ES2937382T3

ES2937382T3 - Péptidos y composiciones para uso en cosmética y medicina

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Publication number: ES2937382T3
Application number: ES19707004T
Authority: ES
Inventors: Ariadna Grau-Campistany; Pastor Silvia; Patricia Carulla; Juan Carlos Escudero; Julia A Boras; Giner Isabel Devesa; Ballester Gregorio Fernandez
Original assignee: Lipotrue SL
Current assignee: Lipotrue SL
Priority date: 2018-02-27
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2039-02-22
Also published as: EP3758730B1; CN112040969A; TW201941783A; AU2019228281A1; CN112040969B; JP2021514940A; US20210032287A1; WO2019166347A1; KR20200124218A; US11634458B2; PL3758730T3; CA3090060A1; EP3758730A1; JP7296642B2

Abstract

La presente invención se relaciona con una familia de péptidos que son capaces de interferir en la formación del complejo Munc18-Syntaxin-1 y, por lo tanto, son útiles en la prevención y/o tratamiento de exocitosis neuronal y/o trastornos de la contractilidad muscular; y para prevenir, reducir y/o eliminar el envejecimiento cutáneo y/o los signos de expresión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Péptidos y composiciones para uso en cosmética y medicina

La presente invención se relaciona con el campo de la biología molecular, más precisamente con la biología molecular aplicada a la cosmética y la medicina, aún más precisamente con los péptidos y composiciones que comprenden dichos péptidos, capaces de modular la unión o la interacción entre Munc18 (por sus siglas en inglés) y Sintaxina-1 y, por lo tanto, la unión del complejo SNARE (por sus siglas en inglés). Debido a esta actividad, los péptidos y las composiciones de la presente invención son capaces de modular la fusión de vesículas sinápticas y la contractilidad muscular. Por lo tanto, dichos péptidos y composiciones son efectivos en el tratamiento de afecciones relacionadas con la modulación de los aspectos mencionados anteriormente (por ejemplo, relajación muscular) y son útiles tanto en cosmética (actividad antiarrugas y actividad contra la hiperhidrosis) como en medicina (trastornos de la contracción neuronal y/o muscular).

La modulación anormal del complejo SNARE y de la fusión de vesículas sinápticas lleva, entre otros, a una contracciónrelajación muscular anormal, que se sabe que es muy relevante tanto en cosmética como en medicina.

Por un lado, la base o mecanismo de formación de las arrugas (por ejemplo, las arrugas de expresión facial) es una tensión de los músculos que arrastra la piel hacia adentro. Esta tensión muscular es el resultado de una hiperactividad de los nervios que enervan los músculos correspondientes. Dicha hiperactividad nerviosa es, a su vez, caracterizada por una liberación descontrolada y excesiva de neurotransmisores que excitan las fibras musculares.

Por otro lado, la hiperactividad nerviosa (caracterizada, como ya se ha notado anteriormente, por una liberación descontrolada y excesiva de neurotransmisores que excitan las fibras musculares) que lleva a una alteración de la contracción-relajación muscular, que también está en la base de varias enfermedades conocidas, por ejemplo, demencia senil, demencia relacionada con el Alzheimer, demencia relacionada con el SIDA, epilepsia, esclerosis amiotrófica o esclerosis múltiple/lateral (Jabbari B, (2018) Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine - A Disease-Oriented Approach, Springer, Cham; Jankovic J, (2004)) Botulinum toxin in clinical practice, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 75:951-957).

De un modo similar a lo expuesto anteriormente, las anomalías en el complejo SNARE y en la fusión de vesículas sinápticas que llevan a una desregulación de la exocitosis neuronal no solamente producen una activación o excitación excesiva del músculo sino también de otras estructuras u órganos tales como, por ejemplo, las glándulas. Por lo tanto, dichas condiciones también llevan a alteraciones cosméticas y médicas (para las cuales son útiles los péptidos y composiciones de la presente invención) no relacionadas con la contracción muscular como, por ejemplo, hiperhidrosis (excesiva activación o excitación de las glándulas sudoríparas) (Jabbari B, (2018) Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine - A Disease-Oriented Approach, Springer, Cham; Luvisetto S, Gazerani P, Cianchetti C, Pavone F, (2015) Botulinum Toxin Type A as a Therapeutic Agent against Headache and Related Disorders, Toxins (Basilea), Sep; 7(9): 3818-3844; Molderings GJ, Haenisch B, Brettner S, et al, (2016) Pharmacological treatment options for mast cell activation disease, Arch Pharmacol. 2016; 389: 671-694; Basar E, Arici C, (2016), Use of Botulinum Neurotoxin in Ophthalmology, Turk J Ophthalmol. Dic; 46(6): 282-290; Schlereth T, Dieterich M, Birklein F (2009), Hyperhidrosis - causes and treatment of enhanced sweating, Dtsch Arztebl Int. Ene; 106(3): 32-7).

La liberación de neurotransmisores se debe a la fusión de vesículas presinápticas que, como es ampliamente sabido, está controlada por interacciones complejas entre diferentes proteínas que están a cargo de acercar las vesículas con el neurotransmisor a la membrana presináptica, posicionando dicha vesícula para su secreción, permitiendo la fusión. de las membranas para la secreción y desensamblando el complejo generado para permitir su reciclaje. Todo este procedimiento, incluido el ensamblaje y desensamblaje de las proteínas participantes, necesita ser estrictamente controlado ya que cualquier tipo de desregulación puede llevar a alteraciones, con efectos tanto estéticos como de salud.

Las moléculas que regulan la exocitosis neuronal contribuyen a la relajación de la tensión muscular y, por lo tanto, a prevenir, disminuir y/o eliminar las arrugas (preferiblemente, arrugas faciales), y/o prevenir, mejorar o curar enfermedades relacionadas con la exocitosis neuronal anormal o desregulada.

En este sentido, tradicionalmente se ha considerado que la fusión de vesículas presinápticas (cargadas de neurotransmisores, preferiblemente, acetilcolina) es impulsada o controlada por proteínas SNARE (es decir, Sintaxina-1 y SNAP-25 (por sus siglas en inglés) en la membrana de la neurona; y sinaptobrevina o VAMP (por sus siglas en inglés) en la membrana de la vesícula). Por lo tanto, se consideró que el complejo proteico SNARE es un objetivo clave para el control de la neurosecreción.

En este sentido, se han generado varios enfoques terapéuticos y cosméticos dirigidos contra el complejo proteico SNARE, como por ejemplo:

- Toxinas botulínicas: han sido ampliamente usadas con la finalidad de reducir y/o eliminar las arrugas de expresión, especialmente del serotipo A (BOTOX® Cosmetic, Allergan Inc.). Dichas toxinas botulínicas se inyectan localmente y sus efectos paralizantes son reversibles con una duración promedio de 6 meses, por lo tanto, requiriendo inyecciones repetidas. Es conocido el riesgo de desencadenar una reacción inmunitaria contra la preparación botulínica que lleva a una pérdida de la eficacia del tratamiento. También se han considerado otros serotipos de toxinas botulínicas, tales como B, F y E, para superar este problema, sin embargo, dichos serotipos también tienen el riesgo de desencadenar una respuesta inmune. A nivel molecular, las toxinas botulínicas son proteasas que degradan proteínas neuronales que están involucradas en el mecanismo de exocitosis activada por iones de calcio. Por ejemplo, la toxina botulínica A trunca la proteína neuronal SNAP-25.

- También es conocido en el estado de la técnica que ciertos péptidos derivados de las secuencias de las proteínas que forman el complejo SNARE pueden inhibir la exocitosis neuronal, tales como por ejemplo: péptidos derivados de los dominios amino y carboxilo de SNAP-25 (ver, por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO97/34620, la patente europea EP1180524B1 y la patente europea EP2123673B1), y péptidos derivados de sinaptobrevina o de Sintaxina (ver, por ejemplo, la solicitud de patente PCT WO97/34620; Blanes-Mira C, Clemente J, Jodas G, Gil A, Fernandez-Ballester G, Ponsati B, Gutierrez L, Perez-Paya E, Ferrer-Montiel A, A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity, International Journal of Cosmetic Science, (2002), 24, 303-310).

Sin embargo, aún existe la necesidad de encontrar moléculas adicionales o alternativas que interfieran en los mecanismos de liberación de neurotransmisores sinápticos y permitan su inhibición, permitiendo la inhibición de la exocitosis neuronal y, por lo tanto, proporcionando, entre otros, la relajación muscular o el agotamiento de la hiperestimulación glandular y los correspondientes efectos cosméticos y farmacéuticos.

Estudios recientes han sugerido una regulación más compleja de la liberación de neurotransmisores sinápticos en la cual, además del complejo proteico SNARE, otras proteínas, tales como Munc13 y Munc18, tendrían un papel importante tanto en la regulación del procedimiento como en permitir la fusión de las membranas (Rizo J and Südhof TC (2012) The Membrane Fusion Enigma: SNARE, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices - Guilty as Charged?; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28: 279-308). En este sentido, la interacción entre Munc18 (SEQ ID NO: 1) y la Sintaxina-1 (SEQ ID NO: 2) ha sido descrita como central y esencial, tanto para la generación del complejo SNARE como para la fusión de las membranas. Por un lado, Munc18 interactúa con el dominio Habc (por sus siglas en inglés) de Sintaxina-1 permitiendo la estabilización de dicho Munc18 y su tráfico adecuado. Por otro lado, la interacción de Munc18 con el péptido N de Sintaxina-1 es necesaria para la interacción de Munc18 con el complejo SNARE y para la fusión de las membranas (Zhou P, et al, (2013) Syntaxin-1 N-peptide and Habc-domain perform distinct essential functions in synaptic vesicle fusion; The EMBO Journal, 32: 159-171; Rizo J and Südhof TC (2012) The Membrane Fusion Enigma: SⁿARE, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices - Guilty as Charged?; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28: 279-308).

Los inventores de la presente invención, tras una extensa y exhaustiva investigación, han encontrado sorprendentemente que los péptidos que compiten con secuencias específicas situadas en la superficie de interacción entre Munc18 y Sintaxina-1 permiten una interferencia o inhibición de dicho complejo Munc18-Sintaxina-1 y, por lo tanto, una inhibición de la liberación de neurotransmisores (preferiblemente, acetilcolina y CGRP (péptido relacionado con el gen de la calcitonina, por sus siglas en inglés)), y una inhibición de la contracción muscular (tanto, indirectamente por medio de la inhibición de la exocitosis neuronal, como también por proporcionar un efecto directamente en las células musculares). Sorprendentemente, se ha encontrado que los péptidos que compiten con otras secuencias ubicadas en la superficie de interacción entre Munc18 y Sintaxina-1 no proporcionan los efectos mencionados anteriormente. Por lo tanto, los inventores de la presente invención han encontrado que los péptidos que compiten con SEQ ID NO: 3 (correspondientes a las posiciones 46 a 51 de Munc18, es decir, de SEQ ID NO: 1) y/o s Eq ID NO: 4 (correspondientes a las posiciones 63 a 66 de Munc18, es decir, de SEQ ID NO: 1), ambas de Munc18, son ventajosas sobre otras secuencias ubicadas en la superficie de interacción entre Munc18 y Sintaxina-1 por la interferencia de la interacción entre Munc18 y Sintaxina-1. Dichos péptidos (los péptidos de la presente invención) han mostrado una interferencia efectiva de la interacción entre Munc18 y Sintaxina-1. Adicionalmente, estos péptidos han mostrado un efecto relajante muscular directo, ya que tienen la capacidad de actuar directamente sobre las células musculares, es decir, en el lado postsináptico por la modulación de los genes involucrados en la contracción muscular, y la modulación de la movilización de calcio, como se ha visto para otros péptidos (Schagen SK (2017) Topical treatments with effective anti-aging results, Cosmetics, 4, 16; Solicitud de Patente PCT WO2006047900). Por lo tanto, han mostrado un efecto tanto en el lado presináptico como en el lado postsináptico al permitir una inhibición efectiva de la liberación de acetilcolina en las neuronas, y una modulación de la expresión génica y una reducción de la movilización de calcio en las células musculares. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención resuelven el problema mencionado anteriormente y son útiles para el tratamiento tanto de signos estéticos como de enfermedades relacionadas con la desregulación de la exocitosis neuronal y/o la contractilidad muscular.

Los inventores no tienen conocimiento de ninguna técnica anterior que proporcione moléculas que interfieran en la interacción entre Munc18 y Sintaxina-1 para inhibir la liberación de neurotransmisores (y, por lo tanto, inhibir la exocitosis neuronal) y la contractilidad muscular.

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1, compitiendo con regiones específicas de la superficie de interacción entre Munc18 y Sintaxina-1. Más precisamente, los péptidos de la presente invención compiten con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO:4, estando ambas secuencias ubicadas en Munc18, en su superficie de interacción con Sintaxina-1.

También se describe en la presente una composición que comprende un péptido de la presente invención (un péptido de la presente invención o una combinación de los mismos).

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a una composición o péptido de la presente invención para su uso como medicamento, más precisamente para su uso en la prevención, mejora y/o tratamiento de la exocitosis neuronal y/o los trastornos de la contractilidad muscular, incluso más precisamente para su uso en la prevención, mejora y/o tratamiento de enfermedades asociadas con la desregulación de la formación del complejo SNARE, la desregulación de la contracción del músculo estriado, la desregulación de la liberación de acetilcolina y/o CGRP, y/o la desregulación de la activación del canal de Ca2+.

Asimismo, la presente invención en un tercer aspecto se refiere al uso como un cosmético de un péptido o una composición de la presente invención para prevenir, reducir y/o eliminar signos cosméticos relacionados con la desregulación de la exocitosis neuronal y/o de la contractilidad muscular en un sujeto, más específicamente, del envejecimiento de la piel o de los signos de expresión.

El término "grupo alifático no cíclico" y su plural, como se usan en la presente, tienen el significado común dado en el estado de la técnica a dichos términos. Por lo tanto, estos términos se refieren, por ejemplo y sin restricción, a grupos alquilo, alquenilo y alquinilo, lineales o ramificados.

El término "grupo alquilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo saturado, lineal o ramificado, que tiene entre 1 y 24, preferiblemente entre 1 y 16, más preferiblemente entre 1 y 14, aún más preferiblemente entre 1 y 12, e incluso más preferiblemente entre 1, 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono, y que esté unido al resto de la molécula por una unión simple, incluyendo, por ejemplo y sin restricción a, metilo, etilo, isopropilo, n-propilo, /-propilo, isobutilo, terc-butilo, n-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, heptilo, octilo, decilo, dodecilo, laurilo, hexadecilo, octadecilo, amilo, 2-etilhexilo, 2-metilbutilo, 5-metilhexilo, y similares. Los grupos alquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como un halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "grupo alquenilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo lineal o ramificado que tiene entre 2 y 24, preferiblemente entre 2 y 16, más preferiblemente entre 2 y 14, aún más preferiblemente entre 2 y 12, incluso más preferiblemente de 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono, con una o más uniones dobles carbono-carbono, preferiblemente con 1, 2 o 3 uniones dobles carbono-carbono, conjugados o no conjugados, que está unido al resto de los molécula a través de una unión simple, incluyendo, por ejemplo y sin restricción a, los grupos vinilo, oleílo, linoleílo, y similares. Los grupos alquenilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como un halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "grupo alquinilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo lineal o ramificado que tiene entre 2 y 24, preferiblemente entre 2 y 16, más preferiblemente entre 2 y 14, aún más preferiblemente entre 2 y 12, incluso más preferiblemente de 2, 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono, con una o más uniones triples carbono-carbono, preferiblemente con 1, 2 o 3 uniones triples carbono-carbono, conjugados o no conjugados, que está unido al resto de los molécula a través de una unión simple, incluyendo, por ejemplo y sin restricción a, los grupos etinilo, 1-propinilo, 2-propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 3-butinilo, pentinilo, tal como 1-pentinilo, y grupos similares. Los grupos alquinilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como un halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "grupo alicíclico" y su plural, como se usan en la presente, tienen el significado común dado en el estado de la técnica a dichos términos. Por lo tanto, estos términos se usan para referirse, por ejemplo y sin restricción, a grupos cicloalquilo o cicloalquenilo o cicloalquinilo.

El término "cicloalquilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo alifático mono o policíclico saturado que tiene entre 3 y 24, preferiblemente entre 3 y 16, más preferiblemente entre 3 y 14, aún más preferiblemente entre 3 y 12 , incluso más preferiblemente de 3, 4, 5 o 6 átomos de carbono y que está unido al resto de la molécula a través de una unión simple, incluyendo, por ejemplo y sin restricción a, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, metilciclohexilo, dimetilciclohexilo, octahidroindeno, decahidronaftaleno, dodecahidrofenaleno, adamantilo, y similares, y que pueden estar opcionalmente sustituidos por uno o más grupos, tales como un alquilo, halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "cicloalquenilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo alifático mono o policíclico no aromático que tiene entre 5 y 24, preferiblemente entre 5 y 16, más preferiblemente entre 5 y 14, aún más preferiblemente entre 5 y 12, incluso más preferiblemente de 5 o 6 átomos de carbono, con una o más uniones dobles carbono-carbono, preferiblemente con 1, 2 o 3 uniones dobles carbono-carbono, conjugados o no conjugados, que se une al resto de la molécula a través de una unión simple, que incluye, por ejemplo y sin restricción a, los grupos ciclopent-1-en-1-ilo y grupos similares, y que puede estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos, tales como un alquilo, halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "cicloalquinilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo alifático mono o policíclico no aromático que tiene entre 8 y 24, preferiblemente entre 8 y 16, más preferiblemente entre 8 y 14, aún más preferiblemente entre 8 y 12, incluso más preferiblemente de 8 o 9 átomos de carbono, con una o más uniones triples carbono-carbono, preferiblemente con 1, 2 o 3 uniones triples carbono-carbono, conjugados o no conjugados, que se une al resto de la molécula a través de una unión simple, que incluye, por ejemplo y sin restricción a, los grupos ciclooct-2-in-1-ilo y similares, y que puede estar opcionalmente sustituido por uno o más grupos, tales como un alquilo, halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "grupo arilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo aromático que tiene entre 6 y 30, preferiblemente entre 6 y 18, más preferiblemente entre 6 y 10, aún más preferiblemente 6 o 10 átomos de carbono, que comprende 1,2, 3 o 4 anillos aromáticos, unidos por una unión carbono-carbono o condensados, y que está unido al resto de la molécula a través de una unión simple, incluyendo, por ejemplo y sin restricción a, fenilo, naftilo, difenilo, indenilo, fenantrilo o antranilo, entre otros. El grupo arilo puede estar opcionalmente sustituido con uno o más sustituyentes, tales como un halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "grupo aralquilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo alquilo sustituido por un grupo aromático, con entre 7 y 24 átomos de carbono e incluyendo, por ejemplo y sin restricción a, -(CH2)1-6-fenilo, -(CH2)1-6-(1-naftilo), -(CH2)1-6-(2-naftilo), -(CH2)1-6-CH(fenilo)2, y similares. Los grupos aralquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como un halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "grupo heterocíclico" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un anillo heterocíclico o hidrocarbonado de 3 a 10 miembros, en el cual uno o más de los átomos del anillo, preferiblemente 1,2 o 3 de los átomos del anillo, es un elemento diferente al carbono, tal como nitrógeno, oxígeno o azufre, y puede ser saturado o insaturado. Para los fines de esta invención, el heterociclilo puede ser un sistema cíclico, monocíclico, bicíclico o tricíclico que puede incluir sistemas de anillos condensados; y los átomos de nitrógeno, carbono o azufre pueden estar opcionalmente oxidados en el radical heterociclilo; el átomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado; y el radical heterociclilo puede estar parcial o completamente saturado, o puede ser aromático. Cada vez con mayor preferencia, el término heterocíclico se refiere a un anillo de 5 o 6 miembros. Los grupos heterocíclicos pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como un halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

El término "grupo heteroarilalquilo" y su plural, como se usan en la presente, se refieren a un grupo alquilo sustituido con un grupo heterociclilo aromático sustituido o no sustituido, teniendo el grupo alquilo de 1 a 6 átomos de carbono y el grupo heterociclilo aromático entre 2 y 24 átomos de carbono, y de 1 a 3 átomos distintos al carbono e incluyendo, por ejemplo y sin restricción, -(CH2)1-6-imidazolilo, -(Ch2)1-6-triazolilo,2) 1 -6-triazolilo, -(CH2)1-6-tienilo, -(CH2)1-6-furilo, -(c H2)1-6-pirrolidinilo, y similares. Los grupos heteroarilalquilo pueden estar opcionalmente sustituidos con uno o más sustituyentes, tales como un halógeno, hidroxilo, alcoxilo, carboxilo, carbonilo, cianuro, acilo, alcoxicarbonilo, amino, nitro, mercapto y alcoxitiol.

Los términos "halo" o "halógeno", como se usan en la presente, se refieren a flúor, cloro, bromo o yodo, y sus aniones se denominan haluros.

Como se usa en la presente, el término "derivado" y su plural, se refieren tanto a compuestos cosméticamente aceptables, es decir, derivados del compuesto de interés que se puede usar en la preparación de un cosmético, como a derivados cosméticamente inaceptables ya que estos pueden ser útiles en la preparación de derivados cosméticamente aceptables. El término "derivado" y su plural también se refieren tanto a compuestos farmacéuticamente aceptables, esto es, derivados del compuesto de interés que puede ser usado en la preparación de un medicamento, como a derivados farmacéuticamente inaceptables ya que estos pueden ser útiles en la preparación de derivados farmacéuticamente aceptables.

Como se usa en la presente, el término "sal" y su plural, se refieren a cualquier tipo de sal de entre aquellas conocidas en el estado de la técnica, por ejemplo, sales de haluros, sales de hidroxiácidos (tales como sales de oxiácidos, sales de ácidos, sales básicas y sales dobles), sales de hidroxos, sales mixtas, sales de oxilos, u otras sales hidratadas. Este término comprende tanto sales cosmética y/o farmacéuticamente aceptables como sales cosmética y/o farmacéuticamente inaceptables, ya que estas últimas pueden ser útiles en la preparación de sales cosmética y/o farmacéuticamente aceptables.

Como se usa en la presente, el término "isómero" y su plural, se refieren a isómeros ópticos, enantiómeros, estereoisómeros o diastereoisómeros. Los enantiómeros o diastereoisómeros individuales, así como sus mezclas, se pueden separar por técnicas convencionales conocidas en el estado de la técnica.

Como se usa en la presente, el término "solvato" y su plural, se refieren a cualquier solvato conocido en el estado de la técnica, tal como solvatos polares, apolares o anfifílicos, e incluyen cualquier solvato cosméticamente aceptable que, cuando se administra o aplica al sujeto interesado (directa o indirectamente) proporciona el compuesto de interés (el péptido o péptidos de la presente invención). Preferiblemente, el solvato es un hidrato, un solvato con un alcohol, tal como metanol, etanol, propanol o isopropanol, un solvato con un éster, tal como acetato de etilo, un solvato con un éter, tal como éter metílico, éter etílico o THF (tetrahidrofurano, por sus siglas en inglés), o un solvato con DMF (dimetilformamida, por sus siglas en inglés), y más preferiblemente un hidrato o un solvato con un alcohol, tal como etanol.

Además, como se usa en la presente, el término "aminoácido" y su plural, incluyen los aminoácidos codificados por el código genético así como los aminoácidos no codificados, ya sean naturales o no, y ya sean D- y L-aminoácidos. Los ejemplos de aminoácidos no codificados son, sin restricción, citrulina, ornitina, sarcosina, desmosina, norvalina, ácido 4-aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 6-aminohexanoico, 1-naftilalanina, 2-naftilalanina, ácido 2-aminobenzoico, ácido 4-aminobenzoico, 4-clorofenilalanina, ácido 2,3-diaminopropiónico, ácido 2,4-diaminobutírico, cicloserina, carnitina, cisteína, penicilamina, ácido piroglutámico, tienilalanina, hidroxiprolina, aloisoleucina, alotreonina, ácido isonipecótico, isoserina, fenilglicina, estatina, p-alanina, norleucina, N-metilaminoácidos, a-aminoácidos y p-aminoácidos, entre otros, así como sus derivados. No obstante, en el estado de la técnica se conocen otros aminoácidos no naturales (ver, por ejemplo, "Unusual amino acids in peptide síntesis" de DC Roberts and F Vellaccio, The Peptides, Vol. 5 (1983), Chapter VI, Gross E and Meienhofer J, Eds., Academic Press, Nueva York, EE. UU.).

Como se usa en la presente, "arrugas de expresión" son las arrugas resultantes del estrés ejercido por las contracciones de los músculos faciales responsables de provocar las expresiones faciales en la piel de la cara. Dichas arrugas se suelen ubicar en la frente, en el entrecejo, alrededor de la boca y/o alrededor de los ojos.

En una realización del primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1 caracterizado porque compite con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4 y porque la secuencia del péptido es SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:4.

En esta realización se contempla que el péptido de la presente invención comprenda al menos un motivo unido en su N-terminal y/o en su C-terminal. Dicho al menos un motivo se puede unir al péptido por cualquier medio conocido en el estado de la técnica, preferiblemente covalentemente. En una realización preferida, el péptido comprende un motivo unido covalentemente a su N-terminal y un motivo unido covalentemente a su C-terminal.

En una realización, el al menos un motivo N-terminal (preferiblemente, un motivo N-terminal) se selecciona de un H, un alifático no cíclico sustituido o no sustituido, un aliciclilo sustituido o no sustituido, un heterociclilo sustituido o no sustituido, un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, un arilo sustituido o no sustituido, un aralquilo sustituido o no sustituido, y de R5-CO-, en donde R5 se selecciona del grupo formado por un radical alquilo de C1-C24 sustituido o no sustituido, un alquenilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un alquinilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un alquinilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquilo de C3-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquenilo de C5-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquinilo de C8-C24 sustituido o no sustituido, un arilo de C6-C30 sustituido o no sustituido, un aralquilo de C7-C24 sustituido o no sustituido, un anillo heterociclilo sustituido o no sustituido de 3 a 10 miembros, y un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido de 2 a 24 átomos de carbono y de 1 a 3 átomos distintos de carbono y una cadena alquílica de 1 a 6 átomos de carbono. Más preferiblemente, el al menos un motivo N-terminal (preferiblemente, un motivo N-terminal) se selecciona de un H o de R5-CO-, en donde R5 se selecciona del grupo formado por un radical alquilo de C1-C24 sustituido o no sustituido, un alquenilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un alquinilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquilo de C3-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquenilo de C5-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquinilo de C8-C24 sustituido o no sustituido, un arilo de C6-C30 sustituido o no sustituido, un aralquilo de C7-C24 sustituido o no sustituido, un anillo heterociclilo sustituido o no sustituido de 3 a 10 miembros, y un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido de 2 a 24 átomos de carbono y de 1 a 3 átomos distintos de carbono y una cadena alquílica de 1 a 6 átomos de carbono. Aún más preferiblemente, el al menos un motivo N-terminal (preferiblemente, un motivo N-terminal) se selecciona de H, acetilo (en adelante, Ac), ferc-butanoílo, hexanoílo, 2-metilhexanoílo, ciclohexanocarboxilo, octanoílo, decanoílo, lauroílo, miristoílo, palmitoílo (en adelante, Pal), estearoílo, oleoílo y linoleoílo. En la realización más preferida, el al menos un motivo N-terminal (preferiblemente, un motivo N-terminal) es Ac.

En una realización, el al menos un motivo C-terminal (preferiblemente, un motivo C-terminal) se selecciona de un H, de -NR3R4-, de -OR3 y de -SR3, en donde R3 y R4 se seleccionan independientemente de un H, un grupo alifático no cíclico sustituido o no sustituido, un aliciclilo sustituido o no sustituido, un heterociclilo sustituido o no sustituido, un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, un arilo sustituido o no sustituido y un aralquilo sustituido o no sustituido. En la realización más preferida, el al menos un motivo C-terminal (preferiblemente, un motivo C-terminal) es NH2.

Por lo tanto, más preferiblemente, el péptido de la presente invención comprende un motivo unido al extremo N-terminal y un motivo unido al extremo C-terminal, en donde el motivo unido al extremo N-terminal es Ac y el motivo unido al extremo C-terminal es NH2.

Se contempla que un péptido de la presente divulgación tenga una secuencia con al menos 70% de identidad con SEQ ID NO: 3 o Se Q ID n O: 4, aún más preferiblemente, 80% de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, incluso más preferiblemente, 90% de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4, incluso más preferiblemente, 95% de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 4; e incluso más preferiblemente, 99% de identidad con SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO:4. En una primera realización preferida del primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1 caracterizado porque compite con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4 y porque la secuencia del péptido está de acuerdo con la fórmula (I):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-R2 (i)

sus isómeros, sales, solvatos y/o derivados cosmética y farmacéuticamente aceptables y sus mezclas, en donde:

AA1 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada positivamente o cadena lateral polar no cargada; AA2 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral hidrófoba no polar;

AA3 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral hidrófoba no polar;

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada;

AA5 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral hidrofóbica no polar o cadena lateral aromática;

AA6 es Trp;

R1 se selecciona de un H, un alifático no cíclico sustituido o no sustituido, un aliciclilo sustituido o no sustituido, un heterociclilo sustituido o no sustituido, un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, un arilo sustituido o no sustituido, un aralquilo sustituido o no sustituido y de R5-CO-, en donde R5 se selecciona del grupo formado por un radical alquilo de C1-C24 sustituido o no sustituido, un alquenilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un alquinilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquilo de C3-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquenilo de C5-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquinilo de C8-C24 sustituido o no sustituido, un arilo de C6-C30 sustituido o no sustituido, un aralquilo de C7-C24 sustituido o no sustituido, un anillo heterociclilo sustituido o no sustituido de 3 a 10 miembros, y un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido de 2 a 24 átomos de carbono y de 1 a 3 átomos distintos de carbono y una cadena alquílica de 1 a 6 átomos de carbono; y

R2 se selecciona de un H, de -NR3R4-, de -OR3 y de -SR3, en donde R3 y R4 se seleccionan independientemente de un H, un grupo alifático no cíclico sustituido o no sustituido, un aliciclilo sustituido o no sustituido, un heterociclilo sustituido o no sustituido, un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, un arilo sustituido o no sustituido, y un aralquilo sustituido o no sustituido.

Más preferiblemente, en esta realización preferida, en la fórmula (I):

AA1 es His;

AA2 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral hidrófoba no polar;

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada;

AA5 se selecciona de Met o del grupo de aminoácidos con cadena lateral aromática; y

AA6 es Trp.

Más preferiblemente, en esta realización preferida, en la fórmula (I):

AA1 es His;

AA2 se selecciona del grupo de Gly, Ala, Val, Leu, Met e Ile;

AA3 se selecciona del grupo de Gly, Ala, Val, Leu, Met e Ile;

AA4 se selecciona del grupo de Lys, Arg, His, Asp y Glu;

AA5 se selecciona del grupo de Met, Phe, Tyr y Trp; y

AA6 es Trp.

Más preferiblemente, en esta realización preferida, en la fórmula (I):

AA1 es His;

AA2 se selecciona del grupo de Ala e Ile;

AA3 se selecciona del grupo de Leu y Met;

AA4 se selecciona del grupo de Arg y Asp;

AA5 se selecciona del grupo de Met, Phe y Trp; y

AA6 es Trp.

Aún más preferiblemente, en esta realización preferida, la secuencia de un péptido de acuerdo con la presente invención es:

R1-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 5-R2);

R1-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 6-R2);

R1-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 7 -R2);

R1-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 8-R2); y/o

R1-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 9-R2).

R1 se selecciona preferiblemente de un H o de R5-CO-, en donde R5 se selecciona del grupo formado por un radical alquilo de C1-C24 sustituido o no sustituido, un alquenilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un alquinilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquilo de C3-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquenilo de C5-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquinilo de C8-C24 sustituido o no sustituido, un arilo de C6-C30 sustituido o no sustituido, un aralquilo de C7-C24 sustituido o no sustituido, un anillo heterociclilo sustituido o no sustituido de 3 a 10 miembros, y un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido de 2 a 24 átomos de carbono y de 1 a 3 átomos distintos de carbono y una cadena alquílica de 1 a 6 átomos de carbono. Aún más preferiblemente, Ri se selecciona de un H, acetilo (en adelante, Ac), ferc-butanoílo, hexanoílo, 2-metilhexanoílo, ciclohexanocarboxilo, octanoílo, decanoílo, lauroílo, miristoílo, palmitoílo (en adelante, Pal), estearoílo, oleoílo y linoleoílo. Aún más preferiblemente, R1 es Ac.

Preferiblemente, R2 es NH2.

Por lo tanto, más preferiblemente, R1 es Ac y R2 es NH2.

Por lo tanto, en esta realización preferida, preferiblemente, la secuencia de un péptido de acuerdo con la presente invención es:

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 5-NH2);

Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 6-NH2);

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 7 -NH2);

Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 8-NH2); y/o

Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 9-NH2).

En una segunda realización preferida del primer aspecto, la presente invención se refiere a un péptido capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1 caracterizado porque compite con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO:4 y porque la secuencia del péptido es:

R1-Arg-Arg-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 10 -R2), en donde

R1 se selecciona de un H, un alifático no cíclico sustituido o no sustituido, un aliciclilo sustituido o no sustituido, un heterociclilo sustituido o no sustituido, un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, un arilo sustituido o no sustituido, un aralquilo sustituido o no sustituido y de R5-CO-, en donde R5 se selecciona del grupo formado por un radical alquilo de C1-C24 sustituido o no sustituido, un alquenilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un alquinilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquilo de C3-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquenilo de C5-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquinilo de C8-C24 sustituido o no sustituido, un arilo de C6-C30 sustituido o no sustituido, un aralquilo de C7-C24 sustituido o no sustituido, un anillo heterociclilo sustituido o no sustituido de 3 a 10 miembros, y un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido de 2 a 24 átomos de carbono y de 1 a 3 átomos distintos de carbono y una cadena alquílica de 1 a 6 átomos de carbono; y R2 se selecciona de H, de -NR3R4-, de -OR3 y de -SR3, en donde R3 y R4 se seleccionan independientemente de un H, un grupo alifático no cíclico sustituido o no sustituido, un aliciclilo sustituido o no sustituido, un heterociclilo sustituido o no sustituido, un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, un arilo sustituido o no sustituido, y un aralquilo sustituido o no sustituido.

R1 se selecciona preferiblemente de un H o de R5-CO-, en donde R5 se selecciona del grupo formado por un radical alquilo de C1-C24 sustituido o no sustituido, un alquenilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un alquinilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquilo de C3-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquenilo de C5-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquinilo de C8-C24 sustituido o no sustituido, un arilo de C6-C30 sustituido o no sustituido, un aralquilo de C7-C24 sustituido o no sustituido, un anillo heterociclilo sustituido o no sustituido de 3 a 10 miembros, y un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido de 2 a 24 átomos de carbono y de 1 a 3 átomos distintos de carbono y una cadena alquílica de 1 a 6 átomos de carbono. Incluso más preferiblemente, R1 se selecciona de un H, acetilo Ac, ferc-butanoílo, hexanoílo, 2-metilhexanoílo, ciclohexanocarboxilo, octanoílo, decanoílo, lauroílo, miristoílo, Pal, estearoílo, oleoílo y linoleoílo. Aún más preferiblemente, R1 es Ac.

Preferiblemente, R2 es NH2.

Por lo tanto, más preferiblemente, R1 es Ac y R2 es NH2.

Por lo tanto, en esta realización preferida, la secuencia de un péptido de acuerdo con la presente invención es:

Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 10 -NH2).

Se contempla que los aminoácidos usados o presentes en los péptidos de la presente invención sean L-aminoácidos, D-aminoácidos, o combinaciones de los mismos. En una realización preferida, los aminoácidos usados o presentes en los péptidos de la presente invención son L-aminoácidos.

Preferiblemente, los isómeros mencionados anteriormente son estereoisómeros. Se contempla que dichos estereoisómeros sean enantiómeros o diastereoisómeros. Por lo tanto, en una realización preferida de la presente invención, el péptido es una mezcla racémica, una mezcla diastereoisómera, un enantiómero puro o un diastereoisómero puro.

Los péptidos de la presente invención se pueden sintetizar y producir por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Por ejemplo, se pueden sintetizar y producir por síntesis química (preferiblemente, por medio de la síntesis de péptidos en fase sólida), expresando dichos péptidos en cultivos celulares o por medio de la producción transgénica del péptido en plantas o animales. Además, los péptidos de la presente invención se pueden purificar por cualquier medio conocido en el estado de la técnica.

Como es evidente a partir de los ejemplos que se incluyen a continuación, los péptidos de la presente invención proporcionan una interferencia efectiva de la interacción entre Munc18 y Sintaxina-1, lo que lleva, en un nivel presináptico, a una inhibición de la liberación de acetilcolina y, por lo tanto, a una inhibición de contracción muscular. Además, como se puede derivar de los ejemplos que se incluyen a continuación, los péptidos de la presente invención tienen un efecto directo a nivel postsináptico al inducir la relajación muscular directamente en las células musculares. Por lo tanto, los péptidos de la presente invención resuelven los problemas antes mencionados y proporcionan péptidos adicionales o alternativos capaces de tratar (prevenir, reducir y/o eliminar) signos estéticos y/o enfermedades relacionadas con la desregulación de la exocitosis neuronal y/o la contractilidad muscular.

Se divulga en la presente una composición que comprende al menos un péptido de acuerdo con la presente invención.

Se contempla que la composición comprenda un tipo de péptido de la presente invención o una combinación o mezcla de diferentes péptidos de la presente invención.

En una realización preferida, la composición es una composición cosmética.

La composición cosmética comprende una cantidad cosméticamente efectiva del al menos un péptido de la presente invención. Más preferiblemente, la composición cosmética comprende de 0,0001% a 0,05% (m/v) de al menos un péptido de la presente invención, más preferiblemente de 0,0005% a 0,005% (m/v) de al menos un péptido de la presente invención y, aún más preferiblemente, de 0,05% a 0,001% (m/v) de al menos un péptido de la presente invención.

La composición cosmética, como consecuencia de la actividad de los péptidos de la presente invención (esto es, inhibición de la interacción entre Munc18 y Sintaxina-1 y, por lo tanto, inhibición de la liberación de neurotransmisores y modulación de la contracción muscular), proporciona la prevención, reducción y/o eliminación del envejecimiento de la piel y/o signos de expresión (preferiblemente, arrugas). Más precisamente, la composición cosmética proporciona la prevención, reducción y/o eliminación de las arrugas de expresión facial, más preferiblemente, arrugas en la frente, arrugas en el entrecejo, y/o arrugas y líneas finas alrededor de la boca y/o alrededor los ojos.

Se contempla que la composición cosmética también comprenda al menos un ingrediente cosmético adicional. Dicho ingrediente cosmético adicional puede ser al menos un excipiente y/o al menos un principio activo cosmético adicional.

Los ingredientes cosméticos adicionales comprenden los habitualmente usados en el estado de la técnica tales como, por ejemplo, coadyuvantes, tales como un estabilizante, un solubilizante, un vitamínico, un colorante y de perfumería; portadores; y/u otros principios activos cosméticos.

Dichos ingredientes cosméticos adicionales, deberán ser física y químicamente compatibles con el resto de los componentes de la composición y, especialmente, con los péptidos de la presente invención comprendidos en la composición de la presente invención. Asimismo, la naturaleza de dichos ingredientes cosméticos adicionales no debe alterar inaceptablemente los beneficios de los péptidos y composiciones de la presente invención. Dichos ingredientes cosméticos adicionales pueden ser de origen sintético o natural, tales como, por ejemplo, extractos de plantas, o se pueden derivar de un proceso de biofermentación (ver, por ejemplo, CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, 11° ed. (2006)).

Se contempla que los ingredientes cosméticos adicionales mencionados anteriormente comprendan aquellos ingredientes comúnmente usados en las composiciones para el cuidado; limpieza de piel y/o cabello; y/o desodorantes y/o cremas para prevenir la hiperhidrosis; tales como, por ejemplo, agentes inhibidores de la síntesis de melanina, agentes blanqueadores o despigmentantes, agentes antienvejecimiento, agentes inhibidores de la NO-sintasa (por sus siglas en inglés), antioxidantes, agentes anticontaminación atmosférica y/o atrapantes de radicales libres, agentes antiglicación, agentes emulsionantes, emolientes, disolventes orgánicos, propulsores líquidos, acondicionadores de la piel, tales como, por ejemplo, agentes humectantes, sustancias que retienen la humedad, alfahidroxiácidos, humectables, vitaminas, pigmentos o colorantes, tintes, polímeros gelificantes, espesantes, tensioactivos, suavizantes, otros agentes antiarrugas, agentes capaces de reducir o eliminar las bolsas de los ojos, agentes exfoliantes, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, bactericidas, agentes estimulantes de la síntesis de macromoléculas dérmicas o epidérmicas y/o capaces de prevenir o inhibir su degradación, tales como, por ejemplo, agentes estimulantes de la síntesis de colágeno, agentes estimulantes síntesis de elastina, agentes que estimulan la síntesis de laminina, agentes que inhiben la degradación del colágeno, agentes inhibidores de la degradación de elastina, agentes estimulantes de la proliferación de fibroblastos, agentes estimulantes de la proliferación de queratinocitos, agentes estimulantes de la diferenciación de queratinocitos, agentes estimulantes de la síntesis de lípidos y de componentes del estrato córneo (ceramidas, ácidos grasos, etc.), agentes dermorrelajantes, agentes estimulantes de la síntesis de glicosaminoglicanos, agentes reparadores de ADN, agentes protectores de ADN, agentes estimulantes de la actividad del proteosoma, agentes antipruriginosos, agentes para el tratamiento de pieles sensibles, agentes reafirmantes, agentes astringentes, agentes reguladores de la producción de sebo, agentes estimulantes de la lipólisis, agentes anticelulíticos, agentes calmantes, agentes antiinflamatorios, agentes que actúan sobre la circulación capilar y/o la microcirculación, agentes que actúan sobre las mitocondrias celulares, agentes destinados a mejorar la unión dermoepidérmica, conservantes, perfumes, agentes quelantes, extractos de plantas, aceites esenciales, extractos marinos, agentes derivados de un proceso de biofermentación, sales minerales, extractos celulares, y/o filtros solares (fotoprotectores orgánicos o minerales activos contra los rayos ultravioleta A y B), entre otros.

En una realización, al menos uno de los ingredientes cosméticos adicionales es una sustancia o principio activo cosmético que puede ejercer actividades cosméticas iguales, similares, complementarias o diferentes a las divulgadas anteriormente para los péptidos de la presente invención. Se contempla que la composición cosmética comprenda otros agentes antiarrugas o antienvejecimiento, por ejemplo, colágeno, elastina, factores de crecimiento, potenciadores del ácido hialurónico, agentes de función de barrera, agentes iluminadores, agentes estimulantes de la expresión y/o síntesis de colágeno I, III, IV y/o VI, y laminina; agentes estimulantes de la síntesis de glicosaminoglicanos o ácido hialurónico; agentes que estimulan la expresión y/o síntesis de elastina y otras proteínas relacionadas con fibras elásticas; agentes que inhiben la degradación de colágeno y/o de fibras elásticas; agentes que estimulan la expresión y/o síntesis de proteínas relacionadas con mitocondrias (por ejemplo, sirtuinas y aconitasa); agentes que estimulan la expresión y/o síntesis de proteínas de adhesión focal; agentes que estimulan la proliferación y/o diferenciación de queratinocitos y/o fibroblastos; antioxidantes; anticontaminación atmosférica y/o agentes atrapantes de radicales libres; agentes antiglicación; agentes desintoxicantes; agentes que disminuyen el envejecimiento cronológico, envejecimiento ambiental y envejecimiento por inflamación; y agentes reductores de la producción de melanina y/o inhibidores de la tirosinasa, y/o agentes estimulantes de la síntesis de lípidos y de componentes de la epidermis (queratinas) y más específicamente del estrato córneo (queratinas, ceramidas, filagrina, loricrina y SPRR1B, por sus siglas en inglés). Más preferiblemente, el al menos uno de los ingredientes cosméticos adicionales es Argireline® (acetil hexapéptido-8), Leuphasyl® (pentapéptido-3), Inyline® (acetil hexapéptido-30), Syn-Ake® (tripéptido-3), o combinaciones del mismo.

Además, la composición cosmética (o el péptido de la presente invención) se puede formular en cualquier forma usualmente usada en el estado de la técnica como, por ejemplo, solución, suspensión, emulsión, pasta, gel, crema, polvo, aerosol, loción, aceite, linimento, suero, espuma, ungüento, barra o lápiz, incluidas las formulaciones "sin enjuague" y "con enjuague". La composición cosmética también se puede incorporar por medio de técnicas conocidas en el estado de la técnica a diferentes tipos de complementos sólidos, tales como toallitas, hidrogeles, parches adhesivos (o no adhesivos) o mascarillas faciales, o se podría incorporar a diferentes productos de líneas de maquillajes, tales como correctores, bases de maquillaje, lociones o lociones desmaquillantes, entre otros.

También se contempla que la composición cosmética o un péptido de la presente invención, ambos como se divulgan en la presente, también se pueden incorporar en sistemas cosméticos de liberación sostenida y/o portadores, tales como liposomas, milipartículas, micropartículas y nanopartículas, así como en esponjas, vesículas, micelas, miliesferas, microesferas, nanoesferas, lipoesferas, milicápsulas, microcápsulas y nanocápsulas, así como en microemulsiones y nanoemulsiones, con el fin de obtener una mayor penetración del principio activo.

Preferiblemente, la composición cosmética es adecuada o adaptada para ser aplicada por medio de iontoforesis, más preferiblemente, en la cara y/o el cuerpo de un sujeto, más preferiblemente, en la cara, el cuello, las manos y/o las axilas de un sujeto, incluso más preferiblemente en la cara y/o el cuello de un sujeto (preferiblemente, un humano).

Preferiblemente, la composición cosmética es adecuada o adaptada para ser aplicada por medio de inyección subcutánea, más preferiblemente, en la cara y/o el cuerpo de un sujeto, más preferiblemente, en la cara, cuello, manos y/o axilas de un sujeto, incluso más preferiblemente en la cara y/o el cuello de un sujeto (preferiblemente, un humano).

Lo más preferiblemente, la composición cosmética es adecuada o está adaptada para ser aplicada tópicamente (más preferiblemente, en forma de crema), más preferiblemente, en la cara y/o el cuerpo de un sujeto, más preferiblemente, en la cara, cuello, manos y/o axilas de un sujeto, incluso más preferiblemente en la cara y/o el cuello de un sujeto (preferiblemente, un humano).

La composición puede ser una composición farmacéutica.

La composición farmacéutica divulgada en la presente comprende una cantidad farmacéuticamente efectiva del al menos un péptido de la presente invención.

La composición farmacéutica, como consecuencia de la actividad de los péptidos de la presente invención (es decir, inhibición de la liberación de neurotransmisores y, modulación de la contracción muscular), proporciona la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas a la exocitosis neuronal y/o trastorno de la contractilidad muscular, más precisamente para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades asociadas con una desregulación de la formación del complejo SNARE, una desregulación de la contracción del músculo estriado, una desregulación de la liberación de acetilcolina y/o CGRP, y/o una desregulación de la activación de los canales de Ca2+, preferiblemente, demencia senil, demencia relacionada con el Alzheimer, demencia relacionada con el SIDA, epilepsia, esclerosis amiotrófica, esclerosis múltiple/lateral, migraña crónica, mastocitosis, distonía o trastornos de ansiedad.

La composición farmacéutica también proporciona el tratamiento de miotonía, distrofia miotónica, miotonía congénita, enfermedad de Parkinson, parkinsonismo secundario, enfermedad de Huntington, espasticidad, discinesia tardía (TD, por sus siglas en inglés) o distoma (blefaroespasmo, síndrome de Meige, calambres en las manos, distoma de extremidades 0 estrabismo).

La composición farmacéutica se puede presentar en cualquier forma conocida en el estado de la técnica que sea adecuada para la vía elegida. Se contempla que la composición farmacéutica sea adecuada o adaptada para ser administrada por cualquier medio y vía conocida en el estado de la técnica (por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa u oral; en este último caso, por ejemplo, en forma de una solución salina y/o de un material biodegradable, tal como polímeros de ácido poliláctico (PLA, por sus siglas en inglés), ácido poliglicólico (PGA, por sus siglas en inglés), copolímeros de ácido poliláctico-ácido glicólico, policaprolactonas y/o colesterol).

Se contempla que la composición farmacéutica también comprenda al menos un ingrediente farmacéutico adicional. Dicho ingrediente farmacéutico adicional puede ser al menos un excipiente y/o al menos un principio activo farmacéutico adicional. Se contempla que el al menos un ingrediente activo farmacéutico adicional sea una benzodiazepina, clonazepam, lorazepam, diazepam, baclofeno, un anticolinérgico, trihexifenidilo, benztropina, un agente que agota la dopamina, tetrabenazina, clozapina, o combinaciones de los mismos.

En un segundo aspecto, como se expuso anteriormente, la presente invención se refiere a un péptido de acuerdo con la presente invención o una composición que comprende dicho péptido para su uso en medicina, caracterizada porque el péptido es capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1, ya que compite con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4, y en que:

- la secuencia del péptido es SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4; o

- el péptido tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (I):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-R2 (I)

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada;

AA6 es T rp;

R2 se selecciona de un H, de -NR3R4-, de -OR3 y de -SR3, en donde R3 y R4 se seleccionan independientemente de un H, un grupo alifático no cíclico sustituido o no sustituido, un aliciclilo sustituido o no sustituido, un heterociclilo sustituido o no sustituido, un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, un arilo sustituido o no sustituido, y un aralquilo sustituido o no sustituido;

o

- el péptido tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (II):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-R2 (II)

AA1 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada positivamente;

AA2 es cualquier aminoácido;

AA3 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada positivamente;

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral aromática;

Las realizaciones explicadas en el primer aspecto de la presente invención se aplican a los péptidos de este segundo aspecto de la presente invención con las adaptaciones apropiadas. También, las explicaciones realizadas anteriormente para la composición son aplicables a este segundo aspecto de la invención con las adaptaciones oportunas.

En una realización preferida el péptido de fórmula (I) es:

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 5-NH2);

Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 6-NH2);

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 7 -NH2);

Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 8-NH2); y/o

Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 9-NH2).

En otra realización preferida, en el péptido de fórmula (II):

AA1 se selecciona del grupo de Arg;

AA2 es cualquier aminoácido;

AA3 se selecciona del grupo de Arg;

y AA4 se selecciona del grupo de Phe.

más preferiblemente, el péptido de fórmula (II) es:

R1-Arg-Arg-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 10 -R2); y/o

R1-Arg-Met-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 11 -R2).

aún más preferiblemente, el péptido de fórmula (II) es:

Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 10 -NH2);

y/o Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 11 -NH2).

Como se señaló anteriormente y como se deriva directamente de los ejemplos que se incluyen a continuación, los péptidos divulgados anteriormente (y, por lo tanto, las composiciones que los comprenden), son capaces de inhibir la liberación de acetilcolina y la contracción muscular y, por lo tanto, debido a dichas actividades son útiles como medicamentos.

En una realización preferida, los péptidos o composiciones divulgados anteriormente son para uso en la prevención y/o tratamiento (preferiblemente, tratamiento) de una exocitosis neuronal y/o trastorno de la contractilidad muscular.

El trastorno de la contractilidad muscular es, preferiblemente, la hipercontractilidad muscular.

Preferiblemente, la exocitosis neuronal y/o el trastorno de la contractilidad muscular es una enfermedad asociada con una desregulación de la formación del complejo SNARE, contracción del músculo estriado, liberación de acetilcolina y/o CGRP, y/o activación del canal de Ca2+.

Más preferiblemente, la exocitosis neuronal y/o el trastorno de la contractilidad muscular se selecciona de demencia senil, demencia relacionada con el Alzheimer, demencia relacionada con el SIDA, epilepsia, esclerosis amiotrófica, esclerosis múltiple/lateral, mastocitosis, migraña crónica, distonía o trastornos de ansiedad.

Por lo tanto, en una realización preferida, los péptidos o composiciones para uso de acuerdo con la presente invención son para uso en la prevención y/o tratamiento de demencia senil, demencia relacionada con el Alzheimer, demencia relacionada con el SIDA, epilepsia, esclerosis amiotrófica, esclerosis múltiple/lateral, mastocitosis, migraña crónica, distonía o trastornos de ansiedad. En cuanto a dichas enfermedades, la demencia senil, demencia relacionada con el Alzheimer, demencia relacionada con el SIDA, epilepsia, esclerosis amiotrófica, esclerosis múltiple/lateral, migraña crónica y trastornos de ansiedad son trastornos de exocitosis neuronal. Por otro lado, la distonía es un trastorno de la contractilidad muscular.

Preferiblemente, la distonía se selecciona de blefaroespasmo, síndrome de Meige, calambres en las manos, distonía de extremidades o estrabismo.

En otra realización preferida, los péptidos o composiciones para uso de acuerdo con la presente invención son para su uso en la prevención y/o tratamiento de miotonía, distrofia miotónica, miotonía congénita, enfermedad de Parkinson, parkinsonismo secundario, enfermedad de Huntington, espasticidad o discinesia tardía (DT). Dichas enfermedades son trastornos de la contractilidad muscular.

Preferiblemente, el péptido o la composición, como se explicó anteriormente, se usa en una cantidad terapéuticamente efectiva.

En una realización preferida, los péptidos y las composiciones para uso de acuerdo con la presente invención son para uso en un mamífero, más preferiblemente en un humano.

En una realización preferida, la composición es una composición farmacéutica de acuerdo con lo expuesto anteriormente.

El péptido o la composición divulgados anteriormente se pueden usar por cualquier medio, o a través de cualquier vía conocida en el estado de la técnica. En cualquier caso, el péptido o composición se adaptará al medio y/o vía elegidos (por ejemplo, por vía subcutánea, intramuscular, intravenosa u oral; en este último caso, por ejemplo, en forma de solución salina y/o de un material biodegradable, tal como polímeros de ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA), copolímeros de ácido poliláctico y ácido glicólico, policaprolactonas y/o colesterol).

Como ya se ha expuesto anteriormente, en un tercer aspecto, la presente invención se refiere al uso como cosmético de un péptido o una composición que comprende dicho péptido para prevenir, reducir y/o eliminar el envejecimiento de la piel y/o signos de expresión en un sujeto, caracterizado por que el péptido es capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1, ya que compite con SEQ ID NO: 3 y/o s Eq ID NO: 4, y en que:

- la secuencia del péptido es SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4; o

- el péptido tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (I):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-R2 (I)

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada;

AA6 es Trp;

o

- el péptido tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (II):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-R2 (II)

AA2 es cualquier aminoácido;

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral aromática;

Las realizaciones explicadas en el primer aspecto de la presente invención se aplican a los péptidos de este tercer aspecto de la presente invención con las adaptaciones apropiadas. También, las explicaciones realizadas anteriormente para la composición son aplicables a este tercer aspecto de la invención con las adaptaciones oportunas.

En una realización preferida el péptido de fórmula (I) es:

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 5-NH2);

Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 6-NH2);

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 7 -NH2);

Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 8-NH2); y/o

Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 9-NH2).

En otra realización preferida, en el péptido de fórmula (II):

AA1 se selecciona del grupo de Arg;

AA2 es cualquier aminoácido;

AA3 se selecciona del grupo de Arg; y

AA4 se selecciona del grupo de Phe.

más preferiblemente, el péptido de fórmula (II) es:

R1-Arg-Arg-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 10 -R2); y/o

R1-Arg-Met-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 11 -R2).

aún más preferiblemente, el péptido de fórmula (II) es:

Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 10 -NH2); y/o

Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 11 -NH2).

Como es evidente, los signos mencionados anteriormente son signos cosméticos.

En este tercer aspecto, la composición es preferiblemente una composición cosmética de acuerdo con lo expuesto anteriormente.

Los signos cosméticos del envejecimiento de la piel son, preferiblemente, las arrugas.

En la realización más preferida, los signos de envejecimiento y/o expresión de la piel son las arrugas faciales (preferiblemente, signos de expresión) y/o la asimetría facial.

En una realización preferida, el péptido o la composición cosmética se aplica por medio de iontoforesis, más preferiblemente, en la cara y/o el cuerpo del sujeto, más preferiblemente, en la cara, el cuello, las manos y/o las axilas del sujeto, incluso más preferiblemente en la cara y/o el cuello del sujeto (preferiblemente, un humano).

En otra realización preferida, el péptido o la composición cosmética se aplica por medio de inyección subcutánea, más preferiblemente, en la cara y/o el cuerpo del sujeto, más preferiblemente, en la cara, cuello, manos y/o axilas del sujeto, incluso más preferiblemente en la cara y/o el cuello del sujeto (preferiblemente, un humano).

En la realización más preferida, el péptido o la composición cosmética se aplica tópicamente (más preferiblemente en forma de crema), más preferiblemente en la cara y/o el cuerpo del sujeto, más preferiblemente en la cara, cuello, manos y/o axilas del sujeto, incluso más preferiblemente en la cara y/o el cuello del sujeto (preferiblemente, un humano).

Preferiblemente, el sujeto es un mamífero, incluso más preferiblemente, un humano.

Además, en el uso como un cosmético de la presente invención, el péptido o la composición cosmética se usan en una cantidad cosméticamente efectiva. Más preferiblemente, el péptido de la presente invención se usa a una concentración de 0,0001% a 0,05% (m/v), más preferiblemente de 0,0005% a 0,005% (m/v) y aún más preferiblemente de 0,05%-0,001% (m/v).

Se contempla que la composición cosmética, como ya se ha expuesto anteriormente, comprenda también al menos un ingrediente cosmético adicional. Dicho ingrediente cosmético adicional puede ser al menos un excipiente y/o al menos un principio activo cosmético adicional, que puede ser como se explicó anteriormente. También se contempla que el péptido de la presente invención se utilice en combinación con al menos un ingrediente cosmético adicional que esté de acuerdo con lo expuesto anteriormente.

Además, el péptido de la presente invención y la composición cosmética se pueden formular en cualquier forma habitualmente usada en el estado de la técnica, tales como, por ejemplo, solución, suspensión, emulsión, pasta, gel, crema, polvo, aerosol, loción, aceite, linimento, suero, espuma, ungüento, barra o lápiz, incluidas las formulaciones "sin enjuague" y "con enjuague"'. El péptido y la composición cosmética también se pueden incorporar por medio de técnicas conocidas en el estado de la técnica a diferentes tipos de complementos sólidos, tales como toallitas, hidrogeles, parches adhesivos (o no adhesivos) o mascarillas faciales, o bien se podría incorporar hasta diferentes productos de líneas de maquillaje, tales como correctores, bases de maquillaje, lociones o lociones desmaquillantes, entre otros.

Para permitir una mejor comprensión, la presente invención se describe con más detalle a continuación con referencia a los dibujos adjuntos, que se presentan a modo de ejemplo, y con referencia a ejemplos ilustrativos y no limitantes.

La figura 1 muestra el porcentaje de liberación de acetilcolina in vitro de las células LAN (por sus siglas en inglés) tratadas con los péptidos analizados en comparación con el control positivo (es decir, estableciendo el porcentaje de liberación de acetilcolina de la muestra de control positivo en 100% y posteriormente realizando la comparación con el resto de las muestras). La figura 1 muestra los resultados obtenidos para los péptidos: Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 (A), Ac-SEQ ID NO: 6-NH2 (B), Ac-SEQ ID NO: 7-NH2 (C), Ac-SEQ ID NO: 8 -NH2 (D), Ac-SEQ ID NO: 9-NH2 (E), Ac-SEQ ID NO: 10-NH2 (F), Ac-SEQ ID NO: 11-NH (G), Ac-SEQ ID NO: 13-NH2 (H), y Ac-SEQ ID NO: 14-NH2 (I). Todos los péptidos, excepto Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (D), se probaron en concentraciones de 0,001 mg/mL, 0,005 mg/mL y 0,01 mg/mL; y el péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (D) se analizó a 0,005 mg/mL y 0,05 mg/mL. Para las figura 1D las columnas de izquierda a derecha en el eje X corresponden a: estado basal (células sin tratamiento), control positivo (células tratadas con 50 mM de KCI), células tratadas con 100 nM de toxina (neurotoxina botulínica A, cadena ligera (BoNT A LC, por sus siglas en inglés) producida de acuerdo con Ibañez C, Blanes-Mira C, Fernandez-Ballester G, Planells-Cases R, and Ferrer-Montiel A, (2004) Modulation of botulinum neurotoxin A catalytic domain estabilidad por fosforilación de tirosina, FEBS Letters, 578, 121-127), células tratadas con 0,1 |jM Palmitoil-Argireline® (palmitoil-acetil hexapéptido-8®), y células tratadas con 0,005 mg/mL y 0,05 mg/mL del péptido correspondiente. Por su parte, para la figura 1A a 1C, y 1E a 1I, las columnas de izquierda a derecha en el eje X corresponden a: estado basal (células sin tratamiento), control positivo (células tratadas con 50 mM de KCI), células tratadas con 100 nM de toxina (BoNT A LC) y células tratadas con 0,001 mg/mL, 0,005 mg/mL y 0,01 mg/mL del péptido correspondiente. Para las figuras 1A a 1I el eje Y muestra el porcentaje de liberación de acetilcolina (con respecto al control positivo).

La figura 2 muestra el porcentaje de unión del complejo Munc18-Sintaxina-1 respecto al control (sin tratamiento), que representa el 100% de unión. En la figura 2 se observa la capacidad de los péptidos Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (A) y Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 (B) para inhibir la formación del complejo Munc18-Sintaxina-1. Las columnas de izquierda a derecha en el eje X de ambas figuras 2A y 2B, corresponden a: control y concentración 0,1, 0,5 y 1 mM del péptido correspondiente a una relación 100 nM de Munc18:10 nM de Sintaxina-1 para el primer grupo de columnas (grupo de columnas a la izquierda) y, para el segundo grupo de columnas, control y concentración 0,1,0,5 y 1 mM del péptido correspondiente a una relación 100 nM de Munc18:5 nM de Sintaxina-1 (grupo de columnas a la derecha). Para ambas figuras el eje Y muestra el porcentaje de formación del complejo, siendo 100% la señal obtenida sin ningún tratamiento.

La figura 3 muestra la modulación en el perfil de expresión génica de miocitos esqueléticos humanos inducida por el tratamiento con los péptidos de la presente invención. La figura 3A muestra los resultados obtenidos para el tratamiento con Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (a una concentración de 0,05 y 0,5 mg/mL, durante 6 horas), en donde las barras, de arriba a abajo, se refieren a los siguientes genes: SCN3A (subunidad alfa 3 del canal controlado por voltaje de sodio), UTRN (utrofina), ACTA1 (actina alfa 1), TNNC1 (troponina C1), CALM3 (calmodulina 3), CAV1 (caveolina 1), CACNB1 (subunidad auxiliar beta 1 del canal controlado por voltaje de calcio), LRP4 (proteína 4 relacionada con el receptor de LDL) y MYH1 (cadena pesada de miosina 1). En la figura 3A los resultados mostrados para los genes MHY1, LRP4, CACNB1 y UTRN corresponden a un tratamiento con 0,05 mg/mL, mientras que el resto corresponde a un tratamiento con 0,5 mg/mL. La figura 3B muestra los resultados obtenidos para el tratamiento con Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 a una concentración de 0,5 mg/mL durante 24 horas, en donde las barras, de arriba hacia abajo, se refieren a los siguientes genes: RAPSN (proteína asociada al receptor de la sinapsis) y ATP2A (transportador de Ca2+ de ATPasa del retículo sarcoplásmico/endoplásmico). La figura 3C muestra los resultados obtenidos para el tratamiento con Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 (a una concentración de 0,05 mg/mL y durante 24 horas), en donde las barras, de arriba a abajo, hacen referencia a los siguientes genes: UTRN (utrofina), ACTA1 (actina alfa 1), TNNC1 (troponina C1), RAPSN (proteína asociada al receptor de la sinapsis), SCN3A (subunidad alfa 3 del canal controlado por voltaje de sodio) y MYH1. La figura 3D muestra los resultados obtenidos para el tratamiento con Ac-SEQ ID NO: IO-NH2 (a una concentración de 0,1 mg/mL y durante 24 horas), en donde las barras, de arriba a abajo, se refieren a los siguientes genes: UTRN (utrofina), TNNC1 (troponina C1), SCN3A (subunidad alfa 3 del canal controlado por voltaje de sodio), CHRNA1 (subunidad alfa 1 del receptor nicotínico de acetilcolina) y CACNB1 (subunidad auxiliar beta 1 del canal controlado por voltaje de calcio). En los cuatro casos, el eje X se refiere al cambio de veces con respecto al estado basal. Un cambio de veces negativo se refiere a la regulación negativa de la expresión génica, mientras que un cambio de veces positivo se refiere a la regulación positiva.

La figura 4 muestra la disminución de la entrada de calcio en los miocitos de músculo esquelético humano después del tratamiento con el péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 y estimulación con KCI 60 mM respecto al control (muestra sin tratar estimulada con KCI 60 mM) que se establece como el 100%. Las columnas de izquierda a derecha en el eje X corresponden a: control y 0,01, 0,05 y 0,1 mg/mL de concentración de péptido. El eje Y muestra el porcentaje de disminución de la señal de calcio respecto al control, establecido como el 100% de la señal.

La figura 5 muestra imágenes representativas de los niveles de expresión de la proteína de cadena pesada de miosina, en células de músculo esquelético humano primario no tratadas (figura 5A) y en células de músculo esquelético humano primario tratadas con 0,05 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (figura 5B). Se observa una reducción de los niveles de proteína de la cadena pesada de miosina en las células de músculo esquelético humano primario tratadas con 0,05 mg/mL de péptido con respecto a las células no tratadas, lo que se puede ver como una pérdida de tinción o de señal en la figura 5B en comparación con la figura 5A.

La figura 6 muestra la disminución de los niveles de proteína de cadena pesada de miosina en células de músculo esquelético humano primario después del tratamiento con el péptido A c-SEq ID NO: 8-NH2 respecto al control basal (células no tratadas) que se establece como el 100%. Las columnas de izquierda a derecha en el eje X corresponden a células no tratadas y 0,05 y 0,5 mg/mL de concentración del péptido. El eje Y muestra los niveles de proteína de cadena pesada de miosina con respecto al control basal, establecidos como el 100% de la señal (en base a la señal de fluorescencia observada para la proteína de cadena pesada de miosina en cada uno de los grupos de tratamiento, medida por medio fluorescencia celular media).

La figura 7 muestra la modulación en la frecuencia de contracción observada en cocultivos de neuronas motoras humanas y miocitos esqueléticos humanos después del tratamiento con el péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2, acetil hexapéptido-8, como control de referencia, o a-bungarotoxina, como control positivo de inhibición, respecto al control basal (células no tratadas) que se establece como el 100%. La línea con cuadrados representa la frecuencia de contracción de las células no tratadas (control basal). La línea con cruces representa la frecuencia de contracción por el control positivo de inhibición de la contracción, a-bungarotoxina. La línea con rombos representa la frecuencia de contracción del acetil hexapéptido-8 de referencia a 0,5 mg/mL. La línea con círculos representa la frecuencia de contracción por péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 a 0,1 mg/mL; y la línea con triángulos representa la frecuencia de contracción por péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 a 0,05 mg/mL. El eje X corresponde a la duración del tratamiento por los diferentes activos y señala diferentes puntos de tiempo: T0, T30min, T2h, T24h y Recuperación. T0 corresponde a las contracciones antes del tratamiento con los compuestos antes mencionados; T30min corresponde al tratamiento de 30 min; T2h corresponde al tratamiento de 2 h; T24h corresponde al tratamiento de 24 h y Recuperación corresponde a la incubación de 24 h después de la eliminación de todos los compuestos. El eje Y muestra el porcentaje de frecuencia de contracción respecto al control basal (células no tratadas), establecido como el 100% de la señal.

La figura 8 muestra la disminución de la exocitosis en una línea celular de neuroblastoma humano después del tratamiento con el péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 o el acetil hexapéptido-8 de referencia respecto al control basal de células no tratadas que se establece como el 100%. Las columnas de izquierda a derecha en el eje X corresponden a células no tratadas, células tratadas con 1 mg/mL de acetil hexapéptido-8 y células tratadas con 0,01 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2. El eje Y muestra el porcentaje de la señal de fluorescencia correspondiente al nivel de exocitosis con respecto al control basal, establecido al nivel del 100%.

La figura 9 muestra el retraso en el tiempo de exocitosis en una línea celular de neuroblastoma humano después del tratamiento con el péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 o el acetil hexapéptido-8 de referencia respecto al control basal de células no tratadas que se establece como el 100%. Las columnas de izquierda a derecha en el eje X corresponden a células no tratadas, 1 mg/mL de acetil hexapéptido-8 y 0,01 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2. El eje Y muestra el porcentaje del tiempo de respuesta correspondiente al retraso de la exocitosis con respecto al control basal, establecido al nivel del 100%.

La figura 10 muestra la producción de colágeno tipo I por fibroblastos dérmicos humanos primarios después del tratamiento con Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 con respecto al control basal (células no tratadas) que se establece como el 100%, a las 24 h del inicio del tratamiento (figura 10a ) y a las 48 h del inicio del tratamiento (figura 10B). Las columnas de izquierda a derecha en el eje X corresponden a: control basal (células no tratadas) y células tratadas con 0,01, 0,05 o 0,1 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2, respectivamente. El eje Y muestra el porcentaje de aumento de la síntesis de proteína de colágeno tipo I con respecto al control, establecido al nivel del 100%.

Ejemplos

Abreviaturas:

Las abreviaturas usadas para los aminoácidos siguen las recomendaciones de la Comisión Conjunta de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB de 1983 delimitadas en Eur. J. Biochem. (1984) 138:937.

Ac, acetilo; Ala, alanina; Arg, arginina; Asn, asparagina; Asp, ácido aspártico; Boc, terc-butiloxicarbonilo; C-terminal, carboxilo-terminal; DCM, diclorometano; DIEA, N,N’-diisopropiletilamina; DIPCDI, N,N’-diisopropilcarbodiimida; DMF, N,N-dimetilformamida; eq, equivalente; ESI-MS, espectrometría de masas de ionización por electropulverización; Fmoc, 9-fluorenilmetiloxicarbonilo; Glu, ácido glutámico; hiPSC, células madre pluripotentes inducidas por humanos; His, histidina; HOBt, 1-hidroxibenzotriazol; HPLC, cromatografía líquida de alta resolución; HRP, peroxidasa de rábano picante; Ile, isoleucina; INCI, Nomenclatura Internacional de Ingredientes Cosméticos; MBHA, p-metilbencidrilamina; Leu, leucina; Lys, lisina; Me, metilo; MeCN, acetonitrilo; MeOH, metanol; Met, metionina; N-terminal, amino-terminal; Pal, palmitoílo; Pbf, 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo; PFA, paraformaldehído; PMA, forbol 12-miristato 13-acetato; Phe, Fenilalanina; PMSF, fenilmetanosulfonilo; RT, temperatura ambiente; tBu, terc-butilo; Thr, Treonina; TFA, ácido trifluoroacético; TIS, triisopropilsilano; TMB, tetrametilbencidina; Trt, trifenilmetilo o tritilo; Trp, triptófano; Tyr, tirosina (por sus siglas en inglés, respectivamente).

En cuanto a los procedimientos de síntesis química incluidos en los ejemplos, se observa que todos los procesos de síntesis se realizaron en jeringas de polipropileno provistas de discos de polietileno poroso o reactores de Pyrex® provistos de placas porosas. Todos los reactivos y disolventes son de calidad de síntesis y se usaron sin ningún tratamiento adicional. Los disolventes y los reactivos solubles se eliminaron por succión. El grupo Fmoc se eliminó con piperidina-DMF (2:8, v/v) (al menos 1 x 1 min, 2 x 10 min, 5 mL/g de resina) (Lloyd Williams P. et al, Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteínas, CRC, 1997, Boca Raton (FL, EE. UU.)). Los lavados entre las etapas de desprotección, acoplamiento y, nuevamente, desprotección, se realizaron con DMF (3 x 1 min) y DCM (3 x 1 min) cada vez usando 10 mL de disolvente/g de resina. Las reacciones de acoplamiento se realizaron con 3 mL de disolvente/g de resina. El control de los acoplamientos se realizó llevando a cabo la prueba de la ninhidrina (Kaiser E. et al, Anal. Biochem., 1970, 34: 595598). Todas las reacciones de síntesis y los lavados se llevaron a cabo a RT.

Ejemplo 1. Determinación in silico de péptidos que interfieren en la interacción de Mync18-Sintaxina-1.

En este experimento, el objetivo fue generar péptidos in silico con afinidad y/o especificidad por las regiones de interacción de Munc18 y Sintaxina-1 y, por lo tanto, que pudieran competir, interferir y romper la interacción y/o unión entre dichas dos proteínas.

Dado que la estructura del complejo Munc18-Sintaxina-1 es conocida y está disponible a una resolución de 2,6 A (número de referencia del Banco de datos de proteínas 3C98; PDB, por sus siglas en inglés), se generó un modelo de estructura tridimensional de esta interacción y se seleccionaron los fragmentos de interacción de Munc18 incluidos en la tabla 1.

Tabla 1. Fragmentos de interacción de Munc18 con Sintaxina-1 seleccionados por medio del estudio in silico.

Sobre la base de dichos fragmentos objetivo, como primer paso de diseño, se mutó el péptido de tipo silvestre (considerado como el péptido aglutinante 100% ) a poli-Ala (considerado como el péptido no aglutinante 0%), y todas las posiciones se trataron como independientes. Cada posición individual se mutó a los 20 aminoácidos naturales, mientras que las otras posiciones permanecieron como Ala. Se determinó la energía de unión teórica entre el fragmento y el resto del complejo para valorar la mejora de la interacción con la mutagénesis en las diferentes posiciones. La tabulación y la normalización de las energías de unión produjeron matrices de puntuación que mostraron qué tan bien encaja un residuo de aminoácido en una posición dada del péptido. Estas matrices se usaron para proponer y construir una lista clasificada de péptidos que putativamente inhiben la formación del complejo Munc18-Sintaxina-1.

En un segundo paso del experimento, la lista de péptidos se modeló en el complejo, pero mutando todas las posiciones en el péptido al mismo tiempo. De esta forma se aseguró que se tuvieran en cuenta las interacciones o incompatibilidades entre posiciones adyacentes en los péptidos. Se evaluó nuevamente la energía de enlace de la interacción péptidocomplejo y se reordenaron los péptidos de acuerdo con esta energía. Las energías de unión, que podrían ser mayores a 100 % o menores a 0 %, se compararon posteriormente con el 100% de unión (tipo silvestre) y el 0 % de unión (péptido poli-Ala). Los mejores péptidos se seleccionaron y propusieron para su posterior estudio y verificación (ver tabla 2).

Tabla 2. Péptidos del estudio in silico seleccionados para su posterior estudio y verificación.

Ejemplo 2. Síntesis y preparación de los péptidos.

-_____ Obtención de la resina Fmoc-AA-i-AA2-AA3-AA4-AAs-AA6-Rink-MBHA, en donde AA1 es L-His; AA2 es L-Ile o L-Ala; AA3 es L-Leu o L-Met; AA4 es L-Asp o L-Arg; AA5 es L-Met, L-Trp o L-Phe; y AA6 es L-Trp.

Se normalizaron los pesos. 4,8 g (2,5 mmol) de la resina Fmoc-Rink-MBHA con una funcionalización de 0,52 mmol/g se trataron con piperidina-DMF de acuerdo con el protocolo general descrito conocido en el estado de la técnica para eliminar el grupo Fmoc. Se incorporaron 3,94 g de Fmoc-L-Trp(Boc)-OH (7,5 mmol; 3 eq) a la resina desprotegida en presencia de DlPcDI (1,17 mL; 7,5 mmol; 3 eq) y HOBt (1,01 g; 7,5 mmol; 3 eq) usando d Mf como disolvente por una hora.

Posteriormente, la resina se lavó como se describe en los métodos generales conocidos en el estado de la técnica y se repitió el tratamiento de desprotección del grupo Fmoc para acoplar el siguiente aminoácido. Siguiendo los protocolos previamente descritos, se acoplaron secuencialmente 2,90 g de Fmoc-Phe-OH, 2,78 g de Fmoc-L-Met-OH o 3,94 g de Fmoc-L-Trp(Boc)-OH (7,5 mmol; 3 eq); subsecuentemente 4,86 g de Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH o 3,08 g de Fmoc-L-Asp(tBu)-OH (7,5 mmol; 3 eq); subsecuentemente 2,65 g de Fmoc-L-Leu-OH o 2,78 g de Fmoc-L-Met-OH (7,5 mmol; 3 eq); subsecuentemente 2,33 g de Fmoc-L-Ala-OH o 2,65 g de Fmoc-L-Ile-OH (7,5 mmol; 3 eq) y subsecuentemente4,64 g de Fmoc-L-His(Trt)-OH (7,5 mmol; 3 eq), cada acoplamiento en presencia de 1,01 g de HOBt (7,5 mmol; 3 eq) y 1,17 mL de DIPCDI (7,5 mmol; 3 eq). Como ya se señaló anteriormente, entre cada paso de adición de aminoácidos, se realizó un tratamiento de desprotección del grupo Fmoc.

Después de la síntesis, las resinas peptídicas se lavaron con DCM (5 veces por 3 minutos cada uno) y se secaron bajo vacío.

-_____ Obtención de la resina Fmoc-AA1-AA2-AA3-AA4-Rink-MBHA, en donde AA1 es L-Arg; AA2 es L-Arg o L-Met; AA3 es L-Arg y AA4 es L-Phe.

Se normalizaron los pesos. 4,8 g (2,5 mmol) de la resina Fmoc-Rink-MBHA con una funcionalización de 0,52 mmol/g se trataron con piperidina-DMF de acuerdo con el protocolo general descrito en el estado de la técnica para eliminar el grupo Fmoc. Se incorporaron 2,90 g de Fmoc-L-Phe-OH (7,5 mmol; 3 eq) a la resina desprotegida en presencia de DIPCDI (1,17 mL; 7,5 mmol; 3 eq) y HOBt (1,01 g; 7,5 mmol; 3 eq) usando DMF como disolvente por una hora.

Posteriormente se lavó la resina como se describe en los métodos generales y se repitió el tratamiento de desprotección del grupo Fmoc para acoplar el siguiente aminoácido. Siguiendo los protocolos descritos anteriormente, se acoplaron secuencialmente 4,86 g de Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH (7,5 mmol; 3 eq); subsecuentemente 4,86 g de Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH o 2,78 g de Fmoc-L-Met-OH (7,5 mmol; 3 eq) y subsecuentemente 4,86 g de Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH (7,5 mmol; 3 eq), cada acoplamiento en presencia de 1,01 g de HOBt (7,5 mmol; 3 eq) y 1,17 mL de DIPCDI (7,5 mmol; 3 eq). Como ya se señaló anteriormente, entre cada paso de adición de aminoácidos, se realizó un tratamiento de desprotección del grupo Fmoc.

-_____ Obtención de resina Fmoc-AAi-AA2-AA3-AA4-AAs-AA6-AA7-AA8-R¡nk-MBHA. en donde AA1 es L-Glu; AA2 es L-Arg; AA3 es L-Ile; AA4 es L-Asn; AAs es L-Lvs: AA6 es L-Arg o L-Met; AA7 es L-Arg y AAs es L-Trp o L-Tyr.

Se normalizaron los pesos. 4.8 g (2.5 mmol) de la resina Fmoc-Rink-MBHA con una funcionalización de 0.52 mmol/g se trataron con piperidina-DMF de acuerdo con el protocolo general descrito conocido en el estado de la técnica para eliminar el grupo Fmoc. Se incorporaron 3.94 g de Fmoc-L-Trp(Boc)-OH o 3.44 g de Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH (7.5 mmol; 3 eq) a la resina desprotegida en presencia de DIPCDI (1.17 mL; 7.5 mmol; 3 eq) y HOBt (1.01 g; 7.5 mmol; 3 eq) usando DMF como disolvente por una hora.

Posteriormente se lavó la resina como se describe en los métodos generales y se repitió el tratamiento de desprotección del grupo Fmoc para acoplar el siguiente aminoácido. Siguiendo los protocolos descritos anteriormente. se acoplaron secuencialmente 4.86 g de Fmoc-Arg(Pbf)-OH (7.5 mmol; 3 eq); subsecuentemente 4.86 g de Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH o 2.78 g de Fmoc-L-Met-OH (7.5 mmol; 3 eq); subsecuentemente 3.51 g de Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (7.5 mmol; 3 eq); subsecuentemente 4.45 g de Fmoc-L-Asn(Trt)-OH (7.5 mmol; 3 eq); subsecuentemente 2.65 g de Fmoc-L-Ile-OH; subsecuentemente 4.86 g de Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH y subsecuentemente 3.19 g de Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH (7.5 mmol; 3 eq). cada acoplamiento en presencia de 1.01 g de HOBt (7.5 mmol; 3 eq) y 1.17 mL de DIPCDI (7.5 mmol; 3 eq). Como ya se señaló anteriormente. entre cada paso de adición de aminoácidos. se realizó un tratamiento de desprotección del grupo Fmoc.

Después de la síntesis. las resinas peptídicas se lavaron con DCM (5 veces por 3 minutos cada uno) y se secaron bajo vacío.

Usando los procedimientos de síntesis mencionados anteriormente. con la selección requerida de aminoácidos. se sintetizaron las siguientes secuencias:

His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp (SEQ ID NO: 5);

His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp (SEQ ID NO: 6);

His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp (SEQ ID NO: 7);

His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp (SEQ ID NO: 8);

His-Ile-Met-Asp-T rp-T rp (SEQ ID NO: 9);

Arg-Arg-Arg-Phe (SEQ ID NO: 10);

Arg-Met-Arg-Phe (SEQ ID NO: 11);

Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Arg-Arg-Trp (SEQ ID NO: 13); y

Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Met-Arg-Tyr (SEQ ID NO: 14).

Ejemplo 3. Eliminación del grupo protector Fmoc N-Terminal de los péptidos sintetizados de acuerdo con el Ejemplo 2.

El grupo Fmoc N-terminal de las resinas peptídicas se desprotegió con piperidina al 20% en DMF (1 x 1 min 2 x 10 min) (Lloyd Williams P. et al. Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteínas. CRC. 1997. Boca Raton (FL. EE. UU.)). Las resinas peptídicas se lavaron con DMF (5 x 1 min). DCM (4 x 1 min) y se secaron bajo vacío.

Ejemplo 4. Procedimiento de introducción del grupo Acetilo R1 en las resinas peptídicas obtenidas de acuerdo con el Ejemplo 3.

1 mmol (1 eq) de las resinas peptídicas obtenidas de acuerdo con el Ejemplo 2 se trató con 25 equivalentes de anhídrido acético en presencia de 25 equivalentes de DIEA usando 5 mL de d Mf como disolvente. Se dejaron reaccionar por 30 minutos. después de lo cual las resinas peptídicas se lavaron con DMF (5 x 1 min). DCM (4 x 1 min) y se secaron bajo vacío.

Ejemplo 5. Proceso de escisión del soporte polimérico de las resinas peptídicas obtenidas de acuerdo con los Ejemplos 3 y 4.

Se normalizaron los pesos. 200 mg de la resina peptídica seca obtenida en cualquiera de los Ejemplos 2. 3 o 4 se trataron con 5 mL de TFA/TIS/H2O (90:5:5) por 2 horas a temperatura ambiente bajo agitación. Los filtrados se recolectaron y se precipitaron usando 50 mL (8 a 10 veces) de éter dietílico frío. Las soluciones etéreas se evaporaron hasta sequedad bajo presión reducida y a temperatura ambiente. los precipitados se redisolvieron en MeCN al 50% en H2O y se liofilizaron.

Ejemplo 6. Caracterización de los péptidos sintetizados y preparados de acuerdo con el Ejemplo 5.

El análisis por HPLC de los péptidos obtenidos de acuerdo con el Ejemplo 5 se realizó con un equipo Shimadzu (Kyoto. Japón) usando una columna de fase inversa (150 x 4.6 mm. XBridge Peptide BEH C18. 3.5 pm. Waters. EE. UU.) en gradientes de MeCN (+0.036% TFA) en H2O (+0.045% TFA) a una velocidad de flujo de 1.25 mL/min. y la detección se realizó a 220 nm. Todos los péptidos mostraron una pureza mayor al 80%. La identidad de los péptidos obtenidos se confirmó por ESI-MS en un detector Water ZQ 4000 usando MeOH como fase móvil y una velocidad de flujo de 0.2 mL/min. Los resultados obtenidos demostraron que los péptidos incluidos en la tabla 3 se sintetizaron efectivamente.

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Tabla 3. Péptidos finales sintetizados.

Ejemplo 7. Medición de la liberación de acetilcolina.

Los péptidos incluidos en la tabla 3 anterior se sintetizaron de acuerdo con los Ejemplos 2 a 6.

Dichos péptidos se probaron en cuanto a su capacidad para modular la liberación de acetilcolina in vitro. Para este fin, las células ^lAⁿse sembraron en placas de cultivo de 48 pozos y se les permitió alcanzar la confluencia adecuada en condiciones controladas (37 °C, 5% de CO2) antes de inducir la diferenciación por el remplazo del medio de cultivo por Neurobasal® A, suplementado con el Suplemento N-2, GlutaMAX™, cloruro de colina y factor de inhibición de la leucemia (GIBCO, Life Technologies, MA, EE. UU.). Una vez que las células adquirieron su morfología diferenciada, se trataron con los péptidos mencionados anteriormente a las siguientes concentraciones por 1 hora: todos los péptidos, excepto Ac-SEQ ID NO: 8-NH2, a 0,001 mg/mL, 0,005 mg/mL y 0,01 mg/mL; y el péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 a 0,005 mg/mL y 0,05 mg/mL. Posteriormente, las células se lavaron con HEPES (por sus siglas en inglés), antes de la estimulación de la liberación de acetilcolina por la despolarización con solución de KCl 50 mM externa. Las células no estimuladas se incubaron con una solución de KCI 4 mM no despolarizante. Después de 30 minutos de incubación con la correspondiente solución de KCI despolarizante o no despolarizante, se recolectaron los sobrenadantes celulares y se usaron para medir los niveles de acetilcolina con el kit de ensayo de acetilcolina Amplex Red (ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.). Los sedimentos celulares se usaron para determinar el contenido de proteínas por el ensayo de prueba de proteínas BCA (por sus siglas en inglés, kit de ensayo de proteínas Pierce BCA, ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.), (con fines de normalización de datos).

El porcentaje de inhibición de la liberación de acetilcolina se calculó considerando una liberación de 100% para el control positivo (células no tratadas y estimuladas con KCI).

Los resultados obtenidos aparecen resumidos en la tabla 4:

Tabla 4. Resumen de los resultados obtenidos en el Ejemplo 7.

Los resultados de este experimento también aparecen resumidos en las figuras 1A a 1I. Como se puede deducir directamente de dichas cifras, los péptidos marcados como activos en la modulación de la acetilcolina en la tabla 4 muestran una disminución significativa en la liberación de acetilcolina en todas las concentraciones probadas. Por otro lado, los péptidos marcados como no activos en la tabla 4 muestran una inhibición de moderada a baja en las concentraciones más bajas, y una pérdida completa de la inhibición en la concentración más alta. Dichos péptidos no mostraron una disminución estadística en la liberación de acetilcolina en ninguna de las concentraciones probadas. El hecho de que a bajas concentraciones se observara una ligera inhibición era de esperar debido a la complicación técnica de este tipo de células y la inherente variabilidad de a prueba, pero la pérdida completa de actividad a la mayor concentración muestra claramente que estos péptidos (Ac-SEQ ID NO: 13-NH2 y Ac-SEQ ID NO: 14 -NH2) no pudieron inhibir la liberación de acetilcolina.

Como se ve en el estado de la técnica (Blanes-Mira C, Clemente J, Jodas G, et al. (2002), A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity, International Journal of Cosmetic Science, 24, 303-310), la inhibición de la exocitosis de las células cromafines permeabilizadas alcanzó valores máximos de 50% cuando se usa BoNT A, o de 40% cuando se usa Argireline®. Por tanto, los resultados obtenidos en este ejemplo comprueban la alta actividad de los péptidos de la presente invención ya que al probar la inhibición de la liberación de acetilcolina directamente sobre células LAN, ni siquiera permeabilizadas, se obtuvieron valores de 20-30% de inhibición.

Ejemplo 8. Ensayo de unión.

Los siguientes péptidos se sintetizaron basados en el estudio in silico del Ejemplo 1 y de acuerdo con los Ejemplos 2 a 6:

Ac-SEQ ID NO: 5-NH2

Ac-SEQ ID NO: 8-NH2

La capacidad de los péptidos para inhibir la interacción proteína-proteína de Munc18 con Sintaxina-1, una proteína del complejo SNARE, se evaluó funcionalmente por medio de un ensayo de unión Munc18/Sintaxina-1 in vitro basado en ELISA (por sus siglas en inglés). Brevemente, los péptidos mencionados anteriormente a 0,1,0,5 y 1 mM se preincubaron con su proteína objetivo Sintaxina-1 (etiquetada con GST, por sus siglas en inglés) a 10 y 5 nM en un amortiguador (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 2 mM MgCh, 2 mM DTT (por sus siglas en inglés), Triton-X100 al 0,5% y leche descremada al 0,5%) por 3 horas a RT. Mientras tanto, Munc18 marcado con His se unió a una placa de 96 pozos recubierta de níquel a 100 nM y se incubó a RT por 1,5 horas. La proteína no unida se lavó posteriormente antes de bloquear los pozos con leche descremada en el amortiguador de lavado (PBS (por sus siglas en inglés) Triton-X100 al 0,02%) por 30 minutos adicionales. Posteriormente, se adicionó a la placa Sintaxina-1 marcada con GST preincubada con los péptidos a 10 y 5 nM, y se incubó por 2 h a RT. Los pozos se lavaron tres veces con el amortiguador de lavado antes de la incubación con el anticuerpo primario (anticuerpo policlonal con etiqueta GST- ThermoFisher Scientific, Massachusetts, EE. UU.) por 45 minutos. Finalmente, después de lavar nuevamente, se adicionó el anticuerpo secundario conjugado con HRP (Anticonejo-IgG-HRP - Sigma, Missouri, EE. UU.) y se incubó a RT. Se usó el sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) para desarrollar la señal. La reacción se detuvo por la adición del reactivo de paro. La cantidad de unión de la proteína Sintaxina-1 a la proteína Munc18 se analizó midiendo la absorbancia a 450 nm.

Los resultados obtenidos en este experimento aparecen resumidos en la figura 2. La figura 2 evidencia que ambos péptidos probados (Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 en un grado aun sorprendentemente mayor), fueron capaces de bloquear significativamente las interacciones proteína-proteína entre Munc18 y Sintaxina-1, mostrando incluso una manera de respuesta a la dosis. La inhibición máxima alcanzó 37% y 67% para los péptidos Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 y Ac-SEQ ID NO: 5-NH2, respectivamente. Basado en estos resultados, se puede ver que los péptidos de la presente invención son capaces de interrumpir la interacción proteína-proteína necesaria para la exocitosis regulada y la consecuente liberación de neurotransmisores.

Ejemplo 9. Modulación de la expresión génica en miocitos humanos de músculo esquelético.

Ac-SEQ ID NO: 5-NH2

Ac-SEQ ID NO: 8-NH2

Ac-SEQ ID NO: 10-NH2

Dichos péptidos se probaron para evaluar su capacidad de modular la expresión de varios genes relacionados con la contracción y relajación muscular en miocitos de músculo esquelético humano (Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. (2000), Molecular Cell Biology, 4° ed; Section 18.3 Myosin: The Actin Motor Protein, Nueva York, WH, Freeman; Kuo, IY and Ehrlich, BE (2015), Signaling in Muscle Contraction, Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 7(2); RAPSN receptor associated protein of the synapse [Homo sapiens (human)], Gene ID en NCBI 5913; Blake DJ, Tinsley JM, Davies KE (1996), Utrophin: a structural and functional comparison to dystrophin, Brain Pathol., 6(1): 37-47; Barik A, Lu Y, Sathyamurthy A, et al. (2014), LRP4 Is Critical for Neuromuscular Junction Maintenance, The Journal of Neuroscience, 34(42), 13892-13905; Kim N, Stiegler AL, Cameron TO, Hallock PT, et al. (2008), LRP4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK, Cell, 135(2), 334-342; Mahavadi S, Nalli A, Kumar D, et al. (2014), Increased expression of caveolin-1 is associated with upregulation of the RhoA/Rho kinase pathway and smooth muscle contraction in diabetes (1110.11), The FASEB Journal, 28:1_suplemento)). Para este fin, se diseñó un panel de genes de datos inteligentes de contractilidad. Dicho panel de genes de datos inteligentes de contractilidad analiza la expresión de los genes relacionados con la contracción y relajación muscular incluidos en la tabla 5.

Tabla 5. Genes analizados en el Ejemplo 9.

Brevemente, se sembraron mioblastos de músculo esquelético humano por duplicado en placas de cultivo de 12 pozos a una densidad de 1 x 105 células/pozo y se mantuvieron en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 95% de humedad, 5% de CO2) por 48-72 h. Posteriormente, se indujo la diferenciación de mioblastos a miocitos con medios de diferenciación específicos (medio SKM-D (por sus siglas en inglés) 1% de antibiótico-antimicótico) y se controló por 7 días más. Las células diferenciadas se trataron con 0,05 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 5-NH2; o con 0,1 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 10 -NH2 por 24 horas; o con 0,05 y 0,5 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 por 6 h; o con 0,5 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 durante 24 h. Las células no tratadas se usaron como control basal. Posteriormente, las células se lisaron para la extracción de ARN con un kit comercial de purificación de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante (mini kit RNeasy, Qiagen, Países Bajos). Posteriormente se cuantificó el ARN por el sistema Nanodrop, se ajustó la concentración y se procesó para la retrotranscripción a ADNc usando un kit disponible comercialmente (High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit, ThermoFisher Scientific, EE. UU.). El ARNc resultante se usó para realizar una RTq-PCR (reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real, por sus siglas en inglés) usando la tecnología TaqMan y un panel de sondas diseñadas para dirigirse a los genes específicos relacionados con la contractilidad muscular mencionados en la tabla 4.

Los resultados de este experimento aparecen resumidos en las figuras 3A a 3D. En dichas figuras se puede observar que cuando se trataron miocitos humanos con el péptido Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 se observó una regulación negativa de UTRn , ACTA1, TNNC1, RAPSN, SCN3A y MYH1. El tratamiento de miocitos con el péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 resultó en una regulación negativa de SCN3A, UTRN, ACTA1, TNNC1, CALM3, CAV1, CACNB1, LRP4 y MYH1 para el tratamiento de 6 horas, junto con una regulación negativa de RAPSN y una regulación positiva de ATP2A para el tratamiento de 24 horas. Finalmente, el tratamiento de miocitos con el péptido Ac-SEQ ID NO: 10 -NH2 resultó en una regulación negativa de UTRN, TNNC1, SCN3A CHRNA1 y CACNB1.

La regulación negativa de los genes mencionados anteriormente puede afectar la función de contractilidad muscular normal de diferentes maneras: RAPSN, CHRNA1, UTRN y LRP4, necesarios para la unión de acetilcolina en la superficie de la célula muscular, pueden afectar la despolarización de la membrana inducida por neurotransmisores y la estabilidad del citoesqueleto; SCN3A y CACNB1, como canales controlados por voltaje, pueden afectar el potencial de membrana y la transmisión de excitación; SLN, involucrado en el transporte de Ca2+, puede afectar la acumulación de calcio intracelular; y MYH1, TNNC1 y ACTA1 pueden afectar la integridad del citoesqueleto y el estímulo de electricidad que impulsa la contracción. Por lo tanto, los resultados obtenidos en este ejemplo y mostrados en la figura 3, demuestran la capacidad de los péptidos de la presente invención para modular la contracción-relajación muscular, contribuyendo a un aumento de la relajación de los músculos.

Ejemplo 10. Ensayo de movilización de calcio.

El péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 se sintetizó de acuerdo con los Ejemplos 2 a 6.

El potencial de dicho péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 para reducir la movilización de calcio en las células del músculo esquelético humano se evaluó in vitro con el kit de ensayo de calcio Fluo-4 NW (ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.). Brevemente, se sembraron mioblastos de músculo esquelético humano por quintuplicados en una placa negra de 96 pozos, fondo transparente, a una densidad de 1 x 104 células/pozo y se mantuvieron en condiciones de cultivo estándar (37 °C, 95% de humedad, 5% de CO2) por 48-72 h. Posteriormente, se indujo la diferenciación de mioblastos a miocitos con medio de diferenciación específico (medio SKM-D 1% a/a) y se controló por 7 días más. Las células diferenciadas se trataron con concentraciones no citotóxicas del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (0,01 mg/mL, 0,05 mg/mL y 0,1 mg/mL) por 48 horas adicionales.

Una vez finalizada la incubación, se reemplazó el medio de cultivo celular por 100 |^jL de solución teñida de carga, y la placa se mantuvo en la incubadora por 30 minutos. Posteriormente, la solución teñida se reemplazó por el amortiguador del ensayo antes de la medición de calcio usando el instrumento FLUOstar Omega (BMG Labtech, Alemania). Para una medición cinética adecuada, se estableció una fase previa al estímulo de 10 segundos para determinar la señal de referencia antes de la inducción del flujo de entrada de calcio por la la adición de KCI a 60 mM. La fase posterior al estímulo se fijó en 90 segundos, con lecturas cada 0,1 segundos a 494/516 nm (excitación/emisión).

Para el análisis de los datos se realizaron los siguientes pasos: 1) Cálculo de una curva cinética media para cada condición; 2) determinación de la señal fluorescente máxima para cada curva después de la estimulación con KCI; 3) cálculo del aumento del cambio de veces contra el valor inicial; 4) normalización de los resultados obtenidos para cada condición (cada concentración de péptido) contra el obtenido para el control (células no tratadas).

Los resultados obtenidos en este experimento aparecen resumidos en la figura 4 y reflejan el potencial de los péptidos de la presente invención (como se ejemplifica por Ac-SEQ ID NO: 8-NH2) para reducir la entrada de calcio de forma dependiente de la dosis (-6%, -20% y -30% a 0,01 mg/mL, 0,05 mg/mL y 0,1 mg/mL respectivamente). Esta reducción de la entrada de calcio repercute en la contractilidad celular favoreciendo la relajación muscular.

Como se puede derivar directamente de los ejemplos anteriores, los péptidos de la presente invención interfieren o inhiben efectivamente la formación del complejo Munc18-Sintaxina-1, permitiendo así una regulación (inhibición) de la exocitosis neuronal. Además, dichos péptidos proporcionan un efecto directo sobre las células musculares induciendo o contribuyendo a su relajación (relajación muscular). Por lo tanto, los péptidos de la presente invención resuelven los problemas mencionados anteriormente presentes en el estado de la técnica.

Ejemplo 11. Disminución de la proteína de cadena pesada de miosina.

El potencial de dicho péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 para disminuir la expresión de la cadena pesada de la proteína miosina en células del músculo esquelético humano se evaluó in vitro por inmunofluorescencia usando un anticuerpo específico contra esta proteína (Biotechne, EE. UU.) seguido de un anticuerpo fluorescente secundario (ThermoFisher, EE. UU.). Brevemente, se sembraron mioblastos de músculo esquelético humano en un cubreobjetos en medio SKM-M (Tebu-Bio, Francia) a una densidad de 3 x 104 células/cm2 y se incubaron durante la noche bajo condiciones de cultivo estándar (37 °C, 95% de humedad, 5% de CO2). Posteriormente, se indujo la diferenciación de mioblastos a miocitos con un medio de diferenciación específico (medio de diferenciación de células musculares esqueléticas, medio SKM-D) y se controló por 7 días más. Las células diferenciadas se trataron con concentraciones no citotóxicas del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (0,05 mg/mL y 0,5 mg/mL) por 48 horas adicionales.

Una vez finalizada la incubación, las células se fijaron con PFA al 4% y se permeabilizaron con Triton al 0,1% (v/v) (Sigma, EE. UU.). Posteriormente, la miosina se tiñó con 0,5 mg/mL de anticuerpo de cadena pesada de miosina durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de un lavado adecuado, la proteína de actina se etiquetó con 50 |jg/mL de faloidina (roja) (Sigma, EE. UU.) por 1 h y, después del lavado, las células se tiñeron con 4 jg/m L del anticuerpo secundario cabra anti-ratón IgG por 1 h. Finalmente, los núcleos se tiñeron con marcador de Hoescht 3,5 jg/m L por 10 min (Sigma, EE. UU.).

Las imágenes microscópicas se adquirieron usando los objetivos 5x y 10x. Se usaron tres réplicas para cada condición y se adquirieron imágenes de tres a cuatro campos de cada cubreobjetos usando la misma configuración.

Las imágenes se analizaron usando el software Image J. Brevemente, se ajustó el umbral para seleccionar la miosina y se midió la fluorescencia media. El número de células positivas se contó usando una tinción con DAPI (por sus siglas en inglés). La intensidad de fluorescencia media de miosina se dividió por el número de células positivas para miosina. Finalmente, todos los datos se normalizaron de la siguiente manera para obtener el % de miosina en comparación con las células no tratadas: % contra control = (fluorescencia por célula en pozos tratados/fluorescencia por célula en pozos no tratados) x 100.

Los resultados obtenidos en este experimento aparecen resumidos en las figuras 5A, 5B y 6 y reflejan el potencial de los péptidos de la presente invención (como se ejemplifica por Ac-SEQ ID NO: 8-NH2) para reducir los niveles de proteína de cadena pesada de miosina de manera dependiente de la dosis (-26% y -38% a 0,05 mg/mL y 0,5 mg/mL en la figura 6, respectivamente). Esta reducción en los niveles de proteína de cadena pesada de miosina tiene un impacto en la contractilidad celular favoreciendo la relajación muscular.

Como se puede derivar directamente del ejemplo anterior, los péptidos de la presente invención proporcionan efectivamente un efecto directo sobre las células musculares induciendo o contribuyendo a su relajación (relajación muscular).

Ejemplo 12. Frecuencia de contracción.

El potencial de dicho péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 para modular la frecuencia de contracción se evaluó in vitro usando células musculares humanas y neuronas motoras derivadas de cocultivos de hiPSC, por medio de vídeo de imágenes en vivo de fibras musculares contráctiles localizadas registradas con un microscopio automatizado InCell 2200 durante 60 segundos, antes y después del tratamiento (después del tratamiento, en cada uno de los puntos de tiempos establecidos).

Se cultivaron células de músculo humano a una densidad de 1 x 106 células en matraces T75 cm2 y posteriormente se transfirieron a placas de 96 pozos para la diferenciación. Las neuronas motoras derivadas de hiPSC se transfirieron a las placas de 96 pozos con las células de músculo en un medio de diferenciación. Los cocultivos se mantuvieron por 10 días con el fin de generar uniones de neuronas con fibras musculares. Se observaron contracciones espontáneas dentro de 5 días.

Posteriormente, los cocultivos se trataron con medio de control (basal), a-bungarotoxina a 1 |^jM, 0,5 mg/mL de acetil hexapéptido-8 como punto de referencia y 0,05 o 0,1 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2. Se grabaron películas de cocultivos durante 60 segundos antes del tratamiento y, después de 30 minutos de incubación, se volvieron a grabar películas durante 60 segundos. La placa de cultivo se incubó nuevamente durante 1 h 30 min con compuestos (2 h de incubación total), y se registraron nuevamente películas de cocultivos durante 60 segundos. La placa de cultivo se incubó nuevamente por un total de 24 h con compuestos y al final de la incubación se registraron nuevamente películas durante 60 segundos. Finalmente, se lavaron los compuestos y se realizó un último registro después de 24 h de dicho lavado de los compuestos para valorar una eventual recuperación de las contracciones musculares (Recuperación).

Las frecuencias de contracción se calcularon antes y después de cada incubación. Para cada condición de cultivo, se analizaron 6 pozos.

Los resultados obtenidos en este experimento aparecen resumidos en la figura 7 y reflejan el potencial de los péptidos de la presente invención (como se ejemplifica por Ac-SEQ ID NO: 8-NH2) para inducir una importante disminución dependiente de la dosis de la frecuencia de contracción muscular después de solo 30 min (25% y 18% de la frecuencia de contracción muscular con respecto a las células basales no tratadas, a 0,05 y 0,1 mg/mL, respectivamente) que se mantiene durante el periodo de incubación de 24 h (23% y 10% a 0,05 y 0,1 mg/mL, respectivamente). El lavado de este compuesto permite una recuperación parcial de la frecuencia de contracción muscular que es mejor a una concentración de 0,05 mg/mL (65% y 35% a 0,05 y 0,1 mg/mL, respectivamente).

El punto de referencia (acetil hexapéptido-8) usado a 0,5 mg/mL indujo una inhibición parcial de la frecuencia de contracción muscular después de 30 min (18% de frecuencia de contracción muscular), pero este efecto se atenuó con incubaciones más largas (45% después de 24 h) y después de un lavado, la frecuencia fue totalmente restaurada (100%).

Como se puede derivar directamente del ejemplo anterior, los péptidos de la presente invención proporcionan efectivamente un efecto directo sobre la contracción muscular durante la formación de uniones de neuronas con fibras musculares, contribuyendo a su relajación (relajación muscular).

Ejemplo 13. Niveles y retraso de exocitosis.

El potencial de dicho péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 para modular la exocitosis de vesículas que contienen neurotransmisores de una línea celular de neuroblastoma se evaluó in vitro usando células SH-SY5Y (por sus siglas en inglés), por imágenes de fluorescencia usando un microscopio de epifluorescencia invertido Zeiss axiovert 200 con un objetivo de 20x y una lámpara de xenón.

Se cultivaron células SH-SY5Y (Sigma, EE. UU.) en matraces T25 en medio suplementado (DMEM/F12, por sus siglas en inglés, GIBCO, EE. UU.). Por encima de 90% de confluencia, las células se tripsinizaron con 1 mL de tripsina-EDTA (por sus siglas en inglés) al 0,5% (v/v). Posteriormente, se adicionaron 5 mL de dicho medio suplementado y se determinó la concentración celular. Las células se sembraron en cubreobjetos de 12 mm recubiertos con polilisina en placas de 24 pozos a 15 x 104 células/pozo en medio suplementado (GIBCO, EE. UU.) y se incubaron bajo condiciones regulares (37 °C, 5% de CO2). Después de 24 h de siembra de células, las células se transfectaron con el indicador de exocitosis usando lipofectamine™ 3000 (Invitrogen, EE. UU.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El constructo reportero contiene la proteína de fusión formada por proteínas intraluminales específicas y una proteína fluorescente sensible al pH.

Para la monitorización de la exocitosis, después de 48 h de expresión de la proteína, las células se incubaron con 0,01 mg/mL del péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 o 1 mg/mL del acetil hexapéptido-8 de punto de referencia por 1 hora a 37 °C y 5% de CO2. Las células no tratadas se usaron como control basal. Posteriormente, las células se pretrataron con PMA 100 a nM por 15 min y se estimularon con ionomicina a 12,5 j M junto con PMA (100 nM) por 5 minutos (estimulación total: 20 min). Se realizaron imágenes de fluorescencia por los últimos 10 min del protocolo de estimulación. La señal de fluorescencia del indicador de exocitosis se controló empleando un filtro de excitación de 483-512 nm y un filtro de emisión de 525-530 nm. Las imágenes se capturaron con la cámara CCD ORCA-ER cada 5 segundos por 10 min usando el software Aquacosmos.

Las células no tratadas se analizaron en N = 4 experimentos independientes con n = 16 cubreobjetos (483 células medidas), las células tratadas con acetil hexapéptido-8 en N = 3 experimentos independientes con n = 10 cubreobjetos (328 células medidas) y células tratadas con Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 en N = 3 experimentos independientes con n = 8 cubreobjetos (240 células medidas). Las células se seleccionaron para controlar individualmente la intensidad de la fluorescencia y el transcurso del tiempo. El pico de fluorescencia provocado por la adición de ionomicina se usó para cuantificar la exocitosis calculando el área bajo la curva (ABC) usando el software GraphPad. Se definieron y analizaron dos parámetros:

- Niveles de exocitosis: Para las células individuales, el área máxima total se obtuvo a partir del análisis del ABC y se normalizó por la línea de base que se definió como la intensidad de fluorescencia 3 ciclos antes de la inyección de ionomicina.

- Retraso de la exocitosis: Para las células individuales, el tiempo de respuesta (min) se obtuvo a partir del análisis del ABC como marco de tiempo entre la inyección de ionomicina (Y) y el inicio del pico (primera X).

Los valores de fluorescencia se normalizaron aún más como cambio porcentual en las células no tratadas en cada experimento como: (nivel de exocitosis de células tratadas/niveles de exocitosis de células no tratadas) x 100 y (tiempo de respuesta de células tratadas/tiempo de respuesta de células no tratadas) x 100.

Para análisis de parámetros de monitorización de exocitosis: Los datos representan porcentajes normalizados a células no tratadas para niveles de exocitosis y retraso de exocitosis. Los datos se expresan como media ± SEM; Los datos se obtuvieron de N = 4 experimentos independientes, n = 16 réplicas (483 células medidas) para células no tratadas; N = 3 experimentos independientes, n = 10 réplicas para acetil hexapéptido-8 (328 células medidas); N = 3 experimentos independientes, n = 8 réplicas (240 células medidas) para Ac-SEQ ID NO: 8-NH2.

Los resultados obtenidos en este experimento aparecen resumidos en las figuras 8 y 9 y reflejan el potencial de los péptidos de la presente invención (como se ejemplifica por Ac-SEQ ID NO: 8-NH2) para reducir (figura 8) y retrasar (figura 9) la exocitosis de vesículas que contienen acetilcolina liberada por neuronas que activan las contracciones musculares a través de receptores específicos de acetilcolina.

Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 incubado por 1 hora a 0,01 mg/mL retrasó significativamente el tiempo de respuesta de exocitosis (retraso de 24%) y disminuyó los niveles de exocitosis (-14%), mientras que el acetil hexapéptido-8 se incubó por 1 hora a 1 mg/mL retrasó significativamente la respuesta de exocitosis (67% de retraso) sin alterar el nivel de exocitosis (7%) en la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y.

Como se puede derivar directamente del ejemplo anterior, los péptidos de la presente invención proporcionan efectivamente un efecto indirecto sobre la contracción muscular al reducir el nivel de vesículas de acetilcolina liberadas por las neuronas al espacio sináptico para la contracción muscular y retrasando dicha exocitosis.

Ejemplo 14. Producción de colágeno.

El potencial de dicho péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 para modular la producción de colágeno tipo I como potencial mejorador de la reafirmación de la piel se evaluó in vitro usando fibroblastos de piel humana.

Las células se sembraron en placas de 96 pozos a razón de 1 x 104 células/pozo y se mantuvieron por 24 h bajo condiciones de cultivo estándar (37 °C, 95% de humedad, 5% de CO2). Después de 24 h de incubación, se retiró el medio y se adicionó nuevo medio que contiene el péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 a 0,01, 0,05 o 0,1 mg/mL a la concentración del pozo. El tratamiento duró 24 horas o 48 horas y al final del ensayo se recolectaron los medios de cultivo celular. Las células tratadas solamente con medio de cultivo se usaron como control basal (células no tratadas).

Después de 24 y 48 horas de tratamiento se midió la cantidad de colágeno tipo I producido y liberado por las células (síntesis ex novo de colágeno tipo I) en medio de cultivo celular por medio de un ensayo ELISA. Los resultados del artículo de prueba se compararon con la condición de control basal (células no tratadas). Los tratamientos se realizaron por triplicado en tres sesiones experimentales diferentes.

La determinación de la síntesis de colágeno tipo I se realizó por medio de un método ELISA competitivo. Las muestras se adicionaron a pozos de enzimas que se habían recubierto previamente con anticuerpos, posteriormente se adicionó el antígeno de reconocimiento marcado con peroxidasa de rábano picante (HRP); después de ser incubados 1 hora a 37 °C, ambos compiten con el antígeno en fase sólida y forman inmunocomplejos. Después de lavar con solución amortiguadora de fosfato, la HRP combinada cataliza la tetrametilbencidina (TMB) en azul y se vuelve amarilla por la acción del ácido; tiene un pico de absorción por debajo de la longitud de onda de 450 nm y su absorbancia se correlaciona negativamente con la densidad del antígeno de la muestra. Las placas se leyeron con un lector de microplacas.

La determinación cuantitativa usa una curva de calibración formada por concentraciones conocidas y crecientes de colágeno tipo I estándar. Los resultados se expresan como concentración de colágeno tipo I (|jg/mL) en 50 |^jL de medio de cultivo celular.

Se realizaron tres ensayos para cada determinación en tres sesiones experimentales diferentes. Se calculó el % de variación en el contenido de colágeno tipo I entre los controles negativos y las muestras y se obtuvo un índice directo de la eficacia del péptido para aumentar la síntesis de colágeno I.

Los resultados obtenidos en este experimento aparecen resumidos en las figuras 10A y 10B y reflejan el potencial de los péptidos de la presente invención (como se ejemplifica por Ac-SEQ ID NO: 8-NH2) para inducir la producción de colágeno tipo I por fibroblastos de piel humana.

El péptido Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 aumentó significativamente la producción de colágeno tipo I por parte de los fibroblastos después de 24 h en 9%, 31% y 37,5% a 0,01, 0,05 y 0,1 mg/mL, respectivamente, y después de 48 h en 16%, 29,5% y 56,5% a 0,01, 0,05 y 0,1 mg/mL, respectivamente.

Como se puede deducir directamente del ejemplo anterior, los péptidos de la presente invención proporcionan efectivamente un efecto fuerte y mejoran la firmeza y la calidad de la piel.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un péptido o composición que comprende dicho péptido para su uso como medicamento caracterizado porque el péptido es capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1, porque compite con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4, y en que:

- la secuencia del péptido es SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4; o

- el péptido tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (I):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-R2 (I)

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada;

AA5 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral hidrofóbica no polar o cadena lateral aromática; AA6 es Trp;

o

- el péptido tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (II):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-R2 (II)

AA2 es cualquier aminoácido;

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral aromática;

2. El péptido o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el péptido de fórmula (I) es:

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 5-NH2);

Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 6-NH2);

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 7 -NH2);

Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 8-NH2); y/o

Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 9-NH2).

3. El péptido o composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque en el péptido de fórmula (II):

AA1 se selecciona del grupo de Arg;

AA2 es cualquier aminoácido;

AA3 se selecciona del grupo de Arg; y

AA4 se selecciona del grupo de Phe.

4. El péptido o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 3, caracterizado porque el péptido de fórmula (II) es:

R1-Arg-Arg-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 10 -R2); y/o

R1-Arg-Met-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 11 -R2).

5. El péptido o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 o 4, caracterizado porque el péptido de fórmula (II) es:

Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 10 -NH2); y/o

Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 11 -NH2).

6. El péptido o composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque es para uso en la prevención y/o tratamiento de trastornos de exocitosis neuronal seleccionados de demencia senil, demencia relacionada con el Alzheimer, demencia relacionada con el SIDA, epilepsia, demencia amiotrófica esclerosis, esclerosis múltiple/lateral, mastocitosis, migraña crónica o trastornos de ansiedad o para uso en la prevención y/o tratamiento de trastornos de la contractilidad muscular seleccionados de miotonía, distrofia miotónica, miotonía congénita, enfermedad de Parkinson, Parkinsonismo secundario, enfermedad de Huntington, espasticidad, discinesia tardía (TD) o distonía.

7. Un uso como cosmético de un péptido o composición que comprende dicho péptido para prevenir, reducir y/o eliminar el envejecimiento de la piel y/o signos de expresión en un sujeto, caracterizado porque el péptido es capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1, ya que compite con SEQ ID NO: 3 y/o ^sE^qID NO: 4, y en que:

- la secuencia del péptido es SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4;

0

- el péptido tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (I):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-R2 (I)

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada;

AA6 es Trp;

o

- el péptido tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (II):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-R2 (II)

AAi se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada positivamente;

AA2 es cualquier aminoácido;

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral aromática;

R1 se selecciona de un H, un alifático no cíclico sustituido o no sustituido, un aliciclilo sustituido o no sustituido, un heterociclilo sustituido o no sustituido, un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido, un arilo sustituido o no sustituido, un aralquilo sustituido o no sustituido, y de R5-CO-, en donde R5 se selecciona del grupo formado por un radical alquilo de C1-C24 sustituido o no sustituido, un alquenilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un alquinilo de C2-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquilo de C3-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquenilo de C5-C24 sustituido o no sustituido, un cicloalquinilo de C8-C24 sustituido o no sustituido, un arilo de C6-C30 sustituido o no sustituido, un aralquilo de C7-C24 sustituido o no sustituido, un anillo heterociclilo sustituido o no sustituido de 3 a 10 miembros, y un heteroarilalquilo sustituido o no sustituido de 2 a 24 átomos de carbono y de 1 a 3 átomos distintos de carbono y una cadena alquílica de 1 a 6 átomos de carbono; y

8. El uso como cosmético de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque el péptido de fórmula (I) es:

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH (Ac-SEQ ID NO: 5-NH2);

Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 6-NH2);

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH (Ac-SEQ ID NO: 7 -NH2);

Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH (Ac-SEQ ID NO: 8-NH2); y/o

Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH (Ac-SEQ ID NO: 9-NH2).

9. El uso como cosmético de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque en el péptido de fórmula (II):

AA1 se selecciona del grupo de Arg;

AA2 es cualquier aminoácido;

AA3 se selecciona del grupo de Arg; y

AA4 se selecciona del grupo de Phe.

10. El uso como cosmético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 o 9, caracterizado porque el péptido de fórmula (II) es:

R1-Arg-Arg-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 10 -R2); y/o

R1-Arg-Met-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 11 -R2).

11. El uso como cosmético de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7, 9 o 10, caracterizado porque el péptido de fórmula (II) es:

Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 10 -NH2); y/o

Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 11 -NH2).

12. Un péptido capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1 caracterizado porque compite con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4 y porque tiene una secuencia de acuerdo con la fórmula (I):

R1-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-R2 (I)

AA4 se selecciona del grupo de aminoácidos con cadena lateral cargada;

AA6 es Trp;

13. El péptido de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque

AA1 es His;

AA2 se selecciona del grupo de Ala e Ile;

AA3 se selecciona del grupo de Leu y Met;

AA4 se selecciona del grupo de Arg y Asp;

AA5 se selecciona del grupo de Met, Phe y Trp;

y AA6 es Trp.

14. El péptido de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, caracterizado porque el péptido de fórmula (I) es:

R1-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 5-R2);

R1-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 6-R2);

R1-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 7 -R2);

R1-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 8-R2); y/o

R1-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-R2 (R1-SEQ ID NO: 9-R2).

15. El péptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque el péptido de fórmula (I) es:

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 5-NH2);

Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 6-NH2);

Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 7 -NH2);

Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 8-NH2); y/o

Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 9-NH2).

16. Un péptido capaz de interferir en la interacción del complejo Munc18-Sintaxina-1 caracterizado porque compite con SEQ ID NO: 3 y/o SEQ ID NO: 4 y porque la secuencia del péptido es:

R1-Arg-Arg-Arg-Phe-R2 (R1-SEQ ID NO: 10 -R2)

en donde

17. El péptido de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizado porque la secuencia del péptido es:

Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH2 (Ac-SEQ ID NO: 10 -NH2).