JP2008519785A - 高められた細胞取り込み活性を有する結合体 - Google Patents

Abstract

本発明は、キャリア配列を含む少なくとも１つの第１の部分（Ｉ）および少なくとも１つの抗腫瘍剤分子またはプロテアーゼ阻害剤分子を含む少なくとも１つの第２の部分（ＩＩ）を含む結合体分子に関し、この結合体分子は、その部分（Ｉ）にＤ−鏡像異性アミノ酸を含む。さらに、本発明は、前記結合体分子を含む医薬組成物、ならびに前記結合体分子の治療的処理への使用に関する。細胞透過性または水溶性を改善する方法もまた開示される。

Description

本発明は、新規の結合体分子およびその使用に関する。さらに詳しくは、本発明は、共有結合したキャリアおよびカーゴ部分を含有する結合体分子に関する。Ｄアミノ酸配列が特定の薬剤分子と共有結合して、特に、抗癌剤およびプロテアーゼ阻害剤の効率的な細胞内送達のための薬剤キャリアとして作用する。例えば、癌性疾患を治療するための薬物を製造するために新規の結合体分子が提供される。

医薬の進歩がヒトおよびそのほかの動物の健康管理に変革をもたらすということに異論はない。しかしながら、薬学分野での際立った進歩がなされたにもかかわらず、薬剤による種々の疾患の治療には、いくつかの重大な制限が依然として残っている。現時点での最も重要な制限の１つは、特に、例えば、その極性化学構造に起因して、薬剤の水溶性が乏しい状況、または薬剤が疎水性の細胞膜を介して細胞に入らない状況での生体内での特定の薬剤の送達に関する。実際、試験管内で大きな有望性を示す一部の薬剤の使用は、その水溶性または不十分な細胞透過性に関する問題点に起因して厳しく制限されている。一般に、強い疎水性プロフィールを示す化合物は体液を介して投与することが困難であるが、強い極性を持つ化合物は、細胞膜を横断しない。これが、生体内での薬剤送達の問題の原因となっている。シスプラチン（シス−ジアミンジクロロプラチン（ＩＩ））（特に、例えば、骨癌、膀胱癌、肺癌または卵巣癌の場合における腫瘍の治療用）は、細胞に効率的に輸送されない多数の水溶性薬剤の一例である。要約すれば、医薬の開発にとって、非経口または経口で投与されることにより、細胞内で作用する薬剤化合物が細胞の細胞質に効率的に輸送され、それによって水溶性を失うことなく細胞内で保持されることを確実にすることが課題である。

特許文献１は、ポリアスパラギン酸および／またはポリグルタミン酸のポリマーを薬剤キャリアとして開示している。この特許は、薬剤がポリマーのマトリクスに内包されるまたは組み入れられる、ポリアスパラギン酸および／またはポリグルタミン酸のポリマーの薬剤キャリアとしての使用を想定している。しかしながら、その中で、薬剤とポリマーとの間で共有結合させて結合体を形成することは想定されていない。特許文献２は、１以上の細胞傷害性分子、例えば、ダウノマイシンが結合される生分解性ポリマーのキャリアの使用を開示している。生分解性ポリマーのキャリアは、例えば、ポリグルタミン酸のホモポリマーであると特定される。しかしながら、ポリグルタミン酸に結合された薬剤の使用は、細胞による薬剤成分の細胞取り込みを高めない。

ポリアスパラギン酸のホモポリマーにカップリングされた抗腫瘍剤（非特許文献１）、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）にカップリングされた抗腫瘍剤（非特許文献２）、ポリアスパラギン酸を含め、ポリアミノ酸にカップリングされた抗腫瘍剤（非特許文献３）、またはＬ−アスパラギン酸とＬ−グルタミン酸とからなるコポリペプチドにカップリングされた抗腫瘍剤（非特許文献４）の生理学的挙動を扱っている多数の論文が公開されている。最後に、特許文献３は、たとえばアミノ酸（例えば、グルタミン酸）と共有結合した抗腫瘍剤タキソールを開示している。これらの結合体はすべて、薬剤成分の毒性を低減するために、または水溶性を改善するために合成された。しかしながら、上述の従来技術の開示は、カーゴ分子の細胞透過性をどのように改善するかという問題の解決にはならない。特許文献４には、高分子カーゴ分子に共有結合したＨＩＶ ｔａｔタンパク質の断片を含有する結合体分子が開示されている。特許文献４では、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質の特定の断片、例えば、ＴＡＴタンパク質のＡＡ３７〜ＡＡ５８が、例えば、タンパク質または核酸のような高分子の細胞質送達を高め得ることが示されている。しかしながら、カーゴ分子の細胞質送達の改善は結局、不満足であることが分かった。

さらに、特許文献４は、細胞膜を横切って細胞内に低分子抗癌剤を運ぶいかなるツールも提供しなかった。それによって、抗癌剤として使用される多数の低分子が非常に低い比率で生細胞に入って行くことが注目されるべきである。結果として、有用な比率では元々は標的細胞に入るのが可能ではないかまたは標的細胞に全く入らない抗癌剤の細胞への取り込みを改善するために、および／または疎水性を示すことが多い有機低分子化合物の溶解性を改善するために、製薬業界での激しい努力が為された。
米国特許第４，６７５，３８１号明細書 米国特許第５，０８７，６１６号明細書 米国特許第４，９６０，７９０号明細書 国際公開第Ｏ９４／０４４６８６号パンフレット １９８２，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，Ｚｕｎｉｎｏ ｅｔ ａｌ １９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｌｉ ｅｔ ａｌ １９８９，Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，Ｒａｍｓａｍｍｙ １９９０，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈａｙａｓｈｉ ａｎｄ Ｉｗａｔｓｕｋｉ

上記技術から示されるように、生物学的に活性のある抗腫瘍剤を細胞内に効率的に送達し、その固有の水溶性を妨害することなくまたは水溶性を高めることによってのいずれかで細胞内にそれを保持する方法を提供することを試みる長い間の切実な必要性が当該技術にはあった。本発明の目的は、本明細書で開示されるような主題によってこの目的を解決することである。

従って、本発明は、キャリア部分としての少なくとも１つの第１の部分（Ｉ）およびカーゴ部分としての少なくとも１つの第２の部分（ＩＩ）を含む結合体分子を提供する。部分（ＩＩ）は、低分子薬剤、特に、抗癌剤またはプロテアーゼ阻害剤の群から選択され、その際、部分（Ｉ）は、以下に記載されるような一般式（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）または（ｉ）によって定義される少なくとも３つのＤ−鏡像異性アミノ酸を含有するペプチド配列である。

本発明の実施形態の１つを実証するために、抗腫瘍剤であるシスプラチン、オキサリプラチン、クロラムブシルおよび抗ウイルス剤サキナビルの結合体を、薬剤送達ビヒクルとしてのキャリア部分と組み合わせた。次いで、これら発明の結合体分子が、例えば、結合されない薬剤よりも優れた生物特性および水溶性を持つことを示した。以下に示す実験データは、例えば、抗腫瘍剤であるシスプラチン、オキサリプラチン、クロラムブシルおよびサキナビル（カーゴ部分）を発明のキャリア部分（部分（Ｉ））に結合することにより、薬剤耐性細胞株についての細胞への薬剤の取り込みの予期しない増強および細胞内でのさらに長い保持を結果として生じ、それによって投与された投与量単位当たりの活性が高められることを実証する。

発明の結合体分子は、部分（Ｉ）（「キャリア」または「輸送配列」）として少なくとも３つの隣接するＤ−鏡像異性アミノ酸を含み、ここで、Ｄ−アミノ酸は好ましくはアルギニン残基またはリジン残基から選択される。従って、部分（Ｉ）によって構成され、キャリア部分として作用する機能的に有効なアミノ配列は強い塩基性特性を示す。好ましい実施形態では、部分（Ｉ）は、一般式（ａ）ＮＨ_２−Ｘｍ−ＣＯＯＨのペプチドを含み、式中、ＸはＤ−アミノ酸であるアルギニンまたはリジンから選択され、「ｍ」は、３と４０との間、好ましくは３と２０との間、最も好ましくは３と１２との間の整数である。

本発明の結合体分子の別の好ましい機能的に有効な部分（Ｉ）は、一般式（ｂ）ＮＨ_２−ＸｎＡｒＸｎ−ＣＯＯＨによって定義される配列を含み、式中、「Ｘ」はＤ−アミノ酸であるアルギニンまたはリジンに関し、「Ａ」は任意の非塩基性Ｄ−アミノ酸に関し、「ｎ」および「ｒ」は１〜２０、好ましくは３〜１０、さらに好ましくは３〜６の整数のアミノ酸を表す。隣接する「Ｘ」残基の数によって、「Ａ」残基はいかなる配列内位置に配置されてもよい。追加の非塩基性Ｄ−アミノ酸は、部分（Ｉ）によって構成されるとき配列に組み入れられてもよい。従って、本発明の結合体分子の機能的に有効な部分（Ｉ）は、以下の一般式の一般的アミノ酸配列を含んでもよい：
（ｃ）ＮＨ_２−ＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐ−ＣＯＯＨ、（ｄ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、（ｅ）ＮＨ_２−ＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、（ｆ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、（ｇ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、（ｈ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨまたは（ｉ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、式中、「Ｘ」はＤ−アミノ酸であるアルギニンまたはリジンに関し、「Ａ」は任意の非塩基性Ｄ−アミノ酸に関し、「ｏ」は０〜１４の整数であり、「ｐ」は「ｏ」とは独立して０〜１４の整数である。

本発明の結合体分子の機能的に有効な部分（Ｉ）の具体例は、強い塩基性特性を示す以下の配列を含有するか、または以下の配列からなってもよい：
ＮＨ_２−ＫＴＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＬＫＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＫＰＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＫＲＦＱＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＧＲＩＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＮＩＧＲＲＲＮ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＡＧＲＮＧＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＰＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＧＫＲＲＧ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＫＲＲＥ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＱＫＲＧＧＳ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＫＳＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＧＳＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＲＱＫ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＡＲＫＧ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＧＲＫ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＲＲＬＳ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＰＲＲＬＳＰ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＧＲＫＹ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＰＫＲＧＭＧ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＧＶＲＲＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＧＹＫＫＶＧＦＳＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＫＦＳＲＬＳＫ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＲＶＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＲＳＲＰ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＲＲＭ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＫＳＭＡＬＴＲＫＧＧＹ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＳＲＲＧ−ＣＯＯＨ（一文字コード）、そのために、本発明によれば、アミノ酸はすべてＤ−鏡像異性アミノ酸である。

好ましい実施形態では、本発明に係る輸送配列は、例えば、天然に生じるタンパク質の既知の膜移行配列に由来することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、本発明の結合体分子の輸送配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）のＨＩＶ ＴＡＴタンパク質のレトロインベルソ順序のＤ−鏡像異性アミノ酸配列である。ＴＡＴはＨＩＶ感染サイクルに不可欠なウイルスタンパク質である。このタンパク質は、例えば、ＷＯ９４／０４６８６、米国特許第５，８０４，６０４号および同第５，６７４，９８０号に記載されており、これらのそれぞれは、本明細書中に参考として援用される。本発明によれば、そのカーゴ部分（ＩＩ）に連結される本発明の結合体分子の部分（Ｉ）は、ＴＡＴタンパク質を構成する全配列の８６アミノ酸（レトロインベルソ型Ｄ型）の一部または全部を含む。特に、本発明の結合体分子のキャリア配列として機能的に有効な部分（Ｉ）は、細胞への取り込み活性、および必要に応じて細胞核への取り込みを依然として示す８６未満のＤ−アミノ酸を有する。細胞への侵入および取り込みに介在する領域を含むレトロインベルソのＴａｔ配列（Ｄ−アミノ酸から構成される）は、既知の技法を用いて定義することができる（例えば、Ｆｒａｎｋｅｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：７３９７−７４０１，１９８９を参照のこと）。好ましくは、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）は、ＴＡＴの塩基性領域（それぞれ、アミノ酸４８〜５７または４９〜５７）（以後、Ｄ−Ｔａｔ配列）を含むが、天然に生じるＴＡＴタンパク質のＴＡＴのシステインリッチ領域（アミノ酸２２〜３６）およびエキソン−２をコードするカルボキシ末端ドメイン（アミノ酸７３〜８６）を含まない。部分（Ｉ）によって構成され、天然のＬ−アミノ酸配列（ＴａｔのＡＡ４８〜ＡＡ５７）に従って設計される好ましいペプチド配列は、例えば、（天然に生じる配列と比べてレトロインベルソ順序で示される）ＮＨ_２−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲＧ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＲＲＲＱＲＲＫＫＲ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＲＲＱＲＲＫＫＲ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＲＲＲＱＲＲＫＫ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＲＱＲＲＫＫＲ−ＣＯＯＨ、ＮＨ_２−ＲＲＱＲＲＫＫ−ＣＯＯＨまたはＮＨ_２−ＲＲＱＲＲＫ−ＣＯＯＨである（それらのすべてはＤ−アミノ酸で構成される）。上記のいずれの所定の配列についても、それぞれ、１〜５個のアルギニン残基またはリジン残基をリジン残基によって、またはアルギニン残基によってそれぞれ置換してもよい。

本発明の特に好ましい実施形態では、部分（Ｉ）は、図１（Ｄ−Ｔａｔ配列）のキャリア配列または本出願の表４に示すＤ−Ｔａｔ配列を含む。表４のＴａｔ配列は本明細書に記載される実施例に使用された。

用語「レトロインベルソ」は、配列の方向が逆転され、各アミノ酸残基のキラリティが反転された、直鎖ペプチドの異性体を言う。本発明に係るレトロインベルソ結合体分子は、例えば、対応する天然のＬ−アミノ酸配列について逆転したアミノ酸配列を合成することによって構築することができる。部分（Ｉ）によって構成されるようなＤ−レトロインベルソ鏡像異性ペプチドでは、各単一のアミド結合におけるカルボキシル基とアミノ基とが交換され、一方、各α炭素での側鎖基の位置は保存される。本発明の結合体分子に使用されるレトロインベルソペプチドは種々の有用な特性を持つ。例えば、それらは、さらに効率的に細胞に入り、さらに安定であり（特に、生体内で）且つ、対応するＬ−ペプチドよりも低い免疫原性を示す。天然に生じるタンパク質はＬ−アミノ酸を含有する。従って、プロテアーゼまたはペプチダーゼのような分解酵素はほとんどすべて、隣接するＬ−アミノ酸の間のペプチド結合を切断する。その結果、レトロインベルソ形態のＤ−鏡像異性アミノ酸から構成されるペプチドは、タンパク質分解には大きく抵抗性である。

本発明の結合体分子の部分（Ｉ）は、キャリア配列または輸送配列として作用する。「輸送配列またはキャリア配列」は、結合体分子または結合体分子の部分（ＩＩ）をそれぞれ細胞の細胞質、または一層さらに特定の細胞の場所へと導くアミノ酸の任意の配列である。輸送配列は、例えば、細胞内の所望の位置、例えば、核、リボソーム、小胞体、リソソームまたはペルオキシソームに結合体分子を導くことができる。その結果、好ましい実施形態では、本発明の結合体分子の輸送配列は、結合体分子を、規定された細胞位置へと導く。いずれにせよ、輸送配列は、原形質膜を横切って、例えば、細胞外細胞環境から原形質膜を介して細胞質に本発明の結合体分子を導くことができ、それによって、特に、結合体分子の水溶性を（カーゴ部分のみの水溶性と比べて）減らすことなく、細胞透過性を高めることにより、または細胞内滞留時間を伸ばすことにより、それぞれ結合体分子またはその薬剤部分（ＩＩ）（カーゴ部分）の細胞取り込みを高め得る。好ましい実施形態では、部分（Ｉ）は、部分（ＩＩ）のみの水溶性に比べて結合体分子の水溶性を高め、本発明の結合体分子の細胞への取り込みを高め、そして／または細胞における本発明の結合体分子の滞留時間を伸ばす（再び、部分（Ｉ）のみの活性剤と比べて）。水溶性は、発明の結合体分子（親水性部分（ＩＩ）を含有する）についてほぼ類似してもよい、個別部分（ＩＩ）のみ、この場合、部分（ＩＩ）は、親水性剤（０．８〜１．３の比）を表す。部分（ＩＩ）としての疎水性剤については、部分（Ｉ）は、部分（ＩＩ）のみの水溶性に比べて、通常、少なくとも１．５倍、さらに好ましくは少なくとも２倍、一層さらに好ましくは少なくとも４倍、結合体分子全体の水溶性を高める。水溶性および比較実験は、例えば、部分（ＩＩ）のみおよび部分（ＩＩ）を含む本発明の結合体分子の水／オクタノールの分配係数を決定することによって、当該技術で公知の種々の方法によって実施され得る。

本発明の結合体分子の機能的に有効な部分（Ｉ）は、好ましくは、３〜５０のＤ−アミノ酸、さらに好ましくは４〜４０のＤ−アミノ酸、一層さらに好ましくは４〜３０のＤ−アミノ酸、一層さらに好ましくは４〜２０のＤ−アミノ酸、最も好ましくは４〜１２のＤ−アミノ酸の範囲である長さを持つ移行配列としてのアミノ酸配列を含む。好ましくは、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）は、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、さらに好ましくは少なくとも７０％、一層さらに好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％の塩基性アミノ酸、好ましくは、アルギニン残基および／またはリジン残基を含有する機能的に有効な移行配列を含む。部分（Ｉ）の移行配列が４〜１２のアミノ酸を有すれば、その塩基性アミノ酸の数は２〜１２の範囲におよぶ。本発明に係る部分（Ｉ）のレトロインベルソ形態は、例えば、Ｄ−アミノ酸を用いた固相合成により、Ｌ−形態のアミノ酸配列の逆転を合成することによって、相当する（天然に生じる）ペプチド配列（Ｌ−アミノ酸から構成される）から得ることができる。

部分（Ｉ）は、例えば、上述のようなＴａｔ配列の断片のような相当する（天然に生じる）配列に類似のたった１つの（すなわち、連続した）塩基性の細胞膜移行配列（Ｄ−レトロインベルソ形態）を含んでもよい。あるいは、部分（Ｉ）は、強い塩基性特性を持つ同一のまたは異なった移行配列に相当し、最終的に天然に生じるタンパク質を基にして合成される、言い換えれば、その組み合わせが天然のタンパク質配列では生じない２つの（天然に生じる）移行配列の組み合わせを基にして合成される、レトロインベルソ順序の２以上のアミノ酸配列を含んでもよい。部分（Ｉ）のこれら２以上の移行配列は、リンカー配列ありで、またはリンカー配列なしで、一緒に連結され得る。リンカー配列が所望であれば、その長さは、好ましくは２〜２０のアミノ酸の範囲内である。

上述のように、部分（Ｉ）は、（１以上の）Ｄ−鏡像異性アミノ酸移行モチーフ（天然の配列と比べたとき、レトロインベルソ順序）を含有してもよく、それは相当する天然に生じるタンパク質またはタンパク質断片に基づく。あるいは、部分（Ｉ）は、天然に生じるタンパク質（断片）配列（本明細書では「誘導体」とも呼ぶ）の機能的等価物のＤ−アミノ酸鎖（レトロインベルソ順序で）を含有してもよい。これら機能的等価物（本発明によれば、レトロインベルソ順序で部分（Ｉ）に含有される）は、その配列が天然に生じるタンパク質の配列ともその断片とも一致しなくても、相当する天然に生じるタンパク質に本質的に類似する、細胞（またはさらに、好ましくは細胞核）の中への取り込み活性を持つキャリア特性を依然として保有する。

誘導体を生成するには、例えば、天然に生じるタンパク質に存在する少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失および／または置換による天然の配列の修飾に基づいて、天然に生じるタンパク質の等価物のアミノ酸配列またはむしろ、その移行配列（例えば、ＴＡＴの移行配列）、従って、Ｄ−鏡像異性アミノ酸（例えば、Ｄ−ＴＡＴ）を含むその発明のレトロインベルソ形態（部分（Ｉ））のアミノ酸配列を提供して、レトロインベルソ部分（Ｉ）の合成のための修飾された出発物質を生成し得る。高いまたは低い安定性を持つ修飾された移行配列に基づく部分（Ｉ）は、既知の技法（以下の「誘導体」の定義を参照のこと）を用いて生成され得る。さらに、結合体分子の膜溶解性をさらに高めるために、糖部分および／または脂質部分、例えば、コレステロールまたはそのほかの脂質を、本発明の結合体部分の部分（Ｉ）として使用されるペプチドに、例えば、部分（Ｉ）の一方または両方の末端に付加して一方または両方の末端で局所の親油性を提供してもよい。あるいは、またはさらに、Ｄ−アミノ酸の側鎖、特に末端のヒドロキシル基およびアミノ基を有する側鎖に糖部分または脂質部分を連結してもよい。

本発明の結合体分子の部分（Ｉ）は、細胞透過性および／またはその細胞内滞留機能を保持しなければならない。しかしながら、部分（Ｉ）に導入された修飾によってそのほかの機能を加えてもよい。従って、部分（Ｉ）を修飾して、例えば、本発明の結合体分子を特定の細胞内の標的局在を効率的に導くことができる。相応して、向上した細胞透過性特性を失うことなく、特定の細胞内の局在が部分（Ｉ）に付与されるように部分（Ｉ）が修飾される。代表的に、特定の細胞区画（例えば、小胞体、ミトコンドリア、グルーム装置、リソソーム小胞）に対して本発明の結合体分子を標的にするための経路設定（ｒｏｕｔｉｎｇ）配列を部分（Ｉ）に導入することができる。他方、本発明の結合体分子の細胞質局在を確実にする特定の配列を添加してもよい。例えば、本発明の結合体分子を細胞質内に保持するために、部分（Ｉ）は、１以上の細胞質構造体に結合する少なくとも１つのさらなる配列を含んでもよい。あるいは、核局在に重要であると考えられる基本領域（Ｄａｎｇ ａｎｄ Ｌｅｅ（１９８９），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：１８０１９−１８０２３；Ｈａｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：１１８１−１１８７；Ｒｕｂｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：１−８）の変更は、部分（Ｉ）の細胞質配置または部分的細胞質配置、従って、本発明の結合体分子の細胞質配置または部分的細胞質配置を生じることができる。従って、部分（Ｉ）は、変更された核局在化シグナルを含有してもよく、それは、本発明の結合体分子の細胞質局在化をもたらす。

本発明の結合体分子の部分（ＩＩ）は、生物学的に活性のあるカーゴ部分を表す。部分（ＩＩ）は好ましくは、抗腫瘍剤、特にアルキル化剤、代謝拮抗剤、細胞分裂抑止剤、またはホルモン処理に関連する薬剤を含有する。金属、特に白金（誘導体）の化合物およびタキソールのクラスを抗腫瘍剤として選択することが好ましい。特に、薬剤部分は、例えば、シスプラチン、トランスプラチン、サトラプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メファラン、アザチオプリン、フルオロウラシル、（６）−メルカプトプリン、メトトレキサート、ナンドロロン、アミノグルテミド、メドロキシプロゲステロン、メゲストロールアセテート、プロカルバジン、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、エピポドフィロトキシン、ポドフィロトキシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ドセタキセル、ダウノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ミトザントロン、トポテカン、ブレオマイシン、ゲムシタビン、フルダラビン、ナベルビン、および５−ＦＵＤＲからなる薬剤の群から選択される。特に好ましいのは、金属を含有する抗癌剤のクラス、例えば、白金化合物のクラスである。

本発明の結合体分子の部分（ＩＩ）として使用してもよいさらなる化合物は、（一般名で同定される）アリトレチノイン、アルトレタミン、アザチオプリン、ビカルタミド、ブスルファン、カペシタビン、シクロホスファミド、エクセスメタン、レトロゾール、フィナステリド、メゲストロールアセテート、トリプトレリン、テモゾロミド、ミフェプリストン、トレチノイン、オーラル、タモキシフェン、テニポシド、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標））、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（登録商標））、ペプロマイシンスルフェート、またはカンプトテシンのクラスである。

部分（Ｉ）に連結してもよい別のクラスの化合物は、インドロカルバゾール化合物、例えば、スタウロスポリン（およびその誘導体）ならびにレベカマイシンである。アニリノキナゾリンのクラスに属する化合物（例えば、ゲフィチニブ）も部分（ＩＩ）として特に好ましいことが言及されるべきである。

一般に、化学療法剤は、その作用機序に基づいて３つの主なカテゴリーに分けることができる。それらは、（ａ）プレＤＮＡ分子の基本構造の合成を停止してもよい。これらの薬剤は多数の異なった様式で機能する。ＤＮＡの基本構造は、天然には細胞内で作られる、葉酸、複素環塩基およびヌクレオチドである。これらの薬剤はすべて、ヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡを作るのに必要な）の形成における何らかの工程を遮断するように機能する。これらの工程が遮断されると、ＤＮＡおよびＲＮＡの基本構造であるヌクレオチドを合成することができない。従って、ヌクレオチドなしでＤＮＡを作ることができないので、細胞は複製することができない。このクラスの薬剤の例には、メソトレキサート（Ａｂｉｔｒｅｘａｔｅ（登録商標））、フルオロウラシル（Ａｄｒｕｃｉｌ（登録商標））、ヒドロキシ尿素（Ｈｙｄｒｅａ（登録商標））、およびメルカプトプリン（Ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ（登録商標））、またはさらに一般的には、任意のヌクレオチドアナログ、例えば、２’−デオキシシチジンアナログが挙げられる。

あるいは、それらは、（ｂ）細胞の核におけるＤＮＡを直接損傷してもよい。これらの薬剤は、ＤＮＡおよびＲＮＡを化学的に損傷する。それらは、ＤＮＡの複製を中断させ、複製を全く停止させるか、またはナンセンスＤＮＡもしくはナンセンスＲＮＡの生成を引き起こす（新しいＤＮＡおよびＲＮＡは有用なものをコードしていない）。このクラスの薬剤の例としては、アントラサイクリン抗癌剤（そのメンバーを本発明の結合体分子の部分（ＩＩ）として使用してもよい）のクラスに属するシスプラチン（Ｐｌａｔｉｎｏｌ（登録商標））および抗生物質−ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ（登録商標））、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標））、およびエトプシド（ＶｅＰｅｓｉｄ（登録商標））または任意のインターカレーターが挙げられる。

最後に、それらは、（ｃ）紡錘体の合成または破壊をもたらしてもよい。紡錘体は、細胞自体が２つの新しい細胞に分裂し始めるとき、細胞において「北極および南極」を伴う分子線路として作用する。これらの紡錘体は、細胞分裂の間、新しくコピーされたＤＮＡを分割し、その結果、コピーがそれぞれ新しい２つの細胞に行くのを助けるので、非常に重要である。これらの薬剤は、これら紡錘体の形成を中断するので、細胞分裂を妨害する。細胞分裂を中断するこのクラスの薬剤の例には、ビンブラスチン（Ｖｅｌｂａｎ（登録商標））、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、およびパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（登録商標））が挙げられる。本発明の結合体分子の部分（ＩＩ）は、上記の作用様式の１つに従って作用してもよい。

言い換えれば、抗腫瘍剤の以下のクラスのそれぞれ、すなわち、アルキル化剤、ニトロソ尿素、代謝拮抗剤、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質およびステロイドホルモンを、本発明の結合体分子の部分（ＩＩ）として使用してもよい。これらの薬剤クラスをさらに詳細に説明するために、各抗癌剤が、上述のように、細胞周期および細胞化学における効果に従って分類されてもよいことが強調される。アルキル化剤は、ＤＮＡを直接攻撃することによって細胞を殺す。アルキル化剤は、慢性白血病、ホジキン病、リンパ腫、ならびに肺、胸、前立腺および卵巣の特定の癌腫の治療に使用されてもよい。シクロホスファミドは、一般に使用されるアルキル化剤の例である。ニトロソ尿素は、アルキル化剤に類似して作用し、ＤＮＡ修復に必要な変化を阻害する。これらの薬剤は、脳血管関門を横断するので、脳腫瘍、リンパ腫、多発性骨髄腫および悪性黒色腫を治療するのに使用される。カルムスチンおよびロムスチンは、このカテゴリーの主要薬剤である。代謝拮抗剤は、特定の活性、普通、ＤＮＡ合成を妨害することによって細胞増殖を遮断する。いったん細胞内に摂取されると、それらは、正常な発生および生殖を中断する。このカテゴリーの薬剤はすべて、細胞周期のＳ期の細胞に影響を及ぼす。代謝拮抗剤は、急性および慢性の白血病、絨毛癌、ならびに消化器、胸および卵巣の一部の癌の治療に使用され得る。一般に使用されている代謝拮抗剤の例は、６−メルカプトプリンおよび５−フルオロウラシル（５ＦＵ）である。抗腫瘍抗生物質は、化合物の多様な群である。一般に、ＤＮＡに結合し、ＲＮＡ合成を阻害することによって、それらは作用する。これらの薬剤は、種々の癌を治療するのに幅広く使用される。この群で最も一般的に使用される薬剤は、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン−Ｃおよびブレオマイシンである。植物（ビンカ）アルカロイドは、植物に由来する抗腫瘍剤である。これらの薬剤は、有糸分裂の間、細胞分裂を遮断することによって特異的に作用する。それらは一般に、急性リンパ芽球性リンパ腫、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、ならびに肺癌、乳癌および精巣癌の治療に使用される。ビンクリスチンおよびビンブラスチンは、この群で一般に使用される薬剤である。ステロイドホルモンは、ある種の癌の治療に有用である。このクラスには、副腎コルチコステロイド、エストロゲン、抗エストロゲン、プロゲステロンおよびアンドロゲンが挙げられる。その特異的な作用機序ははっきりしないが、ステロイドホルモンは特定のホルモン依存性の癌の増殖を緩和する。タモキシフェンは、エストロゲン依存性の乳癌に使用される例である。上述の腫瘍種はすべて、部分（ＩＩ）として上記抗腫瘍剤のいずれかを含む本発明の結合体分子によって治療され得る。

本発明の結合体分子の部分（ＩＩ）として特に好ましいのは、トポイソメラーゼの阻害剤、例えば、イリノテカンまたは有糸分裂キネシンまたはＤＨＦＲである。本発明の結合体分子のそのほかの好ましい標的は、細胞増殖を刺激する因子（ＰＤＧＦ）、細胞内経路、例えば、ＲＡＳ／ＲＡＦシグナル伝達経路、例えば、ＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路のメンバー（例えば、ＲＡＦ−１）、またはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ経路、ＣＭＧＣキナーゼファミリー（ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＰＫ、ＧＳＫ３、ＣＬＫを含む）、ＰＫＡ、ＰＫＧ、ＰＫＣキナーゼファミリーを含有するＡＧＣキナーゼファミリーに属するＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ）−２、ＶＥＧＦＲ−３、血小板由来増殖因子受容体βを含む、例えば、血管新生および腫瘍の進展に関与する受容体チロシンキナーゼ、Ｆｌｔ−３、ＥＴ−１、ＥＴ−２、ＥＴ−３およびＥＴ_Ａ受容体（ＥＴ_ＡＲ）およびＥＴ_ＢＲを含むエンドセリン（ＥＴ）系、ならびにたとえばその機能を阻害することによって標的とされるｃ−ＫＩＴである。従って、本発明の結合体分子の部分（ＩＩ）は、例えば、腫瘍細胞の増殖および腫瘍の血管新生を標的とする阻害剤である。特に好ましいのは、悪性細胞および／または血管細胞における標的に向けられた低分子の抗腫瘍キナーゼ阻害剤が血管新生抑制活性を有することである。ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ｃ−ＫＩＴ、ＰＫＣ、ＲａｆおよびＰＩ３に向けられたもののようなキナーゼ阻害剤は、冒された悪性細胞による血管新生因子の分泌を遮断することにより、血管新生抑制性である。ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ１、ＰＤＧＦＲ、ＰＫＣ、ＲａｆおよびＰＩ３に向けられたもののようなキナーゼ阻害剤は、血管細胞に対する影響によって血管新生抑制性である。サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫＩ）の合成阻害剤の例は、例えば、フラボピリドール、ブチロラクトン、およびそれらの誘導体なので、腫瘍細胞の増殖を抑える。他方、部分（ＩＩ）としての抗腫瘍性化合物は、癌細胞におけるアポトーシスプログラムの活性化剤（例えば、スタウロスポリン）から、またはアポトーシス抑制タンパク質、例えば、Ｂｃｌ−２を下方制御することによって選択されてもよい。

抗腫瘍剤として作用するために、それらが細胞膜を横断しなければならないことはこれら化合物すべてに共通している。部分（ＩＩ）としての、これらのクラスのそれぞれに属する化合物（細胞の核におけるＤＮＡを直接損傷する、紡錘体の合成もしくは破壊をもたらす、またはプレＤＮＡ分子の基本構造の合成を停止させる化合物）を部分（Ｉ）にカップリングさせて本発明の結合体分子を形成することによって、抗癌性化合物の細胞内への侵入が高められ、そして／またはそれらの溶解性が高められ、それによってこれら治療用化合物の有効性が増す。言い換えれば、細胞への取り込みの増加および好ましくは、水性環境（例えば、細胞質ゾル）におけるこれら化合物のより良好な溶解性によって治療用抗癌性化合物の投与量を下げることができる。

あるいは、部分（ＩＩ）は、プロテアーゼ阻害剤、すなわち、プロテアーゼ、特に感染性因子の感染サイクルに関与するプロテアーゼ、例えば、ウイルス、細菌または原生動物のプロテアーゼを阻害する薬剤分子を含む。好ましい実施形態では、本発明の結合体分子の一部としてのこれらのプロテアーゼ阻害剤は、ウイルス感染、細菌感染またはマラリアのような原生動物感染を治療するのに役立ち得る。特に、ウイルス感染、例えば、レトロウイルス疾患をプロテアーゼ阻害剤で治療し得る。ＨＩＶ感染の治療への、プロテアーゼ阻害剤を含む結合体分子の使用が強く好まれる。本明細書に記載されるようなキャリア配列にカップリングするのに使用されるプロテアーゼ阻害剤は、６４０３８５、アバカビルスルフェート、ＡＧ１７７６、アンプレナビル（１４１Ｗ９４またはＶＸ−４７８）、アタザナビル（ＢＭＳ−２３２６３２）、カテプシンＳプロテアーゼ阻害剤、Ｄ１９２７、Ｄ９１２０、エファビレンズ、エムトリシタビン、エンフビルチド（Ｔ−２０）、フォサムプレナビル（ＧＷ−４３３９０８またはＶＸ−１７５）、ＧＳ９００５、ＧＷ６４０３８５（ＶＸ−３８５）、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、インジナビル（ＭＫ−６３９）、Ｌ−７５６、４２３、レボプリン−ＺＧ、ロピナビル（ＡＢＴ−３７８）、ロピナビル／リトナビル（ＬＰＶ ＡＢＴ−３７８／ｒ）、ＭＫ−９４４Ａ、モゼナビル（ＤＭＰ４５０）、ネルフィナビル（ＡＧ−１３４３）、ネビラピン、Ｐ−１９４６、ＰＬ−１００、プリノマスタット、リトナビル（ＡＢＴ−５３８）、ＲＯ０３３−４６４９、ＴＭＣ１１４、サキナビル（Ｒｏ−３１−８９５９）、テノフォビルジソプロキシルフマレート、チプラナビル（ＰＮＵ−１４０６９０）、ＴＬＫ１９７８１、ＴＭＣ−１１４、ベルテックス３８５、ＶＸ−９５０を含む群から選択されてもよい。

さらに好ましい実施形態では、同一であってもよく、同一でなくてもよく、少なくとも２つの薬剤部分が本発明の結合体分子の中で併用される。本発明の結合体分子中で１より多くの薬剤分子が併用されるのであれば、例えば、２つのシスプラチン分子またはシスプラチンとセトラプラチンとの併用であれば、これらの分子は最終的にはスペーサー基またはリンカー基を介して双方ともに連結することができ、そのようなもの（２（以上）の薬剤分子の単一のカーゴ複合体構造）を部分（Ｉ）にカップリングすることができ、あるいは、互いに独立して本発明の結合体分子の部分（Ｉ）にカップリングしてもよい。例えば、それらは、部分（Ｉ）の末端、例えば、末端のアミノ基およびカルボキシル基のいずれかに、および／または部分（Ｉ）のＤ−アミノ酸の好適な側鎖に連結してもよい。あるいは、本発明の結合体分子は、単一の複合体部分（ＩＩ）として部分（Ｉ）にカップリングされた、または本発明の結合体分子で別々にカップリングされた（１より多くの部分（ＩＩ）を与える）複数の薬剤部分を含んでもよい。

部分（ＩＩ）の薬剤分子は通常、本発明の結合体分子の１０〜６０重量％、さらに好ましくは１０〜５０重量％、最も好ましくは１０〜４０重量％を構成する。相応して、部分（Ｉ）のキャリア部分は、本発明の結合体分子の４０〜９０重量％、さらに好ましくは５０〜９０重量％、最も好ましくは６０〜９０重量％を構成する。本発明の結合体分子の分子量は、通常、約１，０００〜約５０，０００ダルトン、好ましくは１，０００〜２０，０００、さらに好ましくは１，０００〜５，０００である。

本発明の結合体分子は、少なくとも部分（Ｉ）および少なくとも１つの部分（ＩＩ）で構成される。さらに、本発明に係る結合体分子は、さらに部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）または（Ｖ）等を含んでもよい。これら追加の部分は任意であり、本発明の結合体分子に追加の機能を付与する。少なくとも１つのさらなる部分は、アミノ酸、オリゴペプチド、糖部分、例えば、複合糖鎖、脂質またはポリペプチド、または有機低分子化合物であることができ、好適な位置、例えば、Ｎ末端、Ｃ末端または内部で本発明の結合体分子に連結することができる。そのようなさらなる部分（例えば、ＨＡ、ＨＳＶ−タグ、Ｈｉｓ６）によって、本発明の結合体分子が精製および／または単離を受け易くなってもよい。所望であれば、生成プロセスの終了時に、本発明の結合体分子から融合相手を取り外すことができる（例えば、タンパク質分解的切断または当該技術で既知のそのほかの方法によって）。あるいは、追加の部分によって、特定の細胞区画へのさらなる輸送配列もしくはそのほかの機能的配列を本発明の分子に融合してもよく、または、部分（Ｉ）もしくは（ＩＩ）に組み入れてもよい。好ましくは、追加の部分（例えば、部分（ＩＩＩ））によって、本発明の結合体分子を特定の細胞種、例えば、免疫細胞、肝細胞等に特異的に結合させ得る。この目的は、特定の細胞マーカーに関する天然に生じるリガンド（例えば、受容体のような膜タンパク質の細胞外の部分に対するリガンド、または膜タンパク質の細胞外の部分に向けられた抗体）を本発明の結合体分子に融合し、例えば、標的の腫瘍細胞に結合させることによって達成される。それによって、発明の結合体分子は、治療される動物の特定の細胞または組織に選択的に導かれてもよい。

本発明の好ましい実施形態では、本発明の結合体分子の少なくとも１つの第１の部分（Ｉ）および少なくとも１つの第２の部分（ＩＩ）は共有結合によって連結される。「共有結合」は、１対以上の電子を共有することによって生じる２つの原子の間の安定な化学的連結に関する。存在するならば、上述のようなさらなる部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）などが、本発明の結合体分子、好ましくはその部分（Ｉ）に共有結合によって連結することができる。

一般に、部分（Ｉ）および部分（ＩＩ）は、連結される部分が反応性のアミノ基またはカルボキシ基を有していれば、リンカーを介して、または直接（リンカーなしで）、例えば、アミド結合によってカップリングすることができる。

存在するならば、上述のようなさらなる部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）などを類似の方式で部分（Ｉ）および／または部分（ＩＩ）にカップリングすることもでき、または、任意で互いに一緒に単一の部分として連結され、部分（Ｉ）もしくは部分（ＩＩ）のいずれかにカップリングすることができる。リンカー配列を用いて、本発明の結合体分子を少なくとも１つのそのほかの部分に融合することもできる（以下を参照のこと）。さらなる部分を本発明の結合体分子の部分（Ｉ）または部分（ＩＩ）のいずれかにカップリングする方式は、その化学的特徴に依存する。追加の部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）等がペプチド様配列のクラスに属していれば、それらは好ましくは、本発明の結合体分子に、部分（Ｉ）のいずれかの末端に連結されるか、あるいは、部分（Ｉ）のＤ−アミノ酸側鎖を介して、例えば、ジスルフィド結合によって連結される。そのほかの化学的性質のさらなる部分を同様に、部分（Ｉ）（末端基もしくは化学的に活性のある側鎖基）、または部分（ＩＩ）に結合してもよい。側鎖を介した結合は好ましくは、例えば、アミド結合またはエステル結合またはエーテル結合を介して、側鎖、アミノ基、チオール基またはヒドロキシル基に基づく。本発明によれば、（部分（Ｉ）のいずれか）のアミノ酸はすべて、およびアミノ酸から作られれば、部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）等は好ましくはＤ−鏡像異性アミノ酸であり、それは、レトロインベルソ順序で連結されることによってその最終的に天然に生じるアナログを反映することに注目しなければならない。にもかかわらず、部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）等は、アミノ酸から構成されるのであれば、Ｌ−アミノ酸（天然に生じる配列順という点で）から構成されてもよく、またはＤ−およびＬ−アミノ酸の組み合わせから作られてもよい。

ペプチド様リンカー配列を使用して部分（Ｉ）と部分（ＩＩ）を融合する、または別の部分、例えば、（ＩＩＩ）を部分（Ｉ）および／または（ＩＩ）に融合するならば、リンカー配列は、好ましくは、２〜１０残基、さらに好ましくは１〜５残基の柔軟な配列を形成する。好ましい実施形態では、リンカー配列は、少なくとも２０％、さらに好ましくは少なくとも４０％、一層さらに好ましくは少なくとも５０％のＧｌｙまたはβ−アラニン残基を含有する。適切なリンカー配列は当業者によって容易に選択され、調製されることができる。それらは、Ｄ−および／またはＬ−アミノ酸から構成されてもよい。

好ましくは、部分（Ｉ）および部分（ＩＩ）は、当該技術で既知の好適な方式で化学的カップリングによって連結される。しかしながら、多数の既知の化学的架橋方法は非特異的である、すなわち、それらは、カップリングの点をキャリア部分またはカーゴ部分の特定の部位に導かないという事実に注意が引かれる。従って、非特異的な架橋剤の使用は、機能的部位を攻撃する可能性があり、活性部位を立体的に遮断する可能性があり、本発明の結合体分子の融合部分を生物学的に不活性にする可能性がある。適切な保護基を用いて潜在的に反応性の基を遮断することが当業者の知識に引用される。あるいは、部分（Ｉ）と部分（ＩＩ）の架橋に適用することができる化学的選択法である強力で多目的のオキシムとヒドラゾンとの連結技法の使用を採用してもよい。この連結技術は、例えば、Ｒｏｓｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９４） ＪＡＣＳ １１６：３０に記載されている。存在するならば、上述のようなさらなる部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）などを互いに、または部分（Ｉ）および／または（ＩＩ）に類似の方式で化学的にカップリングすることができる。

部分（Ｉ）に１回だけ、または２、３回見出される官能基に直接化学的カップリングを行うことによってカップリング特異性を高めることができ、官能基は、部分（ＩＩ）の有機分子に架橋されるべきである。例として、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）にたった１つのシステイン残基が存在するのならば、システインチオール基を使用してもよい。また、例えば、結合体分子の部分（Ｉ）がリジン残基を含有していないのであれば、１級アミンに特異的な架橋剤が部分（Ｉ）のアミノ末端に選択的である。あるいは、側鎖を介してアミド結合を生成することができるように、ペプチドのＮ−末端に配置されたグルタミン酸の側鎖を介して架橋を行ってもよい。従って、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）のＮ−末端にグルタミン酸残基を連結することが有利であってもよい。しかしながら、システイン残基が部分（Ｉ）に導入されるべきであるならば、Ｎ末端またはＣ末端またはその近傍への導入が好ましい。１以上の追加のアミノ酸、例えば、とりわけ、システイン残基を移行配列に付加することによって、または部分（Ｉ）に含まれる移行配列の少なくとも１つの残基を置換することによってのいずれかによる部分（Ｉ）の改変に基づくそのようなアミノ酸配列の変更には、従来の方法を利用することができる。システイン側鎖がカップリング目的に使用される場合、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）は好ましくは、システイン残基を１つ有する。第２のシステイン残基は好ましくは回避されるべきであり、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）でそれらが生じた場合、最終的には置換されるべきである。部分（Ｉ）の一部として使用されるべき元来の移行配列でシステイン残基が置換される場合、部分（Ｉ）のペプチド折り畳みにおいて生じる変化を最小限にとどめることが通常望ましい。置換が化学的に且つ立体的にシステインに類似する場合、部分（Ｉ）の折り畳みにおける変化が最小限にとどめられる。従って、システインの置換としてセリンが好ましい。

本発明の結合体分子の２つの構成成分のカップリングは、例えば、ＨＯＢｔ、ＨＢＴＵ、ＤＩＣＩ、ＴＢＴＵのような標準的なペプチド合成のカップリング試薬を含むカップリング剤または結合剤を介して達成することができる。利用することができる幾つかの分子間架橋剤があり、例えば、Ｍｅａｎｓ ａｎｄ Ｆｅｅｎｅｙ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙ，１９７４，ｐｐ．３９−４３を参照のこと。これらの試薬の中では、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはＮ，Ｎ’−（１，３−フェニレン）ビスマレイミド、Ｎ，Ｎ’−エチレン−ビス−（ヨードアセトアミド）または６〜１１の炭素メチレン架橋を有するそのほかのそのような試薬、および１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンである。本目的に有用なそのほかの架橋試薬には、ｐ，ｐ’−ジフルオロ−ｍ，ｍ’−ジニトロジフェニルスルホン、ジメチルアジピミデート、フェノール−１，４−ジスルホニルクロリド、ヘキサメチレンジイソシアネートまたはジイソチオシアネートまたはアゾフェニル−ｐ−ジイソシアネート、グルタルアルデヒドおよびジスジアゾベンジジンが挙げられる。架橋試薬は、ホモ二官能性であってもよく、すなわち、同一の反応を受ける２つの官能基を有してもよい。好ましいホモ二官能性架橋試薬は、ビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）である。ＢＭＨは、２つのマレイミド官能基を含有し、それは、穏やかな条件下（ｐＨ６．５〜７．７）でスルフヒドリル含有化合物と特異的に反応する。２つのマレイミド基は、炭化水素鎖によって接続される。従って、ＢＭＨは、システイン残基を含有するタンパク質（またはポリペプチド）の不可逆的架橋に有用である。架橋試薬はヘテロ官能性であってもよい。ヘテロ官能性の架橋試薬は、２つの異なった官能基、例えば、アミン反応性基およびチオール反応性基を有し、それぞれ、遊離のアミンおよびチオールを有する２つのタンパク質を架橋する。ヘテロ官能性の架橋試薬の例は、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、およびスクシンイミド４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）、ＭＢＳの伸長鎖アナログである。これらの架橋剤のスクシンイミジル基は、１級アミンと反応し、チオール反応性のマレイミドは、システイン残基のチオールとの共有結合を形成する。架橋試薬は水への溶解性が低いことが多いので、スルホネート基のような親水性部分を架橋試薬に添加して水への溶解性を改善してもよい。スルホ−ＭＢＳおよびスルホ−ＳＭＣＣは、水溶性について改変された架橋試薬の例である。多数の架橋剤が、細胞条件下では本質的に切断不能である結合体を生じる。従って、一部の架橋試薬が、細胞条件下で切断可能であるジスルフィドのような共有結合を含有する。例えば、トラウトの試薬、ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（ＤＳＰ）およびＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）は、周知の切断可能な架橋剤である。切断可能な架橋試薬の使用によって標的細胞に送達された後、輸送ポリペプチドからカーゴ部分を分離することができる。この目的で、直接的なジスルフィド結合が有用であってもよい。化学的架橋は、スペーサーアームの使用を含んでもよい。スペーサーアームは、分子間の自由度を提供し、または結合された部分間の分子間距離を調整し、それによって生物学的活性を保存するのを助けてもよい。スペーサーアームは、スペーサーアミノ酸、例えば、プロリンを含むタンパク質（またはポリペプチド）部分の形態であってもよい。あるいは、スペーサーアームは、「長鎖ＳＰＤＰ」（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ，カタログ番号２１６５１ Ｈ）のような架橋試薬の一部であってもよい。上述のものも含めて多数の架橋試薬が市販されている。それらの使用に関する詳細な指示は、商業的供給元から容易に入手可能である。タンパク質の架橋および結合体の調製の一般的参考文献は、Ｗｏｎｇ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ （１９９１）である。

本発明の結合体分子は、少なくとも１つの天然に生じる移行配列のレトロインベルソＤ−形態を含んでもよい。しかしながら、これら天然に生じる移行配列は、修飾されてもよい（天然に生じる（移行）配列の「誘導体」）。その結果、本発明の結合体分子は、そのペプチド様部分、例えば、部分（Ｉ）にそのような誘導体を含んでもよい。従って、本発明に係る「誘導体」または「結合体分子の誘導体」は、ペプチド様部分、例えば、部分（Ｉ）および／または最終的には、本発明の結合体分子のさらなるペプチド様部分の誘導体を意味することが意図される。アミノ酸配列の１以上の部位での１以上のアミノ酸の置換を手段として、天然に生じるマトリクス配列の任意の部位での１以上のアミノ酸の欠失を手段として、および／または天然に生じるペプチド配列の１以上の部位での１以上のアミノ酸の挿入を手段として、結合体分子に、天然に生じたマトリクスに由来するそのペプチド様部分を示すことが意図される。「誘導体」は、本発明の結合体分子の部分として使用されるならば、その特徴的活性を保持しなければならず、例えば、ペプチド様部分（Ｉ）の移行配列の誘導体は、移行効率性を保持しなければならない。誘導体は機能的に相同でなければならない。

天然に生じる配列の誘導体の調製にアミノ酸の置換が使用されるのであれば、保存的置換が好ましい。保存的置換としては代表的に、以下の群の範囲内での置換が挙げられる：グリシンとアラニン；バリンとイソロイシンとロイシン；アスパラギン酸とグルタミン酸；アスパラギンとグルタミン；セリンとスレオニン；リジンとアルギニンおよびフェニルアラニンとチロシン。従って、好ましい保存的置換の群は、アスパラギン酸−グルタミン酸；アスパラギン−グルタミン；バリン−イソロイシン−ロイシン；アラニン−バリン；フェニルアラニン−チロシン；およびリジン−アルギニンである。本発明の結合体分子のペプチド様部分のそのような変異によって、例えば、その安定性および／または有効性を高めることができる。例えば、配列、機能および抗原性の特徴またはそのほかの機能においてそれらが相当する親配列を有するタンパク質と相同のままであるように変異された配列を有する本発明の結合体分子のペプチド様部分は本発明によって包含される。部分（Ｉ）に含まれる輸送配列の誘導体が機能的なままである（細胞透過性部分としてのその特徴を維持する）ことが特に好ましい。本発明の結合体分子のそのように変異されたペプチド様部分は、特定の適用についての本発明の配列の特性よりも有利であってもよい変化した特性を持つことができる（例えば、高められたｐＨ最適性、高められた温度安定性等）。

本発明の結合体分子は好ましくは、レトロインベルソ順序のＤ−アミノ酸から構成されるので、本発明の結合体分子で使用される誘導体は、「Ｄ型誘導体」と呼ばれる。（ｉ）Ｌ−アミノ酸もしくはＤおよびＬアミノ酸の組み合わせで構成されるリンカーで部分（Ｉ）と部分（ＩＩ）が分離されるのであれば、または（ｉｉ）Ｌ−アミノ酸を含有するさらなる部分（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）が部分（Ｉ）もしくは部分（ＩＩ）に基づく、例えば、Ｄ−アミノ酸に連結されるのであれば、用語「Ｄ型誘導体」が同様に有効である。Ｄ型誘導体は「Ｌ型誘導体」を基にして合成され、それは、相当する天然に生じるアミノ酸配列と比較して導入された修飾を直接反映する。

本発明の結合体分子のペプチド様部分の誘導体は、天然に生じる反応、例えば、天然に生じる移行配列のアミノ酸配列、例えば、ＨＩＶのＴａｔタンパク質の移行配列と実質的な同一性を有するように定義される。特に好ましいのは、天然に生じるアナログに対して少なくとも３０％の配列同一性、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも６０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも７５％の配列同一性、一層さらに好ましくは少なくとも８０％の配列同一性、その上さらに好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。結合体分子の機能的誘導体の単離のための適切な方法ならびに２つのアミノ酸配列のパーセント同一性の決定のための適切な方法は以下に記載される。例えば、配列解析ソフトウエア（遺伝学コンピュータグループの配列解析ソフトウエアパッケージ、ウィスコンシン大学、バイオテクノロジーセンター、ウィスコンシン州、５３７０５、マジソン、ユニバシティ通り１７１０）をその中の初期設定パラメーターと共に用いて、配列同一性を測定する。

誘導体の生成は、周知であり、当業者に周知である標準的な方法に従って実施することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，１９８９，上記を参照のこと）。一般に、ＤＮＡの修飾が特徴的な活性を妨害しないという条件で、好適な宿主のＤＮＡ配列による形質転換および修飾されたＤＮＡ配列の発現により、本発明の結合体分子のＤ−ペプチド部分のマトリクスとして使用される天然に生じるＬ型のペプチド様配列をコードするＤＮＡ配列を修飾して、Ｌ−アミノ酸ペプチドの機能的誘導体（「Ｌ型誘導体」を形成することによって誘導体の調製が達成される。そのようなＬ型誘導体の単離は、遠心分離またはろ過によって培地から（宿主）細胞を分離すること、細胞を粉砕した後、必要に応じて、塩、例えば、硫酸アンモニウムによって上清またはろ液中のタンパク質様成分を沈殿すること、次いで、種々のクロマトグラフィー法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーもしくは同様の技術が認識する手順（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，１９８９，上記を参照のこと）を含む常法を用いて、実施することができる。続いて、前記Ｌ型誘導体の逆転アミノ酸配列を合成して、本発明の結合体分子の部分に使用されるようなＤ型誘導体を生じることによって本発明のＤ−鏡像異性レトロインベルソのペプチド様部分を製造することができる。

上述のように、相当する天然に生じるＬ型アミノ酸配列の逆転アミノ酸配列を合成することによって本発明の結合体分子を生成してもよい。この合成は好ましくは、Ｄ−アミノ酸を所望のレトロインベルソ配列に連結する固相合成によって実施される。使用されるＤ−アミノ酸およびレトロインベルソ順序のアミノ酸の合成とは別に、本発明のＤ−アミノ酸配列の合成は、Ｌ−アミノ酸に基づくペプチドの合成と化学的に同一である。

本発明の結合体分子の部分（Ｉ）として使用されるようなペプチドの合成のための出発物質（レトロインベルソＤ−アミノ酸ペプチドのためのマトリクス）は組換え法で製造されてもよい。高い収率が所望であれば組換え法は好ましい。所望のＤＮＡ配列の構築に関する一般的方法は、例えば、Ｂｒｏｗｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９７９） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８：１０９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，１９８９（上記）に提供されている。続いて、上述のように、本発明の結合体分子のＤ−レトロインベルソ鏡像異性部分（Ｉ）が合成される。あるいは、化学合成（例えば、固相タンパク質合成）により、またはそのほかの好適な方法により、本発明の結合体分子の天然に生じるＬ型の部分（Ｉ）をコードする核酸の試験管内の翻訳によって本発明の部分（Ｉ）に対するマトリクスを製造することができる。その後、上述のように、本発明の結合体分子のＤ−レトロインベルソ鏡像異性形態を合成する。

本発明に係る部分（Ｉ）またはそのほかのペプチド様Ｄ−アミノ酸部分を製造する効率的な方法は、本発明の結合体分子のＬ型の部分（Ｉ）をコードする本明細書で提供される核酸もしくはベクターで好適な宿主細胞を形質転換し、得られた組換え微生物、好ましくは大腸菌を、宿主の増殖および核酸の発現に好適な条件下にて、例えば、誘導因子、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などが補充された好適な培地の存在下で培養することによる遺伝子工学技法を利用することを含み、それによって、核酸が発現され、コードされた部分（Ｉ）のマトリクスペプチド（Ｌ−アミノ酸を含有する）が産生される。続いて、上述のように、Ｄ−レトロインベルソ鏡像異性形態が合成される。

Ｌ型のペプチド様部分、例えば、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）の核酸を含むベクターは、Ｌ型の部分、例えば、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）の１以上の核酸配列を含む核酸配列、最終的にはそのほかの配列を規定する。適切な宿主細胞を形質転換し、前記核酸の発現を生じる際、ベクターを使用することができる。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子または単純に潜在的なゲノムのインサートであってもよい。好適な宿主にいったん形質転換すると、ベクターは、宿主のゲノムとは独立して複製し、機能してもよく、または好適な条件下で、ゲノム自体に組み込まれてもよい。本発明に係る好ましいベクターは、大腸菌ＸＬ−Ｂｌｕｅ ＭＲＦおよびｐＢＫ−ＣＭＶプラスミドである。

上述の用語ベクターの「そのほかの配列」は、以下に関する。一般に、好適なベクターは、複製開始点、例えば、Ｏｒｉ ｐ、ｃｏｌＥＩ Ｏｒｉ、挿入された核酸を発現させる配列および／または、例えば、ＧＦＰのような蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む選択可能な遺伝マーカー、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子、例えば、Ｔｎ３からのｐ−ラクタマーゼ遺伝子、Ｔｎ９０３からのカナマイシン耐性遺伝子もしくはＴｎ９からのクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。

用語「プラスミド」は、染色体外の、普通、自己複製する遺伝エレメントである。プラスミドは一般に、文字および数字の前および／または後の低い「ｐ」によって示される。本明細書の出発プラスミドは、市販されているか、非制限をもとに公共に入手可能であるか、または公開された手順に従って入手可能なプラスミドから構築することができる。さらに、記載されたものと同等のプラスミドは当業者に既知である。本発明のベクターを調製するのに採用した出発プラスミドは、例えば、塩化セシウムＤＮＡ単離のような常法を用いて、これらのプラスミドを含有する適切な大腸菌から単離されてもよい。

適切なベクターとはまた、（組換え）クローニングベクターおよび（組換え）発現ベクターをもいう。ＤＮＡクローニングベクターとは、本発明の結合体分子の１以上のＬ型の部分の１以上の追加の核酸が付加されたＤＮＡ分子を含む、プラスミドおよびファージを含むが、これらに限定されない、自律的に複製するものをいう。発現ベクターとは、発現を達成することが可能であり、好適な宿主中で挿入された核酸の転写を制御する好適な制御配列に操作可能に連結された、本発明の結合体分子の１以上のＬ型の部分の核酸配列を含むＤＮＡクローニングベクター組換え構築物をいう。そのようなプラスミドを容易に改変して、例えば、大腸菌、Ｓｆ９（バキュロウイルスの宿主として）、ＳｐｏｄｏｐｔｅｒａおよびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを含む種々の生物で、本発明の結合体分子のＬ型のペプチド様部分を産生する発現ベクターを構築してもよい。文献は、ＡＶ１２発現ベクターを構築し、宿主細胞をＡＶ１２で形質転換するための技法を含有する。本明細書中に参考として援用される米国特許第４，９９２，３７３号は、これらの技法を記載する多数の参考文献の１つである。

「操作可能に連結される」は、核酸配列の発現（例えば、転写および／または翻訳）が可能であるように核酸配列を制御配列に連結することを意味する。「転写」は、それによってＤＮＡの核酸配列に含有された情報が相補的なＲＮＡ配列に移されるプロセスを意味する。

「制御配列」は、当該技術で周知であり、Ｌ型のペプチド様部分の核酸を発現し、その転写を制御するように選択される。そのような制御配列には、ポリアデニル化シグナル、プロモーター（例えば、天然のもしくは合成のプロモーター）または転写を達成するエンハンサー、転写を制御する任意のオペレーター配列、遺伝子座制御領域、または組織特異的な転写を可能にするサイレンサ、ｍＲＮＡ上での好適なリボゾーム結合部位をコードする配列、ｍＲＮＡを安定化することが可能な配列、ならびに転写および翻訳の終了を制御する配列が挙げられるが、これらに限定されない。制御機能を保存しつつ、例えば、１以上の核酸の欠失、付加、挿入または置換によってこれらの制御配列を修飾することができる。ほかの好適な制御配列は当該技術で周知であり、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９１） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載されている。

特に、様々な生物に関して多数の様々なプロモーターが知られている。例えば、枯草菌で使用されるベクターにとって好ましいプロモーターはＡｐｒＥプロモーターであり、大腸菌で使用される好ましいプロモーターはＴ７／Ｌａｃプロモーターであり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒで使用される好ましいプロモーターはｇｌａＡであり、Ｔｒｉｃｂｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉで使用される好ましいプロモーターはｃｂｂＩである。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターには、β−ラクタマーゼ（レプリコンおよびβ−ラクタマーゼ遺伝子を含有するベクターｐＧＸ２９０７（ＡＴＣＣ３９３４４）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９７８，Ｎａｔｕｒｅ （Ｌｏｎｄｏｎ），２７５：６１５；Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）２８１：５４４）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（ｔｒｐプロモーターの制御のもとでｔｒｐＥ融合タンパク質としてオープンリーディングフレームの発現を促進するように設計されたベクターｐＡＴＨ１（ＡＴＣＣ３７６９５））、およびｔａｃプロモーター（プラスミドｐＤＲ５４０、ＡＴＣＣ−３７２８２から単離可能）のようなハイブリッドプロモーターも挙げられる。しかしながら、そのヌクレオチド配列が一般に知られているそのほかの機能的な細菌性プロモーターについては、当業者が、リンカーまたはアダプタを用いて本発明のＬ型のペプチド様部分をコードするＤＮＡにそれらを連結し、要求される制限部位を供給することができる。細菌系で使用するためのプロモーターはまた、所望の本発明のＬ型のペプチド様部分をコードするＤＮＡに操作可能に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列も含有する。

有用な発現ベクターは、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列の断片、例えば、ＳＶ４０の種々の既知の誘導体もしくは断片、および既知の細菌性プラスミド、例えば、ｃｏｌＥ１、ｐＢＫ、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭｂ９、ｐＵＣ１９およびそれらの誘導体を含む大腸菌由来のプラスミド、さらに広い宿主範囲のプラスミド、例えば、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えば、ファージラムダの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、およびそのほかのＤＮＡファージ、例えば、Ｍ１３およびフィラメント状の短鎖ＤＮＡファージ、酵母プラスミド、真核細胞に有用なベクター、例えば、動物細胞で有用なベクターおよびプラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター、例えば、ファージＤＮＡもしくはそのほかの発現制御配列を用いるように修飾されたプラスミドから構成されてもよい。上述の発現ベクターを用いた発現の技法は当該技術で既知であり、一般に、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，１９８９，上記、に記載されている。

本発明の結合体分子のＬ型のペプチド様部分の前述のベクターまたは核酸を含む好適な「細胞」または「宿主細胞」は、上述の核酸またはベクターのための宿主または発現ビヒクルとして作用する能力を有する。宿主細胞は、例えば、原核細胞、真核細胞または古細菌細胞であることができる。（例えば、形質転換、トランスフェクション、形質伝達の結果として）本明細書で記載するようなベクターまたは核酸を含む宿主細胞としては、細菌細胞（例えば、Ｒ．ｍａｒｉｎｕｓ、大腸菌、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）およびカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ．）を含む真菌、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）または哺乳類細胞（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、宿主細胞は大腸菌を意味する。一般に、該当する挿入された配列の発現を修飾するまたは特定の所望の方式で配列によってコードされる発現されたタンパク質を修飾するもしくはプロセシングする宿主細胞を選択してもよい。従って、外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングが確実に達成されるように適切な細胞または細胞株または宿主系を選択してもよい。例えば、細菌系の中でのタンパク質の発現は、非グリコシル化のコアタンパク質の製造に使用することができるが、哺乳類細胞での発現は不均質なタンパク質の「天然の」グリコシル化を確実にする。

特定の真核細胞宿主で使用するのに真核細胞宿主は限定されない。種々の真核宿主細胞は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）のような寄託機関から入手可能であり、上述のような種々のベクターを伴った使用に好適である。特定の宿主細胞の選択は、本発明のＬ型のペプチド様部分の核酸の発現を導くのに使用される特定の発現ベクターにある程度依存する。真核生物宿主細胞としては、哺乳類細胞ならびに酵母細胞が挙げられる。多数のそのほかの株が一般に利用可能ではあるが、不完全真菌であるＳａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、最も一般に使用される真核微生物である。Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．での発現については、例えば、プラスミドＹＲｐ７（ＡＴＣＣ−４００５３）が一般に使用される（例えば、Ｓｔｉｎｃｈｏｍｂ Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９；Ｋｉｎｇｓｍａｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９７９，Ｇｅｎｅ ７：１４１；Ｓ．Ｔｓｈｅｍｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｇｅｎｅ １０：１５７）。このプラスミドは、トリプトファン中での増殖する能力を欠く酵母の変異株のための選択可能なマーカーを提供するｔｒｐ遺伝子をすでに含有する。

酵母宿主と共に使用するために適切なプロモーター配列としては、３−ホスホグリセレートキナーゼ（プラスミドｐＡＰ１２ＢＤ（ＡＴＣＣ５３２３１）に見い出され、本明細書中に参考として援用される、１９９０年６月１９日に発行された米国特許第４，９３５，３５０号に記載される）、またはそのほかの解糖酵素、例えば、エノラーゼ（プラスミドｐＡＣ１（ＡＴＣＣ３９５３２）に見い出される）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（プラスミドｐＨｃＧＡＰＣ１（ＡＴＣＣ５７０９０、５７０９１）に由来する）、ヘキソキナーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼおよびグルコキナーゼ、ならびに、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ ｍｏｂｉｌｉｓ（本明細書中に参考として援用される、１９９１年３月１９日に発行された米国特許第５，０００，０００号）のアルコールデヒドロゲナーゼおよびピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子が挙げられる。誘導性プロモーターであって、増殖条件を変化させることによって制御可能であるという転写のさらなる利点を有するそのほかの酵母のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２のプロモーター領域、イソチトクロームＣのプロモーター領域、酸性ホスファターゼのプロモーター領域、窒素代謝に関連する分解酵素のプロモーター領域、メタロチオネインのプロモーター領域（プラスミドベクターｐＣＬ２８ＸｈｏＬＨＢＰＶ（ＡＴＣＣ３９４７５）に含有され、本明細書中に参考として援用される米国特許第４，８４０，８９６号に記載される）、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼのプロモーター領域、ならびにマルトースおよびガラクトースの利用を担う酵素（例えば、プラスミドｐＲＹ１２１（ＡＴＣＣ３７６５８）に見い出されるＧＡＬ１）が挙げられる。Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＵＡＳＧａ１のような酵母のエンハンサー（プラスミドＹＥｐｓｅｃ−−ｈＩ１β、ＡＴＣＣ６７０２４のＣＹＣ１プロモーターに関連して見い出される）も酵母のプロモーターと共に有利に使用される。

前述のベクターは、任意の適切な方法（例えば、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストランまたはそのほかの物質を用いた、形質転換、エレクトロポレーション、トランスフェクション、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、リポフェクション、感染または形質導入）を用いて宿主細胞に導入され得る。形質転換は、ＤＮＡが染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込みによって複製可能であるように生物にＤＮＡを導入することに関する。細菌宿主および真核宿主を形質転換する方法は当該技術で周知である。核注入、プロトプラスト融合またはカルシウム処理によるような多数の方法が、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ，１９８９，上記、にまとめられている。トランスフェクションは、コーディング配列が実際発現されていようとそうでなかろうと、宿主細胞によるベクターの取り込みを言う。このベクターの指標または作動が宿主細胞内で生じれば、成功したトランスフェクションが一般に認識される。

あるいは、当業者は、本発明の結合体分子の部分（Ｉ）またはそのほかのペプチド様部分が多数のそのほかの方法によって製造され得ることを認識する。本発明のアミノ酸配列はすべて、固相タンパク質合成を含めた、当該技術で周知の化学的方法によって合成され得る。両方の方法は、米国特許第４，６１７，１４９号に記載されており、この全体は本明細書中に参考として援用される。ペプチドの固相化学合成の原理は当該技術で周知であり、例えば、Ｄｕｇａｓ Ｈ．ａｎｄ Ｐｅｎｎｅｙ Ｃ，１９８１，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐａｇｅ ５４−９２に記載されている。例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａペプチド合成機（カリフォルニア州、フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓより市販）およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製の合成サイクルを利用して固相法によってタンパク質およびペプチドを合成してもよい。ｔ−ブトキシカルボニル保護（Ｂｏｃ）アミノ酸のような保護されたアミノ酸およびそのほかの試薬は多数の化学品供給会社から市販されている。Ｃ末端カルボキサミドの製造のための出発物質４−メチルベンズヒドロキシアミン樹脂に、二重カップルプロトコールを用いた逐次ｔ−ブトキシカルボニル化学反応が適用される。以下の側鎖保護を使用し得る：Ａｒｇ、トシル；Ａｓｐ、ベンジルオキシ；Ｇｌｕ、ベンジルオキシ、シクロヘキシルオキシ；Ｇｌｎ、キサンチル；Ａｓｎ、キサンチル；Ｃｙｓ、４−Ｍｅ−Ｂｚｌ；Ｓｅｒ、ベンジル；Ｔｈｒ、ベンジル；Ｔｙｒ、２−ブロモカルボベンゾキシ。代替法として、利用しやすい修飾の範囲を広げるために、さらに穏やかで且つ利用しやすいフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応戦略を採用することができる。以下の側鎖保護を使用し得る：Ａｒｇ、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル；Ａｓｐ、ｔ−ブトキシ；Ｇｌｕ、ｔ−ブトキシ；Ｇｌｎ、トリチル；Ａｓｎ、トリチル；Ｓｅｒ、ｔ−ブチル；Ｔｈｒ、ｔ−ブチル；Ｔｙｒ、２ｔ−ブチル。

Ｂｏｃ戦略では、ｔ−ブトキシカルボニル部分の取り外し（脱保護）は、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）によって達成され得る。合成の完了に続いて、タンパク質またはペプチドを脱保護し、１０％メタ−クレゾールを含有する無水フッ化水素によって樹脂から切断してもよい。側鎖保護基およびペプチド部分の樹脂からの切断は、０℃以下、好ましくは−２０℃で３０分間、次いで０℃で３０分間行われる。フッ化水素を除いた後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄し、氷酢酸でペプチドを抽出し、次いで凍結乾燥する。Ｆｍｏｃ戦略では、Ｆｍｏｃ脱保護の間、ピペリジンを用いた穏やかな塩基処理に成長中のペプチドを供し、ＴＦＡは、最終的な切断およびペプチジル樹脂にのみ必要とされる。ジエチルエーテルでペプチドを洗浄し、精製の前に凍結乾燥する。

本発明は臨床応用に言及し、医学および生物学の研究に有利に適用され得ることが十分に理解されるべきである。本発明を臨床用途に従わせるために、治療用化合物としての本発明の結合体分子を含み、必要に応じて薬学上許容可能なキャリア、アジュバントおよび／またはビヒクルを含む医薬組成物が提供される。医薬組成物は、癌性疾患／腫瘍性症状／腫瘍の治療が意図される。好ましくは、これらの疾患としては、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、組織細胞性リンパ腫のようなリンパ系の腫瘍、脳の癌（例えば、膠芽細胞腫）、卵巣癌、泌尿生殖器癌、結腸癌、肝臓癌、結腸直腸癌、骨癌、呼吸器癌、眼癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、胃癌、咽頭癌、ならびに、肺腺癌および小細胞肺癌を含めた肺癌、ならびに／または例えば、黒色腫または基底細胞癌および扁平上皮癌を含めた非黒色腫皮膚癌などの皮膚癌が挙げられる。同様に、本発明は、本発明による結合体分子の治療上の有効量を投与する工程を包含する、状態（例えば、上述の状態のうちの１つ）を治療する方法を包含する。

本発明の別の実施形態はまた、癌、例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、組織細胞性リンパ腫のようなリンパ系の腫瘍、急性または慢性の白血病、脳の癌（例えば、膠芽細胞腫）、卵巣癌、泌尿生殖器癌、結腸癌、肝臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、眼癌、骨癌、呼吸器癌、胃癌、咽頭癌、ならびに、肺腺癌および小細胞肺癌を含めた肺癌、ならびに／または黒色腫または基底細胞癌および扁平上皮癌を含めた非黒色腫皮膚癌などの皮膚癌の治療のための治療方法、あるいはその治療もしくはそのための薬物を調製するための本発明の結合体分子または本発明の結合体分子を含む医薬組成物の使用に関する。あるいは、本発明の結合体分子は、ウイルス、細菌または原生動物の感染疾患、特にレトロウイルス感染（例えば、ＨＩＶ感染）もしくはＨＣＶ感染の治療のために、または治療のための薬物を調製するために、使用されてもよい。同様に、本発明は、本発明による結合体分子の治療上の有効量を投与する工程を包含する、状態（例えば、上述の状態のうちの１つ）を治療する方法を包含する。

本発明による「薬学上許容可能なキャリア、アジュバントおよび／またはビヒクル」は、それとともに製剤化される治療用化合物としての本発明の結合体分子の薬理的活性を破壊しない、非毒性のキャリア、アジュバントまたはビヒクルをいう。本発明の組成物で使用してもよい薬学上許容可能なキャリア、アジュバントおよび／またはビヒクルとしては、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）、緩衝剤（例えば、リン酸塩）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム）、亜鉛塩、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の医薬組成物は、非経口でまたは非経口ではなく（例えば、経口で）投与され得る。

本明細書で使用する場合、用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑膜内、腹腔内、胸骨内、くも膜下、肝臓内、病変内および頭蓋内の注射または注入を包含する。非経口で投与される場合、医薬組成物は好ましくは、皮下または静脈内に投与される。本発明の医薬組成物の適切な注射可能形態は、水性または油性の懸濁液であってもよい。好適な分散剤、湿潤剤および懸濁剤を用いて当該技術で既知の方法に従って、これらの懸濁液を製剤化してもよい。無菌の注射可能調製物はまた、非毒性の非経口可能な希釈剤または溶媒、例えば、１，３−ブタンジオールの溶液としての無菌の注射可能な溶液または懸濁液であってもよい。採用され得る許容可能なビヒクルおよび溶媒の中でも、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、無菌の固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来採用されている。

この目的で、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含め、任意の無刺激の固定油を採用し得る。オレイン酸およびそのグリセリド誘導体のような脂肪酸は、例えば、オリーブ油またはヒマシ油、特にそのポリオキシエチル化物は、天然の薬学上許容可能な油なので、注射剤の調製に有用である。これら油の溶液または懸濁液はまた、長鎖のアルコール希釈剤または分散剤、例えば、カルボキシメチルセルロースまたはエマルションおよび懸濁剤を含め、薬学上許容可能な投与形態の処方に共通して使用される同様の分散剤も含有してもよい。薬学上許容可能な固体、液体またはそのほかの投与形態の製造に共通して使用されるそのほかの共通して使用される界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよびそのほかの乳化剤または生物利用性向上剤）も処方の目的で使用されてもよい。

経口で投与される場合、本発明の医薬組成物は、カプセル、錠剤、水性の懸濁液または溶液を含むがこれらに限定されない、任意の経口で許容可能な投与形態でも投与してもよい。経口用の錠剤の場合、共通して使用されるキャリアとしては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤も代表的に添加される。カプセル形態の経口投与については、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーンスターチが挙げられる。水性の懸濁液が経口用途に必要とされる場合、活性成分は、乳化剤および懸濁剤と組み合わせられる。所望であれば、特定の甘味剤、矯味矯臭剤または着色剤も添加してもよい。さらに、標準的な製薬方法を採用して作用の持続時間を制御することができる。これらは当該技術で周知であり、これらとしては制御放出製剤が挙げられ、適切な高分子、例えば、ポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレンビニルアセテート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたは硫酸プロタミンを含み得る。放出を制御するために、高分子の濃度および取り込み方法を調整することができる。さらに、例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレンビニルアセテートコポリマーのようなポリマー物質の粒子に薬剤を組み入れることができる。組み入れることに加えて、微量カプセル中に化合物を捕捉するのにこれらの薬剤を使用することができる。

さらなる投与形態は、例えば、吸入スプレー、局所、直腸内、鼻内、頬内、膣内によるもの、または埋め込んだリザーバを介するものであり、それらの一部は、以下でさらに詳細に記載される。

従って、本発明の医薬組成物は、直腸投与用に坐剤の形態で投与してもよい。室温では固体であるが直腸温で液体であるので直腸で溶解して薬剤を放出する適切な非刺激性の賦形剤と薬剤とを混合することによってこれらを調製することができる。そのような物質としては、カカオ脂、蜜蝋およびポリエチレングリコールが挙げられる。

本発明の医薬組成物は、特に、治療の標的が、眼、皮膚または下部腸管の疾患を含めた、局所適用によって容易に接近可能な領域または臓器を含む場合、局所的に投与してもよい。これら領域または臓器のそれぞれについて適切な局所製剤が容易に調製される。下部腸管の局所適用は、直腸用坐剤処方物（上記を参照）または好適な浣腸剤処方物において達成することができる。局所用経皮パッチも使用してもよい。局所適用については、１以上のキャリアに懸濁されたまたは溶解された活性成分を含有する好適な軟膏で医薬組成物を製剤化してもよい。本発明の結合体分子の局所投与のためのキャリアとしては、鉱物油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックスおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、１以上の薬学上許容可能なキャリアに懸濁または溶解された活性結合体分子を含有する適切なローションまたはクリームで医薬組成物を製剤化してもよい。適切なキャリアとしては、鉱物油、ソルビタン、モノステアレート、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。

眼科用の用途については、等張のｐＨを調整した無菌の生理食塩水中の微細懸濁液として、または好ましくは等張のｐＨに調整した無菌の生理食塩水の溶液として、例えば、塩化ベンジルアルコニウム（ｂｅｎｚｙｌａｌｋｏｎｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）のような保存剤をともなって、または伴わずにのいずれかで、医薬組成物を製剤化してもよい。あるいは、眼科用途については、ワセリンのような軟膏中に医薬組成物を製剤化してもよい。

本発明の医薬組成物は、鼻内エアゾールまたは吸入によって投与されてもよい。そのような医薬組成物は、医薬製剤化についての当該技術で周知の技法に従って調製され、ベンジルアルコールまたはそのほかの好適な保存剤、生物利用性を高める吸収促進剤、フルオロカーボンおよび／または従来の可溶化剤または分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製される。

最も好ましくは、本発明の医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。

キャリア、アジュバントおよびビヒクルと組み合わせて単一投与量形態で医薬組成物を製造してもよい本発明の結合体分子の量は、治療される宿主、投与の特定の様式に依存して変化する。好ましくは、０．０１〜１００ｍｇ／体重ｋｇ／日の間の投与量の阻害剤をこれら組成物を服用する患者に投与することができるように医薬組成物を製剤化すべきである。好ましい投与量は、０．１〜５ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内であり、さらに一層好ましい投与量は、１〜５ｍｇ／体重ｋｇ／日の範囲内である。

本発明の化合物の投与にとって有用な薬学上の投与形態を以下のように説明することができる。

カプセル：カプセルは、標準的な２個の硬質ゼラチンカプセルにそれぞれ１００ｍｇの粉末化活性成分、１７５ｍｇのラクトース、２４ｍｇのタルクおよび６ｍｇのステアリン酸マグネシウムを詰めることによって調製される。軟質ゼラチンカプセル：大豆油中の活性成分の混合物を調製し、ポジティブ置換ポンプによってゼラチンに注入して、１００ｍｇの活性成分を含有する軟質ゼラチンカプセルを形成する。このカプセルを次いで洗浄し、乾燥する。錠剤：錠剤は、投与量単位が、１００ｍｇの活性成分、０．２ｍｇのコロイド状二酸化ケイ素、５ｍｇのステアリン酸マグネシウム、２７５ｍｇの微小結晶セルロース、１１ｍｇのコーンスターチおよび９８．８ｍｇのラクトースであるように従来の手順によって調製される。適切なコーティングを塗布して口当たりをよくしたり、吸収を遅らせたりしてもよい。注射可能物：注射によって投与するのに好適な非経口組成物は、１０重量％のプロピレングリコール中１．５重量％の活性成分および水を撹拌することによって調製される。塩化ナトリウムによって溶液を等張にし、滅菌する。懸濁剤：各５ｍｍが１００ｍｇの微分活性成分、２００ｍｇのカルボキシメチルセルロースナトリウム、５ｍｇの安息香酸ナトリウム、１．０ｇのソルビトール溶液ＵＳＰ、および０．０２５ｍｇのバニリンを含有するように経口投与用に水性懸濁液が調製される。

特定の患者に対する具体的な投与量および治療レジメンは、採用される具体的な結合体分子の活性、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与の時間、排泄速度、薬剤の組合せ、および担当医の判断および治療される特定の疾患の重篤度を含む種々の因子に依存することに留意すべきである。医薬組成物中の本発明の結合体分子の量は、組成物における特定の結合体分子にも依存する。

本明細書で使用される用語は以下のように解釈されるものとする。本明細書で使用される場合、例えば、「治療用化合物」および「治療上有効な量」における、用語「治療」は、少なくともなんらかの最小限の生理的効果を有することを意味する。例えば、「治療用化合物」は、生体に投与された際、少なくともなんらかの最小限の生理的効果を有する。例えば、その存在がレシピエント動物に結果として生理的変化を生じるならば、薬剤は、生体に投与された際、少なくとも幾つかの最小限の生理的効果を有する。例えば、「治療上」の抗腫瘍化合物を投与した際の生理的効果は、腫瘍増殖の阻害または腫瘍サイズの低下または腫瘍の再発の防止であってもよい。「治療上有効な量」の投与は、投与された量が生理的に有意であることを意味する。ある薬物の存在がレシピエント動物に結果として生理的変化を生じるならば、その薬剤は生理的に有意である。例えば、癌または腫瘍性疾患の治療において、腫瘍の増殖を阻害する、腫瘍のサイズを小さくする、または腫瘍の再発を予防する化合物は、治療上有効であると考えられる。用語「抗腫瘍剤」は、腫瘍、腫瘍性疾患または癌に対して治療効果を有する任意の治療剤を意味する。用語「薬剤」は、動物に投与した場合、治療効果を有する任意の薬剤を意味する。治療上の処置への本投与の投与量は、投与された薬剤の治療上有効な量を生じるのに十分である。用語「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は、治療用化合物の治療上有効な量を投与することによる効果を求める動物における任意の状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、状態（ｓｔａｔｅ）、疾患、異常、不均衡、病気等を意味する。状態は、癌／腫瘍性疾患／腫瘍およびそれに関連する状態を含むことを意味する。例えば、「状態を治療する」に使用される用語「治療する」は、少なくとも、治療用化合物の治療上有効な量を投与して治療効果を引き出すことを意味する。それは必ずしも「治癒すること」を意味するわけではなく、むしろ、状態を有する生体に投与した際、状態に少なくとも何らかの最小限の効果を有することを示す。例えば、治療は、薬剤を投与することを包含し、その薬剤の存在が結果としてレシピエント動物に生理的変化を生じればよい。

本発明のさらなる実施形態は、薬剤部分を少なくとも１つの薬剤キャリア部分に共有結合させることによって治療用化合物を創製し、抗癌剤またはプロテアーゼ阻害剤の部分の細胞透過性または細胞内滞留時間を改善する方法に関し、ここで、該治療用化合物は本発明による結合体分子である。本発明による方法によって、細胞内に位置する薬剤分子の部分が相当に増大し得る。好ましくは、本発明による方法は、結合体分子を使用し、その際、薬剤キャリア部分は、約１，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの範囲内の分子量を有する。本発明による方法によって、本発明の結合体分子が、キャリア部分なしの抗癌剤またはプロテアーゼ阻害剤の薬剤部分の細胞透過性または細胞内滞留時間よりも大きな細胞透過性または細胞内滞留時間を有することを確実にし得る。

以下の図面および実施例は、本発明を説明すると考えられ、本発明の範囲をそれらに限定すると解釈すべきではない。本出願の開示によって引用された参考文献はすべて、本明細書中に参考として援用される。

多数の生化学的および薬学的プロセスは、関与する分子の親水性および疎水性に依存しており、化合物に関するこれらのパラメーター化は、定量的な構造−活性の関係（ＱＳＡＲ）の研究において、特に、吸収、生物利用性、薬剤−受容体の相互作用、代謝および毒性に関して重要である。分配係数（ｌｏｇＰ）は、２つの溶媒における化合物の異なる溶解度の尺度である。これら分配係数で最も周知のものは、溶媒であるオクタノールと水とに基づくものである。古典的でかつ最も信頼できる方法は、シェイク−フラスコ法であり、この方法は、既知の容量のオクタノールおよび水の中で既知の量の溶質を混合し、次いで各溶媒中の溶質の分布を測定することからなる。荷電した化合物について正確な方法は、完全な平衡化の後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって双方の相における溶質の分布を測定することにある。

これらの実施例が本発明の範囲を限定することを意図することは決してないが、本発明者らが現在知っている好ましい実施形態の一例を単に説明することが理解されるべきである。追加の実施形態は、本発明の範囲内である。

（実施例１）
（結合体分子：Ｄ−Ｔａｔ−シスプラチンの合成）
１．１．材料
特定しない限り、溶媒および試薬はすべて、スイス、ブックスのフルカから入手し、分析用またはそれより高い等級であり、さらに精製することなく使用した。アミノ酸および樹脂はすべてスイス、ルチェルンのＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから購入した。水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。

１．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−Ａ、５μｍＣ_８粒子を充填したカラム２５０×４ｍｍ ｉ．ｄ．を用い、流速１．０ｍＬ／分にて分析用ＲＰ−ＨＰＬＣを行い、溶出を２１４ｎｍでモニターした。Ｃ_８カラム（２５０×１０ｍｍ ｉｄ、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ３００−Ａ、５μｍ粒度）を用い、流速４ｍＬ／分にて半分取用のペプチド精製を行い、２１４ｎｍでモニターした。ＲＰ−ＨＰＬＣで使用した溶媒は以下のとおりであった：Ａ、０．１％ＴＦＡ（１．０Ｌの蒸留水中１．０ｇのＴＦＡ）；Ｂ、９０％アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ（１．０ｇのＴＦＡを１００ｍＬの水に混合し、次いでアセトニトリルで１．０Ｌにした）。一般に、分析作業で使用した条件は、線形勾配３％Ｂ〜１００％Ｂであり、半分取用作業では、さらに浅い線形勾配（普通、０．５％Ｂ／分）を用いた。検出器の出口で化合物を手動で回収し、室温で部分的に蒸発させ、凍結し、次いで凍結乾燥によって回収した。

１．３．質量分析
Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＩＩ機器（英国、マンチェスターのＭｉｃｒｏｍａｓｓ）において陽イオン方式にてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。１０μＬ／分にて試料を溶媒、アセトニトリル／水／ギ酸（４９．９：４９．９：０．２）に導入した。ウマ心臓のアポミオグロビンを用いてエレクトロスプレー機で外部補正を行った。

１．４．ペプチド（Ｄ−ＴＡＴ−メチオニン）の合成
ペプチド配列は、ＤＭ−Ｇ−Ｇ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＱ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＫ−ＤＫ−ＤＲであり、Ｆｍｏｃで保護されたアミノ酸の側鎖保護は、Ａｒｇ（ｐｂｆ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ化学反応を用いることによって０．４ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−アミド−ＡＭ樹脂にて手動で合成を行った。従って、Ｃ末端のＤ−ＡｒｇからＮ末端のＤ−Ｍｅｔまでの各アミノ酸は、Ｆｍｏｃの脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）およびアミノ酸のカップリング（ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）のサイクルを用いて、順次樹脂に結合された。ＴＦＡ（２．５％ｄＨ_２Ｏ、２．５％ＥＤＴおよび１％ＴＩＳの存在下で５時間）によってペプチドを樹脂から切断し、減圧下でろ過し、冷却エーテルで沈殿させ、乾燥した。粗精製のペプチドを半分取用ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

１．５．シスプラチンに対するペプチドのアルキル化
５．０μｍｏｌのシスプラチン（３．０ｍＬの塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ５．０中で１．５ｍｇ）を、２．０ｍＬの１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解した。この溶液のｐＨ値は７．０であった。５．０μｍｏｌのＤ−ＴＡＴ−メチオニンペプチドを１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７．４）で調製し、溶液のｐＨ値は６．０であった。次いで、暗所にて室温で２つの溶液を混合することによって（混合物のｐＨ値は７．０であった）、アルキル化を開始した。０時間後、１時間後、３時間後および２４時間後、分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで生成物を分析し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣによって最終的に予想されるピーク溶液を精製し、凍結乾燥した。

（比較試験）
１．６．試験条件
ＩＧＲＯＶ−１（卵巣）、ＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰ（卵巣、シスプラチン耐性細胞株）、ＭＣＦ−７（乳癌）、およびＭＲＣ−５（ヒト線維芽細胞）（３種のヒト腫瘍細胞株および１種のヒト線維芽細胞株）の生存に対する、漸増濃度の本発明の結合体分子（シスプラチン−Ｄ−ＴＡＴ）および非結合型の抗癌剤（シスプラチン）の処理の効果を決定した。各細胞株の細胞（１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０（最終容量２００μＬ））を９６ウェルプレート（各試験物質当たり５つの異なる濃度、対照実験が１つ）に播いた。試験物質で処理する前にウェル当たり５，０００個〜４０，０００個の細胞（各細胞株の倍増時間に依存する）を３７℃にて２４時間インキュベートした。各実験は４回行った。処理後のインキュベートを３７℃で９６時間行った。ＭＴＴアッセイを用いてこれらの細胞株の生存に対する（試験管内細胞傷害性活性）シスプラチン−Ｄ−ＴＡＴおよびシスプラチンの影響を決定した。５ｍｇ／ｍＬの、０．２２ミクロンのフィルターを通した、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ、ＢＥ１７−５１７Ｑ、Ｃａｍｂｒｅｘを参照のこと）中のテトラゾリウム試薬（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ Ｍ２００３を参照のこと）溶液２０μＬを各ウェルに加えた。培養プレートを３７℃で４時間インキュベートした。得られた上清を除き、ウェル当たり２００μＬのＤＭＳＯにホルマザン結晶を溶解した。５７０ｎｍでの単一波長の分光光度計プレートリーダー（フィンランド、ヘルシンキのマルチスキャンＬａｂｓｙｓｔｅｍ）で各ウェルの吸収（ＯＤ）を測定した。ジェネシスソフトウエア（フィンランド、ヘルシンキのＬａｂｓｙｓｔｅｍ）によってデータを回収した。プロットした後、各細胞株について試験物質のＩＣ_５０（５０％の細胞増殖を阻害する薬剤の濃度）を算出した。対照の細胞をビヒクルで処理した。

１．７．結果
以下の結果が得られた。シスプラチン−Ｄ−ＴＡＴについて調べた細胞株ＭＲＣ−５、ＭＣＦ−７、ＩＧＲＯＶ−１およびＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰは、この物質に感受性であり、ＭＣＦ−７およびＭＲＣ−５細胞株についてはＩＣ_５０はそれぞれ４．８９〜２０．６１μＭの範囲内であった。ＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰ細胞株（シスプラチン抵抗性細胞株）は、親株のＩＧＲＯＶ−１細胞株と比べた場合、シスプラチン−Ｄ−ＴＡＴ試験物質に対しておよそ２倍の耐性指数を示した。シスプラチン（キャリア部分Ｄ−Ｔａｔなし）で調べた細胞株はすべてその物質に感受性であり、ＩＣ_５０は、ＩＧＲＯＶ−１およびＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰ細胞株についてそれぞれ、１．２０〜５２．３２μＭの範囲であった。しかしながら、ＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰ細胞株は、親株のＩＧＲＯＶ−１細胞株と比べた場合、非結合型のシスプラチン試験物質に対しておよそ４０倍の耐性指数を示した。シスプラチン−Ｄ−ＴＡＴおよびシスプラチンはおよそ同程度に活性があるが、ＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰのようなシスプラチン耐性細胞株は、本発明の結合シスプラチン−Ｄ−Ｔａｔ分子による処理にさらに感受性であることが明瞭に示される。結果を表１および図４に示す。結果は細胞の生存の百分率として表現される。各値は４つの測定値の平均である。

（実施例２）
２．１．結合体分子：Ｓ−Ｔａｔ−オキサリプラチンの合成

２．１．１．材料
特定しない限り、溶媒および試薬はすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ブックス、スイスから入手し、分析用またはそれより高い等級であり、さらに精製することなく使用した。Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）（スイス、メイランのＳａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ Ｓ．Ａ．）として製剤化されたオキサリプラチンを用いた。アミノ酸および樹脂はすべてスイス、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎの、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。

２．１．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
カラム１００×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．５μｍのＣ_１８粒子を用い、流速１．５ｍＬ／分にてセクション１．２で上記に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣを行い、２１４／２８０ｎｍで溶出をモニターした。Ｃ_１８カラム（１００×１９ｍｍ ｉｄ、５μｍ粒度）を用い、流速１５ｍＬ／分で半分取用ペプチド精製を行い、２１４／２８０ｎｍでモニターした。

２．１．３．質量分光分析
線形イオントラップＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（米国、サンノゼ）において陽イオン方式にてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。溶媒１：１（ｖ：ｖ）（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）：（１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸）にて１０μＬ／分で試料を導入した。ウマ心臓のアポミオグロビンを用いて外部補正を行った。

２．１．４．ペプチド（Ｄ−Ｔａｔ−メチオニン）の合成
ペプチド配列は、Ｍ−βＡ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＱ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＫ−ｄＫ−ｄＲ−Ｇ（Ｄ−アミノ酸は同義語として本明細書では「ｄ」でも示される）であり、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸の側鎖保護は、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ化学反応を用いて０．２３ｍＭのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂にて手動で合成を行った。従って、Ｃ末端のＧｌｙからＮ末端のｌ−Ｍｅｔ（Ｌ型）までの各アミノ酸は、Ｆｍｏｃの脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）およびアミノ酸のカップリング（ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）のサイクルを用いて、順次樹脂に結合された。ＴＦＡ（２．５％ｄＨ_２Ｏ、０．５％ＥＤＴおよび２．０％ＴＩＳの存在下で２時間）によってペプチドを樹脂から切断し、大気圧でろ過し、Ｎ_２の気泡で容積を減らし、冷却エーテルで沈殿させ、風乾した。粗精製のペプチドを半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

２．１．５．オキサリプラチンに対するペプチドのアルキル化
１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７．４）５．０ｍＬ中のＥｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）（オキサリプラチナム４．０ｍｇ、ラクトサムモノヒドリカム３６．０ｍｇ）として製剤化されたオキサリプラチン１０μｍｏｌ、１０μｍｏｌのＤ−Ｔａｔ−メチオニンペプチドを５．０ｍＬのｄＨ_２Ｏ中で調製した。室温にて２つの溶液を混合することによりアルキル化を開始した。溶液のｐＨのデータはない。次いで３７℃で反応を行い、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍにて２４時間にわたり分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、標的のピークをＥＳＩ−ＭＳによって特徴付けし、半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、次いで凍結乾燥した。

２．２．結合体分子：Ｌ−Ｔａｔ−オキサリプラチンの合成

２．２．１．材料
特定しない限り、溶媒および試薬はすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ブックス、スイスから入手し、分析用またはそれより高い等級であり、さらに精製することなく使用した。Ｅｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）（スイス、メイランのＳａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ Ｓ．Ａ．）として製剤化されたオキサリプラチンを用いた。アミノ酸および樹脂はすべてスイスのＬａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。Ｌ型のアミノ酸は、本明細書では「ｌ」とする。

２．２．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
カラム１００×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．５μｍのＣ_１８粒子を用い、流速１．５ｍＬ／分にてセクション１．２で上記に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣを行い、２１４／２８０ｎｍで溶出をモニターした。Ｃ_１８カラム（１００×１９ｍｍ ｉｄ、５μｍ粒度）を用い、流速１５ｍＬ／分で半分取用ペプチド精製を行い、２１４／２８０ｎｍでモニターした。

２．２．３．質量分光分析
線形イオントラップＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（米国、サンノゼ）において陽イオン方式にてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。溶媒１：１（ｖ：ｖ）（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）：（１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸）にて１０μＬ／分で試料を導入した。ウマ心臓のアポミオグロビンを用いて外部補正を行った。

２．２．４．ペプチド（Ｌ−Ｔａｔ−メチオニン）の合成
ペプチドの配列は、Ｈ_２Ｎ−Ｍ−βＡ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−ＣＯＮＨ_２であり、Ｆｍｏｃ保護したアミノ酸の側鎖保護は、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ化学反応を用いて０．２３ｍＭのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂にて手動で合成を行った。従って、Ｃ末端のＡｒｇからＮ末端のｌ−Ｍｅｔ（Ｌ型）までの各アミノ酸は、Ｆｍｏｃの脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）およびアミノ酸のカップリング（ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）のサイクルを用いて、順次樹脂に結合された。ＴＦＡ（２．５％ｄＨ_２Ｏ、０．５％ＥＤＴおよび２．０％ＴＩＳの存在下で２時間）によってペプチドを樹脂から切断し、大気圧でろ過し、Ｎ_２の気泡で容積を減らし、冷却エーテルで沈殿させ、風乾した。粗精製のペプチドを半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

２．２．５．オキサリプラチンへのペプチドのアルキル化
１０ｍＭのＮａ_２ＨＰＯ_４緩衝液（ｐＨ７．４）５．０ｍＬ中のＥｌｏｘａｔｉｎ（登録商標）（オキサリプラチナム４．０ｍｇ、ラクトサムモノヒドリカム３６．０ｍｇ）として製剤化されたオキサリプラチン１０μｍｏｌ、１０μｍｏｌのＬ−Ｔａｔ−メチオニンペプチドを５．０ｍＬのｄＨ_２Ｏ中で調製した。室温にて２つの溶液を混合することによりアルキル化を開始した。溶液のｐＨのデータはない。次いで３７℃で反応を行い、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍにて２４時間にわたり分析用ＲＰ−ＨＰＬＣによってモニターし、標的のピークをＥＳＩ−ＭＳによって特徴付けし、半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製し、次いで凍結乾燥した。

２．３．競合試験
２．３．１．試験条件
ＭＣＦ−７（ヒト乳腺癌細胞株）およびＳｉＨａ（ヒト子宮頚部扁平上皮癌細胞株）の生存に対する漸増濃度の本発明の結合体分子（Ｄ−Ｔａｔ−オキサリプラチン）による処理の効果を決定した。Ｄ−Ｔａｔ−オキサリプラチンの効果を結合体Ｌ−Ｔａｔ−オキサリプラチンおよび２つの非結合型の抗癌剤（オキサリプラチンおよびシスプラチン）と比較した。各細胞株の細胞（ウェル当たり１０，０００細胞）を９６ウェルプレートに播いた（ＭＣＦ−７については１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸を補充したＭＥＭ、そしてＳｉＨａについては１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸を補充したＭＥＭ／Ｅａｒｌｅ’ｓで総容量２００μＬ）。各試験物質について６〜１０の異なった濃度で調べた。対照細胞は処理されない。各試験物質で処理する前に細胞を３７℃にて２４時間インキュベートした。各実験は３連一組で行った。処理後のインキュベートは３７℃で９６時間行った。これらの細胞株の生存に対する試験物質の効果（試験管内細胞傷害性アッセイ）をＭＴＴによって測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＣＨＵＶ）中の０．２２μｍのフィルターを通した５ｍｇ／ｍＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド溶液（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ、参照Ｎｏ．８８４１５）２０μＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃にて４時間インキュベートした。上清を除き、ホルマザン結晶をＤＭＳＯ（ウェル当たり２００μＬ）に溶解した。５９５ｎｍにてマイクロプレートリーダー（エキスパートプラスリーダー、Ａｓｙｓ，Ｈｉｔｅｃｈ）で吸収（ＯＤ）を測定した。プリズムソフトウエアを用いて、各試験物質のＩＣ_５０（細胞の増殖を５０％阻害する薬剤の濃度）を算出した。

２．３．２．結果
以下の結果が得られた。本発明の分子、Ｄ−Ｔａｔ−オキサリプラチンについて調べた細胞株、ＭＣＦ−７およびＳｉＨａは双方ともこの物質に感受性であり、ＩＣ_５０は、ＭＣＦ−７およびＳｉＨａそれぞれについて１０８〜１３４μＭの範囲内であった。Ｄ−Ｔａｔ−オキサリプラチンは、オキサリプラチンにカップリングさせたＬ−アミノ酸から構成されるＴａｔ配列からなる結合体分子、Ｌ−Ｔａｔ−オキサリプラチンに比べて、双方の細胞株に対する細胞傷害性活性は低く、Ｌ−Ｔａｔ−オキサリプラチンのＩＣ_５０は、ＭＣＦ−７およびＳｉＨａそれぞれについて５２．７〜５４．９μＭの範囲内であった。双方の結合体分子は、そのＩＣ_５０がＭＣＦ−７では１．５μＭおよびＳｉＨａでは１１．１μＭであると決定された非結合型の分子、オキサリプラチンよりも活性が低い。オキサリプラチンのＩＣ_５０値は、シスプラチンのＩＣ_５０値（ＭＣＦ−７およびＳｉＨａについてそれぞれ９．１および１１．１μＭ）と同じ範囲内である。結果を、以下の表２、図７および８（図の説明にも）に示す。結果は、細胞生存の百分率として表す。各値は３連一組の平均値である。

（実施例３）
３．１．結合体分子：Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシルの合成

３．１．１．材料
特定しない限り、溶媒および試薬はすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ブックス、スイスから入手し、分析用またはそれより高い等級であり、さらに精製することなく使用した。アミノ酸および樹脂はすべてスイス、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎの、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。

３．１．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
カラム１００×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．５μｍのＣ_１８粒子を用い、流速１．５ｍＬ／分にてセクション１．２で上記に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣを行い、２１４／２８０ｎｍで溶出をモニターした。Ｃ_１８カラム（１００×１９ｍｍ ｉｄ、５μｍ粒度）を用い、流速１５ｍＬ／分で半分取用ペプチド精製を行い、２１４／２８０ｎｍでモニターした。

３．１．３．質量分光分析
線形イオントラップＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（米国、サンノゼ）において陽イオン方式にてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。溶媒１：１（ｖ：ｖ）（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）：（１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸）にて１０μＬ／分で試料を導入した。ウマ心臓のアポミオグロビンを用いて外部補正を行った。

３．１．４．結合体分子（Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシル）の合成
ペプチド配列は、βＡ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＱ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＫ−ｄＫ−ｄＲ−Ｇであり、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸の側鎖保護は、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ化学反応を用いて０．２３ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂にて手動で合成を行った。従って、Ｃ末端のＧｌｙからＮ末端の１−βＡ（Ｌ型）までの各アミノ酸は、Ｆｍｏｃの脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）およびアミノ酸のカップリング（ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）のサイクルを用いて、順次樹脂に結合された。Ｎ末端の１−βＡのＦｍｏｃ脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）に続いて、標準のアミノ酸カップリング条件（ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）を用いてクロラムブシルのカップリングを達成した。ＴＦＡ（３％ｄＨ_２Ｏおよび３％ＴＩＳの存在下で７０分間）によって結合体分子を樹脂から切断し、大気圧でろ過し、Ｎ_２の気泡で容積を減らし、冷却エーテルで沈殿させ、風乾した。粗精製の結合体分子を半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

３．２．結合体分子：Ｌ−Ｔａｔ−クロラムブシルの合成

３．２．１．材料
特定しない限り、溶媒および試薬はすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ブックス、スイスから入手し、分析用またはそれより高い等級であり、さらに精製することなく使用した。アミノ酸および樹脂はすべてスイス、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎの、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。

３．２．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
カラム１００×４．６ｍｍ ｉ．ｄ．５μｍのＣ_１８粒子を用い、流速１．５ｍＬ／分にてセクション１．２で上記に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣを行い、２１４／２８０ｎｍで溶出をモニターした。Ｃ_１８カラム（１００×１９ｍｍ ｉｄ、５μｍ粒度）を用い、流速１５ｍＬ／分で半分取用ペプチド精製を行い、２１４／２８０ｎｍでモニターした。

３．２．３．質量分光分析
線形イオントラップＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（米国、サンノゼ）において陽イオン方式にてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。溶媒１：１（ｖ：ｖ）（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）：（１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸）にて１０μＬ／分で試料を導入した。ウマ心臓のアポミオグロビンを用いて外部補正を行った。

３．２．４．結合体分子（Ｌ−Ｔａｔ−クロラムブシル）の合成
ペプチドの配列は、Ｈ_２Ｎ−βＡ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−ＣＯＮＨ_２であり、Ｆｍｏｃ保護したアミノ酸の側鎖微後は、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ化学反応を用いて０．２３ｍＭのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂にて手動で合成を行った。従って、Ｃ末端のＡｒｇからＮ末端のｌ−βＡ（Ｌ型のβＡｌａ）までの各アミノ酸は、Ｆｍｏｃの脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）およびアミノ酸のカップリング（ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）のサイクルを用いて、順次樹脂に結合された。Ｎ−末端のｌ−βＡのＦｍｏｃ脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）に続いて、標準的なアミノ酸カップリング条件（ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）を用いてクロラムブシルのカップリングを達成した。ＴＦＡ（３％ｄＨ_２Ｏおよび３％ＴＩＳの存在下で７０分間）によって結合体分子を樹脂から切断し、大気圧でろ過し、Ｎ_２の気泡で容積を減らし、冷却エーテルで沈殿させ、風乾した。粗精製の結合体分子を半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

３．３．競合試験
３．３．１．試験条件
ＭＣＦ−７（ヒト乳腺癌細胞株）およびＳｉＨａ（ヒト子宮頚部扁平上皮癌細胞株）の生存に対する、漸増濃度の本発明の結合体分子（Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシル）の処理の効果を決定した。Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシルの効果を結合体Ｌ−Ｔａｔ−クロラムブシルおよび２つの非結合の抗癌剤（クロラムブシルおよびシスプラチン）と比較した。各細胞株の細胞（ウェル当たり１０，０００細胞）を９６ウェルプレートに播いた（ＭＣＦ−７については１０％ＦＢＳ、１％Ｌ−グルタミン、１％ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸を補充したＭＥＭ、そしてＳｉＨａについては１０％ＦＢＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸を補充したＭＥＭ／Ｅａｒｌｅ’ｓで総容量２００μＬ）。各試験物質について６〜１０の異なった濃度を調べた。対照細胞は処理されない。各試験物質で処理する前に細胞を３７℃にて２４時間インキュベートした。各実験は３連一組で行った。処理後のインキュベートは３７℃で９６時間行った。これらの細胞株の生存に対する試験物質の効果（試験管内細胞傷害性アッセイ）をＭＴＴによって測定した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ＣＨＵＶ）中の０．２２μｍのフィルターを通した５ｍｇ／ｍＬのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド溶液（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ、参照Ｎｏ．８８４１５）２０μＬを各ウェルに添加し、プレートを３７℃にて４時間インキュベートした。上清を除き、ホルマザン結晶をＤＭＳＯ（ウェル当たり２００μＬ）で溶解した。５９５ｎｍにてマイクロプレートリーダー（エキスパートプラスリーダー、Ａｓｙｓ，Ｈｉｔｅｃｈ）で吸収（ＯＤ）を測定した。プリズムソフトウエアを用いて、各試験物質のＩＣ_５０（細胞の増殖を５０％阻害する薬剤の濃度）を算出した。

３．３．２．結果
以下の結果が得られた。本発明の分子、Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシルについて調べた細胞株、ＭＣＦ−７およびＳｉＨａは双方ともこの物質に感受性であり、ＩＣ_５０は、ＭＣＦ−７およびＳｉＨａそれぞれについて３０〜７１μＭの範囲内であった。Ｄ−Ｔａｔ−クロラムブシルは、クロラムブシルにカップリングさせたＬ−アミノ酸から構成されるＴａｔ配列からなる結合体分子、Ｌ−Ｔａｔ−クロラムブシルに比べて、双方の細胞株に対する細胞傷害性活性は高く、Ｌ−Ｔａｔ−クロラムブシルのＩＣ_５０は、ＭＣＦ−７およびＳｉＨａそれぞれについて８５．７〜１６２μＭの範囲内であった。双方の結合体分子は、調べた濃度の範囲ではプラトーが存在せず、双方の細胞株について１ｍＭより高いと推定されるのでそのＩＣ_５０を算出できなかった非結合型分子のクロラムブシルよりも活性が高かった。シスプラチンで処理した双方の細胞株はこの物質に感受性であり、ＩＣ_５０は７μＭであった。結果を、以下の表３、図７および８（図７および８の説明を参照のこと）に示す。結果を、細胞生存の百分率として表す。各値は３連一組の平均値である。

（実施例４）
４．１．結合体分子：Ｄ−Ｔａｔ−ドキソルビシンの合成

４．１．１．材料
特定しない限り、溶媒および試薬はすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ブックス、スイスから入手し、分析用またはそれより高い等級であり、さらに精製することなく使用した。Ａｄｒｉｂｌａｓｔｉｎ（登録商標）（スイス、チューリッヒ、Ｐｆｉｚｅｒ ＡＧ）として製剤化されたドキソルビシンを用いた。アミノ酸および樹脂はすべてスイス、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎの、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。

４．１．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
カラム１００ｘ４．６ｍｍ ｉ．ｄ．５μｍのＣ_１８粒子を用い、流速１．５ｍＬ／分にてセクション１．２で上記に記載したようにＲＰ−ＨＰＬＣを行い、２１４／２８０ｎｍで溶出をモニターした。Ｃ_１８カラム（１００×１９ｍｍ ｉｄ、５μｍ粒度）を用い、流速１５ｍＬ／分で半分取用ペプチド精製を行い、２１４／２８０ｎｍでモニターした。

４．１．３．質量分光分析
線形イオントラップＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（米国、サンノゼ）において陽イオン方式にてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。溶媒１：１（ｖ：ｖ）（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）：（１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸）にて１０μＬ／分で試料を導入した。ウマ心臓のアポミオグロビンを用いて外部補正を行った。

４．１．４．結合体分子：Ｄ−Ｔａｔ−ドキソルビシンの合成
ペプチド配列は、Ｅ−βＡ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＱ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＫ−ｄＫ−ｄＲ−Ｇであり、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸の側鎖保護は、Ａｒｇ（Ｐｍｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ＯＤｍａｂ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ化学反応を用いて０．２３ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂にて手動で合成を行った。従って、Ｃ末端のＧｌｙからＮ末端のｌ−Ｅ（Ｌ型）までの各アミノ酸は、Ｆｍｏｃの脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）およびアミノ酸のカップリング（ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）のサイクルを用いて、順次樹脂に結合された。Ｎ−末端のｌ−ＥのＦｍｏｃ脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）に続いて、アセチル化（ＤＭＦ中無水酢酸、ＤＩＥＡの活性化）を行った。ＤＭＦ中２％のヒドラジン一水和物を用いて、Ｏｄｍａｂ側鎖保護基の取り外しを行った。Ａｄｒｉｂｌａｓｔｉｎ（登録商標）（凍結乾燥されたドキソルビシン塩酸塩１８％、ＮａＣｌ ８２％）として製剤化されたドキソルビシンのカップリングは、ＯＢｔエステル（ＤＣＭ／ＤＭＦ中ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡの活性化）を介して達成された。

ＴＦＡ（１．７％ｄＨ_２Ｏおよび１．７％ＴＩＳの存在下で２時間）によって結合体分子を樹脂から切断し、大気圧でろ過し、Ｎ_２の気泡で容積を減らし、冷却エーテルで沈殿させ、風乾した。粗精製の結合体分子を半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けし、次いで凍結乾燥した。

（実施例５）
５．１．結合体分子：Ｄ−Ｔａｔ−サキナビルの合成

５．１．１．材料
特定しない限り、溶媒および試薬はすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ブックス、スイスから入手し、分析用またはそれより高い等級であり、さらに精製することなく使用した。Ｉｎｖｉｒａｓｅ（登録商標）（スイス、ライナハのＲｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ）として製剤化されたサキナビルを用いた。アミノ酸および樹脂はすべてスイス、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎの、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。

５．１．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
上記のセクション１．２に記載されたようにＲＰ−ＨＰＬＣを行った。

５．１．３．質量分光分析
線形イオントラップＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（米国、サンノゼ）において陽イオン方式にてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。溶媒１：１（ｖ：ｖ）（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）：（１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸）にて１０μＬ／分で試料を導入した。ウマ心臓のアポミオグロビンを用いて外部補正を行った。

５．１．４．ペプチド（Ｄ−Ｔａｔ−システイン）の合成
ペプチド配列は、ｄＣ−Ｇ−Ｇ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＱ−ｄＲ−ｄＲ−ｄＫ−ｄＫ−ｄＲであり、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸の側鎖保護はＣｙｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ化学反応を用いて０．４０ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂にて手動で合成を行った。従って、Ｃ末端のＤ−ＡｒｇからＮ末端のＤ−Ｃｙｓまでの各アミノ酸は、Ｆｍｏｃの脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）およびアミノ酸のカップリング（ＤＭＦ中のＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）のサイクルを用いて、順次樹脂に結合された。ＴＦＡによってペプチドを樹脂から切断し、氷上（２．５％ｄＨ_２Ｏ、２．５％ＥＤＴおよび１．０％ＴＩＳの存在下で５時間）プレインキュベートし、減圧下でろ過し、冷却エーテルで沈殿させ、真空乾燥した。粗精製のペプチドを半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

５．１．５．サキナビル活性エステルの調製
室温にて無水ＤＣＭ中に３７５μｍｏｌのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを溶解し、これに０℃にて２６５μｍｏｌのＤＭＡＰ、３７５μｍｏｌのＤＩＰＣＩおよびＩｎｖｉｒａｓｅ（登録商標）（ラクトース、ｅｘｃｉｐｉｅｎｓ ｐｒｏ ｃｏｍｐｒｅｓｓｏ ｏｂｄｕｃｔｏ）として製剤化された１１０μｍｏｌのサキナビルを加えた。反応混合物を室温に温め、一晩撹拌した。生成物を０．１ＮのＨＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、減圧下で蒸発させて固形生成物、ＳＱＶ−Ｇｌｙ（Ｂｏｃ）を得た。ＣＨ_２Ｃｌ_２とＴＦＡ（５０：５０）の混合物中でＳＱＶ−Ｇｌｙ（Ｂｏｃ）エステルを３時間インキュベートすることによってＢｏｃ保護基を外した。冷却エーテルから生成物を再結晶化させ、減圧下で一晩乾燥した。室温にて３ｍＬの無水ＤＭＳＯに４７μｍｏｌのＳＱＶ−Ｇｌｙを溶解し、これに９４μｍｏｌのＳＰＤＰを加えた。室温で一定に撹拌しながら、反応混合物のｐＨを８．０に合わせた。一定の撹拌下で反応物を３時間放置した。粗精製のＳＱＶ−Ｇｌｙ−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＳＳ−ピリジルを半分取用ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

５．１．６．ペプチドＤ−Ｔａｔ−Ｄ−システインのサキナビルへの結合
室温にて０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５に２７μｍｏｌのＳＱＶ−Ｇｌｙ−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＳＳ−ピリジルを溶解し、これに、０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５中の５４μｍｏｌのＤ−Ｔａｔ−Ｄ−システインを加えた。一定の撹拌下で反応物を室温に３時間放置した。粗精製の結合体、Ｄ−Ｔａｔ−サキナビルを半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

５．２．結合体分子：Ｌ−Ｔａｔ−サキナビルの合成

５．２．１．材料
特定しない限り、溶媒および試薬はすべてＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｅ ＧｍｂＨ、ブックス、スイスから入手し、分析用またはそれより高い等級であり、さらに精製することなく使用した。Ｉｎｖｉｒａｓｅ（登録商標）（スイス、ライナハのＲｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａ）として製剤化されたサキナビルを用いた。アミノ酸および樹脂はすべてスイス、Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎの、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。水はＭｉｌｌｉ−Ｑシステム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて再精製した。

５．２．２．ＲＰ−ＨＰＬＣ
上記のセクション１．２に記載されたようにＲＰ−ＨＰＬＣを行った。

５．２．３．質量分光分析
線形イオントラップＴｈｅｒｍｏＦｉｎｎｉｇａｎ（米国、サンノゼ）において陽イオン方式にてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）を行った。溶媒１：１（ｖ：ｖ）（アセトニトリル＋０．１％ギ酸）：（１０ｍＭギ酸アンモニウム＋０．１％ギ酸）にて１０μＬ／分で試料を導入した。ウマ心臓のアポミオグロビンを用いて外部補正を行った。

５．２．４．ペプチド（Ｌ−Ｔａｔ−システイン）の合成
ペプチド配列は、Ｈ_２Ｎ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ−ＣＯＮＨ_２であり、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸の側鎖保護はＣｙｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）およびＬｙｓ（Ｂｏｃ）であった。Ｆｍｏｃ化学反応を用いて０．４０ｍｍｏｌのＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋアミド樹脂にて手動で合成を行った。従って、Ｃ末端のＬ−ＡｒｇからＮ末端のＬ−Ｃｙｓまでの各アミノ酸は、Ｆｍｏｃの脱保護（ＤＭＦ中２０％ピペリジン）およびアミノ酸のカップリング（ＤＭＦ中のＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡ活性化）のサイクルを用いて、順次樹脂に結合された。ＴＦＡによってペプチドを樹脂から切断し、氷上（２．５％ｄＨ_２Ｏ、２．５％ＥＤＴおよび１．０％ＴＩＳの存在下で５時間）でプレインキュベートし、減圧下でろ過し、冷却エーテルで沈殿させ、真空乾燥した。粗精製のペプチドを半分取用ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

５．２．５．サキナビル活性エステルの調製
室温にて無水ＤＣＭ中に３７５μｍｏｌのＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを溶解し、これに０℃にて２６５μｍｏｌのＤＭＡＰ、３７５μｍｏｌのＤＩＰＣＩおよびＩｎｖｉｒａｓｅ（登録商標）（ラクトース、賦形剤、ｐｒｏ ｃｐｍｐｒｅｓｓｏ ｏｂｄｕｃｔｏ）として製剤化された１１０μｍｏｌのサキナビルを加えた。反応混合物を室温に温め、一晩撹拌した。生成物を０．１ＮのＨＣｌで洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥し、減圧下で蒸発させて固形生成物、ＳＱＶ−Ｇｌｙ（Ｂｏｃ）を得た。ＣＨ_２Ｃｌ_２とＴＦＡ（５０：５０）との混合物中でＳＱＶ−Ｇｌｙ（Ｂｏｃ）エステルを３時間インキュベートすることによってＢｏｃ保護基を外した。冷却エーテルから生成物を再結晶化させ、減圧下で一晩乾燥した。室温にて３ｍＬの無水ＤＭＳＯに４７μｍｏｌのＳＱＶ−Ｇｌｙを溶解し、これに９４μｍｏｌのＳＰＤＰを加えた。室温で一定に撹拌しながら、反応混合物のｐＨを８．０に合わせた。一定の撹拌下で反応物を３時間放置した。粗精製のＳＱＶ−Ｇｌｙ−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＳＳ−ピリジルを半分取用ＲＰ−ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

５．２．６．ペプチドＬ−Ｔａｔ−Ｌ−システインのサキナビルへの結合
室温にて０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５に２７μｍｏｌのＳＱＶ−Ｇｌｙ−ＣＯＣＨ_２ＣＨ_２ＳＳ−ピリジルを溶解し、これに、０．５ｍＬのＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．５中の５４μｍｏｌのＬ−Ｔａｔ−Ｌ−システインを加えた。一定の撹拌下で反応物を室温に３時間放置した。粗精製の結合体、Ｌ−Ｔａｔ−サキナビルを半分取用ＨＰＬＣで精製し、ＥＳＩ−ＭＳで特徴付けした。

（実施例６）
（水における溶解性特性の向上）
Ｄ−Ｔａｔ−結合体についての分配係数（ｌｏｇＰ）の決定
固形粉末の化合物をプラスチックバイアル（エッペンドルフチューブ）に量り取ることに続いて、１ｍＭの溶液を得るためにナノピュアの水を加え、同一容量のオクタノール（ＵＶ分光法等級）を加え、混合物をボルテックスで１分間、激しく振盪させた。混合物を室温で２４時間放置し、平衡化させた。次いで、双方の相を分離し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により２１４ｎｍにて分析した。

図１０に示された結果は、大部分は疎水性であり、水性溶液への溶解性が低い細胞傷害性化合物へのＤ−Ｔａｔペプチドの結合が、細胞傷害性化合物を全体として水に可溶にすることを明らかに実証している。このことは、水溶性が非常に低い細胞傷害性化合物であるクロラムブシルによって例示されている。部分的にしか水溶性でない抗ウイルス化合物、サキナビルについては、その水溶性も明らかに改善されており、Ｄ−Ｔａｔに結合した後、最大にさえなっている。結合前、ほぼ完璧な水溶性であるドキソルビシンについては、結合した分子は同様の結果を示し、結合したドキソルビシンの完璧な水溶性に影響を及ぼさない。

図１は、ＨＩＶ Ｔａｔ（Ｄ−Ｔａｔ配列）のアミノ酸４８〜５７（ａ）および４９〜５７（ｂ）に相当する（レトロインベルソ順序で）好ましいキャリア配列のＤ−アミノ酸配列を示す。アミノ酸はすべてＤ−鏡像異性アミノ酸である（本明細書では、ＤＲ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＱ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＫ−ＤＫ−ＤＲ（Ｄ−Ｔａｔ配列（ｂ）とも呼ぶ）。 図２は、Ｄ−アミノ酸、例えば、図１に示すＤ−Ｔａｔ配列で構成されるキャリア配列に共有結合でカップリングしたシスプラチンを含む本発明の結合体分子を示す。 図３は、４種の異なった細胞株（ＩＧＲＯＶ−１（Ｃ／Ｄ）、ＭＲＣ−５（Ａ／Ｂ）、ＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰ（Ｅ／Ｆ）、ＭＣＦ−７（Ｇ／Ｈ））に関する、シスプラチンまたは図１に示すＤ−アミノ酸に共有結合でカップリングしたシスプラチンを含む本発明の結合体分子の濃度の関数として細胞生存率をまとめる実験の結果を示す。右欄の図（Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）はシスプラチンによる比較実験を記録し、一方、左欄の図は、本発明の結合体分子の効果を反映する。負の対数をｘ軸に示し、細胞生存率をｙ軸に示す。ＩＣ_５０値も示す。 図４は、細胞株ＩＧＲＯＶ−１（Ａ）、ＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰ（Ｂ）、ＭＣＦ−７（Ｃ）およびＭＲＣ−５（Ｄ）で実施された実験すべてのまとめである。種々の濃度のシスプラチン（各表の下段）またはシスプラチン−Ｄ−Ｔａｔ（各表の上段）（濃度範囲０Ｍ（対照）〜１０^−４Ｍ）について測定された値を示す。培地および水について測定された値もまた示す。 図４は、細胞株ＩＧＲＯＶ−１（Ａ）、ＩＧＲＯＶ−１／ＣＤＤＰ（Ｂ）、ＭＣＦ−７（Ｃ）およびＭＲＣ−５（Ｄ）で実施された実験すべてのまとめである。種々の濃度のシスプラチン（各表の下段）またはシスプラチン−Ｄ−Ｔａｔ（各表の上段）（濃度範囲０Ｍ（対照）〜１０^−４Ｍ）について測定された値を示す。培地および水について測定された値もまた示す。 図５は、２つの異なった細胞株（ＭＣＦ−７およびＳｉＨａ）について、実施例２に示すような有機分子にカップリングしたＤ−Ｔａｔからなる本発明の結合体分子の濃度の関数として細胞生存率をまとめる実験の結果を示す。図５Ａは、ＭＣＦ−７細胞株に対する６つの異なった濃度でのＤ−Ｔａｔ成分を含有する本発明の結合体分子の効果を、結合体分子Ｌ−Ｔａｔオキサリプラチン、非結合体分子オキサリプラチンおよび抗癌剤シスプラチンと比較して記録する。図５Ｂは、ＳｉＨａ細胞株に対する上述の分子の効果を記録する。負の対数をｘ軸に示し、細胞生存率をｙ軸に示す。 図６は、細胞株ＭＣＦ−７およびＳｉＨａで実施した実験の光学密度（ＯＤ）５９５ｎｍでの値として表現される生データを示す。濃度範囲は、１０^−３Ｍ〜１０^−８Ｍで変化する。未処理細胞および培地についての値も示す。 図７は、２つの異なった細胞株（ＭＣＦ−７およびＳｉＨａ）について、有機分子（クロラムブシル）にカップリングしたＤ−Ｔａｔからなる本発明の結合体分子の濃度の関数として細胞生存率をまとめる実験の結果を示す。図７Ａは、ＭＣＦ−７細胞株に対する１０つの異なった濃度での本発明の分子の効果を、結合体分子Ｌ−Ｔａｔクロラムブシルおよび非結合体分子クロラムブシルと比較して記録する。図７Ｂは、ＭＣＦ−７細胞株に対する６つの異なった濃度での本発明の分子の効果を、結合体分子Ｌ−Ｔａｔクロラムブシル、非結合体分子クロラムブシルおよび抗癌剤シスプラチンと比較して記録する。図７Ｃは、ＳｉＨａ細胞株に対する６つの異なった濃度での上述の分子の細胞傷害性効果の比較を記録する。負の対数をｘ軸に示し、細胞生存率をｙ軸に示す。 図７は、２つの異なった細胞株（ＭＣＦ−７およびＳｉＨａ）について、有機分子（クロラムブシル）にカップリングしたＤ−Ｔａｔからなる本発明の結合体分子の濃度の関数として細胞生存率をまとめる実験の結果を示す。図７Ａは、ＭＣＦ−７細胞株に対する１０つの異なった濃度での本発明の分子の効果を、結合体分子Ｌ−Ｔａｔクロラムブシルおよび非結合体分子クロラムブシルと比較して記録する。図７Ｂは、ＭＣＦ−７細胞株に対する６つの異なった濃度での本発明の分子の効果を、結合体分子Ｌ−Ｔａｔクロラムブシル、非結合体分子クロラムブシルおよび抗癌剤シスプラチンと比較して記録する。図７Ｃは、ＳｉＨａ細胞株に対する６つの異なった濃度での上述の分子の細胞傷害性効果の比較を記録する。負の対数をｘ軸に示し、細胞生存率をｙ軸に示す。 図８は、ＭＣＦ−７およびＳｉＨａで実施した実験の光学密度（ＯＤ）５９５ｎｍでの値として表現される生データを示す。濃度範囲は、１０^−３Ｍ〜１０^−８Ｍで変化する。未処理細胞および培地についての値も示す。 図８は、ＭＣＦ−７およびＳｉＨａで実施した実験の光学密度（ＯＤ）５９５ｎｍでの値として表現される生データを示す。濃度範囲は、１０^−３Ｍ〜１０^−８Ｍで変化する。未処理細胞および培地についての値も示す。 図９は、細胞生存率に対する結合体分子の細胞傷害性効果を示す図を提示する。上昇する濃度の結合体分子（Ｌ−Ｔａｔ−クロラムブシルもしくはＤ−Ｔａｔ−クロラムブシル）または親分子であるクロラムブシルと共に２種の細胞株ＭＣＦ−７（Ａ）およびＳｉＨａ（Ｂ）を９６時間インキュベートした。 図１０は、２１４ｎｍにて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって同定され、定量された遊離の（白四角）またはＤ−Ｔａｔ結合形態の（黒四角）細胞傷害性化合物の量を示す。スケールは、水中に分配された化合物のパーセントである。調べた化合物（左から右）：クロラムブシル活性物質、Ｌｅｕｋｅｒａｎ（登録商標）として製剤化されたクロラムブシルおよびＤ−Ｔａｔ−クロラムブシル結合体、サキナビル（Ｉｎｖｉｒａｓｅ）およびＤ−Ｔａｔ−サキナビル結合体、ドキソルビシン（Ａｄｒｉｂｌａｓｔｉｎ）およびＤ−Ｔａｔ−ドキソルビシン結合体、オキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）およびＤ−Ｔａｔ−オキサリプラチン結合体。

Claims (19)

1. 結合体分子であって、キャリア配列を含む少なくとも１つの第１の部分（Ｉ）、ならびに抗癌剤分子およびプロテアーゼ阻害剤分子を含む群から選択される有機薬剤分子を含む少なくとも１つの第２の部分（ＩＩ）を含み、該結合体分子が該部分（Ｉ）にＤ−鏡像異性アミノ酸を含む、結合体分子。
2. 前記少なくとも１つの第１の部分（Ｉ）および少なくとも１つの第２の部分（ＩＩ）が共有結合で連結される、請求項１に記載の結合体分子。
3. 部分（Ｉ）が、前記結合体分子を規定の細胞位置に導くキャリア配列を含む、請求項１または２のいずれかに記載の結合体分子。
4. 部分（Ｉ）が、特に、細胞透過性を高めることによって、細胞内滞留時間を増やすことによっておよび／またはその溶解性を高めることによって、細胞への前記結合体分子の取り込みを高めるキャリア配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の結合体分子。
5. 部分（Ｉ）が、キャリア配列として、一般式（ａ）〜（ｉ）：（ａ）ＮＨ_２−Ｘｍ−ＣＯＯＨ、（ｂ）ＮＨ_２−ＸｎＡｒＸｎ−ＣＯＯＨ、（ｃ）ＮＨ_２−ＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐ−ＣＯＯＨ、（ｄ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、（ｅ）ＮＨ_２−ＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、（ｆ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、（ｇ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨ、（ｈ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨまたは（ｉ）ＮＨ_２−ＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏＸｐＡｏ−ＣＯＯＨのうちの１つに記載のＤ−ペプチド配列を含み、式中、「Ｘ」はＤアミノ酸であるアルギニンまたはリジンから選択され、「ｍ」は３と４０との間、好ましくは３と２０との間、最も好ましくは３と１２との間の整数であり、「Ａ」は任意の非塩基性Ｄアミノ酸に関し、「ｎ」および「ｒ」は１〜２０、好ましくは３〜１０、さらに好ましくは３〜６のアミノ酸の整数を表し、「ｏ」および「ｐ」は０〜１４の整数である請求項１〜４のいずれかに記載の結合体分子。
6. 部分（Ｉ）が、Ｄ−ＴＡＴ配列（Ｄアミノ酸で構成されるレトロインベルソの順序のＨＩＶ Ｔａｔ配列）またはその断片であるキャリア配列を含む請求項１〜４のいずれかに記載の結合体分子。
7. 部分（Ｉ）が、ＤＲ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＱ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＫ−ＤＫ−ＤＲ−ＤＧまたはＤＲ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＱ−ＤＲ−ＤＲ−ＤＫ−ＤＫ−ＤＲのＤアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の結合体分子。
8. 部分（ＩＩ）が、少なくとも１つのプロテアーゼ阻害剤分子または少なくとも１つの抗腫瘍薬剤分子を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の結合体分子。
9. 部分（ＩＩ）が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、例えばゲムシタビン、シタラビン、クロラムブシル、メルファランのような細胞分裂抑止剤、およびホルモン処理に関連する薬剤からなる群から選択される少なくとも１つの抗腫瘍薬剤分子を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の結合体分子。
10. 部分（ＩＩ）が、タキソールクラスの化合物またはプラチン誘導体の化合物およびクラスからなる群から選択される少なくとも１つの抗腫瘍薬剤分子を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の結合体分子。
11. 部分（ＩＩ）が、シスプラチン、サトラプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンおよびネダプラチンからなる群から選択される少なくとも１つの抗腫瘍薬剤分子を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の結合体分子。
12. 部分（ＩＩ）が、６４０３８５、アバカビルスルフェート、ＡＧ１７７６、アンプレナビル（１４１Ｗ９４またはＶＸ−４７８）、アタザナビル（ＢＭＳ−２３２６３２）、カテプシンＳプロテアーゼ阻害剤、Ｄ１９２７、Ｄ９１２０、エファビレンズ、エムトリシタビン、エンフビルチド（Ｔ−２０）、フォサムプレナビル（ＧＷ−４３３９０８またはＶＸ−１７５）、ＧＳ９００５、ＧＷ６４０３８５（ＶＸ−３８５）、ＨＣＶプロテアーゼ阻害剤、インジナビル（ＭＫ−６３９）、Ｌ−７５６、４２３、レボプリン−ＺＧ、ロピナビル（ＡＢＴ−３７８）、ロピナビル／リトナビル（ＬＰＶ、ＡＢＴ−３７８／ｒ）、ＭＫ−９４４Ａ、モゼナビル（ＤＭＰ４５０）、ネルフィナビル（ＡＧ−１３４３）、ネビラピン、Ｐ−１９４６、ＰＬ−１００、プリノマスタット、リトナビル（ＡＢＴ−５３８）、ＲＯ０３３−４６４９、ＴＭＣ１１４、サキナビル（Ｒｏ−３１−８９５９）、テノフォビルジソプロキシルフマレート、チプラナビル（ＰＮＵ−１４０６９０）、ＴＬＫ１９７８１、ＴＭＣ−１１４、ベルテックス３８５、ＶＸ−９５０からなる群から選択されるプロテアーゼ阻害剤分子のクラスの少なくとも１つの分子を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の結合体分子。
13. 請求項１〜１２のいずれかに記載の結合体分子、および必要に応じて、薬学上許容可能なキャリア、アジュバントおよび／またはビヒクルを含む、医薬組成物。
14. 例えば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、組織細胞性リンパ腫などの癌性疾患、脳の癌（膠芽細胞腫）、卵巣癌、泌尿生殖器癌、結腸癌、肝臓癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、リンパ系癌、胃癌、咽頭癌、ならびに、肺腺癌および小細胞肺癌を含めた肺癌、ならびに／または、例えば、黒色腫または基底細胞癌および扁平上皮癌を含めた非黒色腫皮膚癌などの皮膚癌の治療および／または予防のための、あるいは治療のための薬物を調製するための、請求項１〜１１のいずれかに記載の結合体分子または請求項１３に記載の医薬組成物の使用。
15. ウイルス感染症、細菌感染症または原生動物感染症、特にＨＩＶ感染の治療および／または予防のための、あるいは治療のための薬物を調製するための、請求項８もしくは１２に記載の結合体分子または請求項１３に記載の医薬組成物の使用。
16. 薬剤部分を少なくとも１つの薬剤キャリア部分に共有結合させることによって治療用化合物を創製し、抗癌剤またはプロテアーゼ阻害剤部分の細胞透過性、細胞内滞留時間または水溶性を改善する方法であって、ここで該治療用化合物が請求項１〜１２のいずれかに記載の結合体分子である、方法。
17. 前記薬剤キャリア部分が、約１，０００ダルトン〜約５０，０００ダルトンの範囲内の分子量を有する、請求項１６に記載の方法。
18. 前記細胞透過性、細胞内滞留時間または水溶性が、前記抗癌剤またはプロテアーゼ阻害剤部分そのままの細胞透過性、細胞内滞留時間または水溶性よりも高い、請求項１６または１７に記載の方法。
19. 治療上有効量の請求項１〜１２のいずれかに記載の結合体分子を投与する工程を包含する、状態を治療する方法。

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