KR20200124218A

KR20200124218A - 화장품 및 의약에 사용하기 위한 펩티드 및 조성물

Info

Publication number: KR20200124218A
Application number: KR1020207022005A
Authority: KR
Inventors: 아리아드나 그라우-캄피스타니; 파스토르 실비아; 파트리샤 카룰라; 후안 카를로스 에스쿠데로; 줄리아 에이. 보라스; 이사벨 데베사 기네르; 그레고리오 페르난데스 발레스테르
Original assignee: 리포트루, 엘스.엘.
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2020-11-02
Also published as: JP7296642B2; US11634458B2; CA3090060A1; PL3758730T3; EP3758730B1; ES2937382T3; JP2021514940A; AU2019228281A1; CN112040969B; EP3758730A1; US20210032287A1; CN112040969A; TW201941783A; WO2019166347A1

Abstract

본 발명은 복합체 Munc 18-Syntaxin-1의 형성을 방해할 수 있고, 따라서 신경 세포 엑소사이토시스(nuuronal exocytosis) 및/또는 근육 수축성 장애의 예방 및/또는 치료에 유용하며, 피부 노화 및/또는 발현 징후를 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한 펩티드 계열에 관한 것이다.

Description

화장품 및 의약에 사용하기 위한 펩티드 및 조성물

본 발명은 분자 생물학 분야, 보다 정확하게는 화장품 및 의약에 적용되는 분자 생물학, 더욱 정확하게는 Munc 18과 Syntaxin-1간의 결합 또는 상호 작용, 따라서 SNARE 복합체의 결합을 조절할 수 있는, 펩티드 및 상기 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 이러한 활성으로 인해, 본 발명의 펩티드 및 조성물은 시냅스 소포 융합 및 근육 수축성을 조절할 수 있다. 그러므로, 상기 펩티드 및 조성물은 상기 언급한 측면의 조절(예를 들어, 근육 이완)과 관련된 상태의 치료에 효과적이며, 화장품(주름 개선 활성 및 다한증에 대한 활성) 및 의약(신경 세포 및/또는 근육 수축 장애)의 양쪽 모두에서 유용하다.

SNARE 복합체 및 시냅스 소포 융합의 비정상적인 조절은 무엇보다도 화장품 및 의약 모두에서 매우 관련이 있는 것으로 알려진 비정상적인 근육 수축-이완을 초래한다.

한편, 주름(예를 들어, 표정 주름(facial expression wrinkles)) 형성 기초 또는 메커니즘은 피부를 안쪽으로 드래그하는 근육의 긴장이다. 이 근육 긴장은 해당 근육을 활성화시키는 신경의 과다 활동의 결과이다. 상기 신경 과다 활동은 차례로 근육 섬유를 자극하는 신경 전달 물질의 제어되지 않은 과도한 방출을 특징으로 한다.

다른 한편으로, 근육 수축-이완의 변경을 초래하는 신경 과다 활동(이미 상기 언급된 바와 같이, 근육 섬유를 자극하는 신경 전달 물질의 제어되지 않은 과도한 방출에 의해 특징지워짐)은 또한 몇몇 알려진 질병, 예를 들어, 노인성 치매, 알쯔하이머 관련 치매, AIDS 관련 치매, 간질, 근 위축성 경화증(amiotrophic sclerosis) 또는 다발성/측삭 경화증(multiple/lateral sclerosis)에 기초한다[Jabbari B,(2018) Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach, Springer, Cham; Jankovic J,(2004) Botulinum toxin in clinical practice, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 75:951-957을 참조].

상기 언급된 것과 유사한 방식으로, 신경 세포 엑소사이토시스(neuronal exocytosis)의 조절 곤란을 초래하는 시냅스 소포 융합 및 SNARE 복합체에서의 이상은 근육뿐만 아니라, 예를 들어, 분비선(glands)과 같은 다른 구조 또는 기관의 의 과도한 활성화 또는 자극을 야기할 수 있다. 따라서, 상기 상태는 또한, 예를 들어, 다한증(땀샘의 과도한 활성화 또는 자극)과 같은 근육 수축과 관련이 없는 화장품 및 의학적 변경(본 발명의 펩티드 및 조성물이 유용한 경우)을 초래한다[Jabbari B,(2018) Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach, Springer, Cham.; Luvisetto S, Gazerani P, Cianchetti C, Pavone F,(2015) Botulinum Toxin Type A as a Therapeutic Agent against Headache and Related Disorders, Toxins(Basel), Sep;7(9): 3818-3844.; Molderings GJ, Haenisch B, Brettner S, et.al.,(2016) Pharmacological treatment options for mast cell activation disease, Arch Pharmacol. 2016; 389: 671-694.; Basar E, Arici C,(2016), Use of Botulinum Neurotoxin in Ophthalmology, Turk J Ophthalmol. Dec; 46(6): 282-290.; Schlereth T, Dieterich M, Birklein F(2009), Hyperhidrosis--causes and treatment of enhanced sweating, Dtsch Arztebl Int. Jan;106(3):32-7].

신경 전달 물질 방출은 시냅스 전 소포 융합에 기인하며, 이는 널리 공지된 바와 같이, 신경 전달 물질과 소포를 시냅스 전 막에 근접시키고, 소포의 분비를 위해 상기 소포를 위치시키고, 분비를 위한 막의 융합을 허용하고, 생성된 복합체를 분해하여 재순환되도록 하는 상이한 단백질간의 복잡한 상호 작용에 의해 조절된다. 임의의 유형의 조절 이상이 심미적 및/또는 건강에 영향을 줄 수 있기 때문에 참여 단백질의 조립 및 분해를 포함하여 이 모든 절차를 엄격히 통제해야 한다.

신경 세포 엑소사이토시스를 조절하는 분자는 근육 긴장을 이완시키는 데 기여하고, 따라서, 주름(바람직하게는 얼굴 주름)을 예방, 감소 및/또는 제거하고/하거나, 비정상적이거나 조절이 어려운 신경 세포 엑소사이토시스와 관련된 질병을 예방, 개선 또는 치료하는데 기여한다.

이와 관련하여, 전통적으로 시냅스 전 소포(신경 전달 물질, 바람직하게는 아세틸콜린이 적재됨) 융합이 SNARE 단백질(즉, 뉴런의 막에서 syntaxin-1 및 SNAP-25 및 소포의 막에서 시냅토브레빈(synaptobrevin) 또는 VAMP)에 의해 구동되거나 제어되는 것으로 간주되었다. 따라서, SNARE 단백질 복합체가 신경 분비를 제어하기 위한 주요 표적을 형성하는 것으로 간주되었다.

이와 관련하여, SNARE 단백질 복합체에 대한 몇가지 치료 및 미용 접근법이 생성되었으며, 다음과 같다:

- 보툴리눔 독소: 이들은 표정 주름, 특히 혈청형 A((BOTOX^® Cosmetic, Allergan Inc.)를 감소 및/또는 제거할 목적으로 널리 사용되었다. 상기 보툴리눔 독소는 국소적으로 주사되고 이들의 마비 효과는 6개월의 평균 지속 시간으로 가역적이어서, 따라서 반복 주사가 요구된다. 보툴리눔 제제에 대한 면역 반응을 유발하여 치료 효능의 상실을 유발할 위험이 알려져 있다. 보툴리눔 독소의 다른 혈청형, 예를 들면, B, F 및 E도 이 문제를 극복하는 것으로 고려되었지만, 상기 혈청형은 또한 면역 반응을 유발할 위험이 있다. 분자 수준에서, 보툴리눔 독소는 칼슘 이온 활성화 엑소사이토시스 메카니즘에 관여하는 신경 세포 단백질을 분해하는 프로테아제이다. 예를 들어, 보툴리눔 독소 A는 신경 세포 SNAP-25 단백질을 절단한다.

- SNARE 복합체를 형성하는 단백질의 서열로부터 유래된 특정 펩티드는 예를 들어, SNAP-25의 아미노 및 카르복실 도메인으로부터 유래된 펩티드(예를 들어, PCT 특허 출원 WO97/34620호, 유럽 특허 EP1180524B1호 및 유럽 특허 EP2123673B1호를 참조) 및 시냅토브레빈 또는 신택신으로부터 유래된 펩티드[예를 들어, PCT 특허 출원 WO97/34620호; Blanes-Mira, C., Clemente, J., Jodas, G., Gil, A., Fernandez-Ballester, G., Ponsati, B., Gutierrez, L., Perez-Paya, E., Ferrer-Montiel,A. A synthetic hexapeptide(Argireline) with antiwrinkle activity. International Journal of Cosmetic Science,(2002),24,303-310를 참조]와 같은 신경 세포 엑소사이토시스를 억제할 수 있는 것이 당업계의 기술에 공지되어 있다.

그러나 시냅스 신경 전달 물질 방출의 메카니즘을 방해하고 이의 억제를 허용하여, 신경 세포 엑소사이토시스의 억제를 허용하고, 따라서 무엇보다도 근육 이완 또는 땀샘 과도 자극의 고갈 및 상응하는 미용 및 제약 효과를 제공하는 추가의 또는 대안적인 분자를 찾을 필요가 여전히 존재한다.

최근의 연구들은 SNARE 단백질 복합체 외에, Munc 13 및 Munc 18과 같은 다른 단백질이 절차의 조절 및 막의 융합을 허용하는 데 있어서 중요한 역할을 하는 시냅스 신경 전달 물질 방출의 보다 복잡한 조절을 제안했다[Rizo, J and S

dhof, T.C.(2012) The Membrane Fusion Enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices - Guilty as Charged?; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28:279-308]. 이러한 의미에서, Munc 18(SEQ ID NO: 1)과 Syntaxin-1(SEQ ID NO: 2)간의 상호 작용은 SNARE 복합체의 생성 및 막의 융합에 있어서 중심적이고 필수적인 것으로 기술되어 왔다. 한편으로, Munc 18은 Syntaxin-1의 H_abc-도메인과 상호 작용하여 상기 Munc 18의 안정화 및 그의 적절한 트래피킹(trafficking)을 가능하게 한다. 다른 한편으로, Munc 18과 Syntaxin-1의 N-펩티드의 상호 작용은 Munc 18과 SNARE 복합체의 상호 작용 및 막의 융합에 필요하다[Zhou, P. et.al.(2013) Syntaxin-1 N-peptide and Habc-domain perform distinct essential functions in synaptic vesicle fusion; The EMBO Journal, 32:159-171; Rizo, J and S

dhof, T.C.(2012) The Membrane Fusion Enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices - Guilty as Charged?; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28:279-308].

본 발명의 발명자들은 광범위하고 철저한 연구 끝에 놀랍게도 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용 표면에 위치한 특정 서열과 경쟁하는 펩티드가 상기 복합체 Munc 18-Syntaxin-1의 간섭 또는 억제, 따라서 신경 전달 물질 방출(바람직하게는 아세틸 콜린 및 CGRP(칼시토닌 유전자 관련 펩티드))의 억제 및 근육 수축의 억제(둘다 신경 세포 엑소사이토시스의 억제에 의해 간접적으로, 또한 근육 세포에 직접 효과를 제공함으로써)를 허용한다는 것을 발견하였다. 놀랍게도 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용 표면에 위치한 다른 서열과 경쟁하는 펩티드는 상기 언급된 효과를 제공하지 않는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 발명자들은 Munc 18의 양쪽, SEQ ID NO: 3(Munc18의 46-51 위치, 즉, SEQ ID NO: 1) 및/또는 SEQ ID NO: 4(Munc18의 63 내지 66 위치에 해당, 즉, SEQ ID NO: 1)와 경쟁하는 펩티드가 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용의 간섭에 대해 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용 표면에 위치한 다른 서열보다 유리한 것을 발견했다. 상기 펩티드(본 발명의 펩티드)는 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용의 효과적인 간섭을 나타내었다. 또한, 이들 펩티드는 다른 펩티드에서 볼 수 있는 바와 같이, 근육 수축에 관여하는 유전자를 조절하고 칼슘 가동화를 조절함으로써 근육 세포, 즉 시냅스 후 측면에 직접 작용하는 능력을 갖기 때문에 직접적인 근육 이완 효과를 나타내었다[Schagen, S.K.(2017) Topical treatments with effective anti-aging results, Cosmetics, 4, 16; PCT 특허 출원 WO2006047900호]. 따라서, 신경 세포에서 아세틸콜린 방출의 효과적인 억제, 및 유전자 발현의 조절 및 근육 세포에서의 칼슘 가동화의 감소를 허용함으로써 시냅스 전 측면 및 시냅스 후 측면 모두에서 효과를 나타내었다. 그러므로 본 발명의 펩티드는 상기 언급된 문제를 해결하고, 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 미용 징후 및 질병의 치료에 유용하다.

본 발명자들은 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용을 방해하여 신경 전달 물질 방출(따라서 신경 세포 엑소사이토시스를 억제함) 및 근육 수축성을 억제하는 분자를 제공하는 어떠한 선행 기술도 알지 못한다.

제1 측면에 있어서, 본 발명은 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용 표면의 특정 영역과 경쟁함으로써 Munc 18-Syntaxin-1 복합체 상호 작용을 방해할 수 있는 펩티드에 관한 것이다. 보다 정확하게는 본 발명의 펩티드는 Syntaxin-1과의 상호 작용 표면에서 Munc 18에 위치한 SEQ ID NO: 3 및/또는 SEQ ID NO:4와 경쟁한다.

제2 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명의 펩티드(본 발명의 하나의 펩티드 또는 그의 조합)를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

추가의 측면에 있어서, 본 발명은 의약으로서 사용하기 위한, 보다 정확하게는 본 발명에서 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애의 예방, 개선 및/또는 치료에 사용하기 위한, 더욱 정확하게는 본 발명에서, SNARE 복합체 형성의 조절 곤란, 선 모양 근육 수축의 조절 이상, 아세틸콜린 및/또는 CGRP 방출의 조절 이상 및/또는 Ca²⁺ 채널 활성화의 조절 이상과 관련된 질환의 예방, 개선 및/또는 치료에 사용하기 위한 본 발명의 조성물 또는 펩티드에 관한 것이다.

제4 측면에 있어서, 본 발명은 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애의 예방, 개선 및/또는 치료, 더 정확하게는 SNARE 복합체 형성의 조절 이상, 선 모양 근육 수축의 조절 이상, 아세틸콜린 및/또는 CGRP 방출의 조절 이상 및/또는 Ca²⁺ 채널 활성화의 조절 이상의 예방, 개선 및/또는 치료를 위한 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.

또한, 제5 측면에 있어서, 본 발명은 대상에서 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 미용 징후, 보다 구체적으로는 피부 노화 또는 표정 징후(expression signs)를 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한 본 발명의 펩티드 또는 조성물의 화장품으로서의 사용에 관한 것이다.

제6 측면에 있어서, 본 발명은 대상에서 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 미용 징후, 보다 구체적으로 피부 노화 또는 표정 징후를 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한 본 발명의 펩티드 또는 조성물의 화장품 용도에 관한 것이다.

제7 측면에 있어서, 본 발명은 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 미용 징후(보다 구체적으로는 피부 노화 또는 표정 징후)의 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 이를 예방, 감소 및/또는 제거하는 방법에 관한 것으로, 본 발명의 펩티드 또는 조성물의 사용을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본원에 사용된 용어 "비환식 지방족 그룹" 및 그의 복수형은 당업계의 수준에서 상기 용어에 대해 주어진 공통된 의미를 갖는다. 따라서, 이들 용어는 예를 들어, 선형 또는 분지형 알킬, 알케닐 및 알키닐 그룹을 말하며, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "알킬 그룹" 및 그의 복수형은 1 내지 24개, 바람직하게는 1 내지 16개, 더 바람직하게는 1 내지 14개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 12개, 더욱 더 바람직하게는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 사이의 탄소 원자를 가지며, 또한 단일 결합에 의해 분자의 나머지에 결합되는, 포화, 선형 또는 분지형 그룹을 말하며, 예를 들면, 메틸, 에틸, 이소프로필, n-프로필, i-프로필, 이소부틸, tert-부틸, n-부틸, sec-부틸, n-펜틸, n-헥실, 헵틸, 옥틸, 데실, 도데실, 라우릴, 헥사데실, 옥타데실, 아밀, 2-에틸헥실, 2-메틸부틸, 5-메틸헥실 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 알킬 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "알케닐 그룹" 및 그의 복수형은 2 내지 24개, 바람직하게는 2 내지 16개, 더 바람직하게는 2 내지 14개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 12개, 더욱 더 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6개 사이의 탄소 원자를 가지며, 공액 또는 비공액의 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고, 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 결합되는 선형 또는 분지형 그룹을 말하며, 예를 들어, 비닐, 올레일, 리놀레일 및 유사한 그룹을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 상기 알케닐 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "알키닐 그룹" 및 그의 복수형은 2 내지 24개, 바람직하게는 2 내지 16개, 더 바람직하게는 2 내지 14개, 보다 더 바람직하게는 2 내지 12개, 더욱 더 바람직하게는 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원자를 가지며, 공액 또는 비공액의 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 삼중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고, 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 결합되는 선형 또는 분지형 그룹을 말하며, 예를 들어, 에티닐 그룹, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 1-부티닐, 2-부티닐, 3-부티틸, 펜티닐, 예를 들면, 1-펜티닐 및 유사한 그룹을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 상기 알키닐 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "지환족 그룹(alicyclic group)" 및 그의 복수형은 당업계의 수준에서 상기 용어에 대해 주어진 공통된 의미를 갖는다. 따라서, 이들 용어는 예를 들어, 사이클로알킬 또는 사이클로알케닐 또는 사이클로알키닐 그룹을 말하며, 이에 제한되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "사이클로알킬" 및 그의 복수형은 3 내지 24개, 바람직하게는 3 내지 16개, 더 바람직하게는 3 내지 14개, 보다 더 바람직하게는 3 내지 12개, 더욱 더 바람직하게는 3, 4, 5 또는 6개의 탄소 원소를 가지며, 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 결합되어 있는 포화된 모노-, 또는 폴리사이클릭 지방족 그룹을 말하며, 예를 들어, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헵틸, 메틸 사이클로헥실, 디메틸 사이클로헥실, 옥타히드로인덴, 데카히드로나프탈렌, 도데카히드로페날렌, 아다만틸 등을 포함하나 이에 제한되지 않고, 이들은 알킬, 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "사이클로알케닐" 및 그의 복수형은 5 내지 24개, 바람직하게는 5 내지 16개, 더 바람직하게는 5 내지 14개, 보다 더 바람직하게는 5 내지 12개, 더욱 더 바람직하게는 5 또는 6개의 탄소 원자를 가지며, 공액 또는 비공액의 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 이중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖고, 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 결합되어 있는 비방향족 단환 또는 다환 지방족 그룹을 말하며, 예를 들면, 사이클로펜트-1엔-1-일 그룹 및 유사한 그룹을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 이는 알킬, 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "사이클로알키닐" 및 그의 복수형은 8 내지 24개, 바람직하게는 8 내지 16개, 더 바람직하게는 8 내지 14개, 보다 더 바람직하게는 8 내지 12개, 더욱 더 바람직하게는 8 또는 9개의 탄소 원자를 가지며, 공액 또는 비공액의 하나 또는 그 이상의 탄소-탄소 삼중 결합, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 탄소-탄소 삼중 결합을 갖고, 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 결합되어 있는 비방향족 단환 또는 다환 지방족 그룹을 말하며, 예를 들면, 사이클로옥트-2-인-1일 그룹 및 유사한 그룹을 포함하나 이에 제한되지 않고, 이는 알킬, 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 그룹에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "아릴 그룹" 및 그의 복수형은 6 내지 30개, 바람직하게는 6 내지 18개, 더 바람직하게는 6 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 6 또는 10개의 탄소 원자를 갖는 방향족 그룹을 말하며, 이는 탄소-탄소 결합에 의해 결합되거나 융합된 1, 2, 3 또는 4개의 방향족환을 포함하고, 단일 결합을 통해 분자의 나머지에 결합되어 있으며, 예를 들면, 페닐, 나프틸, 디페닐, 인데닐, 페난트릴 또는 안트라닐을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이 아릴 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "아르알킬 그룹" 및 그의 복수형은 7 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 방향족 그룹에 의해 치환된 알킬 그룹을 말하며, 예를 들면, -(CH₂)1-6-페닐, -(CH₂)1-6-(1-나프틸), -(CH₂)1-6-(2-나프틸), -(CH₂)1-6-CH(페닐)₂등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이 아르알킬 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "헤테로사이클릭 그룹" 및 그의 복수형은 3 내지 10원 헤테로사이클릭 또는 탄화수소 환을 말하며, 여기에서 하나 또는 그 이상의 환 원자, 바람직하게는 1, 2 또는 3개의 환 원자는 질소, 산소 또는 황과 같은, 탄소와 다른 원소로, 포화되거나 불포화될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해, 헤테로사이클릴은 융합 환 시스템을 포함할 수 있는 사이클릭, 모노사이클릭, 비사이클릭 또는 트리사이클릭 시스템일 수 있으며, 헤테로사이클릴 라디킬에서 질소, 탄소 또는 황 원자는 임의로 산화될 수 있고, 질소 원자는 임의로 4급화될 수 있으며, 헤테로사이클릴 라디칼은 부분적으로 또는 완전히 포화되거나 방향족일 수 있다. 선호도가 증가함에 따라, 헤테로사이클릭이란 용어는 5원 또는 6원 환에 관한 것이다. 헤테로사이클릭 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "헤테로아릴알킬 그룹" 및 그의 복수형은 치환 또는 비치환된 방향족 헤테로사이클릴 그룹으로 치환된 알킬 그룹을 말하며, 알킬 그룹은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖고, 방향족 헤테로사이클릴 그룹은 2 내지 24개의 탄소 원자와 탄소 이외의 1 내지 3개의 원자를 가지며, 예를 들면, -(CH₂)1-6-이미다졸릴, -(CH₂)1-6-트리아졸릴, -(CH₂)1-6-티에닐, -(CH₂)1-6-푸릴, -(CH₂)1-6-피롤리디닐 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 헤테로아릴알킬 그룹은 할로, 히드록시, 알콕시, 카르복시, 카르보닐, 시아노, 아실, 알콕시-카르보닐, 아미노, 니트로, 머캅토 및 알콕시티오와 같은 하나 또는 그 이상의 치환기에 의해 임의로 치환될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "할로" 또는 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 말하며, 그의 음이온은 할라이드로 지칭된다.

본원에서 사용된 용어 "유도체" 및 그의 복수형은 화장용 제제에 사용될 수 있는 관심있는 화합물로부터 유래된 화장용으로 허용되는 화합물 및 화장용으로 허용되는 유도체의 제조에 유용할 수 있기 때문에 화장용으로 허용되지 않는 유도체를 모두 가리킨다. 용어 "유도체" 및 이의 복수형은 또한 약제의 제조에 사용될 수 있는 관심있는 화합물로부터 유래된 약제학적으로 허용되는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 유도체의 제조에 유용할 수 있기 때문에 약제학적으로 허용되지 않는 유도체를 모두 가리킨다.

본 명세서에서 사용된 용어 "염" 및 이의 복수형은 당업계의 수준에서 알려진 것들 중에서 임의의 형태의 염, 예를 들어, 할라이드염, 히드록시산 염(옥시산 염, 산 염, 염기성 염 및 이중 염과 같은), 히드록소 염, 혼합 염, 옥시 염 또는 다른 수화된 염을 말한다. 이 용어는 화장용으로 및/또는 약제학적으로 허용되는 염 및 화장용으로 및/또는 약제학적으로 허용되지 않는 염을 모두 포함하며, 후자는 화장용으로 및/또는 약제학적으로 허용되는 염의 제조에 유용할 수 있기 때문이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "이성질체" 및 이의 복수형은 광학 이성질체, 거울상 이성질체, 입체 이성질체 또는 부분 입체 이성질체를 말한다. 개별적인 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체뿐만 아니라, 이들의 혼합물은 당업계에 공지된 통상적인 기술에 의해 분리할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "용매화물" 및 이의 복수형은 극성, 비극성 또는 양쪽성 용매화물과 같은 당업계에 공지된 임의의 용매화물을 가리키며, 관심 대상에게 (직접 또는 간접적으로) 투여되거나 적용될 때, 관심있는 화합물(본 발명의 펩티드(들))을 제공하는 화장용으로 허용되는 임의의 용매화물을 포함한다. 바람직하게는 용매화물은 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 이소프로판올과 같은 알코올과의 용매화물 또는 수화물, 에틸 아세테이트와 같은 에스테르와의 용매화물, 메틸 에테르, 에틸 에테르 또는 THF(테트라히드로푸란)과 같은 에테르와의 용매화물 또는 DMF(이메틸포름아미드)와의 용매화물이고, 보다 바람직하게는 에탄올과 같은 알코올과의 용매화물 또는 수화물이다.

또한, 본원에 사용된 용어 "아미노산" 및 이의 복수형은 유전자 코드에 의해 코드화된 아미노산뿐만 아니라 코드화되지 않은 아미노산을 그것이 천연이거나 아니거나, 이들이 D- 및 L-아미노산이거나 간에 포함한다. 코드화되지 않은 아미노산의 예에는 제한 없이 시투룰린, 오르니틴, 사르코신, 데스모신, 노르발린, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 2-아미노이소부티르산, 6-아미노헥사노산, 1-나프틸알라닌, 2-나프틸알라닌, 2-아미노벤조산, 4-아미노벤조산, 4-클로로페닐알라닌, 2,3-디아미노프로피온산, 2,4-디아미노부티르산, 사이클로세린, 카르니틴, 시스테인, 페니실라민, 피로글루탐산, 티에닐알라닌, 히드록시프롤린, 알로-이솔류신, 알로-트레오닌, 이소니페코트산, 이소세린, 페닐글리신, 스타틴, β-알라닌, 노르류신, N-메틸아미노산, α-아미노산 및 β-아미노산, 및 이들의 유도체가 포함된다. 그럼에도 불구하고, 추가의 비천연 아미노산이 당업계의 수준에서 알려져 있다[예를 들어, "Unusual amino acids in peptide synthesis" by D. C. Roberts and F. Vellaccio, The Peptides, Vol. 5 (1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds., Academic Press, New York, USA를 참조].

본원에 사용된 "표정 주름(expression wrinkles)"은 얼굴 피부에 표정을 유발하는 안면 근육의 수축에 의해 가해지는 스트레스로 생기는 주름이다. 상기 주름은 보통 이마, 눈썹 사이, 입 주위 및/또는 눈 주위에 위치한다.

전술한 바와 같이, 제1 측면에 있어서, 본 발명은 SEQ ID NO: 3 및/또는 SEQ ID NO:4와 경쟁하는 것을 특징으로하는 Munc 18-Syntaxin-1 복합체 상호 작용을 방해할 수 있는 펩티드, 그의 허용되는 이성질체, 염, 용매화물 및/또는 유도체 및/또는 이들의 혼합물에 관한 것이다.

본 발명의 펩티드에 사용되거나 존재하는 아미노산은 L-아미노산, D-아미노산 또는 이들의 조합인 것으로 고려된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드에 사용되거나 존재하는 아미노산은 L-아미노산이다.

바람직하게는 상기 언급된 이성질체는 입체 이성질체이다. 상기 입체 이성질체는 거울상 이성질체 또는 부분 입체 이성질체인 것으로 고려된다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 펩티드는 라세미 혼합물, 부분 입체 이성질체 혼합물, 순수한 거울상 이성질체 또는 순수한 부분 입체 이성질체이다.

본 발명의 펩티드는 그의 N-말단 및/또는 그의 C-말단에 결합된 적어도 하나의 부위를 포함하는 것으로 고려된다. 상기 적어도 하나의 부위는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해, 바람직하게는 공유적으로 펩티드에 결합될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 펩티드는 그의 N-말단에 공유 결합된 하나의 부위 및 그의 C-말단에 공유 결합된 하나의 부위를 포함한다.

일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 N-말단 부위(바람직하게는 하나의 N-말단 부위)가 H, 치환 또는 비치환된 비환식 지방족, 치환 또는 비치환된 알리사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬 및 R₅-CO-(여기에서, R₅는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 3 내지 10원의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭환, 및 탄소 원자 2 내지 24개 및 탄소 원자 이외의 다른 원자 1 내지 3개와 탄소수 1 내지 6의 알킬 쇄를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군 중에서 선택됨) 중에서 선택된다. 더 바람직하게는 적어도 하나의 N-말단 부위(바람직하게는 하나의 N-말단 부위)는 H 또는 R₅-CO- 중에서 선택되며, 여기에서 R₅는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 3 내지 10원의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭환, 및 탄소 원자 2 내지 24개 및 탄소 원자 이외의 다른 원자 1 내지 3개와 탄소수 1 내지 6의 알킬 쇄를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군 중에서 선택된다. 보다 더 바람직하게는 적어도 하나의 N-말단 부위(바람직하게는 하나의 N-말단 부위)는 H, 아세틸(이하에서는 Ac라고 함), tert-부타노일, 헥사노일, 2-메틸헥사노일, 사이클로헥산카르복실, 옥타노일, 데카노일, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일(이하에서는 Pal), 스테아로일, 올레오일 및 리놀레오일 중에서 선택된다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 N-말단 부위(바람직하게는 하나의 N-말단 부위)는 Ac이다.

일 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 C-말단 부위(바람직하게는 하나의 C-말단 부위)는 H, -NR₃R₄- , -OR₃ 및 -SR₃ 중에서 선택되며, 여기서 R₃ 및 R₄ 는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 비환식 지방족 그룹, 치환 또는 비치환된 알리사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 아르알킬 중에서 선택된다. 가장 바람직한 실시형태에 있어서, 적어도 하나의 C-말단 부위(바람직하게는 하나의 C-말단 부위)는 NH₂이다.

따라서, 더 바람직하게는 본 발명의 펩티드는 N-말단에 결합된 하나의 부위 및 C-말단에 결합된 하나의 부위를 포함하며, 여기서 N-말단에 결합된 부위는 Ac이고, C-말단에 결합된 부위는 NH₂이다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 서열은 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO:4이다(상술한 바와 같이, 상기 펩티드는 N-말단에 결합된 적어도 하나의 부위와 C-말단에 결합된 적어도 하나의 부위를 포함할 수 있고, 더 바람직하게는 N-말단에 결합된 하나의 부위와 C-말단에 결합된 하나의 부위를 포함하며, 여기서 N-말단에 결합된 부위는 Ac이고, C-말단에 결합된 부위는 NH₂임). 본 발명의 펩티드는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO:4와 적어도 70% 동일성을 갖는 서열, 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO:4와 80% 동일성을 갖는 서열, 보다 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO:4와 90% 동일성을 갖는 서열, 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO:4와 95% 동일성을 갖는 서열, 더욱 더 바람직하게는 SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO:4와 99% 동일성을 갖는 서열을 갖는 것으로 고려된다.

바람직한 실시형태 중 하나에 있어서, 본 발명의 펩티드 서열은 하기 일반식(I)에 따른 서열과 같다:

R₁-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-R₂(I)

상기 식에서

AA₁ 은 양으로 하전된 측쇄 또는 극성으로 하전되지 않은 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;

AA₂ 는 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고;

AA₃ 은 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;

AA₄ 는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고;

AA₅ 는 비극성 소수성 측쇄 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;

AA₆ 은 Trp이고;

R₁ 은 H, 치환 또는 비치환된 비환식 지방족, 치환 또는 비치환된 알리사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬 및 R₅-CO-(여기에서, R₅ 는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 3 내지 10원의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭환, 및 탄소 원자 2 내지 24개 및 탄소 이외의 원자 1 내지 3개를 가지며 탄소수 1 내지 6의 알킬 쇄를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군 중에서 선택됨) 중에서 선택되고;

R₂ 는 H, -NR₃R₄-, -OR₃ 및 -SR₃중에서 선택되며, 여기에서 R₃ 및 R₄ 는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 비환식 지방족 그룹, 치환 또는 비치환된 알리사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 아르알킬 중에서 선택된다.

이러한 바람직한 실시형태에 있어서, 더 바람직하게는 일반식(I)에서, AA₁ 이 His이고; AA₂ 가 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며; AA₃ 은 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고; AA₄ 는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며; AA₅ 는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군 또는 Met 중에서 선택되고; AA₆ 은 Trp이다.

이러한 바람직한 실시형태에 있어서, 보다 더 바람직하게는 일반식(I)에서, AA₁ 이 His이고; AA₂ 가 Gly, Ala, Val, Leu, Met 및 Ile의 군 중에서 선택되며; AA₃ 이 Gly, Ala, Val, Leu, Met 및 Ile의 군 중에서 선택되고; AA₄ 가 Lys, Arg, His, Asp 및 Glu의 군 중에서 선택되며; AA₅ 가 Met, Phe, Tyr 및 Trp의 군 중에서 선택되며; AA₆ 이 Trp이다.

이러한 바람직한 실시형태에 있어서, 보다 더 바람직하게는 일반식(I)에서, AA₁ 이 His이고; AA₂ 가 Ala 및 Ile의 군 중에서 선택되며; AA₃ 이 Leu 및 Met의 군 중에서 선택되고; AA₄ 가 Arg 및 Asp의 군 중에서 선택되며; AA₅ 가 Met, Phe 및 Trp의 군 중에서 선택되며; AA₆ 이 Trp이다.

이러한 바람직한 실시형태에 있어서, 더욱더 바람직하게는 본 발명에 따른 펩티드의 서열은 다음과 같다:

- R₁-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 5-R₂);

- R₁-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 6-R₂);

- R₁-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 7-R₂);

- R₁-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 8-R₂); 및/또는

- R₁-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-R₂ (R1-SEQ ID NO: 9-R₂).

R₁은 바람직하게는 H 또는 R₅-CO- 중에서 선택되며, 여기서 R₅는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 3 내지 10원의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭환, 및 탄소 원자 2 내지 24개 및 탄소 이외의 원자 1 내지 3개를 가지며 탄소수 1 내지 6의 알킬 쇄를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는 R₁은 H, 아세틸(이하에서는 Ac), tert-부타노일, 헥사노일, 2-메틸헥사노일, 사이클로헥산카르복실, 옥타노일, 데카노일, 라우로일, 미리스토일, 팔미토일(이하에서는 Pal), 스테아로일, 올레오일 및 리놀레오일 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는 R₁은 Ac이다.

바람직하게는 R₂는 NH₂이다.

그러므로, 더 바람직하게는, R₁은 Ac이고, R₂는 NH₂이다.

따라서, 이 바람직한 실시형태에 있어서, 바람직하게는 본 발명에 따른 펩티드의 서열은 다음과 같다:

- Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂);

- Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 6-NH₂);

- Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 7-NH₂);

- Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂); 및/또는

- Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 9-NH₂).

다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 펩티드의 서열은 하기 일반식(II)에 따른 서열과 같다:

R₁-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-R₂(II)

상기 식에서,

AA₁ 은 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;

AA₂ 가 임의의 아미노산이고;

AA₃ 이 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;

AA₄가방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고;

이 바람직한 실시형태에 있어서, 더 바람직하게는 일반식(II)에서,

AA₁ 이 Lys, Arg 및 His의 군 중에서 선택되며;

AA₂ 가 임의의 아미노산이고;

AA₃ 이 Lys, Arg 및 His의 군 중에서 선택되며;

AA₄ 가 Phe, Tyr 및 Trp의 군 중에서 선택된다.

AA₁ 이 Arg의 군 중에서 선택되고;

AA₂ 가 임의의 아미노산이며;

AA₃ 이 Arg의 군 중에서 선택되고;

AA₄ 가 Phe의 군 중에서 선택된다.

이 바람직한 실시형태에 있어서, 더욱 더 바람직하게는 본 발명에 따른 펩티드의 서열은 다음과 같다:

- R₁-Arg-Arg-Arg-Phe-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 10-R₂); 및/또는

- R₁-Arg-Met-Arg-Phe-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 11-R₂).

R₁ 은 바람직하게는 H 또는 R₅-CO- 중에서 선택되고, 여기서 R₅ 는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 3 내지 10원의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭환, 및 탄소 원자 2 내지 24개 및 탄소 이외의 원자 1 내지 3개를 가지며 탄소수 1 내지 6의 알킬 쇄를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는 R₁은 H, 아세틸 Ac, tert-부타노일, 헥사노일, 2-메틸헥사노일, 사이클로헥산카르복실, 옥타노일, 데카노일, 라우로일, 미리스토일, Pal, 스테아로일, 올레오일 및 리놀레오일 중에서 선택된다. 더욱 더 바람직하게는 R₁은 Ac이다.

바람직하게는 R₂는 NH₂이다.

그러므로, 더 바람직하게는, R₁은 Ac이고, R₂는 NH₂이다.

따라서, 이 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명에 따른 펩티드의 서열은 다음과 같다:

- Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 10-NH₂); 및/또는

- Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 11-NH₂).

본 발명의 펩티드는 당업계에서 공지된 임의의 수단에 의해 합성 및 생산될 수 있다. 예를 들어, 이들은 세포 배양물에서 상기 펩티드를 발현시키는 화학 합성에 의해(바람직하게는 고상 펩티드 합성에 의해) 또는 식물 또는 동물에서 펩티드의 유전자 도입 생산에 의해 합성 및 생산할 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 당업계에서 공지된 임의의 수단에 의해 정제할 수 있다.

하기에 포함된 실시예로부터 명백한 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 시냅스 전 수준에서 아세틸콜린 방출의 억제 및 따라서 근육 수축의 억제를 초래하는 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용의 효과적인 간섭을 제공한다. 또한, 하기에 포함된 실시예로부터 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 근육 세포에서 직접 근육 이완을 유도함으로써 시냅스 후 수준에서 직접적인 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 펩티드는 상기 언급된 문제를 해결하고 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 심미적 징후 및/또는 질병을 치료(예방, 감소 및/또는 제거)할 수 있는 추가 또는 대안적인 펩티드를 제공한다.

제2 측면에 있어서, 본 발명은 본 발명에 따른 적어도 하나의 펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 한 유형의 펩티드 또는 본 발명의 상이한 펩티드의 조합 또는 혼합물을 포함하는 것으로 고려된다.

바람직한 일 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 화장용 조성물이다.

본 발명의 화장용 조성물은 화장 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 펩티드를 포함한다. 더 바람직하게는 본 발명의 화장용 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 펩티드 0.0001 내지 0.05%(m/v), 더 바람직하게는 본 발명의 적어도 하나의 펩티드 0.0005 내지 0.005%(m/v), 보다 더 바람직하게는 본 발명의 적어도 하나의 펩티드 0.05 내지 0.001%(m/v)를 포함한다.

본 발명의 펩티드 활성(즉 Munc 18과 Syntaxin-1간의 상호 작용의 억제 및 따라서 신경 전달 물질의 방출 억제 및 근육 수축의 조절)의 결과로서 본 발명의 화장용 조성물은 피부 노화 및/또는 표정 징후(바람직하게는 주름)의 예방, 감소 및/또는 제거를 제공한다. 보다 정확하게는 본 발명의 화장용 조성물은 표정 주름, 보다 바람직하게는 이마의 주름, 눈썹 사이의 주름 및/또는 입 주변 및/또는 눈 주변의 주름 및 미세한 선의 예방, 감소 및/또는 제거를 제공한다.

본 발명의 화장용 조성물은 또한 적어도 하나의 추가 화장용 성분을 포함하는 것으로 고려된다. 상기 추가 화장용 성분은 적어도 하나의 부형제 및/또는 적어도 하나의 추가 화장용 활성 성분일 수 있다.

추가 화장용 성분은 당업계에서 통상 사용되는 것들, 예를 들어, 안정화제, 가용화제, 비타민, 착색제 및 방향제와 같은 보조제; 담체; 및/또는 다른 화장용 활성 성분을 포함한다.

상기 추가의 화장용 성분은 상기 조성물의 나머지 성분, 특히 본 발명의 조성물에 포함된 본 발명의 펩티드와 물리적 및 화학적으로 양립 가능해야 한다. 마찬가지로, 상기 추가의 화장용 성분의 성질은 본 발명의 펩티드 및 조성물의 이점을 수용할 수 없게 변경해서는 안된다. 상기 추가의 화장용 성분은 합성 또는 천연 기원, 예를 들어, 식물 추출물일 수 있거나, 또는 생체 발효 공정으로부터 유래될 수 있다[예를 들어, CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Eleventh Edition (2006)를 참조].

상기 언급된 추가의 화장용 성분은 피부 및/또는 모발의 케어, 세정을 위한 조성물에 통상 사용되는 성분들 및/또는 다한증을 예방하기 위한 크림 및/또는 탈취제, 예를 들면, 멜라닌 합성 억제제, 미백 또는 탈색소제, 노화 방지제, NO-신타제(synthase) 억제제, 산화 방지제, 대기 오염 방지제 및/또는 유리 라디칼 포획제, 당화 방지제, 유화제, 유기용제(emollient), 유기 용매, 액체 분사제, 피부 컨디셔너, 예를 들어, 수화제, 보습 물질, 알파 히드록시산, 보습제, 비타민, 안료 또는 착색제, 염료, 겔화 중합체, 점도 증가제, 계면활성제, 연화제, 기타 주름 방지제, 눈 밑의 백(bag)을 감소 또는 제거할 수 있는 제제, 각질 제거제, 항균제, 항진균제, 살균제, 피부 또는 표피 거대 분자 합성을 자극하는 제제 및/또는 그들의 분해를 방지 또는 억제할 수 있는 제제, 예를 들어, 콜라겐 합성 자극제, 엘라스틴 합성 자극제, 라미닌 합성 자극제, 콜라겐 분해 억제제, 엘라스틴 분해 억제제, 섬유 아세포 증식 자극제, 케라티노사이트 증식 자극제, 케라티노사이트 분화 자극제, 각질층의 성분(세라마이드, 지방산 등)의 합성 및 지질 합성 자극제, 피부 이완제, 글리코사미노글리칸 합성 자극제, DNA 수복제, DNA 보호제, 프로테오좀 활성 자극제, 소양증 방지제, 민감한 피부 치료제, 재확인제(reaffirming agents), 수렴제, 피지 생성 조절제, 지방 분해 촉진제, 항 셀룰라이트제, 진정제, 항염증제, 모세관 순환 및/또는 미세 순환 작용제, 세포 미토콘드리아에 작용하는 제제, 피부 표피 접합을 개선하기 위한 작용제, 보존제, 향료, 킬레이트제, 식물 추출물, 정유, 해양 추출물, 바이오 발효 공정에서 유래한 작용제, 무기염, 세포 추출물 및/또는 솔라 필터(자외선 A 및 B에 대해 활성인 유기 또는 무기 광보호제)를 포함하는 것으로 고려된다.

일 실시형태에 있어서, 추가의 화장용 성분 중 적어도 하나는 본 발명의 펩티드에 대해 상기 개시된 바와 동일, 유사, 상보적 또는 상이한 화장 활성을 발휘할 수 있는 화장용 활성 물질 또는 원칙이다. 본 발명의 화장용 조성물은 다른 주름 방지제 또는 노화 방지제, 예를 들어, 콜라겐, 엘라스틴, 성장 인자, 히알루론산 부스터, 장벽 기능제, 조명제, 콜라겐 I, III, IV 및/또는 VI 및 라미닌의 합성 및/또는 발현 자극제, 글리코사미노글리칸 또는 히알루론산의 합성을 자극하는 제제, 엘라스틴 및 다른 탄성 섬유 관련 단백질의 발현 및/또는 합성을 자극하는 제제, 콜라겐 및/또는 탄성 섬유 분해 억제제, 미토콘드리아 관련 단백질(예를 들면, 시르투인 및 아코니타제)의 발현 및/또는 합성을 자극하는 제제, 국소 접착 단백질의 발현 및/또는 합성을 자극하는 제제, 케라티노사이트 및/또는 섬유 아세포 증식 및/또는 분화를 자극하는 제제, 산화 방지제, 대기압 오염 방지제 및/또는 유리 라디칼 포획제, 당화 방지제, 해독제, 연대기 노화, 환경적 노화 및 염증 노화를 감소시키는 제제, 및 멜라닌 생성을 감소 및/또는 티로시나제를 억제하는 제제 및/또는 표피(케라틴), 보다 구체적으로 각질층(케라틴, 세라마이드, 필라그린, 로리크린 및 SPRR1B)의 성분의 합성 및 지질 합성을 자극하는 제제를 포함하는 것으로 고려된다. 더욱 바람직하게는 추가의 화장용 성분 중 적어도 하나는 Argireline^®(아세틸 헥사펩티드-8), Leuphasyl^®(펜타펩티드-3), Inyline^®(아세틸 헥사펩티드-30), Syn-Ake^®(트리펩티드-3) 또는 이의 조합이다.

또한, 본 발명의 화장용 조성물(또는 본 발명의 펩티드)은 예를 들어, "리브온(leave on)" 및 "린스 오프(rinse-off) 제제를 포함하여, 용액, 현탁액, 에멀젼, 페이스트, 겔, 크림, 파우더, 스프레이, 로션, 오일, 라이닝(liniment), 세럼, 무스, 연고, 바 또는 펜슬과 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 임의의 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 화장용 조성물은 또한 당업계에 공지된 기술에 의해 타월, 하이드로겔, 접착(또는 비접착) 패치 또는 페이스 마스크와 같은 다른 유형의 고체 액세서리에 혼입될 수 있거나, 또는 다른 것 들 중에서, 컨실러, 메이크업 파운데이션, 로션 또는 메이크업 제거 로션과 같은 다른 메이크업 라인 제품에 혼입될 수 있다.

본원에 개시된 바와 같이 본 발명의 화장용 조성물 또는 본 발명의 펩티드는 또한 화장용 서방성 시스템 및/또는 담체, 예를 들면, 리포좀, 밀리입자, 마이크로입자 및 나노입자 중에 뿐만 아니라, 스폰지, 소포, 미셀, 밀리스피어, 마이크로스피어, 나노스피어, 리포스피어, 밀리캡슐, 마이크로캡슐 및 나노캡슐 중에, 또한 활성 성분의 더 큰 침투를 얻기 위해, 마이크로 에멀젼 및 나노에멀젼에 혼입될 수 있는 것으로 또한 고려된다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 화장용 조성물은 이온 영동에 의해, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 신체, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴, 목, 손 및/또는 겨드랑이, 더욱 더 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴 및/또는 목에 적용하기에 적합하거나 적합화된다.

다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 화장용 조성물은 피하 주사에 의해, 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 신체, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴, 목, 손 및/또는 겨드랑이, 더욱 더 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴 및/또는 목에 적용하기에 적합하거나 적합화된다.

가장 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 화장용 조성물은 국소적으로(보다 바람직하게는 크림 형태로), 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 신체, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴, 목, 손 및/또는 겨드랑이, 더욱 더 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴 및/또는 목에 적용하기에 적합화하거나 적합하다.

다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 조성물은 약학 조성물이다.

본 발명의 약학 조성물은 약제학적 유효량의 본 발명의 적어도 하나의 펩티드를 포함한다.

본 발명의 펩티드 활성(즉, 신경 전달 물질 방출의 억제 및 근육 수축의 조절)의 결과로서 본 발명의 약학 조성물은 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료, 더 정확하게는 SNARE 복합체 형성의 조절 이상, 선 모양 근육 수축의 조절 이상, 아세틸콜린 및/또는 CGRP 방출의 조절 이상 및/또는 Ca²⁺ 채널 활성화의 조절 이상과 관련된 질병, 바람직하게는 노인성 치매, 알쯔하이머 관련 치매, AIDS 관련 치매, 간질, 근 위축성 경화증(amiotrophic sclerosis), 다발성/측삭 경화증(multiple/lateral sclerosis), 비만 세포증(mastocytosis), 만성 편두통, 근 긴장 이상증(dystonia) 또는 불안 장애의 예방 및/또는 치료를 제공한다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 근 긴장증(myotonia), 근이영양증(myotonic dystrophy), 선천성 근강직증(myotonia congenita), 파킨슨병(Parkinson disease), 이차 파킨슨병(Secondary Parkinsonism), 헌팅턴병(Huntington disease), 경련(spasticity), 만발성 운동 장애(Tardive Dysinesia, TD), 또는 근 긴장 이상(안검 경련(blepharospasm), 메이그(Meige) 증후군, 손 경련(hand cramps), 사지 근 긴장증(limb dystonia) 또는 사시(strabismus))의 치료를 제공한다.

약학 조성물은 선택된 경로에 적합한 당업계에서 알려진 임의의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 당업계에 공지된 임의의 수단 및 임의의 경로(예를 들어, 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 경구; 후자의 경우, 예를 들어, 염수 용액 및/또는 생분해성 물질, 예컨대, 폴리락트산(PLA)의 중합체, 폴리글리콜산(PGA) 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤 및/또는 콜레스테롤의 형태로) 투여하기에 적합하거나 적합화되는 것으로 생각된다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 적어도 하나의 추가 약제학적 성분을 포함하는 것으로 고려된다. 상기 추가의 약제학적 성분은 적어도 하나의 부형제 및/또는 적어도 하나의 추가의 약제학적 활성 성분일 수 있는 것으로 고려된다. 적어도 하나의 추가의 약제학적 활성 성분이 벤조디아제핀(Benzodiazepine), 클로나제팜(Clonazepam), 로라제팜(Lorazepam), 디아제팜(Diazepam), 바클로펜(Baclofen), 항콜린제(Anticholinergic), 트리헥시페니딜(Trihexyphenidyl), 벤즈트로핀(Benztropine), 도파민-결핍제(Dopamine-depleting agent), 테트라베나진(Tetrabenazine), 클로자핀(Clozapine) 또는 이들의 조합인 것으로 고려된다.

제3 측면에 있어서, 상술한 바와 같이, 본 발명은 의약에 사용하기 위한 본 발명에 따른 펩티드 또는 조성물(즉 상기 언급된 바에 따름)에 관한 것이다.

상기 언급된 바와 같이, 이하에 포함된 실시예로부터 직접 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드(및, 따라서 이들을 포함하는 조성물)는 아세틸콜린의 방출 및 근육 수축을 억제할 수 있고, 따라서 상기 활성으로 인해 이들은 의약으로서 유용하다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 조성물은 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애의 예방 및/또는 치료(바람직하게는 치료)에 사용하기 위한 것이다.

근 수축성 장애는 바람직하게는 근육 과수축성(muscle hypercontractility)이다.

바람직하게는 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애는 SNARE 복합체 형성, 선 모양 근육 수축, 아세틸콜린 및/또는 CGRP 방출, 및/또는 Ca²⁺ 채널 활성화의 조절 이상과 관련된 질환이다.

더 바람직하게는 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애는 노인성 치매, 알쯔하이머 관련 치매, AIDS 관련 치매, 간질, 근위축성 경화증, 다발성/측삭 경화증, 비만 세포증, 만성 편두통, 근 긴장 이상증 또는 불안 장애 중에서 선택된다.

따라서, 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 조성물은 노인성 치매, 알쯔하이머 관련 치매, AIDS 관련 치매, 간질, 근위축성 경화증, 다발성/측삭 경화증, 비만 세포증, 만성 편두통, 근 긴장 이상증 또는 불안 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다. 상기 질환과 관련하여, 노인성 치매, 알쯔하이머 관련 치매, AIDS 관련 치매, 간질, 근위축성 경화증, 다발성/측삭 경화증, 만성 편두통, 및 불안 장애는 신경 세포 엑소사이토시스 장애이다. 다른 한편으로, 근 긴장 이상증은 근육 수축성 장애이다.

바람직하게는 근 긴장 이상증은 안검 경련증, 메이그(Meige) 증후군, 손 경련, 사지 근 긴장 이상 또는 사시 중에서 선택된다.

다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 조성물은 근 긴장증, 근이영양증, 선천성 근강직증, 파킨슨병, 이차 파킨슨병, 헌팅턴병, 경련 또는 만발성 운동 장애(TArdive Dysinesia, TD)의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 것이다. 상기 질환은 근육 수축성 장애이다.

바람직하게는 본 발명의 펩티드 또는 조성물은 치료 유효량으로 사용된다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 및 조성물은 포유류, 더 바람직하게는 인간에서 사용하기 위한 것이다.

바람직한 실시형태에 있어서, 상기 조성물은 상기 언급된 바에 따른 약학 조성물이다.

본 발명의 펩티드 또는 조성물은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 또는 임의의 경로를 통해 사용될 수 있다. 어느 경우에나, 펩티드 또는 조성물은 선택된 수단 및/또는 경로(예를 들어, 피하, 근육 내, 정맥 내 또는 경구; 후자의 경우, 예를 들어, 염수 용액 및/또는 생분해성 물질, 예컨대, 폴리락트산(PLA)의 중합체, 폴리글리콜산(PGA) 폴리락트산-글리콜산 공중합체, 폴리카프로락톤 및/또는 콜레스테롤의 형태로)에 적합할 것이다.

제4 측면에 있어서, 본 발명은 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애의 예방 및/또는 치료(바람직하게는 치료) 방법으로서, 본 발명의 펩티드 또는 조성물을 필요한 대상에게 투여하는 것을 포함한다.

근육 수축성 장애는 바람직하게는 근육 과수축성이다.

바람직하게는 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애는 SNARE 복합체 형성의 조절 곤란, 선 모양 근육 수축 조절 이상, 아세틸 콜린 및/또는 CGRP 방출의 조절 이상 및/또는 Ca²⁺ 채널 활성화의 조절 이상과 관련된 질환이다.

보다 바람직하게는 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애는 노인성 치매, 알쯔하이머 관련 치매, AIDS 관련 치매, 간질, 근위축성 경화증, 다발성/측삭 경화증, 비만 세포증, 만성 편두통, 근 긴장 이상증 및 불안 장애 중에서 선택된다.

상기 질환과 관련하여, 노인성 치매, 알쯔하이머 관련 치매, AIDS 관련 치매, 간질, 근위축성 경화증, 다발성/측삭 경화증, 만성 편두통, 및 불안 장애는 신경 세포 엑소사이토시스 장애이다. 다른 한편으로, 근 긴장 이상증은 근육 수축성 장애이다.

바람직하게는 근 긴장 이상증은 안검 경련증, 메이그 증후군, 손 경련, 사지 근 긴장 이상 또는 사시 중에서 선택된다.

다른 바람직한 실시형태에 있어서, 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애는 근 긴장, 근이영양증, 선천성 근강직증, 파킨슨병, 이차 파킨슨병, 헌팅턴병, 경련 또는 만발성 운동 장애(TD) 중에서 선택된 근육 수축성 장애이다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 치료 방법을 필요로 하는 대상은 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간이다.

상술한 바와 같이, 제5 측면에 있어서, 본 발명은 대상에서 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 징후를 예방, 감소 및/또는 제거하기 위해 본 발명의 펩티드의 화장품 또는 화장용 조성물로서의 사용에 관한 것이다.

명백한 바와 같이, 상기 언급된 징후는 미용 징후이다.

근육 수축성의 조절 이상은 바람직하게는 근육 과수축성이다.

바람직하게는 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 과수축성의 조절 이상과 관련된 미용 징후는 피부 노화 및/또는 표정 징후이다.

피부 노화의 미용 징후는 바람직하게는 주름이다.

가장 바람직한 실시형태에 있어서, 피부 노화 및/또는 표정 징후는 얼굴 주름(바람직하게는 표정 징후) 및/또는 안면 비대칭이다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물은 이온 영동에 의해, 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 신체, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴, 목, 손 및/또는 겨드랑이, 더욱 더 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴 및/또는 목에 적용된다.

또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물은 피하 주사에 의해, 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 신체, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴, 목, 손 및/또는 겨드랑이, 더욱 더 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴 및/또는 목에 적용된다.

가장 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물은 국소적으로(더 바람직하게는 크림의 형태로), 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 신체, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴, 목, 손 및/또는 겨드랑이, 더욱 더 바람직하게는 대상(바람직하게는 인간)의 얼굴 및/또는 목에 적용된다.

바람직하게는, 대상은 포유 동물, 더 바람직하게는 인간이다.

또한, 본 발명의 화장품으로서의 사용에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물은 화장 유효량으로 사용된다. 더 바람직하게는 본 발명의 펩티드는 0.0001% 내지 0.05%(m/v), 더 바람직하게는 0.0005% 내지 0.005%(m/v), 보다 더 바람직하게는 0.05% 내지 0.001%(m/v)의 농도로 사용된다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 화장용 조성물은 또한 적어도 하나의 추가 화장용 성분을 포함하는 것으로 고려된다. 상기 추가 화장용 성분은 적어도 하나의 부형제 및/또는 적어도 하나의 추가 화장용 활성 성분을 포함할 수 있으며, 이는 상기 설명된 바와 같을 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 상기 언급된 것에 따른 적어도 하나의 추가 화장용 성분과 조합하여 사용되는 것으로 고려된다.

또한, 본 발명의 펩티드 및 본 발명의 화장용 조성물은 "리브 온(leave on)" 및 "린스 오프(rinse off)" 제형을 포함하여, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유제, 페이스트, 겔, 크림, 분말, 스프레이, 로션, 오일, 라이닝, 세럼, 무스, 연고, 바 또는 펜슬과 같은 당업계에서 일반적으로 사용되는 임의의 형태로 제형화될 수 있다. 본 발명의 펩티드 및 화장용 조성물은 또한 당업계에 공지된 기술에 의해 타월, 하이드로겔, 접착성(또는 비접착성) 패치 또는 페이스 마스크와 같은 상이한 유형의 고체 액세서리에 혼입될 수 있거나, 또는 컨실러, 메이크업 파운데이션, 로션 또는 메이크업 제거 로션과 같은 상이한 메이크업 라인 제품에 혼입될 수 있다.

또한, 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 화장용 조성물 또는 본 발명의 펩티드는 화장용 서방출 시스템 및/또는 리포좀, 밀리 입자, 마이크로 입자 및 나노 입자와 같은 담체뿐 아니라, 스폰지, 소포, 미셀, 밀리스피어, 마이크로스피어, 나노스피어, 리포스피어, 밀리캡슐, 마이크로캡슐 및 나노캡슐뿐만 아니라 활성 성분의 더 큰 침투를 얻기 위해 마이크로 에멀젼 및 나노 에멀젼에 혼입될 수 있는 것으로 고려된다.

제6 측면에 있어서, 본 발명은 대상에서 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 징후를 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물(즉, 상기 설명한 바와 같은)의 화장품 사용에 관한 것이다.

명백한 바와 같이, 상기 언급된 징후는 미용 징후이다.

피부 노화의 미용 징후는 바람직하게는 주름이다.

가장 바람직한 실시형태에 있어서, 피부 노화 및/또는 표정 징후는 얼굴 주름(바람직하게는 표정 주름) 및/또는 안면 비대칭이다.

바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물은 이온 영동에 의해, 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 신체, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴, 목, 손 및/또는 겨드랑이, 더욱 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 목에 적용된다.

또 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물은 피하 주사에 의해, 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 신체, 보다 바람직하게는 대상의 얼굴, 목, 손 및/또는 겨드랑이, 더욱 더 바람직하게는 대상의 얼굴 및/또는 목에 적용된다.

또한, 본 발명의 화장용 사용에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물은 화장 유효량으로 사용된다. 더 바람직하게는 본 발명의 펩티드는 0.0001% 내지 0.05%(m/v), 더 바람직하게는 0.0005% 내지 0.005%(m/v), 보다 더 바람직하게는 0.05% 내지 0.001%(m/v)의 농도로 사용된다.

상술한 바와 같이, 제7 측면에 있어서, 본 발명은 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 징후의 치료를 필요로 하는 대상에 있어서 이를 예방, 및/또는 감소시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 펩티드 또는 조성물의 사용을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 언급한 징후는 미용 징후이다.

바람직하게는 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성의 조절 이상과 관련된 미용 징후는 피부 노화 및/또는 표정 징후이다.

바람직하게는 피부 노화의 미용 징후는 주름이다.

또한, 본 발명의 방법에 있어서, 본 발명의 펩티드 또는 화장용 조성물은 화장 유효량으로 사용된다. 더 바람직하게는 본 발명의 펩티드는 0.0001% 내지 0.05%(m/v), 더 바람직하게는 0.0005% 내지 0.005%(m/v), 보다 더 바람직하게는 0.05% 내지 0.001%(m/v)의 농도로 사용된다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 화장용 조성물은 또한 적어도 하나의 추가 화장료 성분을 포함하는 것으로 고려된다. 상기 추가 화장료 성분은 적어도 하나의 부형제 및/또는 적어도 하나의 추가 화장용 활성 성분을 포함할 수 있으며, 이는 상기 설명된 바와 같을 수 있다. 또한, 본 발명의 펩티드는 상기 언급된 것에 따른 적어도 하나의 추가 화장용 성분과 조합하여 사용되는 것으로 고려된다.

더 나은 이해를 가능하게 하기 위해, 본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 이하에서 더 상세히 설명하며, 이는 실시예로 제시되고 예시적이며 비제한 실시예를 참조하여 설명된다.

도 1은 양성 대조와 비교하여 분석된 펩티드로 처리된 LAN 세포에 의한 시험관내(in vitro) 아세틸콜린 방출의 백분율을 나타낸다(즉, 양성 대조 샘플의 아세틸콜린 방출의 백분율을 100%로 안정화한 후, 샘플의 나머지와의 비교를 수행함). 도 1은 펩티드: Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂ (A), Ac-SEQ ID NO: 6-NH₂ (B), Ac-SEQ ID NO: 7-NH₂ (C), Ac-SEQ ID NO: 8 -NH₂ (D), Ac-SEQ ID NO: 9-NH₂ (E), Ac-SEQ ID NO: 10-NH₂ (F), Ac-SEQ ID NO: 11-NH₂ (G), Ac-SEQ ID NO: 13-NH₂ (H) 및 Ac-SEQ ID NO:14-NH₂ (I)에 대해 얻어진 결과를 보여준다. Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ (D)를 제외한 모든 펩티드를 0.001mg/mL, 0.005mg/mL 및 0.01mg/mL의 농도로 시험하였고; 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ (D)는 0.005mg/mL 및 0.05mg/mL로 시험하였다. 도 1(D)의 경우, x-축에서 좌측부터 우측으로의 기둥은 기저 상태(처리되지 않은 세포), 양성 대조(50mM의 KCl로 처리된 세포), 100nM의 독소[문헌(Ibanez C., Blanes-Mira C., Fernadez-Ballester G., Planells-Cases R., and Ferrer-Montiel A.,(2004) Modulation of botulinum neurotoxin A catalytic domain stability by tyrosine phosphorylation, FEBS Letters 578, 121-127)에 따라 생산된 보툴리눔 신경독소 A 경쇄(BoNT A LC)]로 처리된 세포, 0.1μM Palmitoyl-Argireline^®(팔미토일-아세틸 헥사펩티드-8^®)로 처리된 세포 및 0.005mg/mL 및 0.05mg/mL의 해당 펩티드로 처리된 세포에 해당한다. 측면에서, 도 1(A) 내지 도 1(C) 및 도 1(E) 내지 도 1(I)의 경우, x-축에서 좌측부터 우측으로의 기둥은 기저 상태(처리하지 않은 세포), 양성 대조(50mM의 KCl로 처리된 세포), 100nM의 독소(BoNTALC)로 처리된 세포 및 0.001mg/mL, 0.005mg/mL 및 0.01mg/mL의 해당 펩티드로 처리된 세포에 해당한다. 도 1(A) 내지 도 1(I)의 경우, y축은 (양성 대조와 관련하여) 아세틸콜린 방출의 백분율을 나타낸다.

도 2는 100%의 결합을 나타내는, 대조군(비처리)과 관련하여 복합체 Munc 18-Syntaxin-1의 결합 백분율을 나타낸다. 도 2에 있어서, 복합체 Munc 18-Syntaxin-1의 형성을 억제하는 펩티드 Ac-SEQ ID NO:8-NH₂ (A) 및 Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂ (B)의 능력이 관찰될 수 있다. 도 2(A) 및 2(B)의 x-축에서 좌측부터 우측으로의 기둥은 기둥의 제1 그룹의 경우, 대조군 및 Munc 18 100nM:Syntaxin-1 10nM의 비로 상응하는 펩티드의 0.1, 0.5 및 1mM의 농도에 해당하며(왼쪽 기둥 그룹), 기둥의 제2 그룹의 경우, 대조군 및 Munc 18 100nM:Syntaxin-1 15nM의 비로 해당 펩티드의 0.1, 0.5 및 1mM 농도에 해당한다(오른쪽 기둥 그룹). 양 도면 모두에서, y축은 복합체 형성 백분율을 나타내며. 어떠한 처리없이 얻어진 신호를 100%로 한다.

도 3은 본 발명의 펩티드를 사용한 처리에 의해 유도된 인간 골격 근세포의 유전자 발현 프로파일에서의 조절을 나타낸다. 도 3(A)는 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ (6시간 동안 0.05 및 0.5mg/mL의 농도)로 처리한 결과를 나타내며, 여기서 막대는 위에서 아래로 다음 유전자를 말한다: SCN3A(나트륨 전압-게이트 채널 알파 서브유닛(Sodium Voltage-Gated Channel Alpha Subunit) 3), UTRN(유트로핀(Utrophin)), ACTA1(액틴(Actin) 알파 1), TNNC1(트로포닌(Troponin) C1), CALM3(칼모둘리나(Calmodulina) 3), CAV1(카베올린(Caveolin) 1), CACNB1(칼슘 전압-게이트 보조(Auxiliary) 서브유닛 베타 1), LRP4(LDL 수용체 관련 단백질(Receptor Related Protein) 4) 및 MYH1(미오신 중쇄(Myosin Heavy Chain) 1). 도 3(A)에서 유전자 MHY1, LRP4, CACNB1 및 UTRN에 대한 결과는 0.05mg/mL 처리에 해당하는 반면, 나머지는 0.5mg/mL 처리에 해당한다. 도 3(B)는 24시간 동안 0.5mg/mL의 농도에서 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 처리한 결과를 보여주며, 여기서 막대는 위에서 아래로 다음 유전자를 말한다: RAPSN(시냅스의 수용체 관련 단백질(Receptor Associated Protein of The Synapse)) 및 ATP2A(ATPase Sarcoplasmic/Endoplasmic Reticulum Ca²⁺운반). 도 3(C)는 Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂ (24시간 동안 0.05mg/mL의 농도)로 처리한 결과를 보여주며, 여기서 막대는 위에서 아래로 다음 유전자를 말한다: UTRN(유트로핀), ACTA1(액틴 알파 1), TNNC1(트로포닌 C1), RAPSN(시냅스의 수용체 관련 단백질), SCN3A(나트륨 전압-게이트 채널 알파 서브유닛 3) 및 MYH1. 도 3(D)는 Ac-SEQ ID NO: 10-NH₂ (24시간 동안 0.1mg/mL 의 농도)로 처리한 결과를 보여주며, 여기서 막대는 위에서 아래로 다음 유전자를 말한다: UTRN(유트로핀), TNNC1(트로포닌 C1), SCN3A(나트륨 전압-게이트 채널 알파 서브유닛 3), CHRNA1(콜린성 수용체 니코틴(Cholinergic Receptor Nicotinic) 알파 1 서브유닛) 및 CACNB1(칼슘 전압-게이트 체널 보조 서브유닛 베타 1). 4가지 경우에 있어서, X-축은 기저 상태와 관련하여 배수 변화를 지칭한다. 음의 배수 변화는 유전자 발현의 하향 조절(downregulation)을 말하고, 양성 배수 변화는 상향 조절(upregulation)을 말한다.

도 4는 100%로 안정화된 대조군(60mM KCl로 자극된 처리하지 않은 샘플)과 관련하여 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 처리하고 60mM KCl로 자극한 후 인간 골격 근세포에서 칼슘 유입의 감소를 나타낸다. X-축에서 좌측부터 우측으로의 기둥은 대조군과 0.01, 0.05 및 0.1mg/mL의 펩티드 농도에 상응한다. Y-축은 100% 신호로서 안정화된, 대조군과 관련하여 칼슘 신호의 감소 백분율을 나타낸다.

도 5는 비처리 1차 인간 골격 근세포(도 5(A)) 및 0.05mg/mL 의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 처리된 1차 인간 골격 근세포(도 5(B))에서의 미오신 중쇄 단백질의 발현 수준의 대표적인 이미지를 보여준다. 미오신 중쇄 단백질 수준의 감소는 비처리된 세포와 관련하여 0.05mg/mL의 펩티드로 처리된 1차 인간 골격 근세포에서 관찰되며, 이는 도 5(A)와 비교하여 도 5(B)에서 염색 또는 신호의 손실로서 볼 수 있다.

도 6은 100%로 안정화된 기저 대조군(비처리 세포)과 관련하여 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 처리한 후 1차 인간 골격 근세포에서 미오신 중쇄 단백질 수준의 감소를 보여준다. X-축에서 좌측부터 우측으로의 기둥은 비처리 세포와 0.05 및 0.5mg/ml의 펩티드 농도에 상응한다. Y-축은 100% 신호로서 안정화된, 기저 대조군과 관련하여 미오신 중쇄 단백질의 수준을 나타낸다(평균 세포 형광에 의해 측정된 바와 같이, 처리군의 각각에 있어서 미오신 중쇄 단백질에 대해 관찰된 형광 신호에 기초하여).

도 7은 100%로 안정화된 기저 대조군(비처리 세포)과 관련하여, 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂, 벤치마크 대조군으로서 아세틸 헥사펩티드-8, 또는 억제의 양성 대조군으로서 α-분가로톡신(bungarotoxin)으로 처리 후 인간 운동 신경 세포(motor neurons) 및 인간 골격 근세포 공배양물 상에서 관찰된 수축 빈도의 조절을 보여준다. 사각형 선은 비처리 세포(기저 대조군)의 수축 빈도를 나타낸다. 십자선은 수축 억제의 양성 대조군, α-분가로톡신에 의한 수축 빈도를 나타낸다. 다이아몬드선은 0.5mg/ml에서 벤치마크 아세틸 헥사펩티드-8에 의한 수축 빈도를 나타낸다. 원의 선은 0.1mg/ml의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 에 의한 수축 빈도를 나타내고, 삼각형의 선은 0.05mg/ml의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂에 의한수축 빈도를 나타낸다. X-축은 상이한 활성제에 의한 처리의 길이에 상응하고, 이는 상이한 시점: T0, T30분, T2h, T24h 및 회복을 지적한다. T0은 상기 언급한 화합물로 처리하기 전의 수축에 해당하고; T30분은 30분 처리에 해당하며; T2h는 2시간 처리에 해당하고; T24h는 24시간 처리에 해당하고; 회복은 모든 화합물을 제거한 후 24시간 인큐베이션(incubation)에 해당한다. Y-축은 100% 신호로서 안정화된, 기저 대조군(비처리 세포)과 관련하여 수축 빈도의 백분율을 나타낸다.

도 8은 100%로 안정화된 비처리 세포의 기본 대조군과 관련하여 벤치마크 에세틸 헥사펩티드-8 또는 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 처리한 후 인간 신경 모세포종 세포주에서 엑소사이토시스의 감소를 보여준다. X-축에서 좌측부터 우측으로의 기둥은 비처리 세포, 1 mg/ml의 아세틸 헥사펩티드-8로 처리된 세포 및 0.01 mg/ml의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂.로 처리된 세포에 해당한다. Y-축은 100% 수준으로 안정화된, 기본 대조군과 관련하여 엑소사이토시스의 수준에 상응하는 형광 신호의 백분율을 나타낸다.

도 9는 100%로 안정화된 비처리 세포의 기저 대조군과 관련하여 벤치마크 아세틸 헥사펩티드-8 또는 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 처리한 후 인간 신경 모세포종 세포주에서 엑소사이토시스 시간의 지연을 나타낸다. X-축에서 좌측부터 우측으로의 기둥은 비처리 세포, 1mg/ml의 아세틸 헥사펩티드-8 및 0.01mg/ml의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂에 해당한다. Y-축은 100% 수준으로 안정화된, 기본 대조군과 관련하여 엑소사이토시스의 지연에 상응하는 반응 시간의 백분율을 나타낸다.

도 10은 처리 개시 후 24시간에(도 10(A)) 및 처리 개시 후 48시간에(도 10(B)), 100%로 안정화된 기저 대조군(비처리 세포)과 관련하여 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 처리한 후 1차 인간 피부 섬유 아세포에 의한 콜라겐 I형 생산을 나타낸다. X축에서 좌측부터 우측으로의 기둥은 기저 대조군(비처리 세포) 및 0.01, 0.05 또는 0.1mg/ml의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂로 각각 처리된 세포에 해당된다. Y축은 100% 수준으로 안정화된, 대조군과 관련하여 콜라겐 I형 단백질 합성의 증가 백분율을 보여준다.

실시예

약어: 아미노산에 사용된 약어는 Eur. J. Biochem. (1984) 138:937에 개요가 서술된 1983 IUPAC-IUB 생화학 명명법 권고에 따른다.

Ac, 아세틸; Ala, 알라닌; Arg, 알기닌; Asn, 아스파라긴; Asp, 아스파르트산; Boc, tert-부틸옥시카르보닐; C-말단, 카르복시-말단; DCM, 디클로로메탄; DIEA, N,N'-디이소프로필에틸아민; DIPCDI, N,N'-디이소프로필카르보디이미드; DMF, N,N-디메틸포름아미드; equiv, 당량; ESI-MS, 전기 분무 이온화 질량 분석법; Fmoc, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐; Glu, 글루탐산; hiPSC, 인간 유도 만능 줄기 세포; His, 히스티딘; HOBt, 1-히드록시벤조트리아졸; HPLC, 고성능 액체 크로마토그라피; HRP, 양고추 냉이 과산화 효소(Horseradish peroxidase); Ile, 이소류신; INCI, 화장품 성분의 국제 명칭; MBHA, p-메틸벤즈히드릴아민; Leu, 류신; Lys, 라이신; Me, 메틸; MeCN, 아세토니트릴; MeOH, 메탄올; Met, 메티오닌; N-말단, 아미노-말단; Palm, 팔미토일; Pbf, 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐; PFA, 파라포름알데히드; PMA, 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트; Phe, 페닐알라닌; PMSF, 페닐메탄술포닐; RT, 실온; tBu, tert-부틸; Thr, 트레오닌; TFA, 트리플루오로아세트산; TIS, 트리이소프로필실란; TMB, 테트라메틸벤지딘; Trt, 트리페닐메틸 또는 트리틸; Trp, 트립토판; Tyr, 티로신.

실시예에 포함된 화학 합성 절차와 관련하여, 모든 합성 공정은 다공성 폴리에틸렌 디스크가 장착된 폴리프로필렌 시린지 또는 다공성 판이 장착된 Pyrex^® 반응기에서 수행되었다는 점에 주목된다. 모든 시약 및 용매는 합성 품질로서 어떠한 추가 처리없이 사용되었다. 용매 및 가용성 시약은 흡입에 의해 제거하였다. Fmoc 그룹을 피페리딘-DMF(2:8, v/v)(적어도 1 x 1분, 2 x 10분, 5mL/g 수지)로 제거하였다[Lloyd Williams P. et al., Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, CRC, 1997, Boca Raton(Fla., USA)] 탈보호, 커플링 및 다시 탈보호의 단계 사이의 세척은 매번 10ml 용매/g 수지를 사용하여 DMF(3 x 1분) 및 DCM(3 x 1분)으로 수행하였다. 커플링 반응은 3ml 용매/g 수지로 수행하였다. 닌히드린 시험을 수행함으로써 커플링의 제어를 실시하였다[Kaiser E. et al., Anal. Biochem., 1970, 34: 595598]. 모든 합성 반응 및 세척은 RT에서 수행하였다.

실시예 1. Munc 18-Syntaxin-1의 상호 작용을 간섭하는 펩티드의 in silico 결정

이 실험에서, 목적은 Munc 18-Suntaxin-1의 상호 작용 영역에 대한 친화성 및/또는 특이성을 갖는 인 실리코(in silico) 펩티드를 생성하는 것이며, 따라서, 상기 2개의 단백질간의 상호 작용 및/또는 결합을 경쟁, 간섭 및 방해할 수 있다.

Munc 18-Syntaxin-1 복합체의 구조가 알려져 있고, 2.6A 해상도에서 이용 가능하므로(단백질 데이터 뱅크 참조 번호 3C98), 이 상호 작용의 3차원 구조 모델이 생성되었고 표 1에 포함된 Munc 18의 상호 작용 단편이 선택되었다.

표 1: 인 실리코 연구에 의해 선택된 Munc 18-Syntaxin-1의 상호 작용 단편

단백질	상호 작용 단편의 서열	길이(아미노산)
Munc18	46-Lys-Met-Thr-Asp-Ile-Met-51 (SEQ ID NO: 3)	6
Munc18	59-Glu-Asp-Ile-Asn-Lys-Arg-Arg-Glu-66 (SEQ ID NO: 12)	8
Munc18	63-Lys-Arg-Arg-Glu -66 (SEQ ID NO: 4)	4

상기 표적 단편에 기초하여, 설계의 제1 단계로서, 야생형 펩티드(100% 결합제 펩티드로서 간주됨)를 폴리-Ala(비결합제 펩티드 0%로서 간주됨)로 변이시키고, 모든 위치를 독립적으로 처리하였다. 각각의 개별 위치는 20개의 천연 아미노산으로 돌연변이되었고, 다른 위치는 Ala로서 남아있다. 단편과 나머지 복합체간의 이론적 결합 에너지는 다른 위치에서 돌연변이 유발과의 상호 작용의 개선을 평가하기 위해 결정되었다. 결합 에너지의 표화 및 정규화는 펩티드의 주어진 위치에 아미노산 잔기가 얼마나 잘 맞는지를 보여주는 스코어링 매트릭스를 생성하였다. 이들 매트릭스를 사용하여 Munc 18-Syntaxin-1 복합체 형성을 추정적으로 억제하는 펩티드의 등급 리스트를 제안하고 구축하였다.실험의 제2 단계에서, 펩티드 리스트는 복합체에 대해 모델링되었지만, 동시에 펩티드의 모든 위치를 돌연변이시켰다. 이러한 방식으로, 펩티드 내의 이웃하는 위치 사이의 상호 작용 또는 비호환성이 고려되었다는 것이 보장되었다. 펩티드-복합체 상호 작용의 결합 에너지를 다시 평가하고, 이 에너지에 따라 펩티드를 재순위화하였다. 이어서 100% 초과 또는 0% 미만일 수 있는 결합 에너지를 100% 결합제(야생형) 및 0% 결합제(폴리 Ala 펩티드)와 비교하였다. 추가 연구 및 검증을 위해 최상의 펩티드가 선택되고 제안되었다(표 2를 참조).

표 2. 추가 연구 및 검증을 위해 선택된 in silico 연구의 펩티드

상호 작용 단편의 서열	펩티드의 서열	펩티드의 ID	ΔG (주울)
46-Lys-Met-Thr-Asp-Ile-Met-51	His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp	SEQ ID NO: 5	-11.02
46-Lys-Met-Thr-Asp-Ile-Met-51	His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp	SEQ ID NO: 6	-10.99
46-Lys-Met-Thr-Asp-Ile-Met-51	His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp	SEQ ID NO: 7	-10.76
46-Lys-Met-Thr-Asp-Ile-Met-51	His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp	SEQ ID NO: 8	-8.68
46-Lys-Met-Thr-Asp-Ile-Met-51	His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp	SEQ ID NO: 9	-11.21
63-Lys-Arg-Arg-Glu-66	Arg-Arg-Arg-Phe	SEQ ID NO: 10	-5.71
63-Lys-Arg-Arg-Glu-66	Arg-Met-Arg-Phe	SEQ ID NO: 11	-5.26
59-Glu-Asp-Ile-Asn-Lys-Arg-Arg-Glu-66	Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Arg-Arg-Trp	SEQ ID NO: 13	-9.23
59-Glu-Asp-Ile-Asn-Lys-Arg-Arg-Glu -66	Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Met-Arg-Tyr	SEQ ID NO: 14	-8.12

실시예 2. 펩티드의 합성 및 제조- AA₁이 L-His이고; AA₂가 L-Ile 또는 L-Ala이며; AA₃이 L-Leu 또는 L-Met이고; AA₄는 L-Asp 또는 L-Arg이며; AA₅는 L-Met, L-Trp 또는 L-Phe이고; AA₆은 L-Trp인, Fmoc-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-Rink-MBHA-수지를 수득하는 단계

가중치를 정규화하였다. 0.52mmol/g의 관능화를 갖는 Fmoc-Rink-MBHA 수지 4.8g(2.5mmol)을 Fmoc 그룹을 제거하기 위해 당업계에 공지된 기재된 일반적인 프로토콜에 따라 피페리딘-DMF로 처리하였다. Fmoc-L-Trp(Boc)-OH 3.94g(7.5mmol; 3 equiv)을 용매로서 DMF를 사용하여 DIPCDI(1.17mL; 7.5mmol; 3 equiv) 및 HOBt (1.01g; 7.5mmol; 3 equiv)의 존재 하에 1시간 동안 탈보호 수지 상에 혼입시켰다.

이어서, 당업계에 공지된 일반적인 방법에 기술된 바와 같이 수지를 세척하고 Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 반복하여 다음 아미노산을 커플링하였다. 전술한 프로토콜에 따라 2.90g의 Fmoc-Phe-OH, 2.78g의 Fmoc-L-Met-OH 또는 3.94g의 Fmoc-L-Trp(Boc)-OH(7.5mmol; 3equiv); 이어서 4.86g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH 또는 3.08g의 Fmoc-L-Asp(tBu)-OH(7.5mmol; 3equiv); 이어서 2.65g의 Fmoc-L-Leu-OH 또는 2.78g의 Fmoc-L-Met-OH(7.5mmol; 3equiv); 이어서 2.33g의 Fmoc-L-Ala-OH 또는 2.65g의 Fmoc-L-Ile-OH(7.5mmol; 3equiv) 및 이어서 4.64g의 Fmoc-L-His(Trt)-OH(7.5mmol; 3 equiv)를 커플링하고, 이어서, 각 커플링을 1.01g의 HOBt(7.5mmol; 3equiv) 및 1.17mL의 DIPCDI(7.5mmol; 3equiv)의 존재 하에서 수행하였다. 이미 언급한 바와 같이, 각각의 아미노산 첨가 단계 사이에, Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 수행하였다.

합성 후, 펩티드 수지를 DCM(매회 3분간씩 5회)으로 세척하고 진공 건조시켰다.

- AA₁이 L-Arg이고; AA₂ 가 L-Arg 또는 L-Met이며; AA₃ 이 L-Arg이고; AA₄ 가 L-Phe인, Fmoc-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-Rink-MBHA-수지를 수득하는 단계

가중치를 정규화했다. 0.52mmol/g의 관능화를 갖는 Fmoc-Rink-MBHA 수지 4.8g(2.5mmol)을 Fmoc 그룹을 제거하기 위해 당업계의 기술된 일반적 프로토콜에 따라 피페리딘-DMF로 처리하였다. 용매로서 DMF를 사용하여 DIPCDI(1.17mL; 7.5mmol; 3equiv) 및 HOBt(1.01g; 7.5mmol; 3equiv)의 존재 하에 2.90g의 Fmoc-L-Phe-OH(7.5mmol; 3equiv)를 1시간 동안 탈보호 수지 상에 혼입시켰다.

이어서, 일반적인 방법에 기술된 바와 같이 수지를 세척하고 Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 반복하여 다음 아미노산을 커플링하였다. 전술한 프로토콜에 따라, 4.86g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol; 3equiv); 이어서 4.86g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH 또는 2.78g의 Fmoc-L-Met-OH(7.5mmol; 3equiv) 및 이어서 4.86g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol; 3equiv)를 커플링하고, 이어서 각 커플링을 1.01g의 HOBt(7.5mmol; 3equiv) 및 1.17mL의 DIPCDI(7.5mmol; 3equiv)의 존재 하에 수행하였다. 이미 전술한 바와 같이, 각 아미노산 첨가 단계 사이에, Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 실시하였다.

합성 후, 펩티드 수지를 DCM으로 세척(매회 3분씩 5회)하여 진공 건조시켰다.

- AA₁ 이 L-Glu이고; AA₂ 가 L-Arg이며; AA₃ 이 L-Ile이고; AA₄ 가 L-Asn이며; AA₅ 가 L-Lys이고; AA₆ 이 L-Arg 또는 L-Met이며; AA₇ 이 L-Arg이고; AA₈ 이 L-Trp 또는 L-Tyr인, Fmoc-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-AA₇-AA₈-Rink-MBHA-수지를 얻는 단계

가중치를 정규화했다. 0.52mmol/g의 관능화를 갖는 -Rink-MBHA 수지 4.8g(2.5mmol)을 Fmoc 그룹을 제거하기 위해 당업계의 기술된 일반적 프로토콜에 따라 피페리딘-DMF로 처리하였다. 용매로서 DMF를 사용하여 DIPCDI(1.17mL; 7.5mmol; 3equiv) 및 HOBt(1.01g; 7.5mmol; 3equiv)의 존재 하에 3.94g의 Fmoc-L-Trp(Boc)-OH 또는 3.44g의 Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH(7.5mmol; 3equiv)를 1시간 동안 탈보호 수지 상에 혼입시켰다.

이어서, 일반적인 방법에 기술된 바와 같이 수지를 세척하고 Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 반복하여 다음 아미노산을 커플링하였다. 전술한 프로토콜에 따라, 4.86g의 Fmoc-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol; 3equiv); 이어서 4.86g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH 또는 2.78g의 Fmoc-L-Met-OH(7.5mmol; 3equiv); 이어서 3.51g의 Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(7.5mmol; 3equiv); 이어서 4.45g의 Fmoc-L-Asn(Trt)-OH(7.5mmol; 3equiv); 이어서 2.65g의 Fmoc-L-Ile-OH; 이어서 4.86g의 Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH 및 이어서 3.19g 의 Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(7.5mmol; 3equiv)를 커플링하였고, 이어서 각 커플링은 1.01g의 HOBt(7.5mmol; 3equiv) 및 1.17mL의 DIPCDI(7.5mmol; 3equiv)의 존재 하에 수행하였다. 이미 전술한 바와 같이, 각 아미노산 첨가 단계 사이에, Fmoc 그룹의 탈보호 처리를 실시하였다.

필요한 아미노산을 선택하여 상기 언급한 합성 절차에 따라 다음 서열을 합성하였다:

His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp(SEQ ID NO: 5);

His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp(SEQ ID NO: 6);

His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO: 7);

His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp(SEQ ID NO: 8);

His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO: 9);

Arg-Arg-Arg-Phe(SEQ ID NO: 10);

Arg-Met-Arg-Phe(SEQ ID NO: 11);

Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Arg-Arg-Trp(SEQ ID NO: 13); 및

Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Met-Arg-Tyr(SEQ ID NO: 14).

실시예 3. 실시예 2에 따라 합성된 펩티드의 Fmoc N-말단 보호 그룹의 제거

펩티딜 수지의 N-말단 Fmoc 그룹을 DMF 중의 20% 피페리딘으로 탈호보(1 x 1분, 2 x 10분)하였다[Lloyd Williams P. et al.(1997) "Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins" CRC, Boca Raton (Fla., USA)]. 펩티딜 수지를 DMF(5 x 1분), DCM(4 x 1분)으로 세척하여 진공 건조시켰다.

실시예 4. 실시예 3에 따라 수득된 펩티딜 수지 상에 R₁ 아세틸 그룹을 도입하는 방법

실시예 2에 따라 수득된 펩티딜 수지 1mmol(1당량)을 용매로서 DMF 5mL를 사용하여 25당량의 DIEA의 존재 하에 25당량의 아세트산 무수물로 처리하였다. 이를 30분간 정치하여 반응시킨 후, 펩티딜 수지를 DMF(5 x 1분), DCM(4 x 1분)으로 세척하여 진공 건조시켰다.

실시예 5. 실시예 3 및 4에 따라 수득된 펩티딜 수지의 중합성 지지체로부터의 절단 공정

가중치를 정규화했다. 실시예 2, 3 또는 4 중 어느 하나에서 수득된 건조된 펩티딜 수지 200mg을 실온에서 교반 하에 2시간 동안 5mL의 TFA/TIS/H₂O(90:5:5)로 처리하였다. 여액을 수집하고 50mL(8 내지 10배)의 냉 디에틸 에테르를 사용하여 침전시켰다. 에테르성 용액을 감압 및 실온에서 증발 건조시키고, 침전물을 H₂O 중 50% MeCN에 재용해하여 동결 건조시켰다.

실시예 6. 실시예 5에 따라 합성되고 제조된 펩티드의 특성

실시예 5에 따라 수득된 펩티드의 HPLC 분석은 역상 칼럼(150x4.6mm, XBridge Peptide BEH C18, 3.5㎛, Waters, USA)을 사용한 시마즈 장치(Kyoto, Japan)로 1.25mL/분의 유속에서 H₂O(+0.045% TFA) 중의 MeCN(+0.036% TFA)의 구배로 수행하고 220nm에서 검출을 행하였다. 모든 펩티드는 80%를 초과하는 순도를 나타냈다. 얻어진 펩티드의 동정은 이동상으로서 MeOH와 0.2mL/분의 유속을 사용하는 Water ZQ 4000 검출기에서 ESI-MS에 의해 확인하였다. 얻어진 결과는 표 3에 포함된 펩티드가 효과적으로 합성되었음을 입증하였다.

표 3. 합성된 최종 펩티드

펩티드	펩티드의 ID
Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂
Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 6-NH₂
Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 7-NH₂
Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂
Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 9-NH₂
Ac-Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Arg-Arg-Trp-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 13-NH₂
Ac-Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Met-Arg-Tyr-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 14-NH₂
Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 10-NH₂
Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH₂	Ac-SEQ ID NO: 11-NH₂

실시예 7. 아세틸콜린 방출의 측정상기 표 3에 포함된 펩티드는 실시예 2 내지 6에 따라 합성되었다.

상기 펩티드를 시험관 내에서 아세틸콜린 방출을 조절하는 능력에 대해 시험하였다. 이를 위해, LAN 세포를 48웰 배양 플레이트 상에 접종하여 N-2 보충제, GlutaMAX^TM, 콜린 클로라이드 및 류케미아(Leukemia) 억제 인자가 보충된 Neurobasal^® A 배지(GIBCO, Life technologies, MA, USA)로 배양 배지를 교체하여 분화를 유도하기 전에 제어 조건(37℃, 5% CO₂) 하에 적절한 합류에 도달하도록 하였다. 상기 세포가 분화된 형태를 획득하면, 이들을 상기 언급된 펩티드로 1시간 동안 다음 농도로 처리하였다: Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂를 제외한 모든 펩티드 0.001mg/mL, 0.005mg/mL 및 0.01mg/mL; 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 0.005mg/mL 및 0.05mg/mL. 이어서 세포를 외부 50mM KCl 용액으로 탈분극에 의해 아세틸콜린 방출을 자극하기 전에 HEPES로 세척하였다. 자극되지 않은 세포를 비탈분극화 4mM KCl 용액으로 인큐베이션 하였다. 상응하는 탈분극화 또는 비탈분극화 KCl 용액으로 30분간 인큐베이션한 후, 세포 상청액을 수집하여 암플렉스 레드 아세틸콜린 분석 키트(Amplex Red Acetylcholine Assay Kit, ThermoFisher Scientific, MA, USA)로 아세틸콜린 수준을 측정하는 데 사용하였다. 세포 펠릿을 사용하여 BCA 단백질 시험 분석(Pierce BCA Protein Assay kit, ThermoFisher Scientific, MA, USA)에 의해 단백질 함량을 측정하였다(데이터 정규화 목적으로).

아세틸콜린 방출 억제의 백분율은 양성 대조군(KCl 세포로 비처리 자극된)에 대한 100% 방출을 고려하여 산출되었다.

얻어진 결과는 표 4에 요약했다:

표 4. 실시예 7에서 수득된 결과의 요약

펩티드	결과
Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 활성
Ac-SEQ ID NO: 6-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 활성
Ac-SEQ ID NO: 7-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 활성
Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 활성
Ac-SEQ ID NO: 9-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 활성
Ac-SEQ ID NO: 10-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 활성
Ac-SEQ ID NO: 11-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 활성
Ac-SEQ ID NO: 13-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 비활성
Ac-SEQ ID NO: 14-NH₂	아세틸콜린 방출 조절에 비활성

이 실험의 결과는 또한 도 1A 내지 1I에 요약되어 나타난다. 상기 도면에서 직접 유도될 수 있는 바와 같이, 표 4에서 아세틸콜린의 조절에 활성으로 표시된 펩티드는 시험된 모든 농도에서 아세틸콜린 방출의 현저한 감소를 나타낸다. 한편, 표 4에서 비활성으로 표시된 펩티드는 가장 낮은 농도에서 중간 내지 낮은 억제 및 최고 농도에서 완전한 억제 상실을 나타낸다. 상기 펩티드는 시험된 임의의 농도에서 아세틸콜린 방출의 통계적인 감소를 나타내지 않았다. 낮은 농도에서 이러한 유형의 세포의 기술적 문제와 시험의 고유한 변동성으로 인해 약간의 억제가 관찰되었다는 사실이 밝혀졌지만, 최고 농도에서 완전한 활성 상실은 이들 펩티드(Ac-SEQ ID NO: 13-NH₂및 Ac-SEQ ID NO: 14-NH₂)가 아세틸콜린 방출을 억제할 수 없었다는 것을 명백히 보여준다.선행 기술[Blanes-Mira C., Clemente J., Jodas G., et.al.(2002), A synthetic hexapeptide(Argireline) with antiwrinkle activity, International Journal of Cosmetic Science, 24, 303-310]에서 볼 수 있는 바와 같이, 투과화된 크로마핀 세포로부터의 엑소사이토시스 억제는 BoNT A를 사용할 경우 최대 50% 또는 Argireline^®을 사용할 경우 40%에 도달했다. 따라서, 이 실시예에서 얻어진 결과는 LAN 세포 상에서 직접 아세틸콜린 방출의 억제를 시험할 때, 심지어 침투될 수 없고, 억제의 20 내지 30%의 값이 얻어진 것과 같이 본 발명의 펩티드의 높은 활성을 입증하였다.

실시예 8. 결합 분석

실시예 1의 인 실리코(in silico) 연구를 바탕으로 실시예 2 내지 6에 따라 다음 펩티드를 합성하였다:

Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂

Ac-SEQ ID NO: 8-NH_2.

SNARE 복합체 단백질인 Syntaxin-1과 Munc 18 단백질-단백질 상호 작용을 억제하는 펩티드의 능력은 시험관내 Munc 18/Syntaxin-1 결합 분석을 바탕으로 한 ELISA에 의해 기능적으로 평가하였다. 간략하게, 상기 언급된 0.1, 0.5 및 1mM의 펩티드를 완충제(20mM Hepes, 150mM NaCl, 2mM MgCl₂, 2mM DTT, 0.5% 트리톤-X100 및 0.5% 탈지 우유) 중의 10 및 5nM의 그들의 표적 단백질 Syntaxin-1((GST-tagged)과 함께 실온에서 3시간 동안 예비 인큐베이션했다. 한편, His 태그된 Munc 18을 100nM에서 니켈 코팅된 96웰 플레이트에 결합시키고 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이션했다. 후속적으로 세정 완충액(PBS+0.02% Triton-X100) 중에서 탈지 우유로 웰을 차단하기 전에 비결합된 단백질을 추가의 30분 동안 세척하였다. 펩티드와 함께 예비 인큐베이션된 GST 태그 Syntaxin-1을 10 및 5nM로 상기 플레이트에 가하여 실온에서 2시간 동안 인큐베이션했다. 웰을 1차 항체(GST tag polyclonal antibody-Thermofisher Scientific, Massachusetts, USA)와 45분간 인큐베이션 하기 전에 세정 완충액으로 3회 세척하였다. 마지막으로, 다시 세척한 후, HRP-접합된 2차 항체(Anti-Rabbit-IgG-HRP - Sigma, Missouri, USA)를 가하여 실온에서 인큐베이션했다. TMB 기질(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 사용하여 신호를 전개하였다. 정지 시약을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정함으로써 Syntaxin-1 단백질의 Munc 18 단백질에 대한 결합량을 분석하였다.

이 실험에서 얻어진 결과는 도 2에 요약된 것으로 나타난다. 도 2는 시험된 두 펩티드(Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂ 는 훨씬 더 높은 정도로)가 Munc 18과 Syntaxin-1간의 단백질-단백질 상호 작용을 현저하게 차단하여 투여량-반응 방식을 보여 주었다. Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 및 Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂펩티드 각각에 대해 최대 억제는 37% 및 67%에 도달했다. 이러한 결과에 근거하여, 본 발명의 펩티드는 조절된 엑소사이토시스 및 결과적인 신경 전달 물질 방출에 필요한 단백질-단백질 상호 작용을 방해할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 9. 골격근 인간 근세포에서의 유전자 발현 조절

실시예 1의 in silico 연구를 바탕으로 실시예 2 내지 6에 따라 다음 펩티드를 합성하였다:

Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂

Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂

Ac-SEQ ID NO: 10-NH_2.

상기 펩티드는 인간 골격 근세포에서 근육 수축 및 이완과 관련된 몇몇 유전자의 발현을 조절하는 능력을 평가하기 위해 시험되었다[Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al.(2000), Molecular Cell Biology, 4th edition; Section 18.3 Myosin: The Actin Motor Protein, Nueva York, W. H. Freeman; Kuo, IY, & Ehrlich, BE(2015), Signaling in Muscle Contraction, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 7(2); RAPSN receptor associated protein of the synapse[Homo sapiens (human)], Gene ID in NCBI 5913; Blake DJ, Tinsley JM, Davies KE(1996), Utrophin: a structural and functional comparison to dystrophin, Brain Pathol., 6(1):37-47; Barik A, Lu Y, Sathyamurthy A, et.al.(2014), LRP4 Is Critical for Neuromuscular Junction Maintenance, The Journal of Neuroscience, 34(42), 13892-13905; Kim N, Stiegler AL, Cameron TO, Hallock PT, et.al.(2008), Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK, Cell, 135(2), 334-342; Mahavadi S, Nalli A, Kumar D, et.al.(2014), Increased expression of caveolin-1 is associated with upregulation of the RhoA/Rho kinase pathway and smooth muscle contraction in diabetes (1110.11), The FASEB Journal, 28:1_supplement)]. 이를 위해 수축성 스마트 데이터 유전자 패널이 설계되었다. 상기 수축성 스마트 데이터 유전자 패널은 표 5에 포함된 근육 수축 및 이완과 관련된 유전자의 발현을 분석한다.

표 5. 실시예 9에서 분석된 유전자

기호	유전자명
MYH1	미오신 중쇄(Myosin Heavy Chain)
SCN3A	나트륨 전압-게이트 채널 알파 서브유닛 3
RAPSN	시냅스의 수용체 관련 단백질
TNNC 1	트로포닌(Troponin) C1
ACTA 1	액틴(Actin)
UTRN	유트로핀(Utrophin)
CACNB1	칼슘 전압-게이트 채널 보조 서브유닛 베타 1
CHRNA1	니코틴성 아세틸콜린 수용체 알파 서브유닛 1
CALM3	칼모둘린(Calmodulin) 3
CAV1	카베올린(Caveolin) 1
LRP4	LDL 수용체 관련 단백질 4

간략하게, 인간 골격근 근아세포를 1 x 10⁵ 세포/웰의 밀도로 12-웰 배양 플레이트에 이중으로 접종하고 48 내지 72시간 동안 표준 배양 조건(37℃, 95% 습도, 5% CO₂)에서 유지했다. 이어서, 근세포로의 근아세포 분화를 특정 분화 배지(SKM-D 배지 + 1% 항생제-항진균제)로 유도하여 7일간 더 모니터링했다. 분화된 세포를 0.05mg/mL의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂; 또는 0.1mg/mL의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 10-NH₂ 로 24시간 동안; 또는 0.05 및 0.5mg/mL의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 6시간 동안; 또는 0.5mg/mL의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 24시간 동안 처리했다. 처리되지 않은 세포를 기저 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 제조업자 지시에 따라 RNA 정제 시판용 키트(RNeasy mini kit, Qiagen, Netherlands)로 RNA 추출을 위해 세포를 용해시켰다. 이어서, RNA를 나노드롭으로 정량하고, 농도로 조정하고, 시판 키트(고용량 cDNA 역전사 키트, Thermofisher Scientific, USA)를 사용하여 cDNA로 역전사를 위해 처리했다. 생성된 cDNA를 사용하여 TaqMan 기술 및 표 4에 언급된 근육 수축성과 관련된 특정 유전자를 표적으로 설계된 프로브 패널을 사용하여 RTqPCR(실시간 정량적 중합 효소 연쇄 반응(Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction))을 실시하였다. 이 실험의 결과는 도 3A 내지 3D에 요약하여 나타내었다. 상기 도면에서, 인간 근세포를 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂ 로 처리할 때 UTRN, ACTA1, TNNC1, RAPSN, SCN3A 및 MYH1의 하향 조절이 관찰되는 것을 알 수 있다. 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 근세포를 처리하면, 6시간 처리 동안 RAPSN의 하향 조절과 함께 SCN3A, UTRN, ACTA1, TNNC1, CALM3, CAV1, CACNB1, LRP4, 및 MYH1의 하향 조절 및 24시간 처리 동안 ATP2A의 상향 조절이 발생하였다. 최종적으로, 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 10-NH₂ 로 근세포를 처리하면, UTRN, TNNC1, SCN3A CHRNA1 및 CACNB1의 하향 조절이 초래되었다.

상기 언급된 유전자의 하향 조절은 상이한 방식으로 정상적인 근육 수축 기능에 영향을 미칠 수 있다: 근육 세포 표면 상의 아세틸콜린의 결합에 필요한 RAPSN, CHRNA1, UTRN 및 LRP4는 신경 전달 물질-유도 막 탈분극 및 세포 골격 안정성에 영향을 미칠 수 있고; 전압 게이트 채널인 SCN3A 및 CACNB1은 막 전위 여기 전송에 영향을 줄 수 있으며; Ca²⁺ 수송에 관여하는 SLN은 세포내 칼슘 축적에 영향을 미칠 수 있고; MYH1, TNNC1 및 ACTA1은 세포 골격 무결성 및 수축을 유발하는 파워 스트라이크에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 이 실시예에서 얻어지고 도 3에 나타낸 결과는 근육 수축-이완을 조절하여 근육 이완의 증가에 기여하는 본 발명의 펩티드의 능력을 입증한다.

실시예 10. 칼슘 가동화(mobilization) 분석

펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 를 실시예 2 내지 6에 따라 합성하였다.

인간 골격 근세포에서 칼슘 가동화를 감소하기 위한 상기 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 의 가능성을 시험관내에서 Fluo-4 NW 칼슘 분석 키트(ThermoFisher Scientific, MA USA)로 평가하였다. 간략하게는, 인간 골격근 근아세포를 1 x 10⁴ 세포/웰의 밀도로 블랙 96-웰 플레이트, 투명 바닥에 5중으로 접종하여 48 내지 72시간 동안 표준 배양 조건(37℃, 95% 습도, 5% CO₂)으로 유지했다. 이어서, 근세포로의 근아세포 분화를 특정 분화 배지(SKM-D 배지 + 1% a/a)로 유도하여 7일간 더 모니터링했다. 분화된 세포를 추가의 48시간 동안 비세포 독성 농도의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ (0.01mg/mL, 0.05mg/mL 및 0.1mg/mL)로 처리했다.

인큐베이션이 완료되면, 세포 배양 배지를 100㎕의 염료 로딩 용액으로 교체하고, 플레이트를 인큐베이터에서 30분간 유지시켰다. 이어서, 염료 용액을 FLUOstar 오메가 기기(BMG Labtech, Germany)를 사용하여 칼슘 측정 전에 분석 완충액으로 교체하였다. 적절한 동력학 측정을 위해, 60mM KCl을 첨가하여 칼슘 유입을 유도하기 전에 기준 신호를 결정하도록 10초의 사전 자극 단계를 설정하였다. 자극 후 단계는 90초로 설정되었으며, 494/516nm(여기/방출)에서 0.1초마다 판독하였다.

데이터 분석을 위해 다음 단계를 수행하였다: 1) 각 조건에 대한 평균 운동 곡선의 계산; 2) KCl로 자극 후 각 곡선에 대한 최대 형광 신호의 결정; 3) 배수 변화 증가 대 기준선의 계산; 4) 각 조건(각 펩티드 농도)에 대해 얻어진 결과 대 대조군(처리되지 않은 세포)에 대해 얻어진 결과의 정규화.

이 실험에서 얻어진 결과는 도 4에 요약하여 도시되고, 용량 의존적 방식으로 칼슘 유입을 감소(0.01mg/mL, 0.05mg/mL 및 0.1mg/mL에서 각각 -6%, -20% 및 -30%)시키는 본 발명의 펩티드(예를 들면, Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂로 예시됨)의 가능성을 반영한다. 칼슘 유입의 감소는 근육 이완에 유리한 세포 수축성에 영향을 미친다.

상기 실시예로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 복합체 Munc 18-Syntaxin-1의 형성을 효과적으로 방해하거나 또는 억제하여, 신경 세포 엑소사이토시스의 조절(억제)을 가능하게 한다. 또한, 상기 펩티드는 이완(근육 이완)을 유도하거나 또는 기여하는 근육 세포에 직접적인 영향을 미친다. 따라서 본 발명의 펩티드는 당업계에 존재하는 상기 언급한 문제를 해결한다.

실시예 11. 미오신 중쇄 단백질 감소

인간 골격 근세포에서 단백질 미오신 중쇄의 발현을 감소시키는 상기 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 의 가능성을 시험관내에서 이 단백질에 대한 특이 항체(Biotechne, USA)를 사용한 면역 형광법에 의해, 이어서 2차 형광 항체(Thermofisher, USA)에 의해 평가했다. 간략하게, 인간 골격근 근아세포를 3 x 10⁴ 세포/cm² 의 밀도로 SKM-M 배지(Tebu-Bio, France) 중의 커버 슬립 상에 접종하여, 표준 배양 조건(37℃, 95% 습도, 5% CO₂)으로 밤새 인큐베이션 했다. 이어서, 근세포로의 근아세포 분화를 특정 분화 배지(Skeletal Muscle Cell Differentiation Medium, SKM-D medium)로 유도하여 7일간 더 모니터링했다. 분화된 세포를 추가의 48시간 동안 비세포 독성 농도의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ (0.05mg/mL 및 0.5mg/mL)로 처리했다.

인큐베이션이 완료되면, 세포를 4% PFA로 고정하여 0.1%(v/v) 트리톤(Sigma, USA)을 사용하여 투과화시켰다. 이어서, 미오신을 실온에서 2시간 동안 0.5mg/ml 미오신 중쇄 항체로 염색하였다. 적절한 세척 후, 액틴 단백질은 1시간 동안 50μg/ml 팔로이딘(Phalloidin)(red)(Sigma, USA)으로 표지하고, 세척 후, 세포를 4μg/ml의 2차 항체 염소 항 마우스 igG로 1시간 동안 염색하였다. 최종적으로, 핵을 3.5μg/ml Hoescht 마커(Sigma, USA)로 10분간 염색했다.

5x 및 10x 대물 렌즈를 사용하여 현미경 이미지를 획득했다. 각각의 조건에 대해 3개의 복제물을 사용하였고, 동일한 설정을 사용하여 각각의 커버슬립의 3 내지 4개의 필드의 이미지를 획득했다.

이미지는 Image J 소프트웨어를 사용하여 분석했다. 곧, 임계값을 조정하여 미오신을 선택하고 평균 형광을 측정하였다. 양성 세포의 수는 DAPI 염색을 사용하여 계수했다. 미오신 평균 형광 강도를 미오신 양성 세포수로 나누었다. 마지막으로, 모든 데이터를 다음과 같이 정규화하여 미처리 세포와 비교한 미오신의 %를 얻었다: 대조군에 대한 % = (처리된 웰에서의 세포당 형광/비처리된 웰에서의 세포당 형광) x 100.

이실험에서 얻은 결과는 도 5A, 도 5B 및 도 6에 요약되어 있으며, 용량 의존적 방식으로 미오신 중쇄 단백질 수준을 감소(도 6 중, 0.05mg/mL 및 0.5mg/mL에서 각각 -26% 및 -38%)시키는 본 발명의 펩티드(Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂로 예시됨)의 가능성을 반영하였다. 미오신 중쇄 단백질 수준의 이러한 감소는 근육 이완을 선호하는 세포 수축성에 영향을 미친다.

상기 실시예로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 이완(근육 이완)을 유도하거나 또는 기여하는 근육 세포에 직접적인 영향을 효과적으로 제공한다.

실시예 12. 수축 빈도

수축 빈도를 조절하기 위한 상기 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 의 가능성은 치료 전 및 치료 후(치료 후, 각각의 확립된 시점에서) 60초간 InCell 2200 자동화 현미경으로 기록된 국소 수축 근육 섬유의 라이브 영상 비디오에 의해 hiPSC 공배양물에서 유래된 인간 근육 세포 및 운동 신경 세포를 사용하여 시험관 내에서 평가되었다.

인간 근육 세포를 T75cm² 플라스크에서 1 x 10⁶ 세포의 밀도로 배양한 다음, 분화를 위해 96웰 플레이트로 옮겼다. hiPSC로부터 유래된 운동 신경 세포를 분화 배지 중 근육 세포를 함유하는 96웰 플레이트 상에 옮겼다. 근육 섬유와 신경 세포 접합을 생성하기 위해 공배양물을 10일간 유지하였다. 자발적인 수축이 5일 내에 관찰되었다.

이어서, 공배양물을 대조 배지(기본), 1μM α-분가로톡신, 벤치 마크 기준으로서 0.5mg/mL의 아세틸 헥사펩티드-8 및 0.05 또는 0.1mg/mL의 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂로 처리했다. 처리 전 60초간 공배양물의 무비(movies)를 기록하고, 30분의 배양 후에, 60초간 다시 무비를 기록했다. 배양 플레이트를 화합물과 함께 1시간 30분간 다시 인큐베이션하고(총 2시간의 인큐베이션), 공배양물의 무비를 60초간 다시 기록했다. 배양 플레이트를 화합물과 함께 총 24시간 동안 다시 인큐베이션하고, 인큐베이션 종료 시에 60초간 다시 무비를 기록하였다. 마지막으로, 화합물을 세척해내고, 상기 화합물로부터 세척한지 24시간 후에 마지막 기록을 수행하여 근육 수축의 회복(복구)을 평가하였다.

각 인큐베이션 전후에 수축 빈도를 계산하였다. 각 배양 조건에 대해 6개의 웰을 분석했다.

이 실험에서 얻어진 결과는 도 7에 요약되어 도시되어 있으며, 24시간 인큐베이션 기간 동안 유지(0.05 및 0.1mg/mL에서 각각 23% 및 10%)되는 단 30분(0.05 및 0.1mg/mL에서 각각, 기준 비처리 세포에 대한 근육 수축 빈도의 25% 및 18%) 후의 근육 수축 빈도의 중요한 용량 의존적 감소를 유발하는 본 발명의 펩티드(Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂로 예시됨)의 가능성을 반영한다. 이 화합물의 세척은 0.05mg/mL 농도에서 더 나은 근육 수축 빈도의 부분 회복을 허용한다(0.05 및 0.1mg/mL에서 각각 65% 및 35%).

0.5 mg/mL로 사용된 벤치마크(아세틸 헥사펩티드-8)는 30분 후(18% 근육 수축 빈도) 근육 수축 빈도의 부분 억제를 유도했지만, 이 효과는 더 긴 인큐베이션(24시간 후 45%) 및 세척 후 약화되었고, 빈도가 전체적으로 회복되었다(100%).

상기 실시예로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 근육 섬유와의 신경 세포 접합 형성 동안 근육 수축에 직접적인 영향을 효과적으로 제공하여 그들의 이완(근육 이완)에 기여한다.

실시예 13. 엑소사이토시스 수준 및 지연

신경 모세포종 세포주로부터의 신경 전달 물질을 함유하는 소포의 엑소사이토시스를 조절하기 위한 상기 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 의 가능성을 SH-SY5Y 세포를 사용한 시험관내에서, 20x 대물 렌즈 및 크세논 램프를 갖는 Zeiss axiovert 200 역상형 형광 현미경을 사용한 형광 이미징에 의해 평가하였다.

SH-SY5Y 세포(Sigma, USA)를 보충 배지(DMEM/F12, Gibco, USA)의 T25 플라스크에서 배양하였다. 90% 합류 이상에서, 세포를 1ml의 0.5%(v/v) 트립신-EDTA로 트립신 처리 하였다. 다음에, 상기 보충 배지 5ml를 첨가하여 세포 농도를 측정했다. 세포를 보충 배지(Gibco, USA)에서 15 x 10⁴ 세포/웰로 24-웰 플레이트 중의 폴리 리신-코팅된 12mm-처리된 커버 슬립 상에 접종하고, 규칙적인 조건(37℃, 5% CO₂)에서 인큐베이션하였다. 24시간 세포 접종 후, 제조사의 지시에 따라 리포펙타민 TM 3000(Invitrogen, USA)을 사용하여 세포를 엑소사이토시스 리포터로 형질 감염시켰다. 리포터 구축물은 관강내-특이 단백질 및 pH-민감성 형광 단백질로 구성된 융합 단백질을 함유했다.

엑소사이토시스 모니터링을 위해, 48시간의 단백질 발현 후, 세포를 0.01mg/mL의 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 펩티드 또는 1mg/mL의 벤치마크 아세틸 헥사펩티드-8과 37℃ 및 5% CO₂에서 1시간 동안 인큐베이션 했다. 비처리된 세포를 기저 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 세포를 15분간 100nM PMA로 예비 처리하고 5분간 PMA(100nM)와 함께 12.5μM 이오노마이신으로 자극했다(총 자극: 20분). 마지막 10분의 자극 프로토콜에 대해 형광 영상화를 수행하였다. 엑소사이토시스 리포터의 형광 신호는 483-512nm 여기 필터 및 525-530nm 방출 필터를 사용하여 모니터링 했다. 아쿠아코스모스(Aquacosmos) 소프트웨어를 사용하여 10분간 5초마다 ORCA-ER CCD 카메라로 이미지를 캡처했다.

n=16 커버 슬립(측정된 483개의 세포)을 사용한 N=4 독립 실험에서 비처리 세포, n=10 커버 슬립(측정된 328개의 세포)을 갖는 N=3 독립 실험에서 아세틸 헥사펩티드-8 처리 세포 및 n=8 커버 슬립(측정된 240개의 세포)을 갖는 N=3 독립 실험에서 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂-처리 세포를 분석했다. 형광 강도 및 시간 경과를 개별적으로 모니터링하도록 세포를 선택했다. 이오노마이신 첨가에 의해 유발된 형광 피크는 GraphPad 소프트웨어를 사용하여 곡선 아래 면적(AUC)을 계산함으로써 엑소사이토시스를 정량하기 위해 사용되었다. 2개의 파라미터가 정의되고 분석되었다:

- 엑소사이토시스 수준: 개별 세포에 대해, 총 피크 면적은 AUC 분석으로부터 얻어졌으며, 이오노마이신 주사 전에 형광 강도 3 사이클로 정의된 기준선에 의해 정규화됨.

- 엑소사이토시스 지연: 개별 세포에 대해, 이오노마이신 주사(Y)와 피크의 시작(firstX) 사이의 시간 프레임으로서 AUC 분석으로부터 반응 시간(분)을 얻었음.

각각의 실험에서 비처리된 세포에 대한 백분율 변화로서 형광값을 다음과 같이 더 정규화 했다: (처리된 세포의 엑소사이토시스 수준/비처리된 세포의 엑소사이토시스 수준) x 100 및 (처리된 세포의 반응 시간/비처리된 세포의 반응 시간) X 100.

엑소사이토시스 모니터링 파라미터의 분석: 데이터는 엑소사이토시스 수준 및 엑소사이토시스 지연에 대해 비처리 세포에 정규화된 백분율을 나타낸다. 데이터는 평균 ± SEM으로 표현된다; 데이터는 N=4 독립 실험, 비처리 세포에 대한 n=16 복제물(측정된 483개의 세포), N=3 독립 실험, 아세틸-헥사펩티드-8에 대한 n=10 복제물(측정된 328개의 세포), N=3 독립 실험, Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂에 대한 n=8 복제물(측정된 240개의 세포)로부터 얻었다.

이 실험에서 얻어진 결과는 도 8 및 도 9에 요약되어 도시되어 있으며, 특정 아세틸콜린 수용체를 통한 근육 수축을 활성화하는 신경 세포에 의해 방출된 아세틸 콜린을 함유하는 소포의 엑소사이토시스를 감소(도 8) 및 지연(도 9)시키는 본 발명의 펩티드(Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂로 예시됨)의 가능성을 반영한다.

Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 는 0.01mg/mL로 1시간 동안 인큐베이션 하여 현저하게 지연된 엑소사이토시스 반응 시간(24% 지연) 및 감소된 엑소사이토시스 수준(-14%)인 반면, 아세틸 헥사펩티드-8은 1mg/mL로 1시간 동안 인큐베이션하여 인간 신경 모세포종 세포주 SH-SY5Y에서 엑소사이토시스 수준(7%)을 변경하지 않으면서 엑소사이토시스 반응을 현저히 지연시켰다(67% 지연).

상기 실시예로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 근육 수축을 위한 시냅스 공간을 신경 세포에 의해 방출된 아세틸콜린 소포의 수준을 감소시키고, 상기 엑소사이토시스를 지연시킴으로써, 근육 수축에 대한 간접 효과를 효과적으로 제공한다.

실시예 14. 콜라겐 생성

피부 형성의 잠재적 개선제로서 콜라겐 I형의 생산을 조절하기 위한 상기 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 의 가능성을 인간 피부 섬유 아세포를 사용하여 시험관내에서 평가하였다.

세포를 1 x 10⁴ 세포/웰로 96-웰 플레이트에 접종하여 표준 배양 조건(37℃, 95% 습도, 5% CO₂)에서 24시간 동안 유지하였다. 24시간 인큐베이션 후, 배지를 제거하고 펩티드 Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 를 0.01, 0.05 또는 0.1mg/mL로 함유하는 새로운 배지를 웰 농도에 첨가하였다. 처리는 24시간 또는 48시간 지속되었고, 분석 종료 시에 세포 배양 배지를 수집했다. 배양 배지만으로 처리된 세포를 기본 대조군(비처리 세포)으로서 사용하였다.

24시간 및 48시간의 처리 후, 세포에 의해 생성되고 방출된 콜라겐 I형(ex-novo 콜라겐 I형 합성)의 양을 세포 배양 배지 중에서 ELISA 분석에 의해 측정하였다. 시험 항목의 결과를 기본 대조군 조건(비처리 세포)과 비교하였다. 처리는 3개의 상이한 실험 세션에서 3회 실시되었다.

콜라겐 I형 합성의 결정은 경쟁적인 ELISA 방법에 의해 수행되었다. 샘플을 항체로 예비 코팅된 효소 웰에 첨가한 다음, 이를 양고추 냉이 과산화 효소(HRP)로 표지된 인식 항원을 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 둘다 고상 항원과 경쟁하여 면역 복합체를 형성한다.

포스페이트 완충액으로 세척한 후, HRP를 합하여 테트라메틸벤지딘(TMB)을 청색으로 촉매화하고, 산의 작용에 의해 황색으로 변하며, 이는 450nm 파장에서 흡수 피크를 가지고, 이의 흡광도는 샘플의 항원 밀도와 음의 상관 관계를 갖는다. 플레이트는 마이크로플레이트 리더에 의해 판독했다.

정량적 측정은 표준 콜라겐 I형의 공지되고 증가하는 농도로 구성된 검정 곡선을 사용한다. 결과는 50㎕ 세포 배양 배지 중의 콜라겐 I형 농도(㎍/ml)로 표현된다.

3가지 상이한 실험 세션에서 각각의 결정에 대해 3회 시험이 실시되었다. 음성 대조군과 샘플 사이의 콜라겐 I형 함량의 % 변화를 계산하고 콜라겐 I형 합성을 증가시키는 펩티드의 효능의 직접적인 지수를 얻었다.

이 실험에서 얻어진 결과는 도 10A 및 도 10B에 요약되어 도시되어 있으며, 인간 피부 섬유 아세포에 의해 콜라겐 I형의 생산을 유도하기 위한 본 발명의 펩티드(Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 로 예시됨)의 가능성을 반영한다.

Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂ 펩티드는 24시간 후 섬유 아세포에 의한 콜라겐 I형 생성을 0.01, 0.05 및 0.1mg/mL에서 각각 9%, 31% 및 37.5%, 48시간 후에 0.01, 0.05 및 0.1mg/mL에서 각각 16%, 29.5% 및 56.5% 정도로 크게 촉진시켰다.

상기 실시예로부터 직접적으로 유도될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 효과적으로 강력한 효과를 제공하여 피부의 탄력 및 질을 개선시킨다.

<110> LIPOTRUE, S.L. <120> PEPTIDES AND COMPOSITIONS FOR USE IN COSMETICS AND MEDICINE <130> 25000 <150> PCT/EP 2019/054479 <151> 2019-02-22 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 594 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Pro Ile Gly Leu Lys Ala Val Val Gly Glu Lys Ile Met His 1 5 10 15 Asp Val Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Glu Trp Lys Val Leu Val 20 25 30 Val Asp Gln Leu Ser Met Arg Met Leu Ser Ser Cys Cys Lys Met Thr 35 40 45 Asp Ile Met Thr Glu Gly Ile Thr Ile Val Glu Asp Ile Asn Lys Arg 50 55 60 Arg Glu Pro Leu Pro Ser Leu Glu Ala Val Tyr Leu Ile Thr Pro Ser 65 70 75 80 Glu Lys Ser Val His Ser Leu Ile Ser Asp Phe Lys Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Ala Lys Tyr Arg Ala Ala His Val Phe Phe Thr Asp Ser Cys Pro Asp 100 105 110 Ala Leu Phe Asn Glu Leu Val Lys Ser Arg Ala Ala Lys Val Ile Lys 115 120 125 Thr Leu Thr Glu Ile Asn Ile Ala Phe Leu Pro Tyr Glu Ser Gln Val 130 135 140 Tyr Ser Leu Asp Ser Ala Asp Ser Phe Gln Ser Phe Tyr Ser Pro His 145 150 155 160 Lys Ala Gln Met Lys Asn Pro Ile Leu Glu Arg Leu Ala Glu Gln Ile 165 170 175 Ala Thr Leu Cys Ala Thr Leu Lys Glu Tyr Pro Ala Val Arg Tyr Arg 180 185 190 Gly Glu Tyr Lys Asp Asn Ala Leu Leu Ala Gln Leu Ile Gln Asp Lys 195 200 205 Leu Asp Ala Tyr Lys Ala Asp Asp Pro Thr Met Gly Glu Gly Pro Asp 210 215 220 Lys Ala Arg Ser Gln Leu Leu Ile Leu Asp Arg Gly Phe Asp Pro Ser 225 230 235 240 Ser Pro Val Leu His Glu Leu Thr Phe Gln Ala Met Ser Tyr Asp Leu 245 250 255 Leu Pro Ile Glu Asn Asp Val Tyr Lys Tyr Glu Thr Ser Gly Ile Gly 260 265 270 Glu Ala Arg Val Lys Glu Val Leu Leu Asp Glu Asp Asp Asp Leu Trp 275 280 285 Ile Ala Leu Arg His Lys His Ile Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Thr 290 295 300 Arg Ser Leu Lys Asp Phe Ser Ser Ser Lys Arg Met Asn Thr Gly Glu 305 310 315 320 Lys Thr Thr Met Arg Asp Leu Ser Gln Met Leu Lys Lys Met Pro Gln 325 330 335 Tyr Gln Lys Glu Leu Ser Lys Tyr Ser Thr His Leu His Leu Ala Glu 340 345 350 Asp Cys Met Lys His Tyr Gln Gly Thr Val Asp Lys Leu Cys Arg Val 355 360 365 Glu Gln Asp Leu Ala Met Gly Thr Asp Ala Glu Gly Glu Lys Ile Lys 370 375 380 Asp Pro Met Arg Ala Ile Val Pro Ile Leu Leu Asp Ala Asn Val Ser 385 390 395 400 Thr Tyr Asp Lys Ile Arg Ile Ile Leu Leu Tyr Ile Phe Leu Lys Asn 405 410 415 Gly Ile Thr Glu Glu Asn Leu Asn Lys Leu Ile Gln His Ala Gln Ile 420 425 430 Pro Pro Glu Asp Ser Glu Ile Ile Thr Asn Met Ala His Leu Gly Val 435 440 445 Pro Ile Val Thr Asp Ser Thr Leu Arg Arg Arg Ser Lys Pro Glu Arg 450 455 460 Lys Glu Arg Ile Ser Glu Gln Thr Tyr Gln Leu Ser Arg Trp Thr Pro 465 470 475 480 Ile Ile Lys Asp Ile Met Glu Asp Thr Ile Glu Asp Lys Leu Asp Thr 485 490 495 Lys His Tyr Pro Tyr Ile Ser Thr Arg Ser Ser Ala Ser Phe Ser Thr 500 505 510 Thr Ala Val Ser Ala Arg Tyr Gly His Trp His Lys Asn Lys Ala Pro 515 520 525 Gly Glu Tyr Arg Ser Gly Pro Arg Leu Ile Ile Phe Ile Leu Gly Gly 530 535 540 Val Ser Leu Asn Glu Met Arg Cys Ala Tyr Glu Val Thr Gln Ala Asn 545 550 555 560 Gly Lys Trp Glu Val Leu Ile Gly Ser Thr His Ile Leu Thr Pro Gln 565 570 575 Lys Leu Leu Asp Thr Leu Lys Lys Leu Asn Lys Thr Asp Glu Glu Ile 580 585 590 Ser Ser <210> 2 <211> 288 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp 1 5 10 15 Asp Asp Asp Val Ala Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu 20 25 30 Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala 35 40 45 Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser 50 55 60 Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser 65 70 75 80 Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile 85 90 95 Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp 100 105 110 Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val 115 120 125 Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg 130 135 140 Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr 145 150 155 160 Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile 165 170 175 Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu 180 185 190 Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser 195 200 205 Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu 210 215 220 Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala 225 230 235 240 Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys 245 250 255 Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys 260 265 270 Val Ile Leu Gly Ile Val Ile Ala Ser Thr Val Gly Gly Ile Phe Ala 275 280 285 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Met Thr Asp Ile Met 1 5 <210> 4 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Arg Arg Glu 1 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 5 His Ile Leu Asp Met Trp 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 6 His Ile Met Asp Phe Trp 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 7 His Ile Leu Asp Trp Trp 1 5 <210> 8 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 8 His Ala Leu Arg Phe Trp 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 9 His Ile Met Asp Trp Trp 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 10 Arg Arg Arg Phe 1 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 11 Arg Met Arg Phe 1 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Asp Ile Asn Lys Arg Arg Glu 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 13 Glu Arg Ile Asn Lys Arg Arg Trp 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially synthesized peptide <400> 14 Glu Arg Ile Asn Lys Met Arg Tyr 1 5

Claims

SEQ ID NO: 3 및/또는 SEQ ID NO: 4와 경쟁하는 것을 특징으로 하는, Munc 18-Syntaxin-1 복합체 상호 작용을 방해할 수 있는 펩티드, 그의 허용되는 이성질체, 염, 용매화물 및/또는 유도체 및/또는 이들의 혼합물.
제1항에 있어서, 그의 서열이 SEQ ID NO: 3 및/또는 SEQ ID NO: 4인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1항에 있어서, 일반식(I)에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드, 그의 화장용으로 및 제약학적으로 허용되는 이성질체, 염, 용매화물 및/또는 유도체및 이들의 혼합물:
R₁-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-AA₅-AA₆-R₂(I)
AA₁ 은 양으로 하전된 측쇄 또는 극성으로 하전되지 않은 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;
AA₂ 는 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고;
AA₃ 은 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;
AA₄ 는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고;
AA₅ 는 비극성 소수성 측쇄 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;
AA₆ 은 W이고;
R₁ 은 H, 치환 또는 비치환된 비환식 지방족, 치환 또는 비치환된 알리사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬 및 R₅-CO-(여기에서, R₅ 는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 3 내지 10원의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭환, 및 탄소 원자 2 내지 24개 및 탄소 이외의 원자 1 내지 3개를 가지며 탄소수 1 내지 6의 알킬 쇄를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군 중에서 선택됨) 중에서 선택되고;
R₂ 는 H, -NR₃R₄-, -OR₃ 및 -SR₃중에서 선택되며, 여기에서 R₃ 및 R₄ 는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 비환식 지방족 그룹, 치환 또는 비치환된 알리사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 아르알킬 중에서 선택된다.
제3항에 있어서, AA₁ 이 H이고; AA₂ 가 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며; AA₃ 은 비극성 소수성 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고; AA₄ 는 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며; AA₅ 는 M 또는 방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고; AA₆ 은 Trp인 것을 특징으로 하는, 펩티드.
제3항 또는 제4항에 있어서, AA₁ 이 His이고; AA₂ 가 Ala 및 Ile의 군 중에서 선택되며; AA₃ 이 Leu 및 Met의 군 중에서 선택되고; AA₄ 가 Arg 및 Asp의 군 중에서 선택되며; AA₅ 가 Met, Phe 및 Trp의 군 중에서 선택되며; AA₆ 이 Trp인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식(I)의 펩티드가
R₁-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 5-R₂);
R₁-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-R₂(R₁-SEQ ID NO: 6-R₂);
R₁-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 7-R₂);
R₁-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 8-R₂); 및/또는
R₁-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-R₂ (R1-SEQ ID NO: 9-R₂)
인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식(I)의 펩티드가
Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 5-NH₂);
Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 6-NH₂);
Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 7-NH₂);
Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 8-NH₂); 및/또는
Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 9-NH₂)
인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1항에 있어서, 일반식(II)에 따른 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 펩티드, 이들의 화장용으로 및 제약학적으로 허용되는 이성질체, 염, 용매화물 및/또는 유도체 및 그들의 혼합물:
R₁-AA₁-AA₂-AA₃-AA₄-R₂ (II)
상기 식에서,
AA₁ 은 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;
AA₂ 가 임의의 아미노산이고;
AA₃ 이 양으로 하전된 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되며;
AA₄가방향족 측쇄를 갖는 아미노산의 군 중에서 선택되고;
R₁ 은 His, 치환 또는 비치환된 비환식 지방족, 치환 또는 비치환된 알리사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아르알킬 및 R₅-CO-(여기에서, R₅ 는 치환 또는 비치환된 C₁-C₂₄ 알킬 라디칼, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알케닐, 치환 또는 비치환된 C₂-C₂₄ 알키닐, 치환 또는 비치환된 C₃-C₂₄ 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 C₅-C₂₄ 사이클로알케닐, 치환 또는 비치환된 C₈-C₂₄ 사이클로알키닐, 치환 또는 비치환된 C₆-C₃₀ 아릴, 치환 또는 비치환된 C₇-C₂₄ 아르알킬, 3 내지 10원의 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릭환, 및 탄소 원자 2 내지 24개 및 탄소 이외의 원자 1 내지 3개를 가지며 탄소수 1내지 6의 알킬 쇄를 갖는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬에 의해 형성된 군 중에서 선택됨) 중에서 선택되고;
R₂ 는 H, -NR₃R₄-, -OR₃ 및 -SR₃중에서 선택되며, 여기에서 R₃ 및 R₄ 는 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 비환식 지방족 그룹, 치환 또는 비치환된 알리사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 및 치환 또는 비치환된 아르알킬 중에서 선택된다.
제8항에 있어서, AA₁ 이 Lys, Arg 및 His의 군 중에서 선택되며; AA₂ 가 아미노산이고; AA₃ 이 Lys, Arg 및 His의 군 중에서 선택되며; AA₄ 가 Phe, Tyr 및 Trp의 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제8항 또는 제9항에 있어서, AA₁ 이 Arg의 군 중에서 선택되고; AA₂ 가 임의의 아미노산이며; AA₃ 이 Arg의 군 중에서 선택되고; AA₄ 가 Phe의 군 중에서 선택는 것을 특징으로 하는 펩티드.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식(II)의 펩티드가
R₁-Arg-Arg-Arg-Phe-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 10-R₂) 및/또는
R₁-Arg-Met-Arg-Phe-R₂ (R₁-SEQ ID NO: 11-R₂)
인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 일반식(II)의 펩티드가
Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 10-NH₂) 및/또는
Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH₂ (Ac-SEQ ID NO: 11-NH₂)
인 것을 특징으로 하는 펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 펩티드를 포함하는 조성물.
의약으로서 사용하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 제13항에 따른 조성물.
신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애의 예방 및/또는 치료에 사용하기 위한 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 제13항에 따른 조성물.
제15항에 있어서, 신경 세포 엑소사이토시스 및/또는 근육 수축성 장애가 노인성 치매, 알쯔하이머 관련 치매, AIDS 관련 치매, 간질, 근 위축성 경화증(amiotrophic sclerosis), 다발성/측삭 경화증(multiple/lateral sclerosis), 비만 세포증(mastocytosis), 만성 편두통, 근 긴장 이상증 및/또는 불안 장애인 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 조성물.
제15항에 있어서, 근육 수축성 장애가 근 긴장(myotonia), 근이영양증(myotonic dystrophy), 선천성 근긴장증(myotonia congenita), 파킨슨병, 2차 파킨슨병, 헌팅턴병, 경련(spasticity) 또는 만발성 운동 장애(Tardive Dysinesia, TD)인 것을 특징으로 하는 펩티드 또는 조성물.
대상에서 피부 노화 및/또는 표정 징후(expression signs)를 예방, 감소 및/또는 제거하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 펩티드 또는 제13항에 따른 조성물의 화장품으로서의 사용.