convencional Código

Ácido α-aminobutírico

Abu L-N-metilalanina Nmala

α-Amino-α-metilbutirato

Mgabu L-N-metilarginina Nmarg

Carboxilato de aminociclopropano

Cpro L-N-metilasparagina Nmasn

Ácido L-N-metilaspártico

Nmasp

Ácido aminoisobutírico

Aib L-N-metilcisteína Nmcys

Carboxilato de aminonorbornilo

Norb L-N-metilglutamina Nmgin

Ácido L-N-metilglutámico

Nmglu

Ciclohexilalanina

Chexa L-N-metilhistidina Nmhis

Ciclopentilalanina

Cpen L-N-metilisoleucina Nmile

D-Alanina

Dal L-N-metil-leucina Nmleu

D-Arginina

Darg L-N-metil-lisina Nmlys

Ácido D-aspártico

Dasp L-N-metilmetionina Nmmet

Aminoácido no convencional

Código Aminoácido no convencional Código

D-Cisteína

Dcys L-N-metilnorleucina Nmnle

D-Glutamina

Dgln L-N-metilnorvalina Nmnva

Ácido D-glutámico

Dglu L-N-metilornitina Nmorn

D-Histidina

Dhis L-N-metilfenilanina Nmphe

D-Isoleucina

Dile L-N-metilprolina Nmpro

D-Leucina

Dleu L-N-metilserina Nmser

D-Lisina

Dlys L-N-metiltreonina Nmthr

D-Metionina

Dmet L-N-metiltriptófano Nmtrp

D-Ornitina

Dorn L-N-metiltirosina Nmtyr

D-Fenilalanina

Dphe L-N-metilvalina Nmval

D-Prolina

Dpro L-N-metiletilglicina Nmetg

D-Serina

Dser L-N-metil-t-butilglicina Nmtbug

D-Treonina

Dthr L-norleucina Nle

D-Triptófano

Dtrp L-norvalina Nva

D-Tirosina

Dtyr α-metilaminoisobutirato Maib

D-Valina

Dval α-metil-γ-aminobutirato Mgabu

D-α-metilanina

Dmala α-etilciclohexilalanina Mchexa

D-α-metilarginina

Dmarg α-metilciclopentilalanina Mcpen

D-α-metilasparagina

Dmasn α-metil-α-naftilalanina Manap

D-α-metilaspartato

Dmasp α-metilpenicilamina Mpen

D-α-metilcisteína

Dmcys N-(4-aminobutil)glicina Nglu

D-α-metilglutamina

Dmgln N-(2-aminoetil)glicina Naeg

D-α-metilhistidina

Dmhis N-(3-aminopropil)glicina Nom

D-α-metilisoleucina

Dmile N-amino-α-metilbutirato Nmaabu

D-α-metil-leucina

Dmleu α-naftilalanina Anap

D-α-metil-lisina

Dmlys N-bencilglicina Nphe

D-α-metilmetionina

Dmmet N-(2-carbamiletil)glicina Ngln

D-α-metilornitina

Dmorn N-(carbamilmetil)glicina Nasn

D-α-metilfenilalanina

Dmphe N-(2-carboxietil)glicina Nglu

D-α-metilprolina

Dmpro N-(carboximetil)glicina Nasp

D-α-metilserina

Dmser N-ciclobutilglicina Ncbut

D-α-metiltreonina

Dmthr N-cicloheptilglicina Nchep

D-α-metiltriptófano

Dmtrp N-ciclohexilglicina Nchex

D-α-metiltirosina

Dmty N-ciclodecilglicina Ncdec

D-α-metilvalina

Dmval N-ciclododecilglicina Ncdod

D-α-metilalanina

Dnmala N-ciclooctilglicina Ncoct

D-α-metilarginina

Dnmarg N-ciclopropilglicina Ncpro

D-α-metilasparagina

Dnmasn N-cicloundecilglicina Ncund

D-α-metilaspartato

Dnmasp N-(2,2-difeniletil)glicina Nbhm

D-α-metilcisteína

Dnmcys N-(3,3-difenilpropil)glicina Nbhe

D-N-metil-leucina

Dnmleu N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp

D-N-metil-lisina

Dnmlys N-metil-γ-aminobutirato Nmgabu

Aminoácido no convencional

Código Aminoácido no convencional Código

N-metilciclohexilalanina

Nmchex D-N-metilmetionina Dnmmet

D-N-metilornitina

Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen

N-metilglicina

Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe

N-metilaminoisobutirato

Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro

N-(1-metilpropil)glicina

Nile D-N-metilserina Dnmser

N-(2-metilpropil)glicina

Nile D-N-metilserina Dnmser

N-(2-metilpropil)glicina

Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr

D-N-metiltriptófano

Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nva

D-N-metiltirosina

Dnmtyr N-metil-α-naftilalanina Nmanap

D-N-metilvalina

Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen

Ácido γ-aminobutírico

Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr

L-t-butilglicina

Tbug N-(tiometil)glicina Ncys

L-etilglicina

Etg Penilcilamina Pen

L-homofenilalanina

Hphe L-α-metilalanina Mala

L-α-metilarginina

Marg L-α-metilasparagina Masn

L-α-metilaspartato

Masp L-α-metil-t-butilglicina Mtbug

L-α-metilcisteína

Mcys L-metiletilglicina Metg

L-α-metilglutamina

Mgln L-α-metilglutamato Mglu

L-α-metilhistidina

Mhis L-α-metilhomofenilalanina Mhphe

L-α-metilisoleucina

Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet

D-N-metilglutamina

Dnmgln N-(3-guanidinopropil)glicina Narg

D-N-metilglutamato

Dnmglu N-(1-hidroxietil)glicina Nthr

D-N-metilhistidina

Dnmhis N-(hidroxietil)glicina Nser

D-N-metilisoleucina

Dnmile N-(imidazoliletil)glicina Nhis

D-N-metil-leucina

Dnmleu N-(3-indoliletil)glicina Nhtrp

D-N-metil-lisina

Dnmlys N-metil-γ-aminobutirato Nmgabu

N-metilciclohexilalanina

Nmchex D-N-metilmetionina Dnmmet

D-N-metilornitina

Dnmorn N-metilciclopentilalanina Nmcpen

N-metilglicina

Nala D-N-metilfenilalanina Dnmphe

N-metilaminoisobutirato

Nmaib D-N-metilprolina Dnmpro

N-(1-metilpropil)glicina

Nile D-N-metilserina Dnmser

N-(2-metilpropil)glicina

Nleu D-N-metiltreonina Dnmthr

D-N-metiltriptófano

Dnmtrp N-(1-metiletil)glicina Nval

D-N-metiltirosina

Dnmtyr N-metil-α-naftilalanina Nmanap

D-N-metilvalina

Dnmval N-metilpenicilamina Nmpen

Ácido γ-aminobutírico

Gabu N-(p-hidroxifenil)glicina Nhtyr

L-t-butilglicina

Tbug N-(tiometil)glicina Ncys

L-etilglicina

Etg Penicilamina Pen

L-homofenilalanina

Hphe L-α-metilalanina Mala

L-α-metilarginina

Marg L-α-metilasparagina Masn

L-α-metilaspartato

Masp L-α-metil-t-butilglicina Mtbug

L-α-metilcisteína

Mcys L-metiletilglicina Metg

Aminoácido no convencional

Código Aminoácido no convencional Código

L-α-metilglutamina

Mgln L-α-metilglutamato Mglu

L-α-metilhistidina

Mhis L-α-metilhomofenilalanina Mhphe

L-α-metilisoleucina

Mile N-(2-metiltioetil)glicina Nmet

L-α-metilleucina

Mleu L-α-metil-lisina Mlys

L-α-metilmetionina

Mmet L-α-metilnorleucina Mnle

L-α-metilnorvalina

Mnva L-α-metilornitina Mom

L-α-metilfenilalanina

Mphe L-α-metilprolina Mpro

L-α-metilserina

Mser L-α-metiltreonina Mthr

L-α-metilvalina

Mtrp L-α-metiltirosina Mtyr

L-α-metilleucina

Mval nbhm L-N-metilhomofenilalanina Nmhphe

N-(N-(2,2-difeniletil)

N-(N-(3,3-difenilpropil)

carbamilmetil-glicina

Nnbhm carbamilmetil(1)glicina Nnbhe

1-carboxi-1-(2,2-difenil hilamino)ciclopropano

Nmbc

Tal y como se menciona más arriba en la presente memoria, la semaforina de la presente invención puede comprender una sustitución conservativa o no conservativa.

La terminología «sustitución conservativa», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia al reemplazo de un aminoácido presente en la secuencia nativa del péptido por un aminoácido que se produce de forma natural o no natural o un peptidomimético que tiene unas propiedades estéricas similares. Cuando la cadena lateral del aminoácido nativo a reemplazar es polar o hidrófoba, la sustitución conservativa debe ser con un aminoácido que se produce de forma natural, un aminoácido que no se produce de forma natural o con un resto peptidomimético que es también polar o hidrófobo (además de tener las mismas propiedades estéricas que la cadena lateral del aminoácido reemplazado).

Como los aminoácidos que se producen de forma natural se agrupan típicamente de acuerdo con sus propiedades, las sustituciones conservativas con aminoácidos que se producen de forma natural se pueden determinar con facilidad si se tiene en cuenta el hecho de que, de acuerdo con la invención, el reemplazo de los aminoácidos cargados por aminoácidos sin carga estéricamente similares se considera que son sustituciones conservativas.

Para producir sustituciones conservativas con aminoácidos que no se producen de forma natural, también es posible utilizar análogos de aminoácidos (aminoácidos sintéticos) bien conocidos en la técnica. Un peptidomimético del aminoácido que se produce de forma natural está bien documentado en la bibliografía conocida por el experto en la técnica.

Cuando afecta a las sustituciones conservativas, el aminoácido sustituyente debe tener en la cadena lateral el mismo grupo funcional que el aminoácido original o uno similar.

La frase «sustituciones no conservativas», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia al reemplazo del aminoácido que aparece en la secuencia original por otro aminoácido que se produce de forma natural o no natural, que tiene diferentes propiedades electroquímicas y/o estéricas. Así pues, la cadena lateral del aminoácido sustituyente puede ser significativamente mayor (o menor) que la cadena lateral del aminoácido nativo que se sustituye y/o puede tener grupos funcionales con propiedades electrónicas significativamente diferentes a las del aminoácido que se sustituye. Los ejemplos de sustituciones no conservativas de este tipo incluyen la sustitución de la alanina por fenilalanina o cicohexilmetilglicina, de la glicina por isoleucina o del ácido aspártico por -NH-CH[(CH2)5-COOH]-CO-. Las sustituciones no conservativas que caen dentro el alcance de la presente invención son las que siguen constituyendo un péptido cuyas propiedades son como las de la semaforina.

Tal y como se menciona, las semaforinas de la presente invención pueden comprender sustituciones. De acuerdo con una realización, la semaforina se puede manipular genéticamente para que sea resistente a la escisión mediante las proproteína convertasas de tipo furina. Así pues, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento de la proproteína convertasa RFRR (SEQ ID n.º 39) se puede mutar en la secuencia KFKK (SEQ ID n.º 40). Esto se ha realizado en la semaforina 3B, con lo que los autores demostraron que esta mutación confería una resistencia parcial a las proproteína convertasas de las células cancerosas sin perturbar la actividad biológica de la semaforina 3B completa [Varshavsky A., Kessler O., Abramovitch S., Kigel B., Zaffryar S. et al. (2008) Cancer Res. 68: 69226931]. En las SEQ ID n.º 33-38 se presentan los ejemplos de secuencias polinucleotídicas y polipeptídicas de las semaforinas que son al menos parcialmente resistentes a las proproteína convertasas.

Tal y como se ha mencionado, los extremos amino y carboxilo de los péptidos de la presente invención pueden estar protegidos por grupos funcionales. Los grupos funcionales adecuados se describen en Green y Wuts, «Protecting Groups in Organic Synthesis», John Wiley and Sons, capítulos 5 y 7, 1991, cuyas enseñanzas se incorporan en la presente memoria por referencia. Los grupos protectores preferidos son los que facilitan el transporte del compuesto unido a éstos al interior de una célula, por ejemplo, al reducir la hidrofilia e incrementar la lipofilia de los compuestos.

Estos restos se pueden escindir in vivo, bien mediante hidrólisis o bien enzimáticamente, dentro de la célula. Los grupos protectores de hidroxilos incluyen grupos protectores éster, carbonato y carbamato. Los grupos protectores de amina incluyen grupos carbonilo alcoxi y ariloxi, tal y como se describe más arriba para los grupos protectores del extremo amino. Los grupos protectores de ácido carboxílico incluyen ésteres alifáticos, bencílicos y arílicos, tal y como se describe más arriba para los grupos protectores del extremo carboxilo. En una realización, el grupo de ácido carboxílico de la cadena lateral de uno o varios restos de ácido glutámico o de ácido aspártico de un péptido de la presente invención está protegido, preferiblemente con un metilo, etilo, bencilo o éster de bencilo sustituido.

Los ejemplos de grupos protectores del extremo amino incluyen grupos acilo (-CO-R1) y grupos alcoxi carbonilo o ariloxi carbonilo (-CO-O-R1), en donde R1 es un grupo alifático, alifático sustituido, bencilo, bencilo sustituido, aromático o aromático sustituido. Los ejemplos específicos de grupos acilo incluyen acetilo, (etil)-CO-, n-propil-CO-, iso-propil-CO-, n-butil-CO-, sec-butil-CO-, t-butil-CO-, hexilo, lauroílo, palmitoílo, miristoílo, estearilo, oleoílo, fenil-CO-, (fenil sustituido)-CO-, bencil-CO- y (bencil sustituido)-CO-. Los ejemplos de grupos alcoxi carbonilo y ariloxi carbonilo incluyen CH3-O-CO-, (etil)-O-CO-, n-propil-O-CO-, iso-propil-O-CO-, n-butil-O-CO-, sec-butil-O-CO-, t-butil-O-CO-, fenil-O-CO-, (fenil sustituido)-O-CO-, bencil-O-CO-, (bencil sustituido)-O-CO-, y adamantano, naftaleno, miristoleílo, tolueno, bifenilo, cinamoílo, nitrobenzoílo, toluoílo, furoílo, benzoílo, ciclohexano, norbornano, Z-caproico. Para facilitar la N-acilación, en el extremo amino de la molécula pueden estar presentes de uno a cuatro restos de glicina.

El grupo carboxilo del extremo carboxilo del compuesto se puede proteger, por ejemplo, con una amida (a saber, el grupo hidroxilo del extremo carboxilo está reemplazado con -NH2. -NHR2 y -NR2R3) o un éster (a saber, el grupo hidroxilo del extremo carboxilo está reemplazado con -OR2). R2 y R3 son independientemente un grupo alifático, alifático sustituido, bencilo, bencilo sustituido, arilo o arilo sustituido. Además, junto con el átomo de nitrógeno, R2 y R3 pueden formar un anillo heterocíclico de C4 a C8 con de aproximadamente 0 a 2 heteroátomos adicionales tales como nitrógeno, oxígeno o azufre. Los ejemplos de anillos heterocíclicos adecuados incluyen piperidinilo, pirrolidinilo, morfolino, tiomorfolino o piperazinilo. Los ejemplos de grupos protectores del extremo carboxilo incluyen -NH2-, -NHCH3-, -N(CH3)2, -NH(etilo), -N(etilo)2, -N(metil)(etilo), -NH(bencilo), -N(alquil C1-C4)(bencilo), -NH(fenilo), -N(alquil C1-C4)(fenilo), -OCH3, -O-(etilo), -O-(n-propilo), -O-(n-butilo), -O-(iso-propilo), -O-(sec-butilo), -O-(t-butilo), -O-bencilo y -O-fenilo.

Las semaforinas de la presente invención también pueden comprender restos que no son aminoácidos, tales como, por ejemplo, restos hidrófobos (diferentes hidrocarburos lineales, ramificados, cíclicos, policíclicos o heterocíclicos y derivados de hidrocarburos) unidos a los péptidos; diferentes grupos protectores, en especial cuando el compuesto es lineal, que están unidos a los extremos del compuesto para disminuir la degradación. Los grupos químicos (no aminoacídicos) presentes en el compuesto pueden haber sido incluidos para mejorar diferentes propiedades fisiológicas; disminuir la degradación o eliminación; disminuir la repulsión mediante diferentes bombas celulares; mejorar las actividades inmunógenas; mejorar diferentes modos de administración (tales como la adhesión de diferentes secuencias que permiten la penetración a través de diferentes barreras, a través de intestino, etc.); incrementar la especificidad; incrementar la afinidad; disminuir la toxicidad, y similares.

De acuerdo con un caso, las semaforinas de la presente invención están unidas a un potenciador de la liberación prolongada. Los ejemplos de potenciadores de la liberación prolongada incluyen, pero sin limitarse a ellos, ácido hialurónico (HA), ácido algínico (AA), metacrilato de polihidroxietilo (Poly-HEMA), polietilenglicol (PEG), dimetoxietano y poliisopropilacrilamida.

La unión del componente de la secuencia aminoacídica de las semaforinas de la invención a otros agentes que no son aminoácidos se puede hacer mediante un enlace covalente, mediante complejo no covalente, por ejemplo, mediante la complejación a un polímero hidrófobo que puede ser degradado o escindido para producir un compuesto capaz de ofrecer la liberación prolongada; mediante el atrapamiento de la parte aminoacídica de la semaforina en liposomas o micelas para producir la semaforina final de la invención. La asociación puede ser mediante el atrapamiento de la secuencia aminoacídica dentro de otro componente (liposoma, micela) o la impregnación de la secuencia aminoacídica dentro de un polímero para producir el péptido final de la invención.

Las semaforinas de la presente invención se pueden sintetizar bioquímicamente tal como utilizando técnicas en fase sólida estándares. Estos procedimientos incluyen la síntesis en fase sólida exclusiva, procedimientos de síntesis en fase sólida parcial, condensación de fragmentos, síntesis clásica en solución. Los procedimientos de síntesis de péptidos en fase sólida se conocen bien en la técnica y además están descritos en John Morrow Stewart y Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptide Syntheses (2.ª ed., Pierce Chemical Company, 1984).

También se pueden utilizar técnicas recombinantes para generar las semaforinas de la presente invención. Estas técnicas se pueden preferir debido al número de aminoácidos de un polipéptido de semaforina y a la gran cantidad

que se requiere del mismo. Tales técnicas recombinantes se describen en Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol.

153: 516-544, Studier et al., (1990) Methods in Enzymol. 185: 60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310: 511-514; Takamatsu et al., (1987) EMBO J. 6: 307-311, Coruzzi et al., (1984) EMBO J. 3: 1671-1680 y Brogli et al., (1984) Science 224: 838-843, Gurley et al., (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565 y Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, apartado VIII, págs. 421-463.

Para producir un vector de expresión para la expresión de las semaforinas de la presente invención, los polinucleótidos que codifican las semaforinas de la presente invención se ligan en un vector de expresión de ácido nucleico, que comprende la secuencia polinucleotídica bajo el control transcripcional de una secuencia reguladora en cis (p. ej., secuencia promotora) adecuada para dirigir la transcripción constitutiva, específica del tejido o inducible de las semaforinas de la presente invención en las células hospedadoras.

La frase «un polinucleótido aislado» hace referencia a una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que se aísla y se proporciona en la forma de una secuencia de ARN, una secuencia polinucleotídica complementaria (ADNc), una secuencia polinucleotídica genómica y/o una secuencia polinucleotídica compuesta (p. ej., una combinación de lo anterior).

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase «secuencia polinucleotídica complementaria» hace referencia a una secuencia que surge de la transcripción inversa del ARN mensajero mediante una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Tal secuencia se puede amplificar posteriormente in vivo o in vitro con una ADN polimerasa dependiente del ADN.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase «secuencia polinucleotídica genómica» hace referencia a una secuencia que procede (se aísla) de un cromosoma y así pues representa una porción contigua de un cromosoma.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase «secuencia polinucleotídica compuesta» hace referencia a una secuencia que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exónicas que se necesitan para codificar la semaforina de la presente invención, así como algunas secuencias intrónicas que se interponen entre ellas. Las secuencias intrónicas pueden tener cualquier origen, que incluye de otros genes, y típicamente incluirán las secuencias señal de ayuste conservadas. Tales secuencias intrónicas pueden además incluir elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.

Tal y como se menciona más arriba en la presente memoria, las secuencias polinucleotídicas de la presente invención se insertan en los vectores de expresión (a saber, una construcción de ácido nucleico) para permitir la expresión de la semaforina recombinante. El vector de expresión de la presente invención puede incluir otras secuencias que convierten este vector en adecuado para la replicación e integración en procariotas, eucariotas o preferiblemente en ambos (p. ej., vectores lanzadera). Los vectores de clonación típicos contienen secuencias de inicio de la transcripción y traducción (p. ej., promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (p. ej., señales de poliadenilación).

Para expresar las semaforinas de la presente invención se pueden utilizar muchas células procariotas o eucariotas como sistemas de expresión en el hospedador. Estas incluyen, pero sin limitarse a ellas, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un vector de expresión recombinante de ADN de bacteriófago, de ADN plasmídico ode ADN de cósmido, que contiene la secuencia codificante de la semaforina; levadura transformada con los vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen la secuencia codificante de la semaforina; sistemas de células vegetales infectadas con los vectores de expresión víricos recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes, tales como plásmido Ti, que contienen la secuencia codificante de la semaforina.

Además de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica la semaforina), la construcción para expresión de la presente invención también puede incluir secuencias manipuladas genéticamente para optimizar la estabilidad, producción, purificación, rendimiento o actividad de la semaforina expresada.

Se pueden utilizar diferentes procedimientos para introducir el vector de expresión de la presente invención en el sistema de células hospedadoras. Tales procedimientos se describen de forma general en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992) en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor. Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich, (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and their Uses. Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa et al., [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, la transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con los vectores víricos recombinantes. Además, véanse las patentes de los EE.UU. n.º 5,464,764 y 5,487,992 para los procedimientos de selección positiva-negativa.

Las células transformadas se cultivan en condiciones eficaces que permiten la expresión de una gran cantidad del péptido recombinante. Las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero sin limitarse a ellas, condiciones eficaces de temperatura, pH, oxígeno, medios y biorreactores, que permiten la producción de proteínas. Un medio eficaz

hace referencia a cualquier medio en el cual una célula se cultiva para producir la semaforina recombinante de la presente invención. Tal medio típicamente incluye una solución acuosa que tiene una fuente asimilable de carbono, nitrógeno y fosfato, y sales, minerales, metales y otros nutrientes, tales como vitaminas, apropiados. Las células de la presente invención se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas de Petri. El cultivo se puede llevar a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno adecuados para una célula recombinante. Tales condiciones de cultivo se encuentran dentro de los conocimientos del experto en la técnica.

Según el vector y el sistema hospedador utilizado para la producción, las semaforinas resultantes de la presente invención pueden permanecer dentro de la célula recombinante, o bien ser secretadas al medio de fermentación, o bien ser secretadas en un espacio entre dos membranas celulares, tal como el espacio periplásmico en E. coli, o bien quedar retenidas en la superficie externa de una célula o membrana vírica.

La semaforina recombinante se recupera después de un tiempo predeterminado en cultivo.

La frase «recuperar la semaforina recombinante» utilizada en la presente memoria hace referencia a recoger todo el medio de fermentación que contiene la semaforina y sin que necesite necesariamente otras etapas de separación o purificación.

Así pues, las semaforinas de la presente invención se pueden purificar con una serie de técnicas estándares de purificación de proteínas, tales como, pero sin limitarse a ellas, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía en fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.

Para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada se puede manipular genéticamente para que codifique una semaforina fusionada a un resto escindible. Tal proteína de fusión se puede diseñar de tal forma que la semaforina se pueda aislar fácilmente por cromatografía de afinidad; p. ej., mediante inmovilización en una columna específica para el resto escindible. Cuando se introduce por manipulación genética un sitio de escisión entre la semaforina y el resto escindible, la semaforina puede liberarse de la columna cromatográfica mediante el tratamiento con una enzima o agente apropiados que escinden específicamente la proteína de fusión por este sitio [p. ej., véase Booth et al., Immunol. Lett., 19: 65-70 (1988); y Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].

La semaforina de la presente invención se recupera preferiblemente en una forma «sustancialmente pura».

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la frase «sustancialmente pura» hace referencia a una pureza que garantiza el uso eficaz de la semaforina en las aplicaciones descritas en la presente memoria.

Además de poderse sintetizar en las células hospedadoras, la semaforina de la presente invención también se puede sintetizar con sistemas de expresión in vitro. Estos procedimientos se conocen bien en la técnica y los componentes del sistema están disponibles en el mercado.

Tal y como se menciona, la semaforina se puede administrar al sujeto que la necesita como polinucleótidos, en donde se expresan in vivo, esto es, genoterapia.

La terminología «genoterapia», tal y como se utiliza en la presente memoria, hace referencia a la transferencia del material genético (p. ej., ADN o ARN) de interés al interior de un hospedador para tratar o prevenir una enfermedad

o afección genética o adquirida o fenotipo. El material genético de interés codifica un producto (p. ej., una proteína, polipéptido, péptido, ARN funcional, antisentido) cuya producción se desea in vivo. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar una hormona, receptor, enzima, polipéptido o péptido de valor terapéutico. Para una revisión, véase, en general, el texto «Gene Therapy» (Advanced in Pharmacology 40, Academic Press, 1997).

Han evolucionado dos estrategias básicas en la genoterapia: genoterapia (1) ex vivo y (2) in vivo. En la genoterapia ex vivo, las células se retiran de un paciente y, mientras se cultivan, se tratan in vitro. Por lo general, se introduce un gen de reemplazo funcional en la célula mediante un vehículo o procedimiento de administración génica apropiado (transfección, transducción, recombinación homóloga, etc.) y un sistema de expresión cuando sea necesario, y entonces las células modificadas se expanden en el cultivo y se devuelven al hospedador o paciente. Se ha demostrado que estas células reimplantadas genéticamente expresan in situ el material genético transfectado. Las células pueden ser autólogas o heterólogas al sujeto. Ya que las células heterólogas es más probable que induzcan una reacción inmunitaria cuando se administran al organismo, se han desarrollado varias estrategias para reducir la probabilidad de rechazo de las células heterólogas. Estas incluyen deprimir el sistema inmunitario del destinatario o bien encapsular las células heterólogas en membranas semipermeables e inmunoaislantes antes del trasplante.

En la genoterapia in vivo, las células diana no se retiran del sujeto, sino que el material genético a transferir se introduce in situ en las células del organismo del destinatario, esto es dentro del destinatario. Estas células genéticamente alteradas se ha demostrado que expresan in situ el material genético transfectado.

Para conferir especificidad, las construcciones de ácido nucleico utilizadas preferiblemente para expresar las semaforinas de la presente invención comprenden elementos de secuencias promotoras específicos de la célula.

Los vectores víricos recombinantes son útiles para la expresión in vivo de las semaforinas de la presente invención ya que ofrecen ventajas tales como la infección lateral y la especificidad de diana. La infección lateral es inherente al ciclo de vida de, por ejemplo, retrovirus y es el proceso mediante el cual una única célula infectada produce una progenie con muchos viriones que brotan de ella e infectan las células circundantes. El resultado es que se infecta muy rápidamente una gran área en la que la mayoría de las células no estaba infectada inicialmente por las partículas víricas originales. Esto se contrapone al tipo de infección vertical en el cual el agente infeccioso se extiende sólo a la progenie hija. También se pueden producir vectores víricos que sean incapaces de diseminarse lateralmente. Esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen concreto destinado sólo a un número localizado de células.

Los presentes inventores han demostrado que, al igual que tienen un efecto directo sobre las células tumorales, las semaforinas también influyen en la angiogénesis mediante la interacción con receptores de las células endoteliales.

Así pues, al igual que para el tratamiento del cáncer, las semaforinas de la presente invención también pueden tratar otras enfermedades asociadas a la angiogénesis, según está definido en las reivindicaciones.

Las enfermedades asociadas a la angiogénesis incluyen, pero sin limitarse a ellas, enfermedades inflamatorias, autoinmunitarias e infecciosas; cáncer dependiente de la angiogénesis, que incluye, por ejemplo tumores sólidos, tumores de transmisión hemática tales como leucemias y metástasis tumorales; tumores benignos, por ejemplo, hemangiomas, neuromas acústicos, neurofibromas, tracomas y granulomas piógenos; artrosis; psoriasis; eccema; angiopatías oculares, por ejemplo, retinopatía diabética, retinopatía de prematuridad, degeneración macular, rechazo del injerto de córnea, glaucoma neovascular, fibroplasia retrolental, rubeosis; síndrome de Osler-Webber; angiogénesis de miocardio; neovascularización de placas; telangiectasia; artropatía hemofílica; angiofibroma; y granulación de las heridas. Además, las composiciones de esta invención se pueden utilizar para tratar enfermedades tales como, pero sin limitarse a ellas, adherencias intestinales, ateroesclerosis, esclerodermia, verrugas y cicatrices hipertróficas (a saber, queloides). Las composiciones de esta invención también pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades en las que la angiogénesis es una consecuencia patológica, tal como linforreticulosis benigna (Rochele minalia quintosa), úlceras (Helicobacter pylori), tuberculosis y lepra.

Las semaforinas o los polinucleótidos que las codifican se pueden administrar a un sujeto por sí solas o pueden formar parte de una composición farmacéutica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, una «composición farmacéutica» hace referencia a una preparación de uno o varios de los ingredientes activos descritos en la presente memoria con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.

En la presente memoria, la terminología «ingrediente activo» hace referencia a la semaforina responsable del efecto biológico.

De aquí en adelante, las frases «vehículo fisiológicamente aceptable» y «vehículo farmacéuticamente aceptable», que se pueden usar indistintamente, hacen referencia a un vehículo o un diluyente que no ocasiona ninguna irritación significativa a un organismo y no anula la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado. En estas frases se incluye un adyuvante.

En la presente memoria, la terminología «excipiente» hace referencia a un sustancia inerte que se añade a una composición farmacéutica para facilitar más la administración de un ingrediente activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diferentes azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas para la formulación y administración de los fármacos se puede encontrar en «Remington's Pharmaceutical Sciences», Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición, que se incorpora en la presente memoria por referencia.

Las vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal, transmucosa, especialmente trasnasal, intestinal o parenteral, entre ellas las inyecciones intramuscular, subcutánea e intramedular, así como la inyección intratecal, intraventricular directa, intracardiaca, p. ej., en la cavidad del ventrículo derecho o izquierdo, en la arteria coronaria común, intravenosa, intraperitoneal, intranasal o intraocular.

Las estrategias convencionales para la administración del fármaco al sistema nervioso central (SNC) incluyen: estrategias neuroquirúrgicas (p. ej., inyección intracerebral o infusión intracerebroventricular); manipulación molecular del agente (p. ej., producción de una proteína quimérica de fusión que comprende un péptido transportador que tiene afinidad por una molécula de la superficie de las células endoteliales en combinación con un agente que es incapaz de cruzar la BHE por sí solo) en un intento de explotar una de las vías de transporte endógeno de la BHE; estrategias farmacológicas diseñadas para incrementar la liposolubilidad de un agente (p. ej., conjugación de agentes hidrosolubles a vehículos lipídicos o colesterol); y la alteración transitoria de la integridad de la BHE mediante ruptura hiperosmótica (que se consigue con la infusión de una solución de manitol en la arteria carótida o el uso de un agente biológicamente activo tal como un péptido de angiotensina). Sin embargo, cada una

de estas estrategias tiene limitaciones, tales como los riesgos inherentes asociados a un procedimiento quirúrgico invasivo, un límite del tamaño impuesto por una limitación inherente de los sistemas del transporte endógeno, unos efectos secundarios biológicos potencialmente indeseables con la administración sistémica de una molécula quimérica que comprende un motivo vehicular que podría ser activo fuera del SNC, y el posible riesgo de daño cerebral dentro de las regiones del cerebro en las que se ha roto la BHE, que las convierten en procedimientos de administración subóptimos.

Otra posibilidad sería que se pueda administrar la composición farmacéutica de una manera local en vez de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección de la composición farmacéutica directamente en una región del tejido de un paciente.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar mediante métodos bien conocidos en la técnica, p. ej., por medio métodos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Así pues, las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular de manera convencional con uno o varios vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y adyuvantes que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que se pueden utilizar desde el punto de vista farmacéutico. La formulación adecuada depende de la vía de administración elegida.

Para la inyección, los ingredientes activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, preferiblemente en tampones fisiológicamente compatibles, tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosa en la formulación se utilizan los penetrantes adecuados para la barrera a permear. Tales penetrantes se conocen de forma general en la técnica.

Para la administración oral, la composición farmacéutica se puede formular fácilmente mediante la combinación de los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Tales vehículos permiten formular la composición farmacéutica como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones viscosas, suspensiones, y similares, para la ingestión oral por un paciente. Las preparaciones farmacéuticas para el uso oral se pueden fabricar con un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir adyuvantes adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, sustancias de relleno tales como azúcares, entre ellos lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa de sodio; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir disgregantes, tales como polivinilpirrolidona entrecruzada, agar o ácido algínico, o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

Los núcleos de las grageas se proporcionan con los revestimientos adecuados. Para este propósito se pueden utilizar soluciones concentradas de glúcidos que pueden opcionalmente contener goma arábica, talco, polivinilpirrolidona, Carbopol® en gel, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones laqueantes y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Se puede añadir materia colorante o pigmentos a los revestimientos de los comprimidos o grageas para identificarlas o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de los compuestos activos.

Las composiciones farmacéuticas que se pueden utilizar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste suave hechas de gelatina así como cápsulas selladas blandas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste suave pueden contener los ingredientes activos en mezcla con una sustancia de relleno tal como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los ingredientes activos se pueden disolver o suspender en los líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deben ir en dosis adecuadas para la vía de administración elegida.

Para la administración yugal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas para chupar formuladas de manera convencional.

Para la administración mediante inhalación nasal, los ingredientes activos para el uso de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación en aerosol para pulverización en un envase presurizado o en un nebulizador con el uso de un propulsor adecuado, p. ej., diclorodifluorometano, triclorofluorometano, dicloro-tetrafluoroetano o dióxido de carbono. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosis se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Se pueden formular cápsulas y cartuchos de, p. ej., gelatina para ser usados en un dispensador que contiene una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa o almidón.

La composición farmacéutica descrita en la presente memoria se puede formular para la administración parenteral, p. ej., mediante una inyección de bolo o una venoclisis continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosis unitarias, p. ej., en ampollas o en contenedores de múltiples dosis con la adición

optativa de un conservante. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.

Las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en una forma hidrosoluble. Adicionalmente, las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como suspensiones para inyección acuosas u oleosas. Los solventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión, tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. De forma optativa, la suspensión puede también contener estabilizantes adecuados o agentes que incrementan la solubilidad de los ingredientes activos para garantizar la preparación de soluciones muy concentradas.

Otra posibilidad sería que el ingrediente activo pueda estar en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, p. ej., una solución estéril en agua sin pirógenos, antes de ser usada.

La composición farmacéutica de la presente invención también se puede formular en composiciones rectales, tales como supositorios o enemas de retención, utilizando, p. ej., bases convencionales para supositorios tales como mantequilla de cacao u otros glicéridos.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para el uso en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para conseguir el propósito deseado. Más específicamente, una cantidad terapéuticamente eficaz significa una cantidad de ingredientes activos (semaforinas) que es eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de un trastorno (p. ej., cáncer) o prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando.

La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está suficientemente dentro de los conocimientos de los expertos en la técnica, en especial a la luz de la descripción detallada dada a conocer en la presente memoria.

Para cualquier preparación utilizada en los procedimientos de la invención, la cantidad o dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células e in vitro. Por ejemplo, se puede formular una dosis en modelos animales para conseguir una concentración o titulación deseadas. Tal información se puede utilizar para determinar de forma más exacta las dosis útiles en los humanos.

La toxicidad y eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en la presente memoria se pueden determinar mediante procedimientos farmacéuticos estándares in vitro, en cultivos de células o en animales experimentales. Los datos obtenidos de estos ensayos de cultivo de células e in vitro y de estudios con animales se pueden utilizar para formular un margen de dosis para ser utilizado en los humanos. La dosis puede variar según la forma farmacéutica empleada y la vía de administración utilizada: la formulación exacta, la vía de administración y la dosis las puede elegir cada médico en vista de la afección del paciente (véase, p. ej., Fingi et al., 1975, en «The Pharmacological Basis of Therapeutics», capítulo 1, pág. 1).

La cantidad y el intervalo de las dosis se pueden ajustar por separado para asegurar que la concentración del ingrediente activo es suficiente para inducir o suprimir el efecto biológico (concentración eficaz mínima, CEM). La CEM variará en cada preparación, pero se puede estimar a partir de los datos in vitro. Las dosis necesarias para conseguir la CEM dependerá de las características de cada individuo y de la vía de administración. Los ensayos de detección se pueden utilizar para determinar las concentraciones plasmáticas.

Según la gravedad y la capacidad de respuesta de la afección a tratar, la dosificación puede ser única o múltiple, y el ciclo de tratamiento puede durar desde varios días a varias semanas o hasta que se logra la curación o se consigue disminuir el estado morboso.

La cantidad de una composición a administrar será por supuesto dependiente del sujeto a tratar, de la gravedad de la aflicción, de la vía de administración, del criterio del médico prescriptor, etc.

Las composiciones de la presente invención pueden, si se desea, presentarse en un envase o dispositivo dispensador, tal como un kit autorizado por la FDA, que puede contener una o más formas de dosis unitaria que contienen el ingrediente activo. El envase puede, por ejemplo, comprender una lámina de plástico o metal, tal como un envase alveolado o blíster. El envase o dispositivo dispensador puede venir acompañado de instrucciones para la administración. El envase o dispositivo dispensador también puede estar acondicionado con un aviso pegado en el contenedor en una forma prescrita por un organismo público que regula la fabricación, uso o venta de sustancias farmacéuticas, en donde dicho aviso recoge la autorización del organismo público para la forma de las composiciones o administración humana o veterinaria. Tal aviso, por ejemplo, puede ser de etiquetado autorizado por la Agencia del Medicamento de los EE.UU. (FDA, por su nombre en inglés) para fármacos con receta o de un prospecto autorizado. También se pueden preparar las composiciones que comprenden una preparación de la invención formuladas en un vehículo farmacéutico compatible, colocadas en un contenedor adecuado y etiquetadas para el tratamiento de una afección indicada, como se describe con más detalle más arriba.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «aproximadamente» hace referencia a ± 10%.

La terminología «comprende», «que comprende», «incluye», «que incluye», «que tiene» y sus conjugados significan «que incluye pero no se limita a».

La terminología «que consiste en» significa «que incluye y se limita a».

La terminología «que consiste esencialmente en» significa que la composición, procedimiento o estructura puede incluir otros ingredientes, etapas y/o partes, pero sólo si los otros ingredientes, etapas y/o partes no alteran materialmente las características básicas y nuevas de la composición, procedimiento o estructura que se reivindica.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, la terminología «procedimiento» hace referencia a maneras, medios, métodos y técnicas con los que llevar a término una tarea dada que incluye, pero sin limitarse a ellos, las maneras, medios, métodos y técnicas bien conocidos por los expertos en las técnicas química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica, o que éstos pueden fácilmente desarrollar a partir de las maneras, medios, métodos y técnicas conocidos.

Ejemplos

Ahora se hace referencia a los ejemplos que vienen a continuación que, junto las descripciones anteriores, ilustran la invención de una manera no limitante. Ahora se hace referencia a los ejemplos que vienen a continuación que, junto las descripciones anteriores, ilustran la invención de una manera no limitante.

Por lo general, la nomenclatura utilizada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Tales técnicas se explican exhaustivamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, «Molecular Cloning: A Laboratory Manual» Sambrook et al., (1989); «Current Protocols in Molecular Biology», volúmenes I-III, Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., «Current Protocols in Molecular Biology», John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, «A Practical Guide to Molecular Cloning», John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson et al., «Recombinant DNA», Scientific American Books, New York; Birren et al., (eds.) «Genome Analysis: A Laboratory Manual Series», vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como las presentadas en las patentes de los EE.UU. n.º 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 y 5.272.057; «Cell Biology; A Laboratory Handbook», volúmenes I-III Cellis, J. E., ed., (1994); «Culture of Animal Cells – A Manual of Basic Technique» de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), tercera edición; «Current Protocols in Immunology», volúmenes I-III, Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds.), «Basic and Clinical Immunology» (8.ª edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), «Selected Methods in Cellular Immunology», W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen exhaustivamente en las patentes y la bibliografía científica, véase, por ejemplo, las patentes de los EE.UU. n.º 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219;

5.011.771 y 5.281.521; «Oligonucleotide Synthesis» Gait, M. J., ed. (1984); «Nucleic Acid Hybridization» Hames, B.

D. y Higgins S. J., eds. (1985); «Transcription and Translation» Hames, B. D.; y Higgins S. J., eds. (1984); «Animal Cell Culture» Freshney, R. I., ed. (1986); «Immobilized Cells and Enzymes» IRL Press, (1986); «A Practical Guide to Molecular Cloning» Perbal, B. (1984) y «Methods in Enzymology», vol. 1-317, Academic Press; «PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications», Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., «Strategies for Protein Purification and Characterization – A Laboratory Course Manual» CSHL Press (1996). Otras referencias generales se dan a conocer a lo largo de este documento. Los procedimientos de este documento se cree que se conocen bien en la técnica y se dan a conocer para la comodidad del lector. Toda la información contenida en este documento se incorpora en la presente memoria por referencia.

Ejemplo 1 comparativo

Las semaforinas de clase 3 inhiben el desarrollo de tumores procedentes de cáncer de mama al actuar selectivamente sobre las células tumorales que expresan el receptor

Material y métodos

Material: los anticuerpos dirigidos contra la β-actina y contra las etiquetas de los epítopos myc y FLAG, así como las sustancias químicas, eran de Sigma (St. Louis, MI). Los medios y los sueros para el cultivo celular eran de Biological-Industries Inc. (Kibbutz BethHaemek, Israel). El Fugene® 6 se obtuvo de Roche Ltd (Suiza). Los anticuerpos dirigidos contra np1 y np2 se compraron a Santa Cruz Inc. (San Diego, CA). Los ADNc que codifican diferentes semaforinas se clonaron en el vector de expresión lentivírico NSPI-CMV-MCS-myc-His que contiene el promotor de SV40 que sirve para expresar el marcador de selección de la puromicina. Los anticuerpos dirigidos contra CD-31 eran de BD Biosciences Pharmingen. El kit de PCR inversa de ARN PerfectPure era de 5-Prime (Gaithersburg, MD).

Plásmidos de expresión: los ADNc de sema3A, sema3F y sema3E se subclonaron en el vector de expresión lentivírico NSPI-CMV-myc-his. El ADNc de sema3G se clonó del ARNm a partir de las HUVEC por RT-PCR. El ADNc de sema3D se clonó por RT-PCR a partir de las HUVEC tratadas con 30 ng/ml del VEGF durante 6 horas. Los

ADNc que codifican la sema3D y la sema3G también se subclonaron en el vector de expresión NSPI. Los ADNc que contienen la etiqueta del epítopo myc se añadieron en fase delante del codón de parada de sema3D, sema3E, sema3F y sema3G. Se añadió una etiqueta del epítopo FLAG delante del codón de parada de sema3A según está descrito [Guttman-Raviv et al., 2007, J. Biol. Chem. 282: 26294-26305].

Generación de lentivirus recombinantes e infección de las células con los lentivirus: las células HEK293-T se inocularon en placas de cultivo de tejidos de 100 mm (2,5 x 106 células por placa). Un día después de la inoculación, las células se transfectaron simultáneamente con el plásmido de expresión lentivírico adecuado (8 µg), con el vector de empaquetamiento pCMVdR8.91 (5 µg) y con un plásmido que codifica la envoltura de revestimiento del virus de la estomatitis vesicular pMD2-VSVG (2 µg), con el uso de Fugene® 6 de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El medio acondicionado que contiene las partículas lentivíricas infecciosas se recogió 48 horas y 72 horas después de la transfección. Se añadió Polybrene® (8 µg/ml) al medio acondicionado y se incubó 8 horas con las células deseadas.

Líneas celulares: las células sin micoplasmas procedentes de cáncer de mama MDA-MB-231, MDA-MB-435, MDAMB-468 y MCF7 se obtuvieron de la ATCC. Las células se cultivaron en DMEM que contenía 4,5 mg/ml de glucosa complementado con STF al 10% y antibióticos. Las células HUVEC, PAE, HEK293 y HEK293-T se cultivaron como se describió previamente [Kessler O. et al., 2004, Cancer Res. 64: 1008-1015]. Las HUVEC se utilizaron entre los pases 3 y 7.

Ensayos de formación de tumores in vivo: las células que expresan las semaforinas o las células de control infectadas con los vectores lentivíricos vacíos se implantaron (5 x 106/ratón) en las almohadillas de grasa de la mama de ratonas hembra balb/c nu/nu de 4 a 6 semanas de edad (Harlan Laboratories). En la mayoría de los experimentos se utilizaron grupos de 9 animales/experimento. Se midieron los tumores dos veces por semana con un calibrador. Se determinó el volumen tumoral (V) con la fórmula V = 0,52 x A2 x B, en la que A es el diámetro corto y B es el largo. Cuando los tumores MDA-MB-231 alcanzaron un volumen medio de 200 a 300 mm3, se extirparon y se pesaron. Cada experimento se repitió al menos dos veces para confirmar los resultados. Se utilizaron microgránulos de estrógenos en los experimentos en los que se determinó el desarrollo de los tumores de células MCF-7 según está descrito previamente [Akiri G. et al., 2003, Cancer Res. 63: 1657-1666].

Inmunohistoquímica: los tumores se incluyeron en OCT y se congelaron en 2-metilbutano enfriado en nitrógeno líquido. A continuación se laminaron en cortes gruesos de 30 µm con un criótomo. Los cortes se bloquearon con acetona fría, y se hicieron reaccionar con un anticuerpo dirigido contra el marcador endotelial CD-31, se tiñó para contrastar con hematoxilina, y se fotografió. Se fotografiaron 8 campos diferentes al microscopio procedentes de diferentes cortes de tres tumores diferentes. Estas fotografías se tomaron de áreas en donde la densidad de los vasos sanguíneos era más alta (método de puntos calientes) [Vermeulen, P. B., 1996, Eur. J. Cancer 32A: 24742484]. El área de los vasos sanguíneos en los campos con la misma superficie se cuantificó con el programa informático Image Pro Plus.

Transferencias Western: se prepararon lisados celulares y se determinó la concentración de proteínas según se describió previamente [Guttman-Raviv, 2007, J. Biol. Chem. 282: 26294-26305]. Para determinar la concentración de las sema3 secretadas en los medios acondicionados de las diferentes líneas celulares, las células se inocularon en placas de 12 pocillos a una concentración de 2 x 105 células/pocillo. Las células se incubaron durante 48 horas en 0,4 ml del medio sin suero. Se analizaron alícuotas del mismol volumen mediante análisis por transferencia Western para detectar la presencia de las sema3 con anticuerpos dirigidos contra la etiqueta adecuada de los epítopos myc o FLAG, según se describió previamente [Guttman-Raviv, 2007, J. Biol. Chem. 282: 26294-26305]. Ninguna de las semaforinas expresadas alteraron la tasa de proliferación ni la tasa supervivencia de las diferentes líneas celulares (no se muestran los datos).

Ensayo de proliferación: las células tumorales (104 células/pocillo) se inocularon por triplicado en placas de 24 pocillos. Las células adheridas se digirieron con tripsina y se contaron cada 24 horas durante 4 días con un contador Coulter. Los datos se representaron en un gráfico semilogarítmico en el que la pendiente de la curva representa la tasa de crecimiento de la línea celular.

Ensayo de adherencia: en los experimentos de adherencia celular se utilizaron placas de cultivo de 12 pocillos sin recubrir así como placas de 12 pocillos no adherentes revestidos con fibronectina (5 µl/ml). Las células tumorales (105 células/pocillo) se inocularon por triplicado en el medio de crecimiento. Las células se lavaron dos veces con PBS, se digirieron con tripsina para liberar las células adheridas y se contaron con un contador Coulter. Las células se contaron 5, 10, 20 y 45 minutos después de que se inocularan. Se calculó entonces el porcentaje de células adheridas respecto al número de células inoculadas y se representó en un gráfico. El tiempo requerido para que se adhieran el 50% de las células inoculadas se utilizó como una medición con la que comparar las propiedades de adherencia de las células de control y de las células que expresan la semaforina.

Ensayo de repulsión de las células endoteliales: se realizaron ensayos de repulsión de células esencialmente según está descrito [Guttman-Raviv, 2007, J. Biol. Chem. 282: 26294-26305).

Ensayo de formación de colonias en agar blando: una primera capa de agar que contiene 2 ml de agar de bajo punto

de fusión (Bio-Rad) al 0,5% disuelto en el medio de crecimiento se vertió en los pocillos de una placa de 6 pocillos para cultivo de células y se dejó polimerizar a 4 ºC durante 20 minutos. Una segunda capa (1 ml) que contenía agar de bajo punto de fusión al 0,3% disuelto en el medio de crecimiento que contiene las células (3 x 103/ml) se colocó en la parte superior de la primera capa y se dejó estar a 4 ºC durante 20 minutos. El medio de crecimiento (2 ml) se añadió en la parte superior de la segunda capa y las células se incubaron en un incubador humidificado a 37 ºC durante 21 días con cambio del medio dos veces a la semana. Al final del experimento, las colonias se tiñeron durante 1 hora con violeta de genciana al 0,005%, y se incubaron con PBS durante una noche para retirar el exceso de violeta de genciana. Las colonias se fotografiaron, y las colonias con un diámetro de 150 µm o más se contaron con el programa morfométrico Image-Pro.

Análisis estadístico: el análisis estadístico se realizó con los datos sin emparejar con una prueba la t de Student de varianzas desiguales. Las barras de error representan el error estándar de la media. La significación estadística se presenta de la manera siguiente: * p < 0,05, ** p < 0,01 y *** p < 0,001.

Resultados

Perfiles de expresión de los receptores de semaforinas de clase 3 en las líneas celulares procedentes de cáncer de mama: las semaforinas pueden influir en el desarrollo de los tumores mediante varios mecanismos, que incluyen efectos directos sobre las células tumorales, efectos sobre la angiogénesis y efectos sobre las células del estroma. Para encontrar si las semaforinas de clase 3 sema3A, sema3D, sema3E, sema3F y sema3G pueden influir en la formación de tumores a partir de las células de cáncer de mama mediante la influencia directa sobre el comportamiento de las células tumorales, los presentes inventores determinaron primero los perfiles de expresión de los receptores de sema3 conocidos en las células. Los diferentes tipos de células procedentes de cáncer de mama expresaban de forma diferente los receptores de sema3. Las células MDA-MB-231 expresan predominantemente np1, un receptor de la sema3A y de la sema3D, pero muy poco np2 o nada de él. Por otra parte, las células MDAMB-435 expresan predominantemente np2, un receptor de la sema3F y la sema3G, y muy poco o nada de np1. Las células MCF-7 expresan np1 (aunque en menos cantidad que las células MDA-MB-231) y no expresan np2 (figura 1A).

Debido a que su dominio intracelular es muy pequeño, las neuropilinas no pueden transducir señales de las sema3 por sí solas y forman complejos con las plexinas, de manera que las plexinas sirven de elemento de transducción de la señal. Las cuatro líneas celulares expresaban plexA1 y todas excepto las células MDA-MB-468 expresaban plexA2. Sin embargo, ninguna de las líneas celulares procedentes del cáncer de mama expresaban plexA4 y sólo las células MCF-7 expresaban un poco de plexA3 (figuras 1B-C). El ARNm que codifica PlaxD1, el receptor de la sema3E, se expresaba en MDA-MB-231 y MCF-7, mientras que las células MDA-MB-435 lo expresaba en menos cantidad y las células MDA-MB-468 no lo expresaban en absoluto (figura 1B-C).

Los efectos de las diferentes sema3 sobre el desarrollo de tumores a partir de las células de cáncer de mama MDAMB-231, MDA-MB-435, MDA-MB-468 y MCF-7: para determinar los efectos de sema3A, sema3D, sema3E, sema3F y sema3G sobre las líneas celulares de cáncer de mama, los ADNc completos que codifican las cinco semaforinas (o un control del vector de expresión vacío) se expresaron en las células con vectores lentivíricos que llevan un marcador de selección que confiere resistencia a la puromicina. Se seleccionaron conjuntos de células infectadas y se les examinó la expresión de la semaforina mediante análisis por transferencia Western con anticuerpos dirigidos contra la etiqueta del epítopo incorporado en las semaforinas recombinantes. Las sema3 contiene los sitios de escisión conservados para las proproteína convertasas de tipo furina y, en el caso de la sema3E, el producto escindido posee propiedades prometastásicas. Sin embargo, había sólo una escisión mínima de cualquiera de las semaforinas recombinantes en las células MDA-MB-231 o en las células MDA-MB-435 (no se muestran los datos). Las células MDA-MB-231 se implantaron posteriormente en las almohadillas de grasa de la mama de ratonas con inmunidad deficiente, y se dejaron desarrollar en tumores. En el caso de las células MDA-MB-231 se vio que se expresaban con eficacia todas las semaforinas que se analizaron (figuras 2A, D, G y J). La expresión de la sema3A, agonista de np1, inhibió casi completamente el desarrollo de tumores a partir de estas células (figuras 2B-C). La sema3D es un agonista de np1 y de np2. La sema3D inhibió completamente la formación de tumores en un experimento (no se muestran los datos) y en otro experimento inhibió fuertemente, aunque no completamente, el desarrollo de tumores (figuras 2E-F). En cambio, la sema3G, agonista de np2, no fue capaz de inhibir el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231 (figuras 2K-L). Por otra parte, la expresión de la sema3F, agonista de np2, inhibió significativamente el desarrollo de tumores desde estas células a pesar de la ausencia de receptores np2. Los tumores que desarrollaron a partir de las células MDA-MB-231 que expresan la sema3F (figura 2C) parecían menos irrigados que los tumores de control, lo que sugiere que la sema3F inhibía la angiogénesis tumoral (figura 2A). La expresión de la sema3E, agonista de PlexD1, también inhibió significativamente el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231, pero los tumores resultantes no parecían privados de vasos sanguíneos (figura 2G-I).

Un cuadro diferente emerge cuando se examinaron los efectos de estas semaforinas sobre el desarrollo de tumores a partir de las células MD-MB-435 que expresan np2. Cuando las células de control se inyectan en las almohadillas de grasa de la mama de ratonas nu/nu balb/c, estas se desarrollan en pequeños tumores que dejan de crecer cuando alcanzan un volumen medio de 50 a 100 mm3 (figuras 3B, E y H). En cambio, no hay tal limitación sobre el desarrollo tumoral en ninguna de las otras líneas celulares procedentes de cáncer de mama utilizadas en este

estudio. La expresión de la sema3F, agonista de np2, inhibió significativamente el desarrollo de tumores desde estas células (figuras 3B y C) y la sema3G, agonista de np2, era un inhibidor incluso más fuerte (figuras 3H-I). En cambio, la expresión de la sema3A, específica de np1, no inhibió el desarrollo de tumores desde estas células (figuras 3B-C) mientras que la sema3D, una semaforina que se fija a ambas neuropilinas, también inhibió significativamente su desarrollo, pero con menos fuerza que la sema3G (figuras 3E-F). Las células MDA-MB-435 también expresan PlexD1, el receptor de la sema3E, aunque en menos cantidad que la encontrada en las células MDA-MB-231 (figuras 1A-B). La expresión de la sema3E no inhibió la formación de tumores a partir de las células MDA-MB-435. Esto no se debía a la escisión por las proproteína convertasas de tipo furina, ya que estaba escindida menos del 5% de la sema3E hallada en el medio acondicionado de estas células (no se muestran los datos).

Los presentes inventores también determinaron cómo la expresión de la sema3A y la sema3F, los agonistas de np1 y np2 mejor estudiados, respectivamente, influye en el desarrollo de tumores a partir de las células MCF-7 dependientes de estrógenos y no metastásicas que expresan predominantemente np1. La expresión de la sema3A inhibió significativamente, aunque no completamente, el desarrollo de tumores desde estas células, mientras que la sema3F no (figuras 4A-C). Estos efectos son similares a los observados con respecto al efecto de estas semaforinas sobre el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231 (figuras 2A y 2C). En conjunto, estos resultados sugieren que la capacidad de las sema3 para inhibir la formación de tumores desde un tipo de células procedente de cáncer de mama depende de la identidad de los receptores de semaforinas que se expresan en las células del tumor en desarrollo, y además indica que las sema3 no deben ser capaces de inhibir la formación de tumores a partir de las células de cáncer de mama que no expresan los receptores de sema3.

Para comprobar esta predicción, se expresaron la sema3A y la sema3F en las células de cáncer de mama MDA-MB468, que no expresan ni np1 ni np2 ni PlexD1 (figuras 1A, C). Estas células forman tumores de crecimiento lento tras la inyección en las almohadillas de grasa de la mam de ratonas nu/nu balb/c. De acuerdo con la presente predicción, ni la expresión de la sema3A ni la expresión de la sema3F inhibieron significativamente la formación de tumores a partir de estas células (figuras 4E-F).

Los efectos de diferentes semaforinas de clase 3 sobre la angiogénesis tumoral: la sema3F fue caracterizada en varios estudios como un inhibidor de la angiogénesis tumoral y como un factor repulsivo para las células endoteliales, y también se halló que la sema3A era un inhibidor de la angiogénesis inducida por el VEGF y también un factor repelente para las células endoteliales, aunque no era un inhibidor de la angiogénesis tumoral. Para comparar las propiedades repelentes de las diferentes semaforinas de clase 3, las células HEK293 que expresan una cantidad parecida de semaforinas se inocularon sobre monocapas de células endoteliales procedentes de la vena umbilical humana (HUVEC, por su nombre en inglés) en densidades clonales. Las células HEK293 secretaban una concentración parecida de semaforina en su medio de crecimiento, según se determinó mediante el análisis por transferencia Western con anticuerpos dirigidos contra la etiqueta del epítopo myc que se fusionó en fase delante del codón de parada de los ADNc de las diferentes semaforinas (no se muestran los datos). Las células de control infectadas con el vector lentivírico vacío no repelieron las células endoteliales, pero las células que expresaban la sema3A, la sema3D y la sema3E repelieron las células endoteliales con eficacia (figura 5A). No obstante, la sema3F, y en particular la sema3G, agonistas de np2, repelieron las HUVEC con menos fuerza que los agonistas de np1 o la sema3E, agonista de PlexD1 (no se muestran los datos). Por lo tanto, las células que expresan la sema3F o bien la sema3G se inocularon encima de células endoteliales aórticas de cerdo (PAE, por su nombre en inglés) manipuladas genéticamente para que expresen a la vez np2 y plexA1. Como se esperaba, estas células fueron repelidas con mucha fuerza por la sema3F, pero también fueron repelidas con menos eficacia por la sema3G (figura 5B).

Para encontrar si las diferentes sema3 que se examinaron en el presente ejemplo inhibían la angiogénesis tumoral, se determinó la concentración de los vasos sanguíneos en los tumores que se desarrollaron a partir del control y de las células procedentes de cáncer de mama que expresan semaforinas. Ya que la sema3A inhibía casi completamente la formación de tumores a partir de las células MDA-MB-231, no fue posible determinar la concentración de los vasos sanguíneos en este caso. Sin embargo, la expresión de la sema3D, agonista de np1, en este tipo celular dio lugar a la formación de tumores que contenían concentraciones significativamente más bajas de vasos sanguíneos que en los tumores que se desarrollaron a partir de las células de control (figura 5C). La reducción de la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor no se correlacionaba con los tipos de receptores de semaforinas que se expresaban en las células cancerosas ya que la expresión de la sema3F y de la sema3G, agonistas de np2, también redujo significativamente la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor en los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-231 (figura 5C). Se observó una reducción cuantitativa similar de la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor independientemente de si se utilizaba la sema3D o la sema3G, incluso aunque la expresión de la sema3D inhibiera la formación de tumores con eficacia mientras que la sema3G no inhibía la formación de tumores (figuras 2A-L). En cambio, la expresión de la sema3E, una semaforina que inhibía el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231 (figuras 2G-I) y que inhibía la invasión de los vasos sanguíneos en los metámeros durante el desarrollo temprano, no dio lugar a una disminución de la concentración de vasos sanguíneos asociados a tumores en los tumores procedentes de MDAMB-231 (figura 5C).

También se examinaron los efectos de la expresión de la sema3A y de la sema3F sobre la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor en las células MCF-7. Estos tumores se desarrollan en las almohadillas de grasa de

la mama de las ratonas sólo en presencia de microgránulos de liberación lenta de estrógenos. La expresión de la sema3A en estas células redujo constante y significativamente la concentración de vasos sanguíneos asociados al tumor. Sin embargo, la expresión de la sema3F no (figura 5D).

En el caso de los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-435, se halló que la expresión de la sema3A y la sema3D reducía con fuerza la concentración de vasos sanguíneos en los tumores resultantes (figura 5E) incluso aunque el desarrollo de tumores desde estas células no estuviera inhibido por estas semaforinas (figuras 3A-I). No fue posible determinar la concentración de vasos sanguíneos en los tumores que se desarrollaron a partir de las células que expresan la sema3F o la sema3G ya que los tumores resultantes eran demasiado pequeños o inexistentes, como en el caso de la sema3G. La expresión de la sema3E produjo una disminución de la concentración de vasos sanguíneos en los tumores que se desarrollaban desde estas células, pero la disminución, aunque estadísticamente significativa, era pequeña.

En conjunto, estos experimentos indican que aunque la mayoría de las semaforinas serían capaces de inhibir la angiogénesis, como se puso de manifiesto con la reducción de la concentración de vasos sanguíneos en los tumores, e incluso aunque la inhibición pueda contribuir a inhibir la progresión tumoral, no solía haber correlación entre esta capacidad y la inhibición del desarrollo tumoral que se correlacionaba principalmente con la expresión de los receptores de semaforinas adecuados en las células tumorales.

Los efectos de la expresión de diferentes semaforinas de clase 3 sobre el comportamiento de las células tumorales in vitro: los experimentos descritos más arriba en la presente memoria sugieren que la expresión de las semaforinas podría modular con fuerza el comportamiento de las células tumorales. De hecho, otros investigadores han descrito los efectos de las diferentes semaforinas de clase 3 sobre la adherencia, diseminación y proliferación de diferentes tipos de células tumorales [Tomizawa, Y. et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 98: 13954-13959; Bielenberg, D. R et al., 2004, J. Clin. Invest. 114: 1260-1271; Nasarre, P. et al., 2005, Neoplasia. 7: 180-189]. No obstante, no se inhibió la proliferación de células MDA-MB-231 que expresaban la sema3A, o bien la sema3F, o bien la sema3D o bien la sema3E, en comparación con las células de control infectadas con los lentivirus que contenían el vector vacío. De igual forma, la proliferación de las células MCF-7 que expresaban la sema3A o bien la sema3F no se vio alterada en comparación con los controles, y las células MDA-MB-435 que expresaban la sema3A o la sema3F tampoco resultaron afectadas en comparación con las células de control (no se muestran los datos). Estos resultados indican que el efecto que estas semaforinas tienen sobre el crecimiento de tumores in vivo probablemente no está mediado por un efecto directo sobre la maquinaria de proliferación de las células tumorales. También se examinó el efecto de la expresión de las diferentes semaforinas sobre la adherencia de las diferentes células tumorales al plástico o a la fibronectina. Ni la expresión de la sema3A ni la de la sema3F influyó en la tasa o extensión de la adherencia de las células MDA-MB-231, MDA-MB-435 o MCF-7, independientemente de si el sustrato era plástico o fibronectina (no se muestran los datos).

La capacidad para formar colonias en agar blando es un distintivo que diferencia muchos tipos de células cancerosas de sus equivalentes normales. Por lo tanto, los presentes inventores determinaron si la expresión de diferentes semaforinas de clase 3 en las células MDA-MB-231 o MDA-MB-435 perturbaba su capacidad para formar colonias en agar blando. Ninguna de las semaforinas inhibió completamente la formación de colonias de células MDA-MB-231. Sin embargo, tanto la sema3A como la sema3D, semaforinas que inhiben con fuerza la formación de tumores desde estas células (figuras 2A-L), también inhibieron significativamente la formación de colonias grandes en agar blando (figuras 6A-B). Sorprendentemente, la sema3F también inhibió significativamente la formación de colonias grandes en agar blando a pesar de la ausencia de los receptores np2 en estas células. No obstante, la sema3F se fija a np1, aunque con una afinidad 10 veces más baja, y es posible que en este efecto inhibidor intervenga np1. Otro agonista de np2, la sema3G, que, a diferencia de la sema3F, no inhibe en absoluto el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231 (figuras 2J-L) y que no se fija a np1, no tuvo ningún efecto sobre el desarrollo de colonias en agar blando (figuras 6A-B). Estos resultados indicaron que la semaforina necesita fijarse al receptor de semaforinas expresado por las células tumorales para ser capaz de inhibir la formación de colonias en agar blando. Las células MDA-MB-231 también expresan PlexD1, el receptor de la sema3E, y la expresión de la sema3E inhibe la formación de tumores desde estas células (figuras 2G-I). Sin embargo, la sema3E no conseguía inhibir la formación de colonias grandes a partir de las células MDA-MB-231 en agar blando (figuras 6A-B).

Basándose en estos resultados, los presentes inventores predijeron que sema3D, sema3F y sema3G, que inhiben la formación de tumores a partir de las células MDA-MB-435 (figuras 3A-I), también deberían inhibir con eficacia la formación de colonias en agar blando a partir de estas células que expresan np2. De hecho, la sema3D y la sema3G inhibieron con eficacia la formación de colonias tal y como se predijo. Sin embargo, inesperadamente, se encontró que la sema3F inhibía la formación de colonias en agar blando desde estas células, incluso aunque no inhibiera la formación de tumores a partir de estas células (figuras 6C-D). Otra observación inesperada fue que la sema3E, que no inhibía la formación de tumores desde estas células, inhibió la formación de colonias (figura 6C-D). Finalmente, se esperaba que la sema3A no influyera en la formación de colonias, ya que su receptor no se expresa en las células MDA-MB-435 (figuras 10A-C). De hecho, la formación de colonias a partir de las células MDA-MB-435 no se vio inhibida por la sema3A. En su lugar, fue incluso estimulada (figuras 6C-D).

En conjunto, estos resultados sugieren que las diferentes semaforinas son capaces de modular directamente el

comportamiento de las células MDA-MB-231 y MDA-MB-435, aunque había excepciones a esta regla.

La expresión de np1 en las células MDA-MB-435 estimula el desarrollo tumoral y la estimulación se anula con la coexpresión de la sema3A: los experimentos descritos más arriba sugieren que la expresión de determinados receptores de las semaforinas de clase 3 en las células tumorales procedentes de cáncer de mama es probablemente el factor más importante que determina si una semaforina de clase 3 dada será un inhibidor eficaz del desarrollo tumoral. Para comprobar esta hipótesis, los presentes inventores se preguntaron si la expresión de np1 en las células MDA-MB-435 convertiría los tumores que se desarrollarían de estas células en sensibles a la sema3A. Los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-435 que expresan np1 no dejaron de desarrollarse cuando alcanzaron un volumen medio de 50 a 100 mm3 como sí ocurría con las células MDA-MB-435 de tipo silvestre (figuras 3A-I). Las células MDA-MB-435 que expresan np1 formaron rápidamente tumores en formación cuando se implantaron en las almohadillas de grasa de la mama de las ratonas (figuras 7A-C). Incluso aunque estas células que expresan np1 formaron tumores que estaban irrigados, la concentración de vasos sanguíneos dentro de estos tumores, según se determinó mediante tinción con un anticuerpo dirigido contra CD-31, no era significativamente diferente de la de los tumores de control (figura 7D). Cuando la sema3A, agonista de np1, se coexpresaba en éstas con np1, las células que expresaban ambos genes revirtieron al comportamiento mostrado por las células originales y formaron tumores que dejaban de crecer cuando los tumores alcanzaban un volumen de 50 a 100 mm3, gracias a lo cual se elimina la ventaja de crecimiento conferida por la presencia de np1 (figuras 7A-C), pero no la conferida por la presencia de np2, que se puede inhibir con los agonistas de np2, tales como la sema3F o la sema3G (figuras 3A-I). El interesante señalar que la densidad de los vasos sanguíneos de los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-435 que expresan la sema3A o la sema3A + np1 era similar y significativamente más baja que la de los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-435 que no expresan la sema3A (figura 7D), lo que indica de nuevo que la inhibición de la angiogénesis representa parte del mecanismo mediante el cual las semaforinas modulan la progresión tumoral, pero que puede no ser siempre suficiente inhibir la expansión tumoral.

Discusión

Los presentes resultados indican por primera vez que sema3A, sema3D, sema3E y sema3G inhiben la formación de tumores de diferentes líneas celulares procedentes de carcinomas de mama humanos. De debe destacar que ya se había descrito que la sema3E era un agente prometastásico, pero la actividad prometastásica estaba asociada a un producto de escisión generado por las proproteína convertasas de tipo furina y no por la proteína completa. En los presentes experimentos no había casi ninguna escisión de la sema3E en las células MDA-MB-231 ni en las células MDA-MB-435.

Muchos tipos de células neoplásicas expresan uno o más de np1, np2 o PlexD1, los receptores de semaforinas de clase 3. Los tipos de células procedentes de cáncer de mama que se emplearon en los presentes ejemplos para estudiar los efectos antineoplásicos de las diferentes semaforinas expresan diferentes combinaciones de receptores de semaforinas de clase 3 en su superficie celular. Ambas neuropilinas, así como varios tipos de plexinas, también se expresan en las células endoteliales, en donde desempeñan una función importante en la transducción de las señales angiogénicas inducidas por el VEGF, y participan en los efectos antiangiogénicos de las sema3. En el presente estudio, los presentes inventores han intentado evaluar la importancia relativa de los efectos antiangiogénicos frente a los efectos directos de las sema3 a la hora de determinar las propiedades antineoplásicas de las diferentes sema3. En conjunto, los presentes ejemplos indican que la expresión de un determinado receptor de semaforinas en las células neoplásicas es probablemente el factor más importante que determina si una semaforina de clase 3 dada funcionará como un inhibidor eficaz del desarrollo tumoral. Así pues, el desarrollo de los tumores a partir de las células MDA-MB-231 que expresan np1, pero no np2, se ve fuertemente inhibido por la sema3A y la sema3D, agonistas de np1, pero no por la sema3G, agonista de np2. Esta conclusión también está respaldada por los experimentos que han demostrado que en el caso de las células MDA-MB-435 que expresan np2, la sema3A no inhibe el desarrollo tumoral y la sema3D inhibe débilmente el desarrollo tumoral, mientras que la sema3G y la sema3F funcionan como inhibidores muy eficaces en el caso de estas células. Además, ni la sema3A ni la sema3F fueron capaces de inhibir el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-468 que no expresan neuropilinas.

La sema3E es única entre las sema3 ya que es la única semaforina que no se fija a las neuropilinas y que, en cambio, activa directamente la PlexD1. Tanto las células MDA-MB-231 como las MDA-MB-435 expresan PlexD1, aunque el nivel de expresión en las células MDA-MB-435 es significativamente más bajo que en las células MDAMB-231. La sema3E inhibió significativamente el desarrollo de tumores a partir de las células MDA-MB-231, pero no del todo a partir de las células MDA-MB-435. Es posible que el nivel de expresión de PlexD1 de las células MDAMB-435 esté por debajo de un umbral crítico que no permite la inhibición del desarrollo de tumores debido a la sema3E. Así pues, este resultado quizás también se pueda considerar como uno que apoya el criterio general mencionado anteriormente. La PlexD1 puede formar complejos con las neuropilinas y, al menos en el caso de np1, esta interacción puede influir en la naturaleza de la respuesta biológica a la sema3E. Por lo tanto, es posible que, en las células MDA-MB-435, el efecto de la sema3E pueda estar inhibido por np2, mientras que, en las células MDAMB-231, np1 puede influir en la señalización de la sema3E de manera diferente, y dar lugar a diversas respuestas biológicas.

Los presentes inventores demostraron por primera vez que sema3D, sema3G, sema3A y sema3E funcionan como inhibidores de la angiogénesis tumoral, ya que su expresión en las células tumorales dio lugar a una reducción significativa de la densidad de vasos sanguíneos asociados al tumor. Estos resultados indican que, por norma, la expresión de las semaforinas tiende a reducir la densidad de los vasos sanguíneos en los tumores que se desarrollan a partir de las células MDA-MB-231, MDA-MB-435 o MCF-7, incluso en el caso de que el desarrollo tumoral no se inhiba con la semaforina dada. Sin embargo, había unas pocas excepciones a esta regla. La densidad de los vasos sanguíneos en los tumores procedentes de las células MCF-7 que expresan la sema3F no se redujo en comparación con los tumores procedentes de las células MCF-7 de control. Sin embargo, el desarrollo de los tumores a partir de las células MCF-7 requiere estrógenos, unas hormonas que recientemente se encontró que inhiben la expresión de np2, el receptor de la sema3F, lo que puede explicar, quizás, la ausencia de efecto antiangiogénico en este caso. Además, se encontró que la expresión de la sema3E en las células MDA-MB-231 tampoco consiguió reducir la densidad de los vasos sanguíneos en los tumores resultantes, a pesar de la inhibición significativa del crecimiento tumoral.

La densidad de los vasos sanguíneos asociados a tumores viene determinada por un equilibrio entre la velocidad de la angiogénesis tumoral, que tiende a incrementar la densidad de los vasos sanguíneos, y la tasa de proliferación de las células tumorales, que tiende a disminuirla. Por lo tanto, es posible que un pequeño tumor cuya expansión se inhibió fuertemente mediante un agente antiangiogénico contenga la misma densidad de vasos sanguíneos que un tumor cuya expansión estaba mucho menos afectada por el agente antiangiogénico, simplemente porque en el último caso, la reducción de la densidad de los vasos sanguíneos no alcanzó el umbral por debajo del cual se inhibe la expansión de la masa tumoral. Se observó que, en la mayoría de los casos, la expresión de las semaforinas de clase 3 en las células tumorales reduce la densidad de los vasos sanguíneos en los tumores resultantes, independientemente de los tipos de receptores con los cuales interaccionan las semaforinas específicas, e independientemente de si las sema3 eran capaces de inhibir el desarrollo de los tumores. Por ejemplo, la sema3G disminuyó significativamente la densidad de los vasos sanguíneos en los tumores procedentes de las células MDAMB-231 al igual que lo hacían la sema3D y la sema3F, incluso aunque, a diferencia de estas semaforinas, la sema3G no inhibiera el desarrollo tumoral.

Los presentes inventores razonaron que si la expresión de los receptores de semaforinas en las células tumorales es el factor principal que determina si las sema3 podrán inhibir el desarrollo tumoral, entonces la expresión de las semaforinas debe influir también en el comportamiento de tales células tumorales en los ensayos in vitro. Las semaforinas de clase 3 tales como la sema3F y la sema3B inhiben la adherencia y la migración de algunas células tumorales. Por lo tanto, fue sorprendente que ni la proliferación ni las propiedades de adherencia de las diferentes células tumorales utilizadas en este estudio se modificaran por la expresión de las diferentes semaforinas. Hasta ahora, la única propiedad de las células tumorales que se halló que estaba afectada por la expresión de las semaforinas fue su capacidad para formar colonias en agar blando. En general, las semaforinas que inhibieron la formación de los tumores a partir de las células MDA-MB-231 o bien de las células MDA-MB-435 también fueron capaces de inhibir el crecimiento independiente de anclaje de las células tumorales. El crecimiento independiente de anclaje es un distintivo de la mayoría de las células malignas y estas observaciones indican que las sema3 influyen directamente sobre una característica de las células tumorales que está correlacionada con sus propiedades malignas. Sin embargo, también se observaron unas pocas excepciones a esta regla. La expresión de la sema3E en las células MDA-MB-231 no inhibió el crecimiento sin anclaje de las células incluso aunque la formación de tumores de estas células estuviera inhibido. Se observó otra discrepancia en el caso de la sema3F, que cuando se expresó en las células MDA-MB-435 inhibió fuertemente la formación de tumores, pero no el crecimiento sin anclaje de estas células. La razón para estas discrepancias aún está investigándose, pero, no obstante, en general, hay una buena concordancia entre los efectos de las sema3 sobre el desarrollo de los tumores y su capacidad para inhibir el crecimiento sin anclaje.

En conclusión, los presentes inventores han hallado por primera vez que sema3A, sema3D, sema3E y sema3G poseen propiedades antineoplásicas similares a las mostradas por los supresores de tumores previamente identificados sema3F y sema3B. También se halló que todas estas semaforinas pueden repeler las células endoteliales con diferente potencia y que todas ellas son capaces de reducir significativamente la densidad de los vasos sanguíneos de los tumores que se desarrollan a partir de las células tumorales que expresan estas semaforinas. La sema3E era una excepción, ya que incluso aunque funcionara como un potente agente repelente para las células endoteliales in vitro, no tenía ningún efecto sobre la densidad de los vasos sanguíneos de los tumores que se desarrollaron a partir de las células MDA-MB-231, y sólo un pequeño efecto sobre la densidad de los vasos sanguíneos de los tumores que se desarrollan a partir de las células MDA-MB-435. Además, se observó que cada una de las semaforinas tenía una fuerte correlación entre la capacidad de inhibir el crecimiento tumoral in vivo y la capacidad de inhibir el crecimiento independiente de anclaje in vitro. Estas observaciones condujeron a la conclusión de que las semaforinas permiten la inhibición eficaz del desarrollo tumoral cuando una semaforina concreta es capaz de inhibir directamente las propiedades malignas de las células tumorales y cuando esta semaforina también es capaz de inhibir con eficacia la angiogénesis tumoral. Los presentes resultados sostienen que las semaforinas se pueden usar como agentes antiangiogénicos generales. Sin embargo, para la máxima eficacia como agentes antineoplásicos, la selección de las semaforinas, o de las combinaciones de semaforinas, concretas tendrá que tener en cuenta la identidad de los receptores de semaforinas que se expresan en las células tumorales de los tumores deseados.

LISTA DE SECUENCIAS

<110> Rappaport Family Institute for Research in the Medical Sciences Neufeld, Gera Kigel, Boaz Kessler, Ofra Varshavsky, Asya

5 <120> COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN SEMAFORINAS PARA EL TRATAMIENTO DE LASENFERMEDADES RELACIONADAS CON LA ANGIOGÉNESIS Y LOS MÉTODOS DE SELECCIÓN DE LAS MISMAS

<130> 44039 10

<150> US 60/960,910

<151> 2007-10-19

<160> 40 15

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20 20 <212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario 25

<400> 1

<210> 2 30 <211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220> 35 <223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

40 <210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

45 <220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<400> 4

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

10 <210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

15 <220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

25 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<210> 8

<211> 20 35 <212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario 40

<400> 8

<210> 9 45 <211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220> 50 <223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

55 <210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

60 <220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<210> 12

<211> 17 15 <212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario 20

<400> 12

<210> 13 25 <211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220> 30 <223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

35 <210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

40 <220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<400> 15

<210> 16

<211> 17

<212> DNA 60 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> Oligonucleótido de DNA monocatenario

<400> 16

<210> 17

<211> 644

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 17

<210> 18

<211> 909

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 18

<210> 19

<211> 1873

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 19

<210> 20

<211> 1894

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 20

<210> 21

<211> 1871

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 21

<210> 22

<211> 1894

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 22

<210> 23

<211> 492

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 23

<210> 24

<211> 522

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 24

<210> 25

<211> 1925

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 25

<210> 26

<211> 771

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 26

<210> 27

<211> 748

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 27

<210> 28

<211> 751

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 28

<210> 29

<211> 777

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 29

<210> 30

<211> 775

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 30

<210> 31

<211> 785

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 31

<210> 32

<211> 782

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 32

<210> 33

<211> 2334

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 33

<210> 34

<211> 2328

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<210> 35

<211> 2349

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<210> 36

<211> 777

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 36

<210> 37

<211> 775

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 37

<210> 38

<211> 782

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 38

<210> 39

<211> 4 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Secuencia de reconocimiento de pro-proteína convertasa 10

<400> 39

<210> 40 15 <211> 4

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> Secuencia de reconocimiento de pro-proteína convertasa mutada

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Procedimiento ex vivo para la selección de una semaforina seleccionada del grupo que consiste en Sema3D, Sema3E y Sema3G, para el tratamiento del cáncer en un sujeto, en donde el método comprende la determinación de la expresión de un receptor de semaforinas en las células tumorales de una muestra de tumor de dicho sujeto, en donde una cantidad de dicho receptor de semaforinas indica qué semaforina es idónea para el tratamiento del cáncer del sujeto.

2. 2.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cuando dicho receptor de semaforinas comprende NP1, dicha semaforina comprende Sema3D.

3. 3.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cuando dicho receptor de semaforinas comprende NP2, dicha semaforina comprende Sema3G.

4. 4.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde cuando dicho receptor de semaforinas comprende PlexD1, dicha semaforina comprende Sema3E.

5. 5.

   Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha determinación se lleva a cabo con un anticuerpo.

6. 6.

   Semaforina seleccionada del grupo que consiste en la Sema3D resistente a las proproteína convertasas, la Sema3E resistente a las proproteína convertasas y la Sema3G resistente a las proproteína convertasas, para ser usada en el tratamiento de una enfermedad asociada a la angiogénesis seleccionada del grupo que consiste en cáncer, artritis, artrosis, placas ateroescleróticas, neovascularización de injerto de córnea, cicatrices hipertróficas o queloides, retinopatía proliferativa, retinopatía diabética, degeneración macular, granulación, glaucoma neovascular y uveítis.

7. 7.

   Composición farmacéutica, que comprende como un ingrediente activo una semaforina resistente a las proproteína convertasas, que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 36, SEQ ID n.º 37 y SEQ ID n.º 38, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. 8.

   Semaforina para ser usada de acuerdo con la reivindicación 6, en donde las semaforinas tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID n.º 36, SEQ ID n.º 37 y SEQ ID n.º 38.