JP5086254B2 - Sp1ポリペプチド、変性sp1ポリペプチドおよびそれらの使用 - Google Patents
Sp1ポリペプチド、変性sp1ポリペプチドおよびそれらの使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5086254B2 JP5086254B2 JP2008520063A JP2008520063A JP5086254B2 JP 5086254 B2 JP5086254 B2 JP 5086254B2 JP 2008520063 A JP2008520063 A JP 2008520063A JP 2008520063 A JP2008520063 A JP 2008520063A JP 5086254 B2 JP5086254 B2 JP 5086254B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- complex
- dox
- polypeptide
- cys2
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
- A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Zoology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Composite Materials (AREA)
- Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
過酷な条件に対する並外れた抵抗性を有するストレス誘導されるシャペロン様タンパク質の特異なファミリーが近年、広範囲の多様な植物種において同定されている。アスペンのSP1タンパク質(配列番号1)によって例示されるが、このファミリーのタンパク質は、煮沸、変性剤およびプロテアーゼに対する抵抗性、保存されたアミノ酸配列相同性の領域、特異な三次元立体配座、オリゴマー形成、ならびに、生物学的に活性なタンパク質に対する強い安定化作用によって特徴付けられる。
アスペン植物(Populus tremula)から単離されたSP1は、塩分ストレス、低温ストレスおよび熱ストレスをはじめとする広範囲の様々な環境ストレスに応答し、また、ストレス回復時に蓄積する。有意な配列類似性が、既知のタンパク質ファミリーに関して何ら見出されておらず、また、様々なSP1ホモログが、ゲノム配列またはESTのいずれかに由来する、機能が未知の仮想タンパク質として、数多くの植物種および細菌種において認められている。
疾患を治療するために用いられる多くの薬物は、水溶液における溶解性が不十分であるか、または、治療的濃度において有害な副作用を有するかのいずれかである。従って、多くの医学的適用は、薬物の効果的な濃度を、治療を必要とする生物(例えば、哺乳動物)において標的細胞または標的組織に効率的に送達するための好適な方法がないことを欠点として有する。
不十分な溶解性、これによって、疎水性の薬物が水性媒体では沈殿し得るので、好都合な薬学的形式を達成することにおける困難を引き起こす。しかしながら、可溶化のための賦形剤(例えば、Cremphor(タキソールにおけるパクリタキセルのための溶解剤)など)の使用にはまた、毒性が伴う。
本発明は、添付図面を参照して、本明細書において例としてのみ記載されている。ここでこれらの図面を特に参照することによって、示されている詳細は、例としてのものであり、本発明の好ましい実施形態の例証的考察のみを目的としており、本発明の原理および概念的側面の最も有用かつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示されている。この点に関して、本発明の基本的理解に必要なもの以上に詳細に本発明の構造的詳細を示す試みはなされず、これらの図面を用いて行なわれる説明は、この発明のいくつかの形態がどのようにして実際に具体化されうるかを当業者に明らかにする。
図2a〜図2bは、NTA−Ni金ナノ粒子が中心の空洞において6Hタグに結合することを示す組換えSP1:6HSP1の電子顕微鏡写真である。図2aは透過電子顕微鏡写真(TEM)である。タンパク質−ナノゴールド−タンパク質−ナノゴールド...の交互配列に留意すること。図2bはナノゴールド−6HS−SP1コンジュゲートのグラフィック表示である。
図3は、2つのSP1変異体がヘテロオリゴマーのSP1複合体に自己集合することを示すSDS−PAGEである。組換えHISタグ化SP1(6H)およびN末端欠失SP1(ΔN)のモノマーが同時に電気溶出され(6HΔN)、Ni−NTAアガロースで精製され、プロテイナーゼK(PK)消化に供された。タンパク質サンプルをSDSサンプル緩衝液においてSDS対サンプルの過剰な割合で調製し、このとき、5分間の煮沸(b)または煮沸非処理(nb)のいずれかに供した。レーン1=WT:野生型SP1。煮沸されたモノマー状のゲル精製形態の6HSP1(レーン2)およびΔNSP1(レーン3)をクーマシーブルー染色によって可視化し、切り出し、1:1の比率(v/v)で混合した(レーン4およびレーン5)。タンパク質を、以前に記載されたように、電気溶出によって同時に溶出させた(Wang(2002))。ヘテロオリゴマー複合体をNi−NTAアガロースビーズで単離した(レーン6およびレーン7)。モノマーSP1を消化するが、SP1複合体を消化しないプロテイナーゼKを、6HSP1およびΔNSP1のモノマー形態をNi−NTA精製タンパク質から除くために用いた(レーン8およびレーン9)。ヘテロオリゴマーSP1の組成をSDS−PAGEによって求め、銀染色によって可視化した。
図4は、腫瘍特異的ペプチドのCRGDおよびRGDCのSP1表面での多重呈示を示す。これらのペプチドをSP1のN末端に挿入した。CRGD変異体(レーン1〜レーン3)およびRGD−C変異体(レーン5〜レーン7)はともに高分子量の複合体を形成することに留意すること(レーン3およびレーン7)。タンパク質が還元剤の存在下でサンプル適用緩衝液において煮沸されるとき、複合体はより低分子量の化学種(モノマーおよびダイマーなど)に解離する。還元剤が存在しない場合(レーン1およびレーン5)、および、(還元剤が存在しない)酸化状態下での煮沸では、より大きいレベルのダイマーが認められる(レーン2)。レーン4=分子量マーカー。
図5aおよび図5bは、組換え変異体SP1の発現、精製およびリフォールディングを示すPAGE分析の写真である。Cys2loop1RGd SP1変異体は発現時に可溶性タンパク質を形成せず(封入体(IB)に見出され)、フレンチプレスによって抽出され、遠心分離(20分、17000xg)によって沈降した。可溶性SP1を含有しない上清(図5a、レーン1)を集め、SP1のIBを含有するペレット(図5a、レーン2)を薄い尿素で洗浄し、5Mの尿素および10mMのDTTにおいて可溶化し、遠心分離した(30分、20000xg)。ペレット(図5a、レーン3)を捨て、上清を集め、2mMのDTTを含む緩衝液に対して4日間にわたって透析した(図5a、レーン4)。透析された変異体SP1を低温で3週間保存し(図5b、レーン1およびレーン2)、SP1モノマー、ならびに、非特異的なタンパク質を30分間の熱処理によって除き、プロテアーゼ(アルカラーゼ、10000の希釈度)によって消化し(図5b)、透析した(図5b、レーン4)。MW=分子量マーカー(上方バンド=SP1複合体、下方バンド=SP1モノマー)。複合体化していないより低分子量の形態(図5a、レーン2およびレーン4;図5b、レーン1およびレーン2)から、より高分子量のオリゴマー形態(図5b、レーン3およびレーン4)への変化に留意すること。
図6a〜図6cは、イオン交換クロマトグラフィー(図6a)および疎水性相互作用クロマトグラフィー(図6b)の両方を使用する、組換え細胞の粗製の耐熱性抽出物の組換えSP1の精製を示す。図6cは、Source−Q疎水性相互作用カラムでの分離の精製された生成物と比較したときの、粗製の組換え細胞抽出物(レーン1)および耐熱性画分(レーン2)のPAGE分析である。
図7は、ゲルろ過HPLC(TSK300カラム)(上段)および逆相HPLC(C−18カラム)(下段)の両方で単一ピークとして溶出する純粋なSP1の特徴付けを示す。
図8a〜図8cは、Cys2 SP1変異体による薬物複合体形成および制御された放出の仮想的なモデルを例示するグラフィック表示である。図8aは、遊離チオールと、ジスルフィド結合との間での動的平衡に依存する、Cys2変異体の中心の空洞のレドックス依存的な開放および閉鎖についてのモデルを示す(還元剤は平衡を遊離チオールの方向に変化させ、酸化剤は平衡をジスルフィド結合の方向に変化させる)。図8aは、Cys2 SP1モノマーが還元状態(LSB+2%b−メルカプトエタノールにおける10分間の煮沸)のもとで優勢であること(レーン1)、および、Cys SP1ダイマーが非還元性の条件のもとで優勢であること(レーン2)を例示するSDS−PAGEである。図8cは、Cys2 SP1変異体によるレドックス依存的な薬物複合体形成を例示するグラフィック表示である。
図9は、Cys2 SP1による小分子とのレドックス依存的な複合体形成を示すヒストグラムである。純粋なCys2変異体(リン酸塩緩衝化生理的食塩水(pH=7.5)(PBS)において1.5mg/ml)を、グルタチオン(還元型形態、GSH、3mM)の存在下または非存在下、1mMのフルオレセイン−アミンと室温で2時間インキュベーションした。結合反応を、過酸化水素(0.01%)を加えることによって停止させ、続いて、限外ろ過(30kDのカットオフフィルターを使用する)および徹底的な洗浄を行った。吸収分析を278nmおよび492nmの両方で行い、結果が492/278の比率として表された。還元剤(GSH)が存在しない場合、フルオレセイン−アミンの保持が無視できるほどであることに留意すること。
図10は、組換えSP1と比較したときの、Cys2 SP1によるレドックス依存的なフルオレセインアミン複合体形成のグラフィック表示である。フルオレセイン−アミンを、DTT(10mM)の非存在下または存在下、純粋なSP1またはCys2 SP1変異体(PBS(pH=7.5)において1.5mg/ml)とインキュベーションした。結合反応を、過酸化水素(0.01%)を加えることによって停止させ、続いて、限外ろ過(30kDのカットオフフィルターを使用する)および徹底的な洗浄を行った。サンプルをゲルろ過HPLCによって分析し、228nmおよび490nmの両方で検出した。計算されたデータが右側に示される。Cys2 SP1変異体による還元状態(10mM DTT)下でのフルオレセイン−アミンの優れた保持に留意すること。
図11は、Cys2 SP1によるフルオレセイン−アミンとの濃度依存的な複合体形成を例示するヒストグラムである。フルオレセイン−アミン(10mM、33mM、100mMまたは333mM)を、10mMのDTTの存在下、Cys2 SP1または純粋な野生型SP1とインキュベーションし、結合画分および非結合画分を図10でのように限外ろ過およびHPLCによって分析した。高濃度のCys2 SP1のCys2 SP1による優れた結合に留意すること。
図12は、Cys2 SP1によるドキソルビシンとの優れたレドックス依存的な複合体形成を示すヒストグラムである。純粋な野生型SP1またはCys2 SP1変異体(20mMリン酸ナトリウム緩衝化(pH=6.8)における1.5mg/ml)を、穏やかに回転しながら、DTT(10mM)の存在下、DOX(1mg/ml)と室温で一晩インキュベーションした。結合反応を、過酸化水素(0.01%)を加えることによって停止させ、続いて、限外ろ過(30kDのカットオフフィルターを使用する)および徹底的な洗浄を、流出が無色になるまで行った。光学密度を、nanodrop分光光度計を使用して278nmおよび477nmの両方で測定した。野生型SP1に対する効果がないことと比較して、Cys2 SP1による薬物結合に対する還元剤の劇的な効果には留意すること。
図13は、Cys2 SP1によるドキソルビシンのドックス依存的な放出を示すヒストグラムである。ドキソルビシン(DOX)を上記の図9〜図12に記載されるようにCys2 SP1内に複合体化した。0mM、2mMおよび20mMのGSHの存在下での薬物の放出を限外ろ過およびサイズ排除HPLC分析(228nmおよび475nmでの検出)によって測定した。
図14は、Cys2 SP1によるDOX複合体形成に対する酸化の影響を例示するヒストグラムである。ドキソルビシン(DOX)を上記の図9〜図13に記載されるようにCys2 SP1および野生型SP1と反応させた。酸化されたタンパク質は、GSHによる処理に先立って、過剰なH2O2への暴露を示す。DOX複合体形成を限外ろ過およびサイズ排除HPLC分析(228nmおよび475nmでの検出)によって測定した。右側パネルは、477nmで測定されるRP−HPLCでの結合DOXおよび遊離DOXの検出を示す。1=保持物;2=流出;および3=DOX標準物(20μg/ml)。
図15は、SP1−DOX複合体を特徴付けるSDS PAGE蛍光分析の写真である。DOXを標準的な条件(図11を参照のこと)のもとでCys2 SP1変異体と複合体化し、SDS−PAGEによって分離し、固定し、洗浄し、DOXを、緑色フィルターを使用して、473nmでの蛍光画像化装置(FUJIFILM FLA−500、FUJI、日本)による走査によって可視化した。クーマシー染色を、サンプルのタンパク質含有量を比較するために使用した。DOXが、極端な条件(SDS−PAGEゲル)のもとでさえ、Cys2 SP1変異体のすべての形態(複合体、ダイマーおよびモノマー)との堅固な複合体を形成し続けたことに留意すること。
図16は、熱、還元および血清にさらされたときのDOX−SP1複合体の安定性を例示する蛍光PAGE分析の写真である。SP1およびDOXを上記の図9〜図14に記載されるように反応させて、複合体を形成させた。サンプルは、熱処理(80℃で30分)(レーン1〜レーン4)、プロテアーゼ処理(1:1000で希釈されたアルカラーゼ、45℃で30分間)(レーン1〜レーン3およびレーン5)のいずれかを、希釈されたマウス血清(1:10)(レーン1およびレーン2)の存在下または非存在下で受けた。SDS−PAGE分析のために、すべてのサンプルを、2%β−メルカプトエタノールを含む緩衝液(LSB)において10分間煮沸した。変性条件およびタンパク質分解条件に対するSP1−DOX複合体の優れた抵抗性に留意すること。
図17は、Cys2タンパク質およびSP1融合タンパク質によるDOXとの効果的な複合体形成を例示する蛍光PAGE分析の写真である。組換え野生型(レーン1およびレーン2)、Cys2(レーン3およびレーン4)、および、N末端のさらなる腫瘍特異的ペプチドRGD(CRGD)を有するSP1融合タンパク質(レーン5およびレーン6)、または、逆順序でのRGD(RGDC)を有するSP1融合タンパク質(レーン7およびレーン8)を、上記の図9〜図14に記載されるようにDOXと反応させて、複合体を形成させ、その後、LSBにおける煮沸による変性を伴って(レーン2、レーン4、レーン6およびレーン8)、または、伴うことなく(レーン1、レーン3、レーン5およびレーン7)、SDS−PAGEで分離した。高分子量の複合体における強い蛍光に留意すること(非煮沸サンプル、レーン1、レーン3、レーン5およびレーン7)。これは、すべての変異体SP1による薬物の効果的な結合、および、はるかにより低い程度ではあるが、野生型による薬物の効果的な結合を示している。
図18は、有機溶媒に対するSP1の高分子量オリゴマー複合体の抵抗性を示す写真である。野生型SP1(レーン1〜レーン3)またはCys2 SP1(レーン4〜レーン6)(10mMリン酸ナトリウム(pH7)における1mg/ml)を凍結乾燥し、緩衝液(レーン1およびレーン4)または溶媒(10分のインキュベーション時間)(レーン2およびレーン5=メタノール;レーン3およびレーン6=ヘキサン)に再懸濁した。サンプルを水に再懸濁し、高分子量オリゴマー複合体の存在についてSDS−PAGEによって分析した。オリゴマー複合体がすべての条件のもとで持続すること、および、Cys2 SP1変異体が野生型よりも一層大きい抵抗性を有することに留意すること。
図19は、SP1との複合体によるパクリタキセル(PTX)の可溶化を示すHPLC分析である。精製された組換えの凍結乾燥された野生型SP1をパクリタキセル溶液(0.1ml、アセトン:ヘキサン(1:2)に溶解、0.25mg/ml)と混合し、20分間にわたって超音波処理し、溶媒をスピードバキュームによってエバポレーションした。水に溶解し、さらなる超音波処理およびボルテックス混合を行った後、50μlのサンプルをRP HPLCによって分析した。上段パネルはHPLCピーク(225nm)を示す(SP1=黒色;SP1−PTX=赤色;PTX=青色;PTX/H2O=マゼンタ色)。下段パネルは、複合体化されたSP1−PTXの(30kDでの)限外ろ過の結果を示す。高い割合のPTXがSP1−PTX複合体によって溶液中に保持されることに留意すること。
図20は、SP1−PTX複合体からのPTXの効率的なエタノール抽出を示すHPLC分析である。上記の図19でのように調製されたSP1−PTX複合体を沈殿させ(赤色線)、その後、80%エタノールにより抽出し(黄色線)(−20℃で2時間)、その後、HPLCで分析した(下段パネル)(青色=処理されていない複合体)。タンパク質沈殿によるPTXの欠損、および、抽出されたサンプルにおけるPTXの出現に留意すること。
図21は、PTX抽出に対する還元状態の影響を示すHPLC分析である。上記の図19でのように調製されたSP1−PTX複合体を、10mM GSHの存在下(中塗り四角−マゼンタ色)または非存在下(中塗り三角、青色)、(タンパク質沈殿を引き起こさない条件のもとで)0%〜60%のエタノールにより抽出し、その後、HPLCで分析した。酸化された複合体によるPTXの優れた保持に留意すること。
図22は、SP1によるPTX結合に対する還元状態の影響を示すHPLC分析である。SP1−PTX複合体を還元状態(b−メルカプトエタノール、mM)の非存在下または存在下で図19でのように調製し、上記で記載されたように限外ろ過(無菌の0.22μmフィルター)およびHPLCによって分離した。還元状態下で形成された複合体の優れた水溶性に留意すること。
図23は、SP1に対する薬物(ビンブラスチン)の複合体形成を示すグラフである。左側パネル−純粋なSP1(MESにおける48μM)の放射スペクトル(励起波長=286.00nm)を、蛍光計を使用して求めた。未変性SP1(左側の曲線)およびアンフォールディング(6MグアニジニウムHCl)による変性SP1(右側の曲線)の両方を調べた。未変性タンパク質のトリプトファンの蛍光に対するビンブラスチンの正味の影響を、変性タンパク質による相対的な消光をそれぞれの最大放射波長(それぞれ、340nmおよび321nm)において未変性タンパク質の相対的な消光から引くことによって計算した。折り畳まれたSP1タンパク質およびアンフォールディングによる変性SP1タンパク質の両方のトリプトファンの蛍光がビンブラスチンの複合体化によって消光され、しかし、折り畳まれたタンパク質の場合、赤方移動もまた伴うことに留意すること。
図24aおよび図24bは、SP1−DOX複合体のインビボトロ細胞毒性効果を例示するグラフである。図24a−96ウエルマイクロタイタープレートで培養されたHT−29細胞を、非複合体化DOX(中塗り長円、マゼンタ色)、または、図9〜図15に記載されるように調製されたSP1−DOX複合体(中塗り三角、青色)に、示された濃度でさらした。図24b−HT−29細胞を、非複合体化SP1(DOX非含有)(中塗りひし形、青色)またはSP1−DOX複合体(中塗り三角、黄色)に、示された濃度でさらした。生細胞の割合をMITアッセイによって求め、IC50を計算した。非複合体化SP−1には細胞毒性がないこと(図24b)、ならびに、遊離DOXおよびSP1複合体化DOCについてのIC50値が同等であることに留意すること。
図25a〜図25bは、遊離PTXと比較して、SP1−PTX複合体のインビトロ細胞毒性を示すグラフである。SP1−PTX複合体を上記の図19〜図22に従って調製した。HT−29細胞を上記の図24でのように調製した。図25aは、SP1−PTXおよび遊離PTX(DMSO中)にさらされたHT−29細胞のIC50を示す。細胞を、遊離PTX(中塗り円、緑色)またはSP1−PTX複合体(中塗り三角、赤色)に、示された濃度でさらした。図25bは、示された濃度で非複合体化SP1(中塗り三角、青色)またはSP1−PTX複合体(中塗り三角、赤色)にさらされたHT−29細胞のIC50を示す。非複合体化SP−1には細胞毒性がないこと、ならびに、遊離PTXおよびSP1−PTX複合体の両方についてのIC50値が類似することに留意すること。
図26は、SP1複合体の優れた薬力学および標的化を例示する免疫ブロット分析である。B16−F10(B16)メラノーマ腫瘍細胞を有するC57B1のオスのマウスを3つの群に分けた:A群−1回の注射(フルオレセインアミン−SP1コンジュゲート(10mg/ml、0.1ml/マウス)によるiv)、n=5匹のマウス;B群−非コンジュゲート化フルオレセインアミンの溶液(PBSにおける34mM、0.1ml/動物)による1回の注射、n=5匹のマウス;および、C群は処置を受けなかった(n=2匹のマウス)。内臓器官を注射後24時間で集め、−70℃で保存した。血液を集め、室温で放置して凝固させた。腫瘍抽出物および血清サンプルをSDS PAGEで分析し、タンパク質をニトロセルロースにブロッティングした。SP1の免疫検出を、ウサギ抗SP1抗体およびHRPコンジュゲート化二次抗体を用いて行った。SP1が注射後24時間で腫瘍および血清の両方に多量に存在することに留意すること。
図27aおよび図27bは、非複合体化DOXと比較して、SP1複合体化DOXの優れた抗腫瘍効果を示すヒストグラムである。ヒトLS147T結腸ガン(動物一匹あたり100万個の細胞)の皮下異種移植された腫瘍を有するCD1ヌードマウスを2つの群に分け(n=6)、これらに、SP1−Dox(PBSにおいて50mg/kg、約0.5mg/KgのDOX相当量)またはPBS(図27a)、あるいは、非複合体化DOX(3mg/Kg)またはPBS(図27b)のいずれかを単独で、尾静脈内への静脈内注射により、1週間に2回、4週間にわたって与えた。腫瘍を移植後35日で取り出し、重量測定した。遊離DOXと比較したとき、複合体化されたSP1−DOXの著しくより大きい抗腫瘍有効性に留意すること。
図28aおよび図28bは、遊離DOXと比較して、SP1複合体化DOXの処置による副作用の著しい減少を示すヒストグラムである。s.c.異種移植されたヒトLS147T結腸ガン腫瘍を有するCD1ヌードマウスを、本明細書中上記の図27aおよび図27bに記載されるように静脈内SP1複合体化DOC(図28a)または遊離非複合体化DOC(図28b)により処置した。PBSをコントロールに注射した。動物を屠殺前に重量測定した(腫瘍注入後35日)。SP1複合体化DOXを受けたマウスにおける無視できるほどの体重減少と比較して、複合体化されていない遊離DOXによる重度の体重減少に留意すること。
図29は、サイズ排除HPLC分析によるSP1−DOX複合体の検出を示すグラフである。SP1−DOX複合体が278nm(SP1について特徴的)および475nm(DOXについて特徴的)の両方で検出可能である。
図30は、278nmにおけるサイズ排除クロマトグラフィー(サイズ排除HPLC)での典型的なSP1標準曲線を示す。SP1がカラム(TSK G3000SWXL、Tosohaas)から7分後に溶出され、278nmにおいて検出されるだけである。挿入図は、SP1が所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
図31は、490nmでのFA標準物プロフィルのサイズ排除クロマトグラフィー(サイズ排除HPLC)のクロマトグラムを示す。区別可能なピークでカラムから溶出される遊離FAとは対照的に、DOXは区別可能なピークで溶出されない(図29)。挿入図は、FAが所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
図32は、RP−HPLCでの(278nm(左側パネル)および225nm(右側パネル)の両方で求められる)Cys2 SP1の標準物プロフィルを示す。挿入図は、Cys2 SP1が所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
図33は、RP−HPLCでの(477nmで求められる)DOXの標準物プロフィルを示す。挿入図は、DOXが所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
図34は、RP−HPLCでの(225nmで求められる)PTXの標準物プロフィルを示す。挿入図は、PTXが所定の濃度範囲にわたって定量的に検出されることを示す。
本発明の変性SP1ポリペプチドとともに使用される好適な腫瘍血管ペプチドには、下記のペプチドが含まれるが、それらに限定されない:
1.変異についての標準名称法(最初のメチオニン残基を含む野生型配列を使用するアミノ酸位置)
2.2位でのCys残基の挿入および19位でのグリシン残基の挿入 K18R(Cys2loop1RGd)
3.サンプルを適用緩衝液において煮沸しない場合の、SDSPAGEによる試験。いくつかのSP1変異体は発現時に可溶性タンパク質を形成することができず、封入体(IB)を形成する。このようなIBは0.5M尿素によりアンフォールドされ、透析によってリフォールドされた。
4.SP1モノマーならびにほとんどの他のタンパク質が分解する条件であるプロテイナーゼK処理(50ug/ml;30分;℃)またはアルカラーゼ処理(1/1000の希釈度、60分;45℃)のいずれかの後におけるSDS PAGEによる試験。
5.2MのGHClでのインキュベーション(室温で1時間)の後での複合体安定性がSDS PAGEによって試験された。
6.熱安定性タンパク質は、100℃での10分間のインキュベーションまたは85℃での30分のインキュベーションの熱処理後で沈殿しないタンパク質として定義される。
7.タンパク質の融点がDSCによって調べられた。
8.サンプルがb−メルカプトエタノールの非存在下または存在下で適用緩衝液において10分間煮沸される際の、ダイマー形成がSDS PAGEによって試験される。
9.封入体(IB)のリフォールディングは調べられなかった。
10.複合体をIBのリフォールディングの後で形成する。複合体の集合が、プロテイナーゼ消化を使用してモノマー形態を除くことによって確認された。
組換えSP1の発現
567bpのcDNAクローンを、抗SP1抗体を使用して、水ストレスを与えたアスペンシュートに由来するラムダ発現ライブラリーからの7x105個の組換えファージプラークをスクリーニングすることによって単離した(Wang他、米国特許出願第10/233409号)。大腸菌株BL21(DE3)を、sp1遺伝子を有するプラスミド(pET29a、カナマイシン耐性が付与される)により形質転換した(Wang他、Plant Phys、2002、130:865〜75)。野生型SP1ならびにその変異体を大腸菌において作製および発現させた:さらなるタグを何ら有しない全長SP1(これはSP1(配列番号1)と呼ばれる);6個のヒスチジンのタグをSP1のN末端に導入して、6HSP1(配列番号7)を作製し、システイン残基をSP1の21位に導入して、Cys2 SP1(配列番号3)を作製し、ΔNSP1(配列番号2)をSP1のN末端におけるアミノ酸2〜6の欠失によって作製した。これらの組換えSP1タンパク質の発現は、Wang他(Acta Crys、2003、D59:512〜14)に記載されるように、標準的な組換え手法に従った。
組換えSP1を、Wang他(2003)に記載されるように、大腸菌から製造した。6HSP1を、溶出緩衝液が400mMのイミダゾールを含有したということを除いて、供給者のプロトコルに従ってNi−NTAアガロースビーズ(P−6611、Sigma Chemicals、St.Louis、MI)でさらに精製した。ΔNSP1の煮沸安定性の画分を、アニオン交換カラムSOURCE−15Q(Amersham Biosciences、英国)への準備として、15mM〜20mMのピペラジン(pH5.9)の20体積に対して透析した(2回)。移動相における緩衝液Aは20mMピペラジン(pH5.1)であり、1MのNaClを含む同じ緩衝液を緩衝液Bとして使用した。ΔNSP1を23%〜25%の緩衝液Bによって溶出した。1Mの最終濃度での硫酸アンモニウム、および、7.5のpHへのNaOHを、精製されたΔNSP1に加え、その後、1M硫酸アンモニウムを含有する50mMリン酸塩緩衝液(pH7.5)により予備洗浄されたHiTrapフェニルセファロースHPカラム(Amersham Biosciences、英国)に負荷した。ΔNSP1を47%〜48%の50mMリン酸塩(pH7.5)(緩衝液B)において溶出した。その後、ΔNSP1を、25mMリン酸塩(pH7.5)を使用して30kDaカットオフの限外ろ過濃縮装置によって濃縮および透析ろ過した。
平衡沈降研究を、Beckman Optima(登録商標)XL−1分析超遠心分離機(Beckman Instruments,INC.)を使用して行った。アスペンSP1を200倍の20mM Tris−HCl(pH8.0)で一晩透析した。その後、サンプルを透析液により希釈して、約202μM、152μM、68μM、22.5μMおよび6.5μMのタンパク質溶液を作製した。サンプルを6セクターセルにおいて、6000rpmおよび7000rpmのローター速度で20℃において遠心分離した。データを、280nm、220nmおよび254nmで集め、下記の式を使用して分析した:M=[2RT/(1−ν)ρω2][d(ln(c))/dr2)]、ただし、典型的なν=0.73cm3g−1およびρ=0.9994gcm−1。
SP1(0.05mg/ml)を、グロー放電処理された、カーボンおよびニトロセルロースにより被覆された銅の400メッシュのグリッドに塗布し、2%酢酸ウラニルにより染色した。画像をFEI Tecnai−12顕微鏡により得て、Kodak S0163フィルムまたはMegaviewIIIデジタルカメラ(Soft Imaging Systems、Munster、ドイツ)で記録した。顕微鏡写真をImacon FlextightIIスキャナーによりデジタル化した。上面の野生型SP1粒子を平均化するための画像処理をSPIDERプログラム群(Frank他、1996)により行い、この画像処理は、最初の無参照アラインメント(並進および回転)、その後、参照に基づいた3回のアラインメントからなっていた。SP1の低温陰染色画像を4μlのSP1(1mg/ml)をレース状グリッド(SPI Supplies、West Chester、PA)に置き、16%モリブデン酸アンモニウムを加え(Adrian他、1998)、液体エタンに沈めることによって調製した。低用量の低温条件のもとでの画像化を、FEI Tecnai F20顕微鏡で行い、TVIPS(Gauting、ドイツ)1kX1k Biocamカメラで記録した。
SP1(1mg/ml)を50mMトリエタノールアミン緩衝液(pH7.5)における0.25%グルタルアルデヒド(GA)と室温でインキュベーションした(72時間)。非架橋SP1生成物および架橋SP1生成物を質量分析法による分析に供した。マトリックス支援レーザー脱離飛行時間型質量分析(MALDI−TOF−MS)をMicromass TofSpec 2Eリフレクトロン質量分析計(The Protein Research Center、Technion、Haifa、イスラエル)で行った。
SP1(20μg)を種々のSP1モノマー:SDSモル比でSDSサンプル緩衝液において調製し、煮沸し(5分間)(または、煮沸することなく)、その後、SDS−PAGE分析に供した。SP1オリゴマー(10μg)の熱安定性をSP1モノマー:SDS=1:1733で同じ緩衝液において調べ、異なる温度で1分間〜10分間加熱した。
V8プロテアーゼ緩衝液(125mM Tris−HCl(pH6.8)、10%グリセロール、0.5%SDS)または標準的緩衝液(20mM Tris−HCl(pH7.5)、1mM EDTA、50mM NaCl)のいずれかにおいて調製されたSP1(10μg)を2分間煮沸し、または、煮沸することなく、その後、プロテアーゼ(黄色ブドウ球菌V8プロテアーゼ、トリプシン、プロテイナーゼK、Sigma Chemicals Inc.、イスラエル)を加えた。プロテアーゼを50μg/mlの最終濃度に加えた(SP1:プロテアーゼは1:20(w/w)に等しい)。消化を37℃で1時間行った。その後、サンプルをSDSサンプル緩衝液において調製し、煮沸し、または、煮沸することなく、その後、17%トリシン−SDS−PAGEに供した。
植物の総可溶性タンパク質または濃縮された煮沸可溶性の総タンパク質を50μg/mlのプロテイナーゼKとインキュベーションした(37℃、1時間)。類似した手順を総組換え細菌タンパク質に対して適用した。PKを煮沸(10分間)によって不活性化し、その後、遠心分離した(15000xg、10分間)。SP1を限外ろ過(10kDaカットオフ、VIVASCIENCE、Binbrook Lincoln、英国)によって濃縮した。
Cys2SP1遺伝子を、N末端のアラニンをシステインに部位特異的に変異誘発することによって構築した。野生型およびCys2 SP1(配列番号3)の両方(2mg/ml)を10mM DTTの存在下または非存在下で一晩インキュベーションし、2%SDSサンプル緩衝液と事前に煮沸し、その後、SDS−PAGE分析に供した。
10mMリン酸ナトリウム(pH7)における1mg/mlのサンプルの150ulを一晩凍結乾燥し、150μlの有機溶媒に10分間、再懸濁した。30分のスピードvac処理の後、サンプルを150μlの水に再懸濁し、SDS−PAGEによって分析した。
精製された6HSP1およびΔNSP1を最初に、これらのタンパク質をSDSサンプル緩衝液において煮沸することによってモノマー形態に変性した。その後、変性させたタンパク質を調製用SDS−PAGEで分離し、クーマシーブルー染色によって可視化した。2つの組換えタンパク質バンドのモノマー形態を切り出した。6HSP1(配列番号7)およびΔNSP1(配列番号2)のモノマー形態を有するゲル片を1:1の比率(v/v)で混合した。表面/体積の比率を高めるために、ゲル片を、乳棒および乳鉢を液体窒素の存在下で使用して粉砕した。その後、タンパク質を、以前に記載されたように、電気溶出によって同時溶出した(Wang他、2002)。ヘテロオリゴマー複合体を、溶出されたタンパク質をNi−NTAアガロースビーズに供することによって単離し、結合したタンパク質を、標準的な手順(P6611についてのSigmaプロトコル)を使用して400mMイミダゾールによって溶出した。プロテイナーゼK(これはモノマーSP1を消化するが、SP1複合体は消化しない)(この論文に記載される)を用いて、6HSP1(配列番号7)およびΔNSP1(配列番号2)のモノマー形態をNi−NTA精製タンパク質から除いた。ヘテロオリゴマーSP1の組成をSDS−PAGEによって求め、銀染色によって可視化した。
区別可能な吸収特性を有し、分光学的測定によって測定することができる水溶性リガンドのFAおよびDOXとの複合体形成の検出のために限外ろ過を使用した。遊離FAおよびDOXはSP1よりもはるかに小さい(それぞれ、0.35kDaおよび0.58kDa対150kDa):遊離FAおよびDOXは30kDaの分子量カットオフメンブランを通過する(流出画分)一方で、遊離SP1およびSP1複合体はともにメンブランの上に保持される(保持画分)。数回のさらなる洗浄サイクルにより、残留する遊離FAおよびDOXが除かれ、リガンド−SP1複合体が保持画分に残留する。
サイズ排除クロマトグラフィーは、異なるサイズの分子を穏和な条件のもとで分離するための一般的な方法であり、これを用いて、穏和な条件のもとでのFA複合体形成およびDOX複合体形成を調べた。SP1が7分後にカラムから溶出され、278nmにおいて検出されるだけであり、遊離FAが16分後にカラム(TSK G3000SWXL、Tosohaas)から溶出され、490nmにおいて検出される。SP1−FA複合体およびSP1−DOX複合体もまた、同じ時間で溶出したが、これらはそれぞれ、490nmおよび475nmでも検出される。SP1が7分後にカラムから溶出され、278nmにおいて検出されるだけである。DOX/SP1の比率が、溶液で得られる標準曲線から求められる。
逆相HPLC(RP−HPLC)分析では、遊離DOX、PTXおよびSP1が分離される。両方の化合物が樹脂(C−18)に結合し、異なるアセトニトリル濃度で溶出され、278nmと、225nm(SP1)、225nm(PTX)および477nm(DOX)との両方で検出される。
20mMリン酸Na緩衝液(pH6.7)におけるパイロジェン非含有のCys2 SP1変異体(配列番号3)(最終濃度、2mg/ml)をDOX溶液(Teva、イスラエル)により1:2の希釈で希釈した(最終濃度、1mg/ml)。示された場合、GSHを加えた。溶液を一晩混合する。示された場合(酸化された場合)、H2O2を0.1%に加え、緩衝液を加えて、3倍の体積にし、溶液を超音波処理する(22秒を3回、3%の振幅での1:1のパルス/中断、0.5分の中断、Vibra−Cell 750W超音波処理機を使用する)。
エタノールにより5倍(V:V)に希釈された溶液を−20℃で3時間インキュベーションし、1250Xgで30分間、室温で遠心分離した。ペレット化物を洗浄し、冷エタノールに再懸濁し、再びペレット化し、再懸濁して、HPLCによって分析した。
SP1−DOX溶液を30Kカットオフのミクロコンフィルター(Millipor Ltd.、Billerica、MA)での限外ろ過によって洗浄し、その後、リン酸Na緩衝液(pH6.7)およびPBSにより、流出が無色になるまで洗浄した。
3mgのSP1(25mg/ml、PBSにおける120ul)を6時間、15mlのプラスチックチューブにおいて凍結乾燥した。300ulのPTX(乾燥アセトン/ヘキサン(1:1)+0.1%β−メルカプトエタノールにおける1mg/ml)を加え、アセトン/ヘキサン+0.1%β−メルカプトエタノールを加えて4mlの最終体積にした。混合物を超音波処理した(1秒のパルス、3秒の中断、45”の超音波処理時間、合計で3分、35%の強度、氷上で)。有機溶媒を乾燥によって一晩エバポレーションし、0.4mlのPBSを加え、混合物を超音波処理した(1秒のパルス、3秒の中断、30”のサニテーション時間、合計で2.5分、35%の強度、氷上で)。破片を遠心分離(5分、14000RPM)によってペレット化した。組織培養実験のために、アリコートをろ過した。
ヒト結腸腺ガン(HT−29)細胞。細胞を、10%ウシ胎児血清、1%グルタミンおよび1%Antibiotic−Antimicotic溶液(Biolab、イスラエル)が補充されたDMEM培地(Biological Industries、Bet Haemek)を含有する50mlのフラスコで成長させた。細胞をトリプシン処理し、5x104個の細胞を含有する2mlの培地を6ウエルプレートのそれぞれのウエルに入れた。SP1、薬物、または、薬物と複合体化されたSP1を示された濃度で加えた。細胞を、5%CO2を含有する加湿された大気において37℃でインキュベーションした。48時間後、薬物の存在または非存在の培地を、成分および薬物の絶え間ない供給を維持するために、それぞれのウエルにおいてそれぞれ交換した。4日後、培地を除き、培養における生細胞の数を顕微鏡観察によって求めた。
B16−F10(B16)メラノーマ腫瘍を有するC57B1のオスのマウスを、Kalechman(Int J Cancer、2000、86:281〜8)によって記載されるように調製し、世話をした。B16F10メラノーマ細胞(マウスあたり5x105個または5x106個の細胞)をマウスの側方尾静脈に注入し、ガン腫瘍の存在をマウスの全体的な様子および/または組織病理学検査によってメラノーマ細胞注入後14日目で評価した。マウスを3つの群に分けた:A群−1回の注射(フルオレセインアミン−SP1複合体溶液によるiv)(SP1−FAコンジュゲート、PBSにおける10mg/ml;0.1ml/動物)、N=5匹のマウス。B群には、FAが1週において1回与えられた(N=5匹のマウス)。C群は注射を受けなかった(N=2匹のマウス)。注射後24時間で内臓器官を集め、−70℃で保存した。血液を集め、室温で凝固させ、血清を分離し、凍結した。
ヒトLS147T結腸ガン(動物一匹あたり100万個の細胞)をCD1ヌードマウス(3週齢〜4週齢、18g〜20g)に皮下移植した(Meyer他、1995、Am J Dermatopath、17:368〜73)。8日後、3mm〜10mmの腫瘍が注入点に現れた。この時点で、動物を2つの群に分けた(それぞれにおいて6匹の動物)。平均腫瘍サイズおよび動物の体重は類似していた。
(実施例1:)
SP1タンパク質の構造
天然SP1およびその組換え形態の両方のSDSゲル電気泳動分析では、SP1が2つの形態で出現することが示される:サンプルがSDSの存在下でのゲル適用緩衝液において煮沸されるときに現れるモノマー(12.4kDa)、および、SP1がPAGEでの適用に先だって煮沸されないときに現れるオリゴマー形態(116kDaのタンパク質)(Wang他、2002;Dgany、2004;Wang他、2006;米国特許出願第10/443209号を参照のこと)。いくつかの方法を用いて、溶液中のSP1が、150kDaの分子量を有するドデカマーを形成することが明らかにされている。平衡状態での分析超遠心分離を用いて、SP1のオリゴマー状態を分析した。SP1の濃度がゼロに近づくにつれ、溶液におけるSP1粒子の測定された分子量(5.6μMのモノマー濃度において144kDa)が、ドデカマーについて計算された値(148kDa)に近づいた。
X線結晶学研究(Dgany他(2004)を参照のこと)では、SP1鎖が、3つのα−らせん、すなわち、H1(残基23〜39)、H2a(残基74〜81)およびH2b(残基84〜93)を伴うα型およびβ型の折り畳みと、4つの逆平行のβ鎖、すなわち、B3(残基9〜17)、B1(残基45〜50)、B2(残基65〜71)およびB4(残基97〜108)によって形成されるβ−シートとを有することが示された。N末端セグメントは溶媒の方を向き、また、最初の2つの残基について、説明できる電子密度の欠如及びThr−3およびLys−4についての温度因子の大きさによって立証されるように可動性である。残基51〜64によって形成される長いループは大部分が構造化されていない。このループは分子から突き出ており、ダイマー接触に関与する。H1およびH2のらせんにより、数多くの親水性側鎖および酸性側鎖が溶媒の方を向く外側の凸型表面が規定される。
ダイマー・ダイマーの接触は主に親水性側鎖および荷電基を伴うか、または、水分子によって媒介される。これらの接触は主として、B1、H1およびN末端テールに沿って生じる(Dgany(2004)を参照のこと)。ダイマー間の相互作用の結果として、6個のダイマーにより、環状構造が擬6回軸のまわりに作られる。ドデカマーの環状構造は外径が約50Åであり、内径が約15Åである。それぞれのダイマーにおける残基18〜22を含むループが溶媒の方に突き出ており、これに対して、N末端のアームが環状構造の内側部分に向かって伸びている。隣接するダイマーにおける等価な分子の間での接触は同一ではないので(Dgany、2004)、6回対称性が破れる。
SP1は、煮沸および変性に対して安定性を有するプロテアーゼ抵抗性の分子である
SDSの存在下でのSP1複合体の安定性を、精製されたSP1を種々のモル比でのSDSと種々の温度でインキュベーションすることによって調べた。モノマーへのSP1複合体の解離には、ゲルへの負荷の前に煮沸することが付随して、600:1(SDS:SP1モノマー)を超えるモル比が必要であった。煮沸がない場合、3467対1の比率でさえ、SP1はSDS−PAGEで複合体として持続した。80℃以下の温度での1734倍のSDS(1%)とのSP1のインキュベーションは、複合体の著しい解離を引き起こさなかった(Wang、2006)。
SP1変異体
SP1変異体を、オリゴマー化および/または結合および/または他の分子との複合体化のための能力、ならびに/あるいは、サブユニット間のジスルフィド結合を形成する能力、および/または、中心の空洞の大きさを変化させる能力を高めるために、あるいは、そうでない場合には、SP1の安定性を変化させるために構築することができる。数多くのSP1変異体タンパク質を、SP1の性質に対する特定の変化の影響を調べるために構築した。
種々の変異体SP1モノマーが自己集合して、機能的なオリゴマー複合体を形成することができるかどうかを明らかにするために、変異体の間でのヘテロダイマー形成を調べた。
SP1変異体の結合特性
SP1変異体の結合特性を明らかにするために、また、SP1および変異体が、それらに複合体化された分子を安定化させる能力を調べるために、野生型SP1および変異体SP1を様々な生物学的に活性な薬剤にさらし、得られた複合体を、複合体化された薬剤の活性、安定性および生物学的利用能について調べた。
SP1に対する薬剤の複合体化を変性および制御する能力を明らかにするために、Cys2 SP1変異体は、SP1の2位に挿入されたシステイン残基(野生型SP1はCys残基を全く含有しない)を、中心の空洞に面するN末端に有する(Cys2変異体)。Cys2変異体(これはサンプル適用緩衝液と混合され、2%β−メルカプトエタノールの存在下または非存在下での10分間の煮沸に供された)のSDS PAGE分析では、Cys2 SP1変異体がジスルフィド結合を形成することが示される(図8b)。還元されたCys2 SP1変異体(これは10mMのDTTにより処理された)は、還元剤を除いたとき、容易に酸化される(図8b)。Cys−2 SP1におけるジスルフィド結合の特異性がさらに、Cys−2 SP1が、遊離スルフヒドリルに特異的な試薬(例えば、5,5’−ジチオ−ビス(2−ニトロ安息香酸)(DTNBまたはエルマン試薬)およびフルオレセインマレイミドなど)と反応しないことによって証明される(データ示さず)。
1.野生型と比較した場合の、Cys2 SP1変異体によるリガンド複合体化の効率。
2.タンパク質の還元は、野生型SP1の複合体化ではなく、Cys2 SP1変異体によるリガンド複合体形成を増大させることができるか。
3.Cys2 SP1変異体の酸化は、リガンドを添加する前では、リガンドの複合体化を打ち消すことができるか。
4.Cys2 SP1−リガンド複合体の還元はリガンドの解離を増大させることができるか。
5.複合体化したリガンドをCys2 SP1との会合によって安定化させることができるか。
FAの吸収ピークは、490nm、および、はるかにより低い程度ではあるが、278nmにある(所与のFA濃度について、OD278/OD490=0.19)(図31を参照のこと)。一方、SP1の吸収ピークは278nmにあり(図30を参照のこと)、SP1は490nmでは検出されない。Cys2 SP1は吸収ピークを225nmおよび278nmに有する(図32を参照のこと)。FAがCys2 Sp1変異体と複合体化することが、FAおよびCys2 SP1変異体をGSHの非存在下または存在下でインキュベーションし、続いて、タンパク質の酸化、限外ろ過(30kDaのカットオフ)、および、保持画分のGSH含有PBSまたはGSH非含有PBSによる徹底的な洗浄の後で明らかにされた。278nmおよび490nmの両方での吸収分析(図9)では、GSHによるタンパク質の還元はFAおよびCys2 SP1の複合体化を増大させること、また、FA−Cys2 SP1複合体の還元はFAの解離を増大させることが示される。
小分子とともにSPの化学的変性は、2つのタイプの新しい複合体の作製を可能にする。小分子は、分子的会合のための新しい部位をもたらすことによって、タンパク質との共有結合性の結合、または、非共有結合性の結合をもたらすことができる。
アントラサイクリン系抗生物質のドキソルビシンは最も有用な抗新生物剤の1つであり、血液学的悪性腫瘍だけでなく、いくつかの固形腫瘍に対して活性がある。ドキソルビシンは、様々な新生物状態(例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、軟組織および骨の肉腫、乳ガン、卵巣ガン、移行細胞膀胱ガン、甲状腺ガン、胃ガン、ホジキン病、悪性リンパ腫および気管支原性ガンなど)を治療するために使用される。さらに、ドキソルビシンの多くのコロイド状キャリア(例えば、リポソームおよびポリマーナノ粒子など)が、心臓毒性を軽減すること、および、治療的効力を改善することを目指して研究されている。
臨床使用における1つの共通する問題が、多くの薬物の不良な溶解性である。Dgany他(Dgany、2004)によって示されるように、SP1についてのX線結晶学データから、H1およびH2のらせんが、数多くの親水性側鎖および酸性側鎖が溶媒の方を向く外側の凸側表面を規定することが予測される。この表面の内側および向き合うβ−シートが、芳香族残基および疎水性残基が多い疎水性の中心の空洞を取り囲む。これにより、小さい疎水性分子の可溶化が達成されるかどうかを明らかにするために、SP1をパクリタキセルと複合体化させた。
ビンブラスチンはビンカアルカロイドであり、ホジキン病、リンパ性リンパ腫、組織球性リンパ腫、進行性精巣ガン、進行性乳ガン、カポジ肉腫を治療するために主に有用である。SP1に対するビンブラスチンの結合を内因性トリプトファンの蛍光測定によって求めた。
SP1会合薬物の高まった生物学的活性
薬物送達剤または薬物送達キャリアとしてのSP1の効力を評価するために、SP1およびSP1変異体と複合体化された薬物分子の生物学的活性を求めた。従って、SP1と複合体化された薬物分子およびマーカー分子を新生物成長のインビトロモデルおよび動物モデルにおいて調べた。
ヒト結腸直腸腺ガン細胞株のHT−29を使用して、SP1−DOX複合体の生物学的活性を、遊離薬物および複合体化されていないSP1タンパク質の生物学的活性と比較して評価した。遊離ドキソルビシンおよびSP1−DOX複合体(これは限外ろ過またはエタノール沈殿のいずれかによって調製された)についての50%阻害濃度(IC50)(これは、細胞成長の50%を阻害した化合物の用量として定義される)は類似しており(図24a、0.6ug/ml)、一方、複合体化されていないタンパク質は不活性であった。従って、SP1−DOX複合体は、遊離DOXと少なくとも同じくらいに生物学的に活性がある。
投与されたSP1複合体化分子の循環からの腫瘍での蓄積速度およびクリアランスを追跡するために、フルオレセインおよびSP1−フルオレセイン複合体を、B16−F10(B16)メラノーマ腫瘍を有するC57B1のオスのマウスに注射した。SP1−フルオレセインの注射後24時間で、マウスから採血し、動物を屠殺し、腫瘍を取り出し、緩衝液中で均質化し、組織抽出物を熱処理して、非特異的なタンパク質を除いた。標的組織におけるSP1−FA複合体の蓄積を検出するために、サンプルを、SDS−PAGE分析、および、抗SP1抗体による免疫ブロット検出に供した。図26は、注射されたSP1複合体の約2%〜5%が腫瘍に見出され、注射されたSP1複合体の約3%〜15%が注射後24時間で循環に留まったままであり、一方、遊離フルオレセインアミンは迅速に排出されることを示す。
DOXの抗腫瘍活性に対するSP1複合体化の影響を、CD1ヌードマウスにおけるLS147(ヒト結腸ガン)モデル(Meyer、1995)を使用してインビボで明らかにした。SP1−DOX複合体または遊離DOX(それぞれ、0.5mg/kgおよび3mg/kgのDOX、1週間に2回の尾静脈へのiv)を受けている動物の腫瘍成長速度を比較した(図27aおよび図27b)。遊離DOXのこの用量(3mg/Kg)はマウスにおける最大耐量に匹敵する。腫瘍移植後35日で、動物を屠殺し、腫瘍を取り出し、その重量を記録した(図27aおよび図27b)。体重減少はDOXの共通する副作用であるので、動物の体重もまた測定した(図28aおよび図28b)。
遊離分子およびSP1複合体化分子のRP−HPLCおよびサイズ排除HPLCのプロフィル
逆相(RP)HPLCおよびサイズ排除HPLCを、SP1およびSP1変異体と複合体化している分子(例えば、DOX、PXTおよびFAなど)を検出および定量するために使用した。
配列番号31〜62は、腫瘍表面特異的ペプチドの配列である。
配列番号63〜81は、腫瘍脈管ペプチドの配列である。
配列番号82〜121は、ファージディスプレー(PD)及び細胞表面ディスプレー(SCD)によって選択された無機結合ポリペプチドの配列である。
配列番号122は、6XHisタグの配列である。
Claims (13)
- 改変されたSP1ポリペプチドのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドであって、前記改変されたSP1ポリペプチドが、配列番号1に対して少なくとも95%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつそのN末端部分にシステイン残基を含む、煮沸安定および界面活性剤に対して安定なタンパク質である、単離されたペプチド。
- 前記システイン残基は配列番号1のアミノ酸残基2に位置される、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 配列番号3,5,6または9のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 配列番号3に示されるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の単離されたペプチド。
- 請求項1に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号3に示されるポリペプチドをコードする、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれか1つに記載の改変されたSP1ポリペプチドの複数の自己集合したモノマーを含む組成物。
- 治療薬、診断用薬または化粧剤と分子的会合の状態である請求項1〜4のいずれか1つに記載の改変されたSP1ポリペプチドを含む、単離された組成物。
- 前記分子的会合は可逆的な分子的会合である、請求項8に記載の組成物。
- 前記治療薬が、ドキソルビシン、パクリタキセルおよびビンブラスチンからなる群から選択される治療薬である、請求項8に記載の組成物。
- 前記治療薬、診断用薬または化粧剤と前記分子的会合を形成することはレドックス依存的である、請求項8〜10のいずれかに記載の組成物。
- 治療薬、診断用薬または化粧剤をその必要性のある対象に送達するための医薬品を製造するための、請求項8または9に記載の組成物の使用。
- 溶液における物質の溶解性を高める方法であって、
(a)物質を、請求項1〜4のいずれか1つに記載の改変されたSP1ポリペプチドと接触させ、その結果、複合体を形成すること、および
(b)前記複合体を、溶媒を用いて溶解し、その結果、溶液を形成し、それにより、溶液における物質の溶解性を高めること
を含む方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US69677905P | 2005-07-07 | 2005-07-07 | |
US60/696,779 | 2005-07-07 | ||
PCT/IL2006/000795 WO2007007325A2 (en) | 2005-07-07 | 2006-07-09 | Sp1 polypeptides, modified sp1 polypeptides and uses thereof |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012042816A Division JP5450693B2 (ja) | 2005-07-07 | 2012-02-29 | Sp1ポリペプチドを含む組成物およびその使用 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009502122A JP2009502122A (ja) | 2009-01-29 |
JP2009502122A5 JP2009502122A5 (ja) | 2009-08-27 |
JP5086254B2 true JP5086254B2 (ja) | 2012-11-28 |
Family
ID=37637586
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008520063A Expired - Fee Related JP5086254B2 (ja) | 2005-07-07 | 2006-07-09 | Sp1ポリペプチド、変性sp1ポリペプチドおよびそれらの使用 |
JP2012042816A Active JP5450693B2 (ja) | 2005-07-07 | 2012-02-29 | Sp1ポリペプチドを含む組成物およびその使用 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012042816A Active JP5450693B2 (ja) | 2005-07-07 | 2012-02-29 | Sp1ポリペプチドを含む組成物およびその使用 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US9051379B2 (ja) |
EP (2) | EP1904526A4 (ja) |
JP (2) | JP5086254B2 (ja) |
CA (1) | CA2613619A1 (ja) |
IL (1) | IL188611A (ja) |
WO (1) | WO2007007325A2 (ja) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2007007325A2 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Fulcrum Sp Ltd. | Sp1 polypeptides, modified sp1 polypeptides and uses thereof |
JP5798034B2 (ja) * | 2008-09-21 | 2015-10-21 | ウェイン・ステイト・ユニバーシティ | クラミジア属にわたる(Genus−WideChlamydial)ペプチドワクチン抗原 |
WO2011027342A2 (en) | 2009-09-03 | 2011-03-10 | Fulcrum S.P. Materials Ltd. | Multi-site modified sp1 polypeptides and uses thereof |
US9629995B2 (en) * | 2011-05-26 | 2017-04-25 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Biomolecular electronic device and process of use |
WO2014122654A2 (en) | 2013-02-07 | 2014-08-14 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. | Hybrid nanopores and uses thereof for detection of analytes |
US9966096B2 (en) | 2014-11-18 | 2018-05-08 | Western Digital Technologies, Inc. | Self-assembled nanoparticles with polymeric and/or oligomeric ligands |
US10542961B2 (en) | 2015-06-15 | 2020-01-28 | The Research Foundation For The State University Of New York | System and method for infrasonic cardiac monitoring |
IL243839B (en) | 2016-01-28 | 2018-01-31 | Sp Nano Ltd | Conductive wires |
IL243838A (en) | 2016-01-28 | 2017-07-31 | Sp Nano Ltd | The composition containing sp1 protein and carbon nanoparticles and its uses |
US10752834B2 (en) * | 2018-05-17 | 2020-08-25 | Chung Yuan Christian University | Composite fluorescent gold nanoclusters with high quantum yield and method for manufacturing the same |
US11159833B2 (en) * | 2018-11-23 | 2021-10-26 | Sony Corporation | Buffer management for storing files of a received packet stream |
US10756243B1 (en) * | 2019-03-04 | 2020-08-25 | Chung Yuan Christian University | Light-emitting diode package structure and method for manufacturing the same |
CN111662899B (zh) * | 2020-06-08 | 2022-12-27 | 南京林业大学 | 一种连接肽介导的酶固定化BaPAD催化剂及其制备方法和应用 |
CN114217012B (zh) * | 2021-11-10 | 2023-09-12 | 中国科学院上海技术物理研究所 | 一种汞系量子点传统热注入流程中原位修饰的方法 |
WO2023170209A1 (en) * | 2022-03-09 | 2023-09-14 | Ospedale San Raffaele Srl | Fusion proteins and uses thereof |
Family Cites Families (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
NL154599B (nl) | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
US3901654A (en) | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
US3867517A (en) | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
NL171930C (nl) | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
US3850578A (en) | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
US4179337A (en) | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
US3935074A (en) | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4034074A (en) | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
US3984533A (en) | 1975-11-13 | 1976-10-05 | General Electric Company | Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction |
US4002531A (en) | 1976-01-22 | 1977-01-11 | Pierce Chemical Company | Modifying enzymes with polyethylene glycol and product produced thereby |
US4098876A (en) | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
US4879219A (en) | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
US5011771A (en) | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
US4666828A (en) | 1984-08-15 | 1987-05-19 | The General Hospital Corporation | Test for Huntington's disease |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4801531A (en) | 1985-04-17 | 1989-01-31 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis |
US5272057A (en) | 1988-10-14 | 1993-12-21 | Georgetown University | Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase |
US5097025A (en) * | 1989-08-01 | 1992-03-17 | The Rockefeller University | Plant promoters |
US5192659A (en) | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
US5073292A (en) * | 1990-06-07 | 1991-12-17 | Lever Brothers Company, Division Of Conopco, Inc. | Heavy duty liquid detergent compositions containing enzymes stabilized by quaternary nitrogen substituted proteins |
US5281521A (en) | 1992-07-20 | 1994-01-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified avidin-biotin technique |
JPH09173078A (ja) | 1995-09-14 | 1997-07-08 | Tadayuki Imanaka | 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法 |
BR9808786A (pt) | 1997-05-14 | 2000-07-11 | Rhone Poulenc Rorer Pharma | Composto peptìdio cìclico ou um seu sal ou pró-medicamento farmaceuticamente aceitáveis, composição farmacêutica, e, processos para tratar doenças associadas com a regulagem do cálcio em um paciente e para tratar a osteopenia ou a osteoporose em um mamìfero hospedeiro |
US6187335B1 (en) | 1997-12-31 | 2001-02-13 | Orasomal Technologies, Inc. | Polymerizable fatty acids, phospholipids and polymerized liposomes therefrom |
DE19926475A1 (de) * | 1999-06-10 | 2000-12-14 | Ktb Tumorforschungs Gmbh | Träger-Pharmaka-Konjugate |
GB2355009A (en) | 1999-07-30 | 2001-04-11 | Univ Glasgow | Peptides conjugated to bile acids/salts |
US6565888B1 (en) | 2000-08-23 | 2003-05-20 | Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the targeted delivery of biologically active agents |
US20020098999A1 (en) | 2000-10-06 | 2002-07-25 | Gallop Mark A. | Compounds for sustained release of orally delivered drugs |
TWI321054B (en) | 2000-12-19 | 2010-03-01 | California Inst Of Techn | Compositions containing inclusion complexes |
US7253341B2 (en) * | 2001-03-05 | 2007-08-07 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Denaturant stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof |
IL157766A0 (en) * | 2001-03-05 | 2004-03-28 | Yissum Res Dev Co | Denaturant stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same and their uses |
US20090253125A9 (en) * | 2001-03-05 | 2009-10-08 | Wangxia Wang | Denaturat stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same, their uses and methods of increasing a specific activity thereof |
US20060074225A1 (en) | 2004-09-14 | 2006-04-06 | Xencor, Inc. | Monomeric immunoglobulin Fc domains |
WO2007007325A2 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-18 | Fulcrum Sp Ltd. | Sp1 polypeptides, modified sp1 polypeptides and uses thereof |
-
2006
- 2006-07-09 WO PCT/IL2006/000795 patent/WO2007007325A2/en active Application Filing
- 2006-07-09 CA CA002613619A patent/CA2613619A1/en not_active Abandoned
- 2006-07-09 US US11/988,314 patent/US9051379B2/en active Active
- 2006-07-09 EP EP06766122A patent/EP1904526A4/en not_active Withdrawn
- 2006-07-09 JP JP2008520063A patent/JP5086254B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-07-09 EP EP12151669.4A patent/EP2487182B1/en active Active
-
2008
- 2008-01-06 IL IL188611A patent/IL188611A/en active IP Right Grant
-
2012
- 2012-02-29 JP JP2012042816A patent/JP5450693B2/ja active Active
-
2014
- 2014-02-27 US US14/191,479 patent/US20140178483A1/en not_active Abandoned
-
2015
- 2015-06-07 US US14/732,732 patent/US20150273076A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1904526A4 (en) | 2009-10-28 |
EP2487182A3 (en) | 2012-11-07 |
WO2007007325A2 (en) | 2007-01-18 |
JP2012153694A (ja) | 2012-08-16 |
WO2007007325A3 (en) | 2009-02-05 |
US9051379B2 (en) | 2015-06-09 |
EP2487182B1 (en) | 2019-10-23 |
US20150273076A1 (en) | 2015-10-01 |
JP5450693B2 (ja) | 2014-03-26 |
EP1904526A2 (en) | 2008-04-02 |
CA2613619A1 (en) | 2007-01-18 |
US20090062197A1 (en) | 2009-03-05 |
US20140178483A1 (en) | 2014-06-26 |
JP2009502122A (ja) | 2009-01-29 |
EP2487182A2 (en) | 2012-08-15 |
IL188611A (en) | 2015-11-30 |
IL188611A0 (en) | 2008-04-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5086254B2 (ja) | Sp1ポリペプチド、変性sp1ポリペプチドおよびそれらの使用 | |
Liu et al. | Self-assembly of mitochondria-specific peptide amphiphiles amplifying lung cancer cell death through targeting the VDAC1–hexokinase-II complex | |
US20190375786A1 (en) | Stable peptides and methods of use thereof | |
AU2011253424B2 (en) | Chlorotoxin variants, conjugates, and methods for their use | |
US8828925B2 (en) | Etoposide and doxorubicin conjugates for drug delivery | |
US20160015823A1 (en) | Peptide-dendrimer conjugates and uses thereof | |
WO2014026054A2 (en) | CD20 scFv-ELPs METHODS AND THERAPEUTICS | |
US8119601B2 (en) | Voltage dependent anion channel (VDAC1) compositions and methods of use thereof for regulating apoptosis | |
JP2008519785A (ja) | 高められた細胞取り込み活性を有する結合体 | |
BR122020017819B1 (pt) | Métodos e composições para o tratamento de câncer | |
JP2001512739A (ja) | 抗生作用ペプチドから誘導される線状ペプチド、製法および活性物質を仲介する用途 | |
AU2017373651B2 (en) | Compositions comprising peptide wkdeagkplvk | |
BR112019024563A2 (pt) | Compostos peptídicos, compostos conjugados e usos dos mesmos para tratar doenças inflamatórias | |
Min et al. | Pro-apoptotic peptides-based cancer therapies: challenges and strategies to enhance therapeutic efficacy | |
TWI825297B (zh) | 抗Her2 抗體藥物偶聯物藥物製劑 | |
WO2011100688A1 (en) | Improved antagonists of muc1 | |
WO2012081531A1 (ja) | 疾病抑制剤 | |
FR2829940A1 (fr) | Compositions pour la vectorisation d'anticorps a travers la barriere hematoencephalique et leur utilisation pour le diagnostic ou le traitement des maladies du systeme nerveux central | |
WO2017101786A1 (zh) | 一种多肽化合物及其制备方法与应用 | |
KR102017973B1 (ko) | 항-b형 간염 바이러스 x 단백질 폴리펩티드 약제 | |
WO2014108475A1 (en) | Peptides for the treatment of cancer | |
US20120165268A1 (en) | P53 fusion proteins and methods of making and using thereof | |
Yang et al. | Molecular superglue-mediated higher-order assembly of TRAIL variants with superior apoptosis induction and antitumor activity | |
EP4393959A1 (en) | Human transferrin receptor-binding antibody-peptide conjugate |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090707 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20090707 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111202 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120229 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120403 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120613 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120821 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120906 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150914 Year of fee payment: 3 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |