TW201941783A - 用於化妝品和藥劑之肽和組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明關於肽家族,該等肽能干擾複合物Munc18-突觸融合蛋白(Syntaxin)-1形成且因此可用於預防及/或治療神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患及預防、減少及/或消除皮膚老化及/或表情標誌。
Description
本發明關於能調節Munc18與突觸融合蛋白-1 (Syntaxin-1)之間的結合或交互作用及因此調節SNARE複合物之結合的分子生物學領域,更確切地關於應用於化妝品及藥劑之分子生物學,甚至更確切地關於肽及包含該肽之組成物。由於此活性,本發明之肽及組成物能調節突觸囊泡融合及肌肉收縮性。因此,該肽及組成物有效治療與上述態樣之調節有關的症狀(例如肌肉鬆弛)且可用於化妝品(抗皺紋活性和抗多汗症活性)及藥劑(神經元及/或肌肉收縮疾患)二者中。
SNARE複合物及突觸囊泡融合的異常調節尤其導致異常的肌肉收縮-鬆弛,已知其與化妝品及藥劑二者非常有關。
一方面,皺紋(例如臉部表情紋)形成基礎或機制為肌肉向內拖拉皮膚的張力。此肌肉張力為使相應肌肉衰弱之神經功能亢進的結果。該神經功能亢進又以失控及過度釋放激發肌纖維之神經遞質為特徵。
另一方面,導致肌肉收縮-鬆弛改變的神經功能亢進(如已於上文所述,以失控及過度釋放激發肌纖維之神經遞質為特徵)亦為許多已知疾病的基礎,例如老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症或多發性/脊髓側索硬化症(Jabbari B, (2018)Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach, Springer, Cham ;Jankovic J, (2004)Botulinum toxin in clinical practice, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 75:951–957)。
在與上述類似的方式中,導致神經元胞吐作用失調之SNARE複合物及突觸囊泡融合的異常不僅於肌肉,且亦於其他的結構或器官(例如腺體)產生過度的肌肉激活或激發。因此,該狀況亦導致與肌肉收縮無關的美容學及醫學改變(本發明之肽及組成物可用於該改變),例如多汗症(過度的汗腺激活或激發)(Jabbari B, (2018)Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach ,Springer, Cham .;Luvisetto S, Gazerani P, Cianchetti C, Pavone F, (2015)Botulinum Toxin Type A as a Therapeutic Agent against Headache and Related Disorders, Toxins (Basel), Sep; 7(9): 3818–3844.;Molderings GJ, Haenisch B, Brettner S等人之(2016)Pharmacological treatment options for mast cell activation disease, Arch Pharmacol. 2016; 389: 671–694.;Başar E, Arıcı C, (2016),Use of Botulinum Neurotoxin in Ophthalmology , Turk J Ophthalmol. Dec; 46(6): 282–290.;Schlereth T, Dieterich M, Birklein F (2009),Hyperhidrosis--causes and treatment of enhanced sweating, Dtsch Arztebl Int. Jan;106(3):32-7)。
神經遞質釋放係由於突觸前囊泡融合,如眾所周知,其係由不同的蛋白質之間複雜的交互作用控制,該交互作用負責使具有神經遞質的囊泡接近突觸前膜,定位該囊泡使其分泌,容許膜融合用於分泌及分解所產生之複合物以容許其再循環。所有的此程序(包括參與蛋白質之組合及分解)皆需要受到嚴格的控制,因為任何類型的失調可導致美學及/或健康效應二者的改變。
調節神經元胞吐作用的分子有助於鬆弛肌肉張力,且因此預防、減少及/或消除皺紋(較佳為臉部皺紋)及/或預防、改善或治癒與異常或失調的神經元胞吐作用有關的疾病。
關於此點,傳統上認為突觸前囊泡(負載神經遞質,較佳為乙醯膽鹼)融合係由SNARE蛋白(亦即神經元之膜中的突觸融合蛋白-1和SNAP-25;及囊泡之膜中的小突觸囊泡蛋白或VAMP)驅動或控制。因此,認為SNARE蛋白複合物構成控制神經分泌的關鍵靶標。
關於此點,已產生許多針對SNARE蛋白複合物之治療及美容方法,例如:
- 肉毒桿菌毒素:彼等係以減少及/或消除表情紋為目標而被廣泛地使用,尤其為血清型A (BOTOX® Cosmetic,Allergan Inc.)。該肉毒桿菌毒素係經局部注射且彼之麻痺效應為可逆的,具有平均6個月的持續時間,因此需要重複注射。已知針對肉毒桿菌製劑觸發免疫反應的風險導致治療功效的喪失。亦認為其他的血清型肉毒桿菌毒素(諸如B、F和E)克服此問題,然而該血清型亦具有觸發免疫反應的風險。在分子水平上,肉毒桿菌毒素為降解涉及鈣離子激活之胞吐作用機制的神經元蛋白質之蛋白酶。例如,肉毒桿菌毒素A截短神經元SNAP-25蛋白質。
- 亦在現有技術中已知自形成SNARE複合物的蛋白質序列衍生之特定的肽可抑制神經元胞吐作用,諸如:自SNAP-25之胺基及羧基結構域衍生之肽(參見例如PCT專利申請案WO97/34620、歐洲專利EP1180524B1和歐洲專利EP2123673B1)及自小突觸囊泡蛋白或自突觸融合蛋白衍生之肽(參見例如PCT專利申請案WO97/34620;Blanes-Mira, C., Clemente, J., Jodas, G., Gil, A., Fernandez-Ballester, G., Ponsati, B., Gutierrez, L., Perez-Paya, E., Ferrer-Montiel, A.A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity . International Journal of Cosmetic Science, (2002), 24, 303-310)。
然而,仍對發現干擾突觸神經遞質釋放機制及容許其抑制的另外或替代分子有需求,容許抑制神經元胞吐作用,且因此尤其提供肌肉鬆弛或耗乏腺體過度刺激及相應的美容和醫藥效應。
最近的研究建議更複雜的突觸神經遞質釋放調節,其中除了SNARE蛋白複合物以外,其他的蛋白質(諸如Munc13和Munc18)可在程序調節及容許膜融合中具有重要的角色(Rizo, J and Südhof, T.C. (2012)The Membrane Fusion Enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices – Guilty as Charged? ; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28:279-308)。在此意義中,在Munc18 (SEQ ID NO: 1)與突觸融合蛋白-1 (SEQ ID NO: 2)之間的交互作用經說明為產生SNARE複合物及膜融合二者之核心且不可或缺的。一方面,Munc18係與突觸融合蛋白-1之Habc -結構域交互作用,容許穩定該Munc18及其適當的運送(trafficking)。另一方面, Munc18與突觸融合蛋白-1之N肽的交互作用為Munc18與SNARE複合物的交互作用及膜融合所必要的(Zhou, P.等人之(2013)Syntaxin-1 N-peptide and Habc-domain perform distinct essential functions in synaptic vesicle fusion ;The EMBO Journal, 32:159-171;Rizo, J and Südhof, T.C. (2012)The Membrane Fusion Enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices – Guilty as Charged? ; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28:279-308)。
本發明之發明人在廣泛且詳盡的研究後驚訝地發現與位於Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用之表面上的特定序列競爭之肽容許干擾或抑制該複合物Munc18-突觸融合蛋白-1,且因此抑制神經遞質釋放(較佳為乙醯膽鹼及CGRP (抑鈣素基因系肽))及抑制肌肉收縮(既間接地藉助於抑制神經元胞吐作用又藉由直接地在肌肉細胞中提供效應)。已驚訝地發現與位於Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用之表面上的其他序列競爭之肽不提供上述效應。因此,本發明之發明人發現與兩種Munc18:SEQ ID NO: 3 (相應於Munc18 (亦即SEQ ID NO: 1)之位置46至51)及/或SEQ ID NO: 4 (相應於Munc18 (亦即SEQ ID NO: 1)之位置63至66)競爭的肽對干擾在Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用優於位於Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用之表面上的其他序列。該肽(本發明之肽)顯示出有效干擾在Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用。另外,該等肽顯示出直接的肌肉鬆弛效應,因為彼等具有藉由調節涉及肌肉收縮之基因及調節鈣動員而直接作用在肌肉細胞上的能力,亦即作用在突觸後側上,如其他的肽所見(Schagen, S.K. (2017)Topical treatments with effective anti-aging results , Cosmetics, 4, 16;PCT專利申請案WO2006047900)。因此,藉由容許有效的抑制神經元中的乙醯膽鹼釋放及調節肌肉細胞上的基因表現和減少肌肉細胞上的鈣動員而在突觸前側及突觸後側二者中顯示出效應。因此,本發明之肽解決上述問題且可用於治療與神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的美容學標誌及疾病二者。
發明人不知道任何提供干擾Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用以抑制神經遞質釋放(且因此抑制神經元胞吐作用)及肌肉收縮性之分子的先前技術。
一方面,皺紋(例如臉部表情紋)形成基礎或機制為肌肉向內拖拉皮膚的張力。此肌肉張力為使相應肌肉衰弱之神經功能亢進的結果。該神經功能亢進又以失控及過度釋放激發肌纖維之神經遞質為特徵。
另一方面,導致肌肉收縮-鬆弛改變的神經功能亢進(如已於上文所述,以失控及過度釋放激發肌纖維之神經遞質為特徵)亦為許多已知疾病的基礎,例如老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症或多發性/脊髓側索硬化症(Jabbari B, (2018)Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach, Springer, Cham ;Jankovic J, (2004)Botulinum toxin in clinical practice, J Neurol Neurosurg Psychiatry, 75:951–957)。
在與上述類似的方式中,導致神經元胞吐作用失調之SNARE複合物及突觸囊泡融合的異常不僅於肌肉,且亦於其他的結構或器官(例如腺體)產生過度的肌肉激活或激發。因此,該狀況亦導致與肌肉收縮無關的美容學及醫學改變(本發明之肽及組成物可用於該改變),例如多汗症(過度的汗腺激活或激發)(Jabbari B, (2018)Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach ,Springer, Cham .;Luvisetto S, Gazerani P, Cianchetti C, Pavone F, (2015)Botulinum Toxin Type A as a Therapeutic Agent against Headache and Related Disorders, Toxins (Basel), Sep; 7(9): 3818–3844.;Molderings GJ, Haenisch B, Brettner S等人之(2016)Pharmacological treatment options for mast cell activation disease, Arch Pharmacol. 2016; 389: 671–694.;Başar E, Arıcı C, (2016),Use of Botulinum Neurotoxin in Ophthalmology , Turk J Ophthalmol. Dec; 46(6): 282–290.;Schlereth T, Dieterich M, Birklein F (2009),Hyperhidrosis--causes and treatment of enhanced sweating, Dtsch Arztebl Int. Jan;106(3):32-7)。
神經遞質釋放係由於突觸前囊泡融合,如眾所周知,其係由不同的蛋白質之間複雜的交互作用控制,該交互作用負責使具有神經遞質的囊泡接近突觸前膜,定位該囊泡使其分泌,容許膜融合用於分泌及分解所產生之複合物以容許其再循環。所有的此程序(包括參與蛋白質之組合及分解)皆需要受到嚴格的控制,因為任何類型的失調可導致美學及/或健康效應二者的改變。
調節神經元胞吐作用的分子有助於鬆弛肌肉張力,且因此預防、減少及/或消除皺紋(較佳為臉部皺紋)及/或預防、改善或治癒與異常或失調的神經元胞吐作用有關的疾病。
關於此點,傳統上認為突觸前囊泡(負載神經遞質,較佳為乙醯膽鹼)融合係由SNARE蛋白(亦即神經元之膜中的突觸融合蛋白-1和SNAP-25;及囊泡之膜中的小突觸囊泡蛋白或VAMP)驅動或控制。因此,認為SNARE蛋白複合物構成控制神經分泌的關鍵靶標。
關於此點,已產生許多針對SNARE蛋白複合物之治療及美容方法,例如:
- 肉毒桿菌毒素:彼等係以減少及/或消除表情紋為目標而被廣泛地使用,尤其為血清型A (BOTOX® Cosmetic,Allergan Inc.)。該肉毒桿菌毒素係經局部注射且彼之麻痺效應為可逆的,具有平均6個月的持續時間,因此需要重複注射。已知針對肉毒桿菌製劑觸發免疫反應的風險導致治療功效的喪失。亦認為其他的血清型肉毒桿菌毒素(諸如B、F和E)克服此問題,然而該血清型亦具有觸發免疫反應的風險。在分子水平上,肉毒桿菌毒素為降解涉及鈣離子激活之胞吐作用機制的神經元蛋白質之蛋白酶。例如,肉毒桿菌毒素A截短神經元SNAP-25蛋白質。
- 亦在現有技術中已知自形成SNARE複合物的蛋白質序列衍生之特定的肽可抑制神經元胞吐作用,諸如:自SNAP-25之胺基及羧基結構域衍生之肽(參見例如PCT專利申請案WO97/34620、歐洲專利EP1180524B1和歐洲專利EP2123673B1)及自小突觸囊泡蛋白或自突觸融合蛋白衍生之肽(參見例如PCT專利申請案WO97/34620;Blanes-Mira, C., Clemente, J., Jodas, G., Gil, A., Fernandez-Ballester, G., Ponsati, B., Gutierrez, L., Perez-Paya, E., Ferrer-Montiel, A.A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity . International Journal of Cosmetic Science, (2002), 24, 303-310)。
然而,仍對發現干擾突觸神經遞質釋放機制及容許其抑制的另外或替代分子有需求,容許抑制神經元胞吐作用,且因此尤其提供肌肉鬆弛或耗乏腺體過度刺激及相應的美容和醫藥效應。
最近的研究建議更複雜的突觸神經遞質釋放調節,其中除了SNARE蛋白複合物以外,其他的蛋白質(諸如Munc13和Munc18)可在程序調節及容許膜融合中具有重要的角色(Rizo, J and Südhof, T.C. (2012)The Membrane Fusion Enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices – Guilty as Charged? ; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28:279-308)。在此意義中,在Munc18 (SEQ ID NO: 1)與突觸融合蛋白-1 (SEQ ID NO: 2)之間的交互作用經說明為產生SNARE複合物及膜融合二者之核心且不可或缺的。一方面,Munc18係與突觸融合蛋白-1之Habc -結構域交互作用,容許穩定該Munc18及其適當的運送(trafficking)。另一方面, Munc18與突觸融合蛋白-1之N肽的交互作用為Munc18與SNARE複合物的交互作用及膜融合所必要的(Zhou, P.等人之(2013)Syntaxin-1 N-peptide and Habc-domain perform distinct essential functions in synaptic vesicle fusion ;The EMBO Journal, 32:159-171;Rizo, J and Südhof, T.C. (2012)The Membrane Fusion Enigma: SNAREs, Sec1/Munc18 Proteins, and Their Accomplices – Guilty as Charged? ; Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 28:279-308)。
本發明之發明人在廣泛且詳盡的研究後驚訝地發現與位於Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用之表面上的特定序列競爭之肽容許干擾或抑制該複合物Munc18-突觸融合蛋白-1,且因此抑制神經遞質釋放(較佳為乙醯膽鹼及CGRP (抑鈣素基因系肽))及抑制肌肉收縮(既間接地藉助於抑制神經元胞吐作用又藉由直接地在肌肉細胞中提供效應)。已驚訝地發現與位於Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用之表面上的其他序列競爭之肽不提供上述效應。因此,本發明之發明人發現與兩種Munc18:SEQ ID NO: 3 (相應於Munc18 (亦即SEQ ID NO: 1)之位置46至51)及/或SEQ ID NO: 4 (相應於Munc18 (亦即SEQ ID NO: 1)之位置63至66)競爭的肽對干擾在Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用優於位於Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用之表面上的其他序列。該肽(本發明之肽)顯示出有效干擾在Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用。另外,該等肽顯示出直接的肌肉鬆弛效應,因為彼等具有藉由調節涉及肌肉收縮之基因及調節鈣動員而直接作用在肌肉細胞上的能力,亦即作用在突觸後側上,如其他的肽所見(Schagen, S.K. (2017)Topical treatments with effective anti-aging results , Cosmetics, 4, 16;PCT專利申請案WO2006047900)。因此,藉由容許有效的抑制神經元中的乙醯膽鹼釋放及調節肌肉細胞上的基因表現和減少肌肉細胞上的鈣動員而在突觸前側及突觸後側二者中顯示出效應。因此,本發明之肽解決上述問題且可用於治療與神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的美容學標誌及疾病二者。
發明人不知道任何提供干擾Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用以抑制神經遞質釋放(且因此抑制神經元胞吐作用)及肌肉收縮性之分子的先前技術。
在第一態樣中,本發明係指能藉由與Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用之表面的特定區域競爭而干擾Munc18-突觸融合蛋白-1複合物交互作用之肽。更確切地,本發明之肽係與SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO:4競爭,該兩個序列係位於Munc18中,在與突觸融合蛋白-1交互作用之其表面上。
在第二態樣中,本發明係指包含本發明之肽(本發明之一種肽或其組合)的組成物。
在另一態樣中,本發明係指本發明之組成物或肽,其係用於作為藥劑,更確切地用於預防、改善及/或治療神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患,甚至更確切地用於預防、改善及/或治療與SNARE複合物形成失調、橫紋肌收縮失調、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放失調及/或Ca2+ 通道激活失調相關聯的疾病。
在第四態樣中,本發明係指用於預防、改善及/或治療神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患,更確切地用於預防、改善及/或治療與SNARE複合物形成失調、橫紋肌收縮失調、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放失調及/或Ca2+ 通道激活失調相關聯的疾病之方法,其包含對有其需要的個體投予本發明之肽或組成物。
此外,本發明之第五態樣係指本發明之肽或組成物用於作為化妝品之用途,該化妝品係用於預防、減少及/或消除與個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的美容學標誌,更特別為皮膚老化或表情標誌。
在第六態樣中,本發明係指本發明之肽或組成物的化妝品用途,其係預防、減少及/或消除與個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的美容學標誌,更特別為皮膚老化或表情標誌。
在第七態樣中,本發明係指預防、減少及/或消除與有其需要之個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的美容學標誌(更特別為皮膚老化或表情標誌)之方法,其特徵在於包含使用本發明之肽或組成物。
如本文所使用之術語「非環狀脂族基」及其複數具有在現有技術中對該術語給出之共同意義。因此,該等術語係指例如且不限於直鏈或支鏈烷基、烯基和炔基。
如本文所使用之術語「烷基」及其複數係指具有介於1與24個之間,較佳為介於1與16個之間,更佳為介於1與14個之間,甚至更佳為介於1與12個之間,且甚至仍更佳為介於1、2、3、4、5或6個碳原子及其以單鍵結合至分子的其餘部分之飽和、直鏈或支鏈基,包括例如且不限於甲基、乙基、異丙基(isopropyl)、正丙基、異丙基(i-propyl)、異丁基、三級丁基、正丁基、二級丁基、正戊基、正己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基、月桂基、十六烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基、2-甲基丁基、5-甲基己基及類似者。烷基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「烯基」及其複數係指具有介於2與24個之間,較佳為介於2與16個之間,更佳為介於2與14個之間,甚至更佳為介於2與12個之間,甚至又更佳為2、3、4、5或6個碳原子、具有一或多個碳-碳雙鍵,較佳為具有1、2或3個碳-碳雙鍵、經共軛或未經共軛、其通過單鍵結合至分子的其餘部分之直鏈或支鏈基,包括例如且不限於乙烯基、油烯基、亞油烯基及類似基團。烯基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「炔基」及其複數係指具有介於2與24個之間,較佳為介於2與16個之間,更佳為介於2與14個之間,甚至更佳為介於2與12個之間,甚至又更佳為2、3、4、5或6個碳原子、具有一或多個碳-碳參鍵,較佳為具有1、2或3個碳-碳參鍵、經共軛或未經共軛、其通過單鍵結合至分子的其餘部分之直鏈或支鏈基,包括例如且不限於乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、戊炔基(諸如1-戊炔基)及類似基團。炔基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「脂環族基」及其複數具有在現有技術中對該術語給出之共同意義。因此,所使用之該等術語係指例如且不限於環烷基或環烯基或環炔基。
如本文所使用之術語「環烷基」及其複數係指具有介於3與24個之間,較佳為介於3與16個之間,更佳為介於3與14個之間,甚至更佳為介於3與12個之間,甚至又更佳為3、4、5或6個碳原子且其通過單鍵結合至分子的其餘部分之飽和單-或多環脂族基,包括例如且不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、甲基環己基、二甲基環己基、八氫茚、十氫萘、十二氫迫苯并萘、金剛烷基及類似基團,且其可隨意地經一或多個基團取代,諸如烷基、鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「環烯基」及其複數係指具有介於5與24個之間,較佳為介於5與16個之間,更佳為介於5與14個之間,甚至更佳為介於5與12個之間,甚至又更佳為5或6個碳原子、具有一或多個碳-碳雙鍵,較佳為具有1、2或3個碳-碳雙鍵、經共軛或未經共軛、其通過單鍵結合至分子的其餘部分之非芳族單-或多環脂族基,包括例如且不限於環戊-1-烯-1-基及類似基團,且其可隨意地經一或多個基團取代,諸如烷基、鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「環炔基」及其複數係指具有介於8與24個之間,較佳為介於8與16個之間,更佳為介於8與14個之間,甚至更佳為介於8與12個之間,甚至又更佳為8或9個碳原子、具有一或多個碳-碳參鍵,較佳為具有1、2或3個碳-碳參鍵、經共軛或未經共軛、其通過單鍵結合至分子的其餘部分之非芳族單-或多環脂族基,包括例如且不限於環辛-2-炔-1-基及類似基團,且其可隨意地經一或多個基團取代,諸如烷基、鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「芳基」及其複數係指具有介於6與30個之間,較佳係介於6與18個之間,更佳介於6與10之間,甚至更佳為6或10個碳原子、其包含1、2、3或4個芳族環、藉由碳-碳鍵結合或稠合,且其通過單鍵結合至分子的其餘部分之芳族基,尤其包括例如且不限於苯基、萘基、二苯基、茚基、菲基或蒽基。芳基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「芳烷基」及其複數係指經具有介於7與24個碳原子的芳族基取代之烷基,及包括例如且不限於-(CH2 )1-6-苯基、-(CH2 )1-6-(1-萘基)、-(CH2 )1-6-(2-萘基)、-(CH2 )1-6-CH(苯基)2 及類似者。芳烷基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「雜環基」及其複數係指3至10員雜環基或烴環,其中環原子中之一或多者,較佳為環原子中之1、2或3個為不同於碳的元素,諸如氮、氧或硫,且可為飽和和不飽和。出於本發明之目的,雜環基可為環、單環、雙環或參環系統,其可包括稠環系統;且氮、碳或硫原子可隨意地於雜環基中氧化;氮原子可隨意地四級化;且雜環基可部分或完全飽和或可為芳族性。隨著漸增的優先選擇,術語雜環基關於5或6員環。雜環基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「雜芳基烷基」及其複數係指經取代或未經取代之芳族雜環基取代之烷基,烷基具有介於1至6個碳原子及芳族雜環基具有介於2至24個碳原子和1至3個非碳以外的原子,且包括例如且不限於-(CH2 )1-6-咪唑基、-(CH2 )1-6-三唑基、-(CH2 )1-6-噻吩基、-(CH2 )1-6-呋喃基、-(CH2 )1-6-吡咯啶基及類似者。雜芳基烷基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本發明文件中所使用之術語「鹵基」或「鹵素」係指氟、氯、溴或碘,且其陰離子被稱為鹵化物。
如本文所使用之術語「衍生物」及其複數同時係指化妝品可接受的化合物,亦即衍生自可用於製備化妝品之關注的化合物,及化妝品不可接受的化合物,因為該等可用於製備化妝品可接受的衍生物。術語「衍生物」及其複數同時亦指醫藥上可接受的化合物,亦即衍生自可用於製備藥劑之關注的化合物,及醫藥上不可接受的化合物,因為該等可用於製備醫藥上可接受的衍生物。
如本發明文件中所使用之術語「鹽」及其複數係指現有技術中已知的那些任何類型的鹽,例如鹵鹽、羥酸鹽(諸如含氧酸鹽、酸鹽、鹼鹽和複鹽(double salt))、羥合鹽(hydroxo salt)、混合鹽、含氧鹽或其他的水合鹽。該術語同時包含化妝品及/或醫藥上可接受的鹽及化妝品及/或醫藥上不可接受的鹽,因為後者可用於製備化妝品及/或醫藥上可接受的鹽。
如本發明文件中所使用之術語「異構物」及其複數係指光學異構物、鏡像異構物、立體異構物或非鏡像異構物。個別的鏡像異構物或非鏡像異構物,以及彼等混合物可以現有技術中已知的慣例技術分離。
如本文所使用之術語「溶劑合物」及其複數係指現有技術中已知的任何溶劑合物,諸如極性、非極性或兩性溶劑合物,且包括任何化妝品可接受的溶劑合物,當投予或施予關注之個體時(直接或間接),其提供關注之化合物(本發明之肽或肽類)。溶劑合物較佳為水合物、具有醇(諸如甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇)之溶劑合物、具有酯(諸如乙酸乙酯)之溶劑合物、具有醚(諸如甲醚、乙醚或THF (四氫呋喃))之溶劑合物或具有DMF (二甲基甲醯胺)之溶劑合物,且更佳為水合物或具有醇(諸如乙醇)之溶劑合物。
另外,如本文所使用之術語「胺基酸」及其複數包括以基因密碼編碼之胺基酸以及未經編碼之胺基酸,不論彼等是否為天然或非天然且不論彼等是否為D-和L-胺基酸。未經編碼之胺基酸的實例尤其為而不限於瓜胺酸、鳥胺酸、肌胺酸、鎖鏈素(desmosine)、正纈胺酸、4-胺基丁酸、2-胺基丁酸、2-胺基異丁酸、6-胺基己酸、1-萘基丙胺酸、2-萘基丙胺酸、2-胺基苯甲酸、4-胺基苯甲酸、4-氯苯基丙胺酸、2,3-二胺基丙酸、2,4-二胺基丁酸、環絲胺酸、肉鹼、半胱胺酸、青黴胺、焦麩胺酸、噻吩基丙胺酸、羥基脯胺酸、別異白胺酸、別蘇胺酸、六氫異煙酸(isonipecotic acid)、異絲胺酸、苯基甘胺酸、斯他汀(statin)、β-丙胺酸、正白胺酸、N-甲基胺基酸、α-胺基酸和β-胺基酸,以及彼等之衍生物。不過,在現有技術中已知更多非天然胺基酸(參見例如“Unusual amino acids in peptide synthesis ” by D. C. Roberts and F. Vellaccio, The Peptides, Vol. 5 (1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds., Academic Press, New York, USA)。
如本文所使用之「表情紋」為由負責在臉部皮膚上引起臉部表情的臉部肌肉收縮而施加之壓力引起的皺紋。該皺紋經常位於前額、眉毛間、嘴周圍及/或眼睛周圍。
如先前於第一態樣中所述,本發明係指能干擾Munc18-突觸融合蛋白-1複合物交互作用之肽、其可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或其混合物,該肽的特徵在於與SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4競爭。
預期用於或存在於發明之肽中的胺基酸為L-胺基酸、D-胺基酸或彼等之組合。在較佳的實施態樣中,用於或存在於本發明之肽中的胺基酸為L-胺基酸。
上述之異構物較佳為立體異構物。預期該立體異構物為鏡像異構物或非鏡像異構物。因此,在本發明之較佳的實施態樣中,肽為消旋性混合物、非鏡像異構物混合物、純鏡像異構物或純非鏡像異構物。
預期本發明之肽包含至少一個結合在其N-端及/或在其C-端之部分。該至少一個部分可以現有技術中已知的任何方式結合至肽,較佳地經共價結合。在較佳的實施態樣中,肽包含至少一個經共價結合至其N-端之部分及至少一個經共價結合至其C-端之部分。
在一實施態樣中,至少一個N-端部分(較佳為一個N-端部分)係選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之芳烷基和R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈。至少一個N-端部分(較佳為一個N-端部分)更佳地選自H或R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈。至少一個N-端部分(較佳為一個N-端部分)甚至更佳地選自H、乙醯基(下文的Ac)、三級丁醯基、己醯基、2-甲基己醯基、環己烷羧基、辛醯基、癸醯基、月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基(以下的Pal)、硬脂醯基、油醯基和亞麻油醯基。在最佳的實施態樣中,至少一個N-端部分(較佳為一個N-端部分)為Ac。
在一實施態樣中,至少一個C-端部分(較佳為一個C-端部分)係選自H、-NR3 R4 -、-OR3 和-SR3 ,其中R3 和R4 係獨立地選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基及經取代或未經取代之芳烷基。在最佳的實施態樣中,至少一個C-端部分(較佳為一個C-端部分)為NH2 。
因此,本發明之肽更佳地包含一個結合至N-端之部分及一個結合至C-端之部分,其中結合至N-端之部分為Ac及結合至C-端之部分為NH2 。
在一實施態樣中,本發明之肽的序列為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4 (如上文所述,該肽可包含至少一個結合至其N-端之部分及/或至少一個結合至其C-端之部分,其更佳地包含一個結合至N-端之部分及一個結合至C-端之部分,其中結合至N-端之部分為Ac及結合至C-端之部分為NH2 )。預期本發明之肽具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少70%之一致性的序列,甚至更佳地具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少80%之一致性的序列,甚至更佳地具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少90%之一致性的序列,甚至更佳地具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少95%之一致性的序列,且甚至更佳地具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少99%之一致性的序列。
在較佳的實施態樣之一者中,本發明之肽的序列係依照式(I):
彼等之化妝品及醫藥上可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或上述之混合物,其中:
AA1 係選自具有正荷電側鏈或極性未荷電側鏈之胺基酸群組;
AA2 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組;
AA3 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組;
AA4 係選自具有荷電側鏈之胺基酸群組;
AA5 係選自具有非極性疏水性側鏈或芳族側鏈之胺基酸群組;
AA6 為Trp;
R1 係選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之芳烷基和R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈;且
R2 係選自H、-NR3 R4 -、-OR3 和-SR3 ,其中R3 和R4 係獨立地選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、和經取代或未經取代之芳烷基。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(I)中:
AA1 為His;
AA2 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組;
AA3 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組;
AA4 係選自具有荷電側鏈之胺基酸群組;
AA5 係選自Met或具有芳族側鏈之胺基酸群組;且
AA6 為Trp。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(I)中:
AA1 為His;
AA2 係選自Gly、Ala、Val、Leu、Met和Ile之群組;
AA3 係選自Gly、Ala、Val、Leu、Met和Ile之群組;
AA4 係選自Lys、Arg、His、Asp和Glu之群組;
AA5 係選自Met、Phe、Tyr和Trp之群組;且
AA6 為Trp。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(I)中:
AA1 為His;
AA2 係選自Ala和Ile之群組;
AA3 係選自Leu和Met之群組;
AA4 係選自Arg和Asp之群組;
AA5 係選自Met、Phe和Trp之群組;且
AA6 為Trp。
甚至更佳地,在此較佳的實施態樣中,依照本發明之肽的序列為:
R1 較佳地選自H或R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈。R1 甚至更佳地選自H、乙醯基(以下的Ac)、三級丁醯基、己醯基、2-甲基己醯基、環己烷羧基、辛醯基、癸醯基、月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基(以下的Pal)、硬脂醯基、油醯基和亞麻油醯基。R1 甚至更佳為Ac。
R2 較佳為NH2 。
因此,更佳地R1 為Ac,且R2 為NH2 。
因此,在此較佳的實施態樣中,依照本發明之肽的序列較佳為:
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽的序列具有式(II):
彼等之化妝品及醫藥上可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或上述之混合物,其中:
AA1 係選自具有正荷電側鏈之胺基酸群組;
AA2 為任何胺基酸;
AA3 係選自具有正荷電側鏈之胺基酸群組;
AA4 係選自具有芳族側鏈之胺基酸群組;
R1 係選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之芳烷基和R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈;且
R2 係選自H、-NR3 R4 -、-OR3 和-SR3 ,其中R3 和R4 係獨立地選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、和經取代或未經取代之芳烷基。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(II)中:
AA1 係選自Lys、Arg和His之群組:
AA2 為任何胺基酸;
AA3 係選自Lys、Arg和His之群組:且
AA4 係選自Phe、Tyr和Trp之群組。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(II)中:
AA1 係選自Arg之群組:
AA2 為任何胺基酸;
AA3 係選自Arg之群組:且
AA4 係選自Phe之群組。
甚至更佳地,在此較佳的實施態樣中,依照本發明之肽的序列為:
R1 較佳地選自H或R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈。R1 甚至更佳地選自H、乙醯基Ac、三級丁醯基、己醯基、2-甲基己醯基、環己烷羧基、辛醯基、癸醯基、月桂醯基 肉豆蔻醯基、Pal、硬脂醯基、油醯基和亞麻油醯基。R1 甚至更佳為Ac。
R2 較佳為NH2 。
因此,更佳地,R1 為Ac,且R2 為NH2 。
因此,在此較佳的實施態樣中,依照本發明之肽的序列為:
本發明之肽可以現有技術中已知的任何方式合成及生產。例如,彼等可藉由令該肽表現在細胞培養物中的化學合成法(較佳地藉助於固相肽合成法)或藉助於轉基因生產植物或動物中的肽而合成及生產。另外,本發明之肽可以現有技術中已知的任何方式純化。
如下列包括的實例可看出本發明之肽對Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用提供有效的干擾,導致在突觸前水平下抑制乙醯膽鹼釋放且因此抑制肌肉收縮。亦如下列包括的實例可推論出本發明之肽係藉由直接在肌肉細胞中誘導肌肉鬆弛而於突觸後水平下具有直接的效應。因此,本發明之肽解決上述問題,且提供能治療(預防、減少及/或消除)美學標誌及/或與神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的疾病之額外或替代的肽。
在第二態樣中,本發明係指包含依照本發明之至少一種肽的組成物。
預期本發明之組成物包含一種類型的本發明之肽或不同類型的本發明之肽的組合或混合物。
在較佳的實施態樣中,本發明之組成物為化妝品組成物。
本發明之化妝品組成物包含化妝品有效量的至少一種本發明之肽。本發明之化妝品組成物更佳地包含0.0001%至0.05% (m/v)的至少一種本發明之肽,更佳為0.0005%至0.005% (m/v)的至少一種本發明之肽,且甚至更佳為0.05%至0.001% (m/v)的至少一種本發明之肽。
由於本發明之肽的活性(亦即抑制Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用,且因此抑制神經遞質釋放及調節肌肉收縮),使本發明之化妝品組成物提供預防、減少及/或消除皮膚老化及/或表情標誌(較佳為皺紋)。更確切地,本發明之化妝品組成物提供預防、減少及/或消除臉部表情紋,更佳為前額的皺紋、眉毛間的皺紋及/或嘴周圍及/或眼睛周圍的皺紋和細紋。
預期本發明之化妝品組成物亦包含至少一種額外的化妝品成分。該額外的化妝品成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的化妝品活性成分。
額外的化妝品成分包含那些現有技術中經常使用之成分,例如佐劑(諸如穩定劑、增溶劑、維生素、著色劑和香料)、載劑及/或其他的化妝品活性成分。
該額外的化妝品成分必須與組成物之其餘組分及尤其與本發明之組成物包含的本發明之肽在物理及化學上可相容。同樣地,該額外的化妝品成分之性質不會不可接受地改變本發明之肽及組成物的優勢。該額外的化妝品成分可為合成或天然來源,諸如植物萃取物,或彼等可衍生自生物發酵過程(參見例如第11版(2006) CTFA化妝品成分手冊(Cosmetic Ingredient Handbook))。
預期上述額外的化妝品成分包含那些常用於護理、清潔皮膚及/或頭髮之組成物;及/或用於防止多汗症之除臭劑及/或乳霜中的成分,諸如尤其為抑制黑色素合成之劑、增白劑或去色素劑、抗老化劑、抑制NO-合成酶之劑、抗氧化劑、抗大氣污染劑及/或自由基誘捕劑、抗糖化劑、乳化劑、潤膚劑、有機溶劑、液體推進劑、皮膚調理劑,諸如濕潤劑、保濕物質、α羥酸、保濕劑、維生素、顏料或著色劑、染料、膠凝聚合物、增稠劑、界面活性劑、軟化劑、其他的抗皺紋劑、能減小或消除眼袋之劑、剝離劑、抗微生物劑、抗真菌劑、殺菌劑、刺激真皮或表皮巨分子合成及/或能預防或抑制彼等降解之劑,諸如刺激膠原蛋白合成之劑、刺激彈力蛋白合成之劑、刺激層黏連蛋白合成之劑、抑制膠原蛋白降解之劑、抑制彈力蛋白降解之劑、刺激纖維母細胞增殖生之劑、刺激角質化細胞增生之劑、刺激角質化細胞分化之劑、刺激脂質合成和角質層組分(腦醯胺、脂肪酸等)合成之劑、皮膚鬆弛劑(dermorelaxing agent)、刺激糖胺聚多醣合成之劑、DNA修補劑、DNA保護劑、刺激生物體中沈澱(proteasome)活性之劑、抗搔癢劑、治療敏感性皮膚之劑、緊緻劑(reaffirming agent)、收斂劑、皮脂生產調節劑、刺激脂質分解之劑、抗脂肪團劑(anti-cellulite agent)、鎮定劑(calming agent)、抗發炎劑、作用於毛細循環及/或微循環之劑、作用於細胞粒腺體之劑、意欲改進真皮-表皮接合之劑、保存劑、香料、螯合劑、植物萃取物、精油、海藻萃取物、衍生自生物發酵過程之劑、無機鹽、細胞萃取物及/或防曬劑(solar filter)(對紫外線A和B具活性之有機或無機光保護劑)。
在一實施態樣中,額外的化妝品成分中之至少一者為化妝品活性主體或物質,其可施加與那些上文以本發明之肽所揭示者相同、類似、輔助或不同的化妝品活性。預期本發明之化妝品組成物包含其他的抗皺紋劑或抗老化劑,例如膠原蛋白、彈力蛋白、生長因子、玻尿酸加強劑、屏障功能劑、增亮劑(illuminating agent)、刺激膠原蛋白I、III、IV及/或VI和層黏連蛋白的表現及/或合成之劑、刺激糖胺聚多醣或玻尿酸合成之劑、刺激彈力蛋白和其他彈性纖維相關蛋白的表現及/或合成之劑、抑制膠原蛋白及/或彈性纖維降解之劑、刺激粒腺體相關蛋白(例如長壽基因(sirtuin)和烏頭酸酶)的表現及/或合成之劑、刺激局部黏附蛋白的表現及/或合成之劑、刺激角質化細胞及/或纖維母細胞增生及/或分化之劑、抗氧化劑、抗大氣污染劑及/或自由基誘捕劑、抗糖化劑、解毒劑、降低自然性老化(chronological aging)、環境性老化和發炎性老化之劑、及降低黑色素生產及/或抑制酪胺酸酶之劑、及/或刺激脂質合成和表皮(角蛋白)組分,且更尤其為角質層(角蛋白、腦醯胺、絲聚蛋白(filaggrin)、兜甲蛋白(loricrin)和SPRR1B)的合成之劑。額外的化妝品成分中之至少一者更佳為Argireline® (乙醯基六肽-8)、Leuphasyl® (五肽-3)、Inyline® (乙醯基六肽-30)、Syn-Ake® (三肽-3)或彼等之組合。
另外,本發明之化妝品組成物(或本發明之肽)可調配成現有技術中經常使用之任何形式,例如溶液、懸浮液、乳液、漿液、凝膠、乳霜、粉末、噴霧、洗液、油、擦劑、血清、慕斯、軟膏、棒或筆,包括「留置型(leave on)」和「洗淨型(rinse-off)」調配物。本發明之化妝品組成物亦可藉助於現有技術中已知的技術併入不同類型的固體配件中,諸如濕巾、水凝膠、黏著性(或非黏著性)貼片或面膜,或其可能併入不同的化妝系列產品中,諸如尤其為遮瑕膏(concealer)、化妝粉底、洗液或卸妝水。
亦預期如本文所揭示的本發明之化妝品組成物或本發明之肽二者亦可出於獲得更大的活性成分穿透之目的而併入化妝品持續釋放系統及/或載劑中,諸如脂質體、毫米粒子(milliparticle)、微米粒子和奈米粒子,以及併入海綿、囊泡、微胞、毫米球、微米球、奈米球、脂質球、毫米膠囊、微米膠囊和奈米膠囊中,以及併入微乳液和奈米乳液中。
在較佳的實施態樣中,本發明之化妝品組成物適合或適用於藉助電離子透入法施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之化妝品組成物適合或適用於藉助皮下注射施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在最佳的實施態樣中,本發明之化妝品組成物適合或適用於局部(更佳地呈乳霜形式)施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之組成物為醫藥組成物。
預期本發明之組成物包含一種類型的本發明之肽或不同類型的本發明之肽的組合或混合物。
本發明之醫藥組成物包含醫藥有效量的至少一種本發明之肽。
由於本發明之肽的活性(亦即抑制神經遞質釋放及調節肌肉收縮),使本發明之醫藥組成物提供預防及/或治療神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患相關聯的疾病,更確切地預防及/或治療與SNARE複合物形成失調、橫紋肌收縮失調、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放失調及/或Ca2+ 通道激活失調相關聯的疾病,較佳為老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、慢性偏頭痛、肥大細胞增多症、緊張不全或焦慮症疾患。
本發明之醫藥組成物亦提供治療肌僵直、肌緊張性營養障礙、先天性肌僵直、帕金森氏症、繼發性帕金森氏症、亨汀頓氏症、痙攣、遲發性不自主運動(TD)或緊張不全(瞼痙攣、麥傑症候群(Meige syndrome)、手抽筋、肢體緊張不全或斜視)。
醫藥組成物可呈現有技術中已知的任何形式,其適合於所選擇的途徑。預期本發明之醫藥組成物適合或適用於現有技術中已知的任何方式及任何途徑投予(例如皮下、肌肉內、靜脈內或經口;在後者的例子中,例如呈鹽水溶液及/或生物可降解的材料(諸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯及/或膽固醇之聚合物)之形式。
預期本發明之醫藥組成物亦包含至少一種額外的醫藥成分。該額外的醫藥成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的醫藥活性成分。預期至少一種額外的醫藥活性成分為苯并二氮呯、氯硝西泮(Clonazepam)、蘿拉西泮(Lorazepam)、地西泮(Diazepam)、貝可芬(Baclofen)、抗膽鹼能劑、苯海索(Trihexyphenidyl)、苯甲托品(Benztropine)、多巴胺耗損劑、丁苯那嗪(Tetrabenazine)、氯氮平(Clozapine)或彼等之組合。
在如上文所述之第三態樣中,本發明係指用於藥劑中的依照本發明之肽或組成物(亦即依照上文所述者)。
如上文所述及自下文所包括的實例可直接推論本發明之肽(及由此包含彼等之組成物)能抑制乙醯膽鹼釋放及肌肉收縮,且由於該活性而使彼等因此可用於作為藥劑。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽或組成物係用於預防及/或治療(較佳為治療)神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患。
肌肉收縮性疾患較佳為肌肉過度收縮。
神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患較佳為與SNARE複合物形成、橫紋肌收縮、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放及/或Ca2+ 通道激活之失調相關聯的疾病。
神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患更佳地選自老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、肥大細胞增多症、慢性偏頭痛、緊張不全或焦慮症疾患。
因此,在較佳的實施態樣中,本發明之肽或組成物係用於預防及/或治療老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、肥大細胞增多症、慢性偏頭痛、緊張不全或焦慮症疾患。關於該等疾病,以老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、慢性偏頭痛和焦慮症疾患為神經元胞吐作用疾患。另一方面,以緊張不全為肌肉收縮性疾患。
緊張不全較佳地選自瞼痙攣、麥傑症候群、手抽筋、肢體緊張不全或斜視。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽或組成物係用於預防及/或治療肌僵直、肌緊張性營養障礙、先天性肌僵直、帕金森氏症、繼發性帕金森氏症、亨汀頓氏症、痙攣或遲發性不自主運動(TD)。該等疾病為肌肉收縮性疾患。
肽或本發明之組成物較佳地以治療有效量使用。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽及組成物係用於哺乳動物,更佳地用於人類。
在較佳的實施態樣中,組成物為依照上文所述之醫藥組成物。
本發明之肽或組成物可以現有技術中已知的任何方式或通過已知的任何途徑使用。在任何例子中,肽或組成物適用於所選擇的方式及/或途徑(例如皮下、肌肉內、靜脈內或經口;在後者的例子中,例如呈鹽水溶液及/或生物可降解的材料(諸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯及/或膽固醇之聚合物)之形式。
在第四態樣中,本發明係指用於預防及/或治療(較佳為治療)神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患之方法,其包含對有其需要的個體投予本發明之肽或組成物。
肌肉收縮性疾患較佳為肌肉過度收縮。
神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患較佳為與SNARE複合物形成失調、橫紋肌收縮失調、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放失調及/或Ca2+ 通道激活失調相關聯的疾病。
神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患更佳地選自老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、肥大細胞增多症、慢性偏頭痛、緊張不全或焦慮症疾患。
關於該等疾病,以老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、慢性偏頭痛和焦慮症疾患為神經元胞吐性疾患。另一方面,以緊張不全為肌肉收縮性疾患。
緊張不全較佳地選自瞼痙攣、麥傑症候群、手抽筋、肢體緊張不全或斜視。
在另一較佳的實施態樣中,神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患為選自肌僵直、肌緊張性營養障礙、先天性肌僵直、帕金森氏症、繼發性帕金森氏症、亨汀頓氏症、痙攣或遲發性不自主運動(TD)之肌肉收縮性疾患。
本發明之肽或組成物較佳地以治療有效量使用。
在較佳的實施態樣中,需要本發明之治療方法的個體為哺乳動物,更佳為人類。
在較佳的實施態樣中,組成物為依照上文所述之醫藥組成物。
本發明之肽或組成物可以現有技術中已知的任何方式或通過已知的任何途徑使用。在任何例子中,肽或組成物適用於所選擇的方式及/或途徑(例如皮下、肌肉內、靜脈內或經口;在後者的例子中,例如呈鹽水溶液及/或生物可降解的材料(諸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯及/或膽固醇之聚合物)之形式。
在如上文所述之第五態樣中,本發明係指本發明之肽或化妝品組成物用於作為化妝品之用途,該化妝品係用於預防、減少及/或消除與個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的標誌之化妝品。
顯然地,上述之標誌為美容學標誌。
肌肉收縮性失調較佳為肌肉過度收縮。
與神經元胞吐作用及/或肌肉過度收縮失調有關的美容學標誌較佳為皮膚老化及/或表情標誌。
皮膚老化的美容學標誌較佳為皺紋。
在最佳的實施態樣中,皮膚老化及/或表情標誌為臉部皺紋(較佳為表情標誌)及/或臉部不對稱。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於電離子透入法施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於皮下注射施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在最佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係以局部(更佳地呈乳霜形式)施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
個體較佳為哺乳動物,甚至更佳為人類。
另外,在用於作為本發明之化妝品中,本發明之肽或化妝品組成物係以化妝品有效量使用。本發明之肽更佳地係以0.0001%至0.05% (m/v),更佳為0.0005%至0.005% (m/v),且甚至更佳為0.05%至0.001% (m/v)之濃度使用。
預期如上文所述的本發明之化妝品組成物亦包含至少一種額外的化妝品成分。該額外的化妝品成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的化妝品活性成分,其可如上文所解釋。亦預期本發明之肽係與依照上文所述之至少一種額外的化妝品成分組合使用。
另外,本發明之肽及本發明之化妝品組成物可調配成現有技術中經常使用之任何形式,例如溶液、懸浮液、乳液、漿液、凝膠、乳霜、粉末、噴霧、洗液、油、擦劑、血清、慕斯、軟膏、棒或筆,包括「留置型」和「洗淨型」調配物。本發明之肽及化妝品組成物亦可藉助於現有技術中已知的技術併入不同類型的固體配件中,諸如濕巾、水凝膠、黏著性(或非黏著性)貼片或面膜,或其可能併入不同的化妝系列產品中,諸如尤其為遮瑕膏、化妝粉底、洗液或卸妝水。
亦預期如本文所揭示的本發明之化妝品組成物或本發明之肽二者亦可出於獲得更大的活性成分穿透之目的而併入化妝品持續釋放系統及/或載劑中,諸如脂質體、毫米粒子、微米粒子和奈米粒子,以及併入海綿、囊泡、微胞、毫米球、微米球、奈米球、脂質球、毫米膠囊、微米膠囊和奈米膠囊中,以及併入微乳液和奈米乳液中。
在第六態樣中,本發明係指本發明之肽或化妝品組成物的化妝品用途(亦即如上文所解釋),其係預防、減少及/或消除與個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的標誌。
顯然地,上述之標誌為美容學標誌。
肌肉收縮性失調較佳為肌肉過度收縮。
與神經元胞吐作用及/或肌肉過度收縮失調有關的美容學標誌較佳為皮膚老化及/或表情標誌。
皮膚老化的美容學標誌較佳為皺紋。
在最佳的實施態樣中,皮膚老化及/或表情標誌為表情臉部皺紋(較佳為表情紋)及/或臉部不對稱。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於電離子透入法施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於皮下注射施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體的臉部及/或頸部。
在最佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係以局部(更佳地呈乳霜形式)施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
個體較佳為哺乳動物,甚至更佳為人類。
另外,在本發明之化妝品用途中,本發明之肽或化妝品組成物係以化妝品有效量使用。本發明之肽更佳地係以0.0001%至0.05% (m/v),更佳為0.0005%至0.005% (m/v),且甚至更佳為0.05%至0.001% (m/v)之濃度使用。
預期如上文所述的本發明之化妝品組成物亦包含至少一種額外的化妝品成分。該額外的化妝品成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的化妝品活性成分,其可如上文所解釋。亦預期本發明之肽係與依照上文所述之至少一種額外的化妝品成分組合使用。
另外,本發明之肽及本發明之化妝品組成物可調配成現有技術中經常使用之任何形式,例如溶液、懸浮液、乳液、漿液、凝膠、乳霜、粉末、噴霧、洗液、油、擦劑、血清、慕斯、軟膏、棒或筆,包括「留置型」和「洗淨型」調配物。本發明之肽及化妝品組成物亦可藉助於現有技術中已知的技術併入不同類型的固體配件中,諸如濕巾、水凝膠、黏著性(或非黏著性)貼片或面膜,或其可能併入不同的化妝系列產品中,諸如尤其為遮瑕膏、化妝粉底、洗液或卸妝水。
亦預期如本文所揭示的本發明之化妝品組成物或本發明之肽二者亦可出於獲得更大的活性成分穿透之目的而併入化妝品持續釋放系統及/或載劑中,諸如脂質體、毫米粒子、微米粒子和奈米粒子,以及併入海綿、囊泡、微胞、毫米球、微米球、奈米球、脂質球、毫米膠囊、微米膠囊和奈米膠囊中,以及併入微乳液和奈米乳液中。
在如上所述之第七態樣中,本發明係指預防及/或減少與有其需要之個體中的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的標誌之方法,其特徵在於包含使用依照本發明之肽或化妝品組成物。
上述之標誌為美容學標誌。
肌肉收縮性失調較佳為肌肉過度收縮。
與神經元胞吐作用及/或肌肉過度收縮失調有關的美容學標誌較佳為皮膚老化及/或表情標誌。
皮膚老化的美容學標誌較佳為皺紋。
在最佳的實施態樣中,皮膚老化及/或表情標誌為臉部皺紋(較佳為表情紋)及/或臉部不對稱。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於電離子透入法施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於皮下注射施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在最佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係以局部(更佳地呈乳霜形式)施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
個體較佳為哺乳動物,甚至更佳為人類。
另外,在本發明之方法中,本發明之肽或化妝品組成物係以化妝品有效量使用。本發明之肽更佳地係以0.0001%至0.05% (m/v),更佳為0.0005%至0.005% (m/v),且甚至更佳為0.05%至0.001% (m/v)之濃度使用。
預期如上文所述的本發明之化妝品組成物亦包含至少一種額外的化妝品成分。該額外的化妝品成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的化妝品活性成分,其可如上文所解釋。亦預期本發明之肽係與依照上文所述之至少一種額外的化妝品成分組合使用。
另外,本發明之肽及本發明之化妝品組成物可調配成現有技術中經常使用之任何形式,例如溶液、懸浮液、乳液、漿液、凝膠、乳霜、粉末、噴霧、洗液、油、擦劑、血清、慕斯、軟膏、棒或筆,包括「留置型」和「洗淨型」調配物。本發明之肽及化妝品組成物亦可藉助於現有技術中已知的技術併入不同類型的固體配件中,諸如濕巾、水凝膠、黏著性(或非黏著性)貼片或面膜,或其可能併入不同的化妝系列產品中,諸如尤其為遮瑕膏、化妝粉底、洗液或卸妝水。
亦預期如本文所揭示的本發明之化妝品組成物或本發明之肽二者亦可出於獲得更大的活性成分穿透之目的而併入化妝品持續釋放系統及/或載劑中,諸如脂質體、毫米粒子、微米粒子和奈米粒子,以及併入海綿、囊泡、微胞、毫米球、微米球、奈米球、脂質球、毫米膠囊、微米膠囊和奈米膠囊中,以及併入微乳液和奈米乳液中。
為了更好地理解,本發明係參考附圖而於下文更詳細地說明,附圖係以實例方式及參考例證性和非限制性實施例呈現。
在第二態樣中,本發明係指包含本發明之肽(本發明之一種肽或其組合)的組成物。
在另一態樣中,本發明係指本發明之組成物或肽,其係用於作為藥劑,更確切地用於預防、改善及/或治療神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患,甚至更確切地用於預防、改善及/或治療與SNARE複合物形成失調、橫紋肌收縮失調、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放失調及/或Ca2+ 通道激活失調相關聯的疾病。
在第四態樣中,本發明係指用於預防、改善及/或治療神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患,更確切地用於預防、改善及/或治療與SNARE複合物形成失調、橫紋肌收縮失調、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放失調及/或Ca2+ 通道激活失調相關聯的疾病之方法,其包含對有其需要的個體投予本發明之肽或組成物。
此外,本發明之第五態樣係指本發明之肽或組成物用於作為化妝品之用途,該化妝品係用於預防、減少及/或消除與個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的美容學標誌,更特別為皮膚老化或表情標誌。
在第六態樣中,本發明係指本發明之肽或組成物的化妝品用途,其係預防、減少及/或消除與個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的美容學標誌,更特別為皮膚老化或表情標誌。
在第七態樣中,本發明係指預防、減少及/或消除與有其需要之個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的美容學標誌(更特別為皮膚老化或表情標誌)之方法,其特徵在於包含使用本發明之肽或組成物。
如本文所使用之術語「非環狀脂族基」及其複數具有在現有技術中對該術語給出之共同意義。因此,該等術語係指例如且不限於直鏈或支鏈烷基、烯基和炔基。
如本文所使用之術語「烷基」及其複數係指具有介於1與24個之間,較佳為介於1與16個之間,更佳為介於1與14個之間,甚至更佳為介於1與12個之間,且甚至仍更佳為介於1、2、3、4、5或6個碳原子及其以單鍵結合至分子的其餘部分之飽和、直鏈或支鏈基,包括例如且不限於甲基、乙基、異丙基(isopropyl)、正丙基、異丙基(i-propyl)、異丁基、三級丁基、正丁基、二級丁基、正戊基、正己基、庚基、辛基、癸基、十二烷基、月桂基、十六烷基、十八烷基、戊基、2-乙基己基、2-甲基丁基、5-甲基己基及類似者。烷基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「烯基」及其複數係指具有介於2與24個之間,較佳為介於2與16個之間,更佳為介於2與14個之間,甚至更佳為介於2與12個之間,甚至又更佳為2、3、4、5或6個碳原子、具有一或多個碳-碳雙鍵,較佳為具有1、2或3個碳-碳雙鍵、經共軛或未經共軛、其通過單鍵結合至分子的其餘部分之直鏈或支鏈基,包括例如且不限於乙烯基、油烯基、亞油烯基及類似基團。烯基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「炔基」及其複數係指具有介於2與24個之間,較佳為介於2與16個之間,更佳為介於2與14個之間,甚至更佳為介於2與12個之間,甚至又更佳為2、3、4、5或6個碳原子、具有一或多個碳-碳參鍵,較佳為具有1、2或3個碳-碳參鍵、經共軛或未經共軛、其通過單鍵結合至分子的其餘部分之直鏈或支鏈基,包括例如且不限於乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、戊炔基(諸如1-戊炔基)及類似基團。炔基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「脂環族基」及其複數具有在現有技術中對該術語給出之共同意義。因此,所使用之該等術語係指例如且不限於環烷基或環烯基或環炔基。
如本文所使用之術語「環烷基」及其複數係指具有介於3與24個之間,較佳為介於3與16個之間,更佳為介於3與14個之間,甚至更佳為介於3與12個之間,甚至又更佳為3、4、5或6個碳原子且其通過單鍵結合至分子的其餘部分之飽和單-或多環脂族基,包括例如且不限於環丙基、環丁基、環戊基、環己基、環庚基、甲基環己基、二甲基環己基、八氫茚、十氫萘、十二氫迫苯并萘、金剛烷基及類似基團,且其可隨意地經一或多個基團取代,諸如烷基、鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「環烯基」及其複數係指具有介於5與24個之間,較佳為介於5與16個之間,更佳為介於5與14個之間,甚至更佳為介於5與12個之間,甚至又更佳為5或6個碳原子、具有一或多個碳-碳雙鍵,較佳為具有1、2或3個碳-碳雙鍵、經共軛或未經共軛、其通過單鍵結合至分子的其餘部分之非芳族單-或多環脂族基,包括例如且不限於環戊-1-烯-1-基及類似基團,且其可隨意地經一或多個基團取代,諸如烷基、鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「環炔基」及其複數係指具有介於8與24個之間,較佳為介於8與16個之間,更佳為介於8與14個之間,甚至更佳為介於8與12個之間,甚至又更佳為8或9個碳原子、具有一或多個碳-碳參鍵,較佳為具有1、2或3個碳-碳參鍵、經共軛或未經共軛、其通過單鍵結合至分子的其餘部分之非芳族單-或多環脂族基,包括例如且不限於環辛-2-炔-1-基及類似基團,且其可隨意地經一或多個基團取代,諸如烷基、鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「芳基」及其複數係指具有介於6與30個之間,較佳係介於6與18個之間,更佳介於6與10之間,甚至更佳為6或10個碳原子、其包含1、2、3或4個芳族環、藉由碳-碳鍵結合或稠合,且其通過單鍵結合至分子的其餘部分之芳族基,尤其包括例如且不限於苯基、萘基、二苯基、茚基、菲基或蒽基。芳基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「芳烷基」及其複數係指經具有介於7與24個碳原子的芳族基取代之烷基,及包括例如且不限於-(CH2 )1-6-苯基、-(CH2 )1-6-(1-萘基)、-(CH2 )1-6-(2-萘基)、-(CH2 )1-6-CH(苯基)2 及類似者。芳烷基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「雜環基」及其複數係指3至10員雜環基或烴環,其中環原子中之一或多者,較佳為環原子中之1、2或3個為不同於碳的元素,諸如氮、氧或硫,且可為飽和和不飽和。出於本發明之目的,雜環基可為環、單環、雙環或參環系統,其可包括稠環系統;且氮、碳或硫原子可隨意地於雜環基中氧化;氮原子可隨意地四級化;且雜環基可部分或完全飽和或可為芳族性。隨著漸增的優先選擇,術語雜環基關於5或6員環。雜環基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本文所使用之術語「雜芳基烷基」及其複數係指經取代或未經取代之芳族雜環基取代之烷基,烷基具有介於1至6個碳原子及芳族雜環基具有介於2至24個碳原子和1至3個非碳以外的原子,且包括例如且不限於-(CH2 )1-6-咪唑基、-(CH2 )1-6-三唑基、-(CH2 )1-6-噻吩基、-(CH2 )1-6-呋喃基、-(CH2 )1-6-吡咯啶基及類似者。雜芳基烷基可隨意地經一或多個取代基取代,諸如鹵基、羥基、烷氧基、羧基、羰基、氰基、醯基、烷氧基-羰基、胺基、硝基、巰基和烷氧硫基。
如本發明文件中所使用之術語「鹵基」或「鹵素」係指氟、氯、溴或碘,且其陰離子被稱為鹵化物。
如本文所使用之術語「衍生物」及其複數同時係指化妝品可接受的化合物,亦即衍生自可用於製備化妝品之關注的化合物,及化妝品不可接受的化合物,因為該等可用於製備化妝品可接受的衍生物。術語「衍生物」及其複數同時亦指醫藥上可接受的化合物,亦即衍生自可用於製備藥劑之關注的化合物,及醫藥上不可接受的化合物,因為該等可用於製備醫藥上可接受的衍生物。
如本發明文件中所使用之術語「鹽」及其複數係指現有技術中已知的那些任何類型的鹽,例如鹵鹽、羥酸鹽(諸如含氧酸鹽、酸鹽、鹼鹽和複鹽(double salt))、羥合鹽(hydroxo salt)、混合鹽、含氧鹽或其他的水合鹽。該術語同時包含化妝品及/或醫藥上可接受的鹽及化妝品及/或醫藥上不可接受的鹽,因為後者可用於製備化妝品及/或醫藥上可接受的鹽。
如本發明文件中所使用之術語「異構物」及其複數係指光學異構物、鏡像異構物、立體異構物或非鏡像異構物。個別的鏡像異構物或非鏡像異構物,以及彼等混合物可以現有技術中已知的慣例技術分離。
如本文所使用之術語「溶劑合物」及其複數係指現有技術中已知的任何溶劑合物,諸如極性、非極性或兩性溶劑合物,且包括任何化妝品可接受的溶劑合物,當投予或施予關注之個體時(直接或間接),其提供關注之化合物(本發明之肽或肽類)。溶劑合物較佳為水合物、具有醇(諸如甲醇、乙醇、丙醇或異丙醇)之溶劑合物、具有酯(諸如乙酸乙酯)之溶劑合物、具有醚(諸如甲醚、乙醚或THF (四氫呋喃))之溶劑合物或具有DMF (二甲基甲醯胺)之溶劑合物,且更佳為水合物或具有醇(諸如乙醇)之溶劑合物。
另外,如本文所使用之術語「胺基酸」及其複數包括以基因密碼編碼之胺基酸以及未經編碼之胺基酸,不論彼等是否為天然或非天然且不論彼等是否為D-和L-胺基酸。未經編碼之胺基酸的實例尤其為而不限於瓜胺酸、鳥胺酸、肌胺酸、鎖鏈素(desmosine)、正纈胺酸、4-胺基丁酸、2-胺基丁酸、2-胺基異丁酸、6-胺基己酸、1-萘基丙胺酸、2-萘基丙胺酸、2-胺基苯甲酸、4-胺基苯甲酸、4-氯苯基丙胺酸、2,3-二胺基丙酸、2,4-二胺基丁酸、環絲胺酸、肉鹼、半胱胺酸、青黴胺、焦麩胺酸、噻吩基丙胺酸、羥基脯胺酸、別異白胺酸、別蘇胺酸、六氫異煙酸(isonipecotic acid)、異絲胺酸、苯基甘胺酸、斯他汀(statin)、β-丙胺酸、正白胺酸、N-甲基胺基酸、α-胺基酸和β-胺基酸,以及彼等之衍生物。不過,在現有技術中已知更多非天然胺基酸(參見例如“Unusual amino acids in peptide synthesis ” by D. C. Roberts and F. Vellaccio, The Peptides, Vol. 5 (1983), Chapter VI, Gross E. and Meienhofer J., Eds., Academic Press, New York, USA)。
如本文所使用之「表情紋」為由負責在臉部皮膚上引起臉部表情的臉部肌肉收縮而施加之壓力引起的皺紋。該皺紋經常位於前額、眉毛間、嘴周圍及/或眼睛周圍。
如先前於第一態樣中所述,本發明係指能干擾Munc18-突觸融合蛋白-1複合物交互作用之肽、其可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或其混合物,該肽的特徵在於與SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4競爭。
預期用於或存在於發明之肽中的胺基酸為L-胺基酸、D-胺基酸或彼等之組合。在較佳的實施態樣中,用於或存在於本發明之肽中的胺基酸為L-胺基酸。
上述之異構物較佳為立體異構物。預期該立體異構物為鏡像異構物或非鏡像異構物。因此,在本發明之較佳的實施態樣中,肽為消旋性混合物、非鏡像異構物混合物、純鏡像異構物或純非鏡像異構物。
預期本發明之肽包含至少一個結合在其N-端及/或在其C-端之部分。該至少一個部分可以現有技術中已知的任何方式結合至肽,較佳地經共價結合。在較佳的實施態樣中,肽包含至少一個經共價結合至其N-端之部分及至少一個經共價結合至其C-端之部分。
在一實施態樣中,至少一個N-端部分(較佳為一個N-端部分)係選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之芳烷基和R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈。至少一個N-端部分(較佳為一個N-端部分)更佳地選自H或R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈。至少一個N-端部分(較佳為一個N-端部分)甚至更佳地選自H、乙醯基(下文的Ac)、三級丁醯基、己醯基、2-甲基己醯基、環己烷羧基、辛醯基、癸醯基、月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基(以下的Pal)、硬脂醯基、油醯基和亞麻油醯基。在最佳的實施態樣中,至少一個N-端部分(較佳為一個N-端部分)為Ac。
在一實施態樣中,至少一個C-端部分(較佳為一個C-端部分)係選自H、-NR3 R4 -、-OR3 和-SR3 ,其中R3 和R4 係獨立地選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基及經取代或未經取代之芳烷基。在最佳的實施態樣中,至少一個C-端部分(較佳為一個C-端部分)為NH2 。
因此,本發明之肽更佳地包含一個結合至N-端之部分及一個結合至C-端之部分,其中結合至N-端之部分為Ac及結合至C-端之部分為NH2 。
在一實施態樣中,本發明之肽的序列為SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4 (如上文所述,該肽可包含至少一個結合至其N-端之部分及/或至少一個結合至其C-端之部分,其更佳地包含一個結合至N-端之部分及一個結合至C-端之部分,其中結合至N-端之部分為Ac及結合至C-端之部分為NH2 )。預期本發明之肽具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少70%之一致性的序列,甚至更佳地具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少80%之一致性的序列,甚至更佳地具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少90%之一致性的序列,甚至更佳地具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少95%之一致性的序列,且甚至更佳地具有與SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4至少99%之一致性的序列。
在較佳的實施態樣之一者中,本發明之肽的序列係依照式(I):
彼等之化妝品及醫藥上可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或上述之混合物,其中:
AA1 係選自具有正荷電側鏈或極性未荷電側鏈之胺基酸群組;
AA2 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組;
AA3 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組;
AA4 係選自具有荷電側鏈之胺基酸群組;
AA5 係選自具有非極性疏水性側鏈或芳族側鏈之胺基酸群組;
AA6 為Trp;
R1 係選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之芳烷基和R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈;且
R2 係選自H、-NR3 R4 -、-OR3 和-SR3 ,其中R3 和R4 係獨立地選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、和經取代或未經取代之芳烷基。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(I)中:
AA1 為His;
AA2 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組;
AA3 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組;
AA4 係選自具有荷電側鏈之胺基酸群組;
AA5 係選自Met或具有芳族側鏈之胺基酸群組;且
AA6 為Trp。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(I)中:
AA1 為His;
AA2 係選自Gly、Ala、Val、Leu、Met和Ile之群組;
AA3 係選自Gly、Ala、Val、Leu、Met和Ile之群組;
AA4 係選自Lys、Arg、His、Asp和Glu之群組;
AA5 係選自Met、Phe、Tyr和Trp之群組;且
AA6 為Trp。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(I)中:
AA1 為His;
AA2 係選自Ala和Ile之群組;
AA3 係選自Leu和Met之群組;
AA4 係選自Arg和Asp之群組;
AA5 係選自Met、Phe和Trp之群組;且
AA6 為Trp。
甚至更佳地,在此較佳的實施態樣中,依照本發明之肽的序列為:
R1 較佳地選自H或R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈。R1 甚至更佳地選自H、乙醯基(以下的Ac)、三級丁醯基、己醯基、2-甲基己醯基、環己烷羧基、辛醯基、癸醯基、月桂醯基、肉豆蔻醯基、棕櫚醯基(以下的Pal)、硬脂醯基、油醯基和亞麻油醯基。R1 甚至更佳為Ac。
R2 較佳為NH2 。
因此,更佳地R1 為Ac,且R2 為NH2 。
因此,在此較佳的實施態樣中,依照本發明之肽的序列較佳為:
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽的序列具有式(II):
彼等之化妝品及醫藥上可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或上述之混合物,其中:
AA1 係選自具有正荷電側鏈之胺基酸群組;
AA2 為任何胺基酸;
AA3 係選自具有正荷電側鏈之胺基酸群組;
AA4 係選自具有芳族側鏈之胺基酸群組;
R1 係選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之芳烷基和R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈;且
R2 係選自H、-NR3 R4 -、-OR3 和-SR3 ,其中R3 和R4 係獨立地選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、和經取代或未經取代之芳烷基。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(II)中:
AA1 係選自Lys、Arg和His之群組:
AA2 為任何胺基酸;
AA3 係選自Lys、Arg和His之群組:且
AA4 係選自Phe、Tyr和Trp之群組。
更佳地,在此較佳的實施態樣中,在式(II)中:
AA1 係選自Arg之群組:
AA2 為任何胺基酸;
AA3 係選自Arg之群組:且
AA4 係選自Phe之群組。
甚至更佳地,在此較佳的實施態樣中,依照本發明之肽的序列為:
R1 較佳地選自H或R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈。R1 甚至更佳地選自H、乙醯基Ac、三級丁醯基、己醯基、2-甲基己醯基、環己烷羧基、辛醯基、癸醯基、月桂醯基 肉豆蔻醯基、Pal、硬脂醯基、油醯基和亞麻油醯基。R1 甚至更佳為Ac。
R2 較佳為NH2 。
因此,更佳地,R1 為Ac,且R2 為NH2 。
因此,在此較佳的實施態樣中,依照本發明之肽的序列為:
本發明之肽可以現有技術中已知的任何方式合成及生產。例如,彼等可藉由令該肽表現在細胞培養物中的化學合成法(較佳地藉助於固相肽合成法)或藉助於轉基因生產植物或動物中的肽而合成及生產。另外,本發明之肽可以現有技術中已知的任何方式純化。
如下列包括的實例可看出本發明之肽對Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用提供有效的干擾,導致在突觸前水平下抑制乙醯膽鹼釋放且因此抑制肌肉收縮。亦如下列包括的實例可推論出本發明之肽係藉由直接在肌肉細胞中誘導肌肉鬆弛而於突觸後水平下具有直接的效應。因此,本發明之肽解決上述問題,且提供能治療(預防、減少及/或消除)美學標誌及/或與神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的疾病之額外或替代的肽。
在第二態樣中,本發明係指包含依照本發明之至少一種肽的組成物。
預期本發明之組成物包含一種類型的本發明之肽或不同類型的本發明之肽的組合或混合物。
在較佳的實施態樣中,本發明之組成物為化妝品組成物。
本發明之化妝品組成物包含化妝品有效量的至少一種本發明之肽。本發明之化妝品組成物更佳地包含0.0001%至0.05% (m/v)的至少一種本發明之肽,更佳為0.0005%至0.005% (m/v)的至少一種本發明之肽,且甚至更佳為0.05%至0.001% (m/v)的至少一種本發明之肽。
由於本發明之肽的活性(亦即抑制Munc18與突觸融合蛋白-1之間的交互作用,且因此抑制神經遞質釋放及調節肌肉收縮),使本發明之化妝品組成物提供預防、減少及/或消除皮膚老化及/或表情標誌(較佳為皺紋)。更確切地,本發明之化妝品組成物提供預防、減少及/或消除臉部表情紋,更佳為前額的皺紋、眉毛間的皺紋及/或嘴周圍及/或眼睛周圍的皺紋和細紋。
預期本發明之化妝品組成物亦包含至少一種額外的化妝品成分。該額外的化妝品成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的化妝品活性成分。
額外的化妝品成分包含那些現有技術中經常使用之成分,例如佐劑(諸如穩定劑、增溶劑、維生素、著色劑和香料)、載劑及/或其他的化妝品活性成分。
該額外的化妝品成分必須與組成物之其餘組分及尤其與本發明之組成物包含的本發明之肽在物理及化學上可相容。同樣地,該額外的化妝品成分之性質不會不可接受地改變本發明之肽及組成物的優勢。該額外的化妝品成分可為合成或天然來源,諸如植物萃取物,或彼等可衍生自生物發酵過程(參見例如第11版(2006) CTFA化妝品成分手冊(Cosmetic Ingredient Handbook))。
預期上述額外的化妝品成分包含那些常用於護理、清潔皮膚及/或頭髮之組成物;及/或用於防止多汗症之除臭劑及/或乳霜中的成分,諸如尤其為抑制黑色素合成之劑、增白劑或去色素劑、抗老化劑、抑制NO-合成酶之劑、抗氧化劑、抗大氣污染劑及/或自由基誘捕劑、抗糖化劑、乳化劑、潤膚劑、有機溶劑、液體推進劑、皮膚調理劑,諸如濕潤劑、保濕物質、α羥酸、保濕劑、維生素、顏料或著色劑、染料、膠凝聚合物、增稠劑、界面活性劑、軟化劑、其他的抗皺紋劑、能減小或消除眼袋之劑、剝離劑、抗微生物劑、抗真菌劑、殺菌劑、刺激真皮或表皮巨分子合成及/或能預防或抑制彼等降解之劑,諸如刺激膠原蛋白合成之劑、刺激彈力蛋白合成之劑、刺激層黏連蛋白合成之劑、抑制膠原蛋白降解之劑、抑制彈力蛋白降解之劑、刺激纖維母細胞增殖生之劑、刺激角質化細胞增生之劑、刺激角質化細胞分化之劑、刺激脂質合成和角質層組分(腦醯胺、脂肪酸等)合成之劑、皮膚鬆弛劑(dermorelaxing agent)、刺激糖胺聚多醣合成之劑、DNA修補劑、DNA保護劑、刺激生物體中沈澱(proteasome)活性之劑、抗搔癢劑、治療敏感性皮膚之劑、緊緻劑(reaffirming agent)、收斂劑、皮脂生產調節劑、刺激脂質分解之劑、抗脂肪團劑(anti-cellulite agent)、鎮定劑(calming agent)、抗發炎劑、作用於毛細循環及/或微循環之劑、作用於細胞粒腺體之劑、意欲改進真皮-表皮接合之劑、保存劑、香料、螯合劑、植物萃取物、精油、海藻萃取物、衍生自生物發酵過程之劑、無機鹽、細胞萃取物及/或防曬劑(solar filter)(對紫外線A和B具活性之有機或無機光保護劑)。
在一實施態樣中,額外的化妝品成分中之至少一者為化妝品活性主體或物質,其可施加與那些上文以本發明之肽所揭示者相同、類似、輔助或不同的化妝品活性。預期本發明之化妝品組成物包含其他的抗皺紋劑或抗老化劑,例如膠原蛋白、彈力蛋白、生長因子、玻尿酸加強劑、屏障功能劑、增亮劑(illuminating agent)、刺激膠原蛋白I、III、IV及/或VI和層黏連蛋白的表現及/或合成之劑、刺激糖胺聚多醣或玻尿酸合成之劑、刺激彈力蛋白和其他彈性纖維相關蛋白的表現及/或合成之劑、抑制膠原蛋白及/或彈性纖維降解之劑、刺激粒腺體相關蛋白(例如長壽基因(sirtuin)和烏頭酸酶)的表現及/或合成之劑、刺激局部黏附蛋白的表現及/或合成之劑、刺激角質化細胞及/或纖維母細胞增生及/或分化之劑、抗氧化劑、抗大氣污染劑及/或自由基誘捕劑、抗糖化劑、解毒劑、降低自然性老化(chronological aging)、環境性老化和發炎性老化之劑、及降低黑色素生產及/或抑制酪胺酸酶之劑、及/或刺激脂質合成和表皮(角蛋白)組分,且更尤其為角質層(角蛋白、腦醯胺、絲聚蛋白(filaggrin)、兜甲蛋白(loricrin)和SPRR1B)的合成之劑。額外的化妝品成分中之至少一者更佳為Argireline® (乙醯基六肽-8)、Leuphasyl® (五肽-3)、Inyline® (乙醯基六肽-30)、Syn-Ake® (三肽-3)或彼等之組合。
另外,本發明之化妝品組成物(或本發明之肽)可調配成現有技術中經常使用之任何形式,例如溶液、懸浮液、乳液、漿液、凝膠、乳霜、粉末、噴霧、洗液、油、擦劑、血清、慕斯、軟膏、棒或筆,包括「留置型(leave on)」和「洗淨型(rinse-off)」調配物。本發明之化妝品組成物亦可藉助於現有技術中已知的技術併入不同類型的固體配件中,諸如濕巾、水凝膠、黏著性(或非黏著性)貼片或面膜,或其可能併入不同的化妝系列產品中,諸如尤其為遮瑕膏(concealer)、化妝粉底、洗液或卸妝水。
亦預期如本文所揭示的本發明之化妝品組成物或本發明之肽二者亦可出於獲得更大的活性成分穿透之目的而併入化妝品持續釋放系統及/或載劑中,諸如脂質體、毫米粒子(milliparticle)、微米粒子和奈米粒子,以及併入海綿、囊泡、微胞、毫米球、微米球、奈米球、脂質球、毫米膠囊、微米膠囊和奈米膠囊中,以及併入微乳液和奈米乳液中。
在較佳的實施態樣中,本發明之化妝品組成物適合或適用於藉助電離子透入法施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之化妝品組成物適合或適用於藉助皮下注射施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在最佳的實施態樣中,本發明之化妝品組成物適合或適用於局部(更佳地呈乳霜形式)施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之組成物為醫藥組成物。
預期本發明之組成物包含一種類型的本發明之肽或不同類型的本發明之肽的組合或混合物。
本發明之醫藥組成物包含醫藥有效量的至少一種本發明之肽。
由於本發明之肽的活性(亦即抑制神經遞質釋放及調節肌肉收縮),使本發明之醫藥組成物提供預防及/或治療神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患相關聯的疾病,更確切地預防及/或治療與SNARE複合物形成失調、橫紋肌收縮失調、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放失調及/或Ca2+ 通道激活失調相關聯的疾病,較佳為老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、慢性偏頭痛、肥大細胞增多症、緊張不全或焦慮症疾患。
本發明之醫藥組成物亦提供治療肌僵直、肌緊張性營養障礙、先天性肌僵直、帕金森氏症、繼發性帕金森氏症、亨汀頓氏症、痙攣、遲發性不自主運動(TD)或緊張不全(瞼痙攣、麥傑症候群(Meige syndrome)、手抽筋、肢體緊張不全或斜視)。
醫藥組成物可呈現有技術中已知的任何形式,其適合於所選擇的途徑。預期本發明之醫藥組成物適合或適用於現有技術中已知的任何方式及任何途徑投予(例如皮下、肌肉內、靜脈內或經口;在後者的例子中,例如呈鹽水溶液及/或生物可降解的材料(諸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯及/或膽固醇之聚合物)之形式。
預期本發明之醫藥組成物亦包含至少一種額外的醫藥成分。該額外的醫藥成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的醫藥活性成分。預期至少一種額外的醫藥活性成分為苯并二氮呯、氯硝西泮(Clonazepam)、蘿拉西泮(Lorazepam)、地西泮(Diazepam)、貝可芬(Baclofen)、抗膽鹼能劑、苯海索(Trihexyphenidyl)、苯甲托品(Benztropine)、多巴胺耗損劑、丁苯那嗪(Tetrabenazine)、氯氮平(Clozapine)或彼等之組合。
在如上文所述之第三態樣中,本發明係指用於藥劑中的依照本發明之肽或組成物(亦即依照上文所述者)。
如上文所述及自下文所包括的實例可直接推論本發明之肽(及由此包含彼等之組成物)能抑制乙醯膽鹼釋放及肌肉收縮,且由於該活性而使彼等因此可用於作為藥劑。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽或組成物係用於預防及/或治療(較佳為治療)神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患。
肌肉收縮性疾患較佳為肌肉過度收縮。
神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患較佳為與SNARE複合物形成、橫紋肌收縮、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放及/或Ca2+ 通道激活之失調相關聯的疾病。
神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患更佳地選自老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、肥大細胞增多症、慢性偏頭痛、緊張不全或焦慮症疾患。
因此,在較佳的實施態樣中,本發明之肽或組成物係用於預防及/或治療老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、肥大細胞增多症、慢性偏頭痛、緊張不全或焦慮症疾患。關於該等疾病,以老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、慢性偏頭痛和焦慮症疾患為神經元胞吐作用疾患。另一方面,以緊張不全為肌肉收縮性疾患。
緊張不全較佳地選自瞼痙攣、麥傑症候群、手抽筋、肢體緊張不全或斜視。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽或組成物係用於預防及/或治療肌僵直、肌緊張性營養障礙、先天性肌僵直、帕金森氏症、繼發性帕金森氏症、亨汀頓氏症、痙攣或遲發性不自主運動(TD)。該等疾病為肌肉收縮性疾患。
肽或本發明之組成物較佳地以治療有效量使用。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽及組成物係用於哺乳動物,更佳地用於人類。
在較佳的實施態樣中,組成物為依照上文所述之醫藥組成物。
本發明之肽或組成物可以現有技術中已知的任何方式或通過已知的任何途徑使用。在任何例子中,肽或組成物適用於所選擇的方式及/或途徑(例如皮下、肌肉內、靜脈內或經口;在後者的例子中,例如呈鹽水溶液及/或生物可降解的材料(諸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯及/或膽固醇之聚合物)之形式。
在第四態樣中,本發明係指用於預防及/或治療(較佳為治療)神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患之方法,其包含對有其需要的個體投予本發明之肽或組成物。
肌肉收縮性疾患較佳為肌肉過度收縮。
神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患較佳為與SNARE複合物形成失調、橫紋肌收縮失調、乙醯膽鹼及/或CGRP釋放失調及/或Ca2+ 通道激活失調相關聯的疾病。
神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患更佳地選自老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、肥大細胞增多症、慢性偏頭痛、緊張不全或焦慮症疾患。
關於該等疾病,以老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、慢性偏頭痛和焦慮症疾患為神經元胞吐性疾患。另一方面,以緊張不全為肌肉收縮性疾患。
緊張不全較佳地選自瞼痙攣、麥傑症候群、手抽筋、肢體緊張不全或斜視。
在另一較佳的實施態樣中,神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患為選自肌僵直、肌緊張性營養障礙、先天性肌僵直、帕金森氏症、繼發性帕金森氏症、亨汀頓氏症、痙攣或遲發性不自主運動(TD)之肌肉收縮性疾患。
本發明之肽或組成物較佳地以治療有效量使用。
在較佳的實施態樣中,需要本發明之治療方法的個體為哺乳動物,更佳為人類。
在較佳的實施態樣中,組成物為依照上文所述之醫藥組成物。
本發明之肽或組成物可以現有技術中已知的任何方式或通過已知的任何途徑使用。在任何例子中,肽或組成物適用於所選擇的方式及/或途徑(例如皮下、肌肉內、靜脈內或經口;在後者的例子中,例如呈鹽水溶液及/或生物可降解的材料(諸如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己內酯及/或膽固醇之聚合物)之形式。
在如上文所述之第五態樣中,本發明係指本發明之肽或化妝品組成物用於作為化妝品之用途,該化妝品係用於預防、減少及/或消除與個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的標誌之化妝品。
顯然地,上述之標誌為美容學標誌。
肌肉收縮性失調較佳為肌肉過度收縮。
與神經元胞吐作用及/或肌肉過度收縮失調有關的美容學標誌較佳為皮膚老化及/或表情標誌。
皮膚老化的美容學標誌較佳為皺紋。
在最佳的實施態樣中,皮膚老化及/或表情標誌為臉部皺紋(較佳為表情標誌)及/或臉部不對稱。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於電離子透入法施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於皮下注射施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在最佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係以局部(更佳地呈乳霜形式)施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
個體較佳為哺乳動物,甚至更佳為人類。
另外,在用於作為本發明之化妝品中,本發明之肽或化妝品組成物係以化妝品有效量使用。本發明之肽更佳地係以0.0001%至0.05% (m/v),更佳為0.0005%至0.005% (m/v),且甚至更佳為0.05%至0.001% (m/v)之濃度使用。
預期如上文所述的本發明之化妝品組成物亦包含至少一種額外的化妝品成分。該額外的化妝品成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的化妝品活性成分,其可如上文所解釋。亦預期本發明之肽係與依照上文所述之至少一種額外的化妝品成分組合使用。
另外,本發明之肽及本發明之化妝品組成物可調配成現有技術中經常使用之任何形式,例如溶液、懸浮液、乳液、漿液、凝膠、乳霜、粉末、噴霧、洗液、油、擦劑、血清、慕斯、軟膏、棒或筆,包括「留置型」和「洗淨型」調配物。本發明之肽及化妝品組成物亦可藉助於現有技術中已知的技術併入不同類型的固體配件中,諸如濕巾、水凝膠、黏著性(或非黏著性)貼片或面膜,或其可能併入不同的化妝系列產品中,諸如尤其為遮瑕膏、化妝粉底、洗液或卸妝水。
亦預期如本文所揭示的本發明之化妝品組成物或本發明之肽二者亦可出於獲得更大的活性成分穿透之目的而併入化妝品持續釋放系統及/或載劑中,諸如脂質體、毫米粒子、微米粒子和奈米粒子,以及併入海綿、囊泡、微胞、毫米球、微米球、奈米球、脂質球、毫米膠囊、微米膠囊和奈米膠囊中,以及併入微乳液和奈米乳液中。
在第六態樣中,本發明係指本發明之肽或化妝品組成物的化妝品用途(亦即如上文所解釋),其係預防、減少及/或消除與個體的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的標誌。
顯然地,上述之標誌為美容學標誌。
肌肉收縮性失調較佳為肌肉過度收縮。
與神經元胞吐作用及/或肌肉過度收縮失調有關的美容學標誌較佳為皮膚老化及/或表情標誌。
皮膚老化的美容學標誌較佳為皺紋。
在最佳的實施態樣中,皮膚老化及/或表情標誌為表情臉部皺紋(較佳為表情紋)及/或臉部不對稱。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於電離子透入法施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於皮下注射施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體的臉部及/或頸部。
在最佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係以局部(更佳地呈乳霜形式)施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
個體較佳為哺乳動物,甚至更佳為人類。
另外,在本發明之化妝品用途中,本發明之肽或化妝品組成物係以化妝品有效量使用。本發明之肽更佳地係以0.0001%至0.05% (m/v),更佳為0.0005%至0.005% (m/v),且甚至更佳為0.05%至0.001% (m/v)之濃度使用。
預期如上文所述的本發明之化妝品組成物亦包含至少一種額外的化妝品成分。該額外的化妝品成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的化妝品活性成分,其可如上文所解釋。亦預期本發明之肽係與依照上文所述之至少一種額外的化妝品成分組合使用。
另外,本發明之肽及本發明之化妝品組成物可調配成現有技術中經常使用之任何形式,例如溶液、懸浮液、乳液、漿液、凝膠、乳霜、粉末、噴霧、洗液、油、擦劑、血清、慕斯、軟膏、棒或筆,包括「留置型」和「洗淨型」調配物。本發明之肽及化妝品組成物亦可藉助於現有技術中已知的技術併入不同類型的固體配件中,諸如濕巾、水凝膠、黏著性(或非黏著性)貼片或面膜,或其可能併入不同的化妝系列產品中,諸如尤其為遮瑕膏、化妝粉底、洗液或卸妝水。
亦預期如本文所揭示的本發明之化妝品組成物或本發明之肽二者亦可出於獲得更大的活性成分穿透之目的而併入化妝品持續釋放系統及/或載劑中,諸如脂質體、毫米粒子、微米粒子和奈米粒子,以及併入海綿、囊泡、微胞、毫米球、微米球、奈米球、脂質球、毫米膠囊、微米膠囊和奈米膠囊中,以及併入微乳液和奈米乳液中。
在如上所述之第七態樣中,本發明係指預防及/或減少與有其需要之個體中的神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性失調有關的標誌之方法,其特徵在於包含使用依照本發明之肽或化妝品組成物。
上述之標誌為美容學標誌。
肌肉收縮性失調較佳為肌肉過度收縮。
與神經元胞吐作用及/或肌肉過度收縮失調有關的美容學標誌較佳為皮膚老化及/或表情標誌。
皮膚老化的美容學標誌較佳為皺紋。
在最佳的實施態樣中,皮膚老化及/或表情標誌為臉部皺紋(較佳為表情紋)及/或臉部不對稱。
在較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於電離子透入法施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在另一較佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係藉助於皮下注射施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
在最佳的實施態樣中,本發明之肽或化妝品組成物係以局部(更佳地呈乳霜形式)施予,更佳地施予個體的臉部及/或身體,更佳地施予個體的臉部、頸部、手部及/或腋窩,甚至更佳地施予個體(較佳為人類)的臉部及/或頸部。
個體較佳為哺乳動物,甚至更佳為人類。
另外,在本發明之方法中,本發明之肽或化妝品組成物係以化妝品有效量使用。本發明之肽更佳地係以0.0001%至0.05% (m/v),更佳為0.0005%至0.005% (m/v),且甚至更佳為0.05%至0.001% (m/v)之濃度使用。
預期如上文所述的本發明之化妝品組成物亦包含至少一種額外的化妝品成分。該額外的化妝品成分可為至少一種賦形劑及/或至少一種額外的化妝品活性成分,其可如上文所解釋。亦預期本發明之肽係與依照上文所述之至少一種額外的化妝品成分組合使用。
另外,本發明之肽及本發明之化妝品組成物可調配成現有技術中經常使用之任何形式,例如溶液、懸浮液、乳液、漿液、凝膠、乳霜、粉末、噴霧、洗液、油、擦劑、血清、慕斯、軟膏、棒或筆,包括「留置型」和「洗淨型」調配物。本發明之肽及化妝品組成物亦可藉助於現有技術中已知的技術併入不同類型的固體配件中,諸如濕巾、水凝膠、黏著性(或非黏著性)貼片或面膜,或其可能併入不同的化妝系列產品中,諸如尤其為遮瑕膏、化妝粉底、洗液或卸妝水。
亦預期如本文所揭示的本發明之化妝品組成物或本發明之肽二者亦可出於獲得更大的活性成分穿透之目的而併入化妝品持續釋放系統及/或載劑中,諸如脂質體、毫米粒子、微米粒子和奈米粒子,以及併入海綿、囊泡、微胞、毫米球、微米球、奈米球、脂質球、毫米膠囊、微米膠囊和奈米膠囊中,以及併入微乳液和奈米乳液中。
為了更好地理解,本發明係參考附圖而於下文更詳細地說明,附圖係以實例方式及參考例證性和非限制性實施例呈現。
縮寫:
用於胺基酸之縮寫係遵照1983 IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature recommendations outlined in Eur. J. Biochem. (1984) 138:937。
Ac,乙醯基;Ala,丙胺酸;Arg,精胺酸;Asn,天冬醯胺酸;Asp,天冬胺酸;Boc,三級丁氧基羰基;C-端,羧基端;DCM,二氯甲烷;DIEA,N,N′-二異丙基乙胺;DIPCDI,N,N′-二異丙基碳二醯亞胺;DMF,N,N-二甲基甲醯胺;equiv,當量;ESI-MS,電噴霧離子化質譜法;Fmoc,9-茀基甲氧基羰基;Glu,麩胺酸;hiPSC,人類誘導性多能幹細胞;His,組胺酸;HOBt,1-羥基苯并三唑;HPLC,高性能液相層析術;HRP,山葵過氧化酶;Ile,異白胺酸;INCI,化妝品成分之國際命名;MBHA,對-甲基二苯甲胺;Leu,白胺酸;Lys,離胺酸;Me,甲基;MeCN,乙睛;MeOH,甲醇;Met,甲硫胺酸;N-端,胺基端;Palm,棕櫚醯基;Pbf,2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基;PFA,三聚甲醛;PMA,佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯;Phe,苯基丙胺酸;PMSF,苯基甲烷磺醯基;RT,室溫;tBu,三級丁基;Thr,蘇胺酸;TFA,三氟乙酸;TIS,三異丙基矽烷;TMB,四甲基聯苯胺;Trt,三苯基甲基或三苯甲基;Trp,色胺酸;Tyr,酪胺酸。
關於實施例中包括的化學合成程序,應注意所有的合成方法皆在裝有多孔聚乙烯盤的聚丙烯注射器或裝有多孔盤的Pyrex® 反應器中進行。所有的試劑及溶劑皆為合成品質,且在沒有任何額外處理下使用。溶劑及可溶性試劑係以抽氣移除。Fmoc基團係以哌啶-DMF (2:8,v/v)(至少1×1 min,2×10min,5毫升/克樹脂)移除(Lloyd Williams P.等人之Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins , CRC, 1997, Boca Raton (Fla., USA))。在去保護、偶合及再去保護階段之間的清洗係以DMF (3×1 min)及DCM (3×1 min)進行,每次使用10毫升溶劑/克樹脂。偶合反應係以3毫升溶劑/克樹脂執行。偶合控制係進行茚三酮試驗來執行(Kaiser E.等人之Anal. Biochem., 1970, 34: 595598)。所有的合成反應及清洗係在RT下進行。
實施例1. 經由電腦模擬(In silico)測定干擾Mync18-突觸融合蛋白-1之交互作用的肽
在此實驗中,目的為產生對Munc18與突觸融合蛋白-1之交互作用區域具有親和力及/或特異性之電腦模擬肽,且因此能競爭、干擾及破壞該兩種蛋白質之間的交互作用及/或結合。
由於Munc18-突觸融合蛋白-1複合物的結構為已知的且以2.6 A解析度(蛋白質數據庫參考號3C98)取得,因此產生此交互作用的三維結構模型且選擇表1中包括的Munc18之交互作用片段。
基於該標靶片段,令作為設計第一步的野生型肽(被認為是100%之結合肽)突變成聚-Ala (被認為是非結合肽0%),且所有的位置被視為獨立的。令每一個別位置突變成20個天然胺基酸,而其他位置保留為Ala。測定在片段與複合物的其餘部分之間的理論結合能,以評定在不同的位置上以突變誘發改進之交互作用。結合能之製表及標準化得到評分矩陣,其顯示胺基酸殘基如何適當地裝配在肽之給定位置。使用該等矩陣提出及建構出推定抑制Munc18-突觸融合蛋白-1複合物形成之肽的分級列表。
在實驗的第二步驟中,令列表之肽在複合物上模式化,但同時使肽中的所有位置突變。以此方式確保將肽中的相鄰位置之間的交互作用或不相容性納入考慮中。再評估肽-複合物交互作用之結合能,且根據此結合能進行肽的重新分級。接著令可能高於100%或低於0%之結合能與100%之結合劑(野生型)及0%之結合劑(聚Ala肽)相比。選擇且提出用於進一步研究及驗證之最好的肽(參見表2)。
實施例2. 肽之合成及製備
-獲得Fmoc-AA1 -AA2 -AA3 -AA4 -AA5 -AA6 -Rink-MBHA-樹脂,其中AA1 為L-His;AA2 為L-Ile或L-Ala;AA3 為L-Leu或L-Met;AA4 為L-Asp或L-Arg;AA5 為L-Met、L-Trp或L-Phe;且AA6 為L-Trp
令重量標準化。令具有0.52毫莫耳/克之官能化的4.8克(2.5毫莫耳) Fmoc-Rink-MBHA樹脂根據現有技術中已知的通用方案以哌啶-DMF處理,以便移除Fmoc基團。令3.94克Fmoc-L-Trp(Boc)-OH (7.5毫莫耳;3當量)在DIPCDI (1.17毫升;7.5毫莫耳;3當量)及HOBt (1.01克;7.5毫莫耳;3當量)的存在下使用DMF作為溶劑經1小時併入去保護之樹脂上。
接著令樹脂以現有技術中已知的通用方法所述方式清洗,且重複Fmoc基團之去保護處理以偶合下一個胺基酸。遵照先前所述之方案,依序偶合2.90克Fmoc-Phe-OH、2.78克Fmoc-L-Met-OH或3.94克Fmoc-L-Trp(Boc)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或3.08克Fmoc-L-Asp(tBu)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著2.65克Fmoc-L-Leu-OH或2.78克Fmoc-L-Met-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著2.33克Fmoc-L-Ala-OH或2.65克Fmoc-L-Ile-OH (7.5毫莫耳;3當量);及接著4.64克Fmoc-L-His(Trt)-OH (7.5毫莫耳;3當量),各偶合係在1.01克HOBt (7.5毫莫耳;3當量)及1.17毫升DIPCDI (7.5毫莫耳;3當量)的存在下。如上文所述,在各胺基酸添加步驟之間執行Fmoc基團之去保護處理。
在合成後,令肽樹脂以DCM清洗(5次,每次3分鐘)且在真空下乾燥。
- 獲得Fmoc-AA1 -AA2 -AA3 -AA4 -Rink-MBHA-樹脂,其中AA1 為L-Arg;AA2 為L-Arg或L-Met;AA3 為L-Arg及AA4 為L-Phe
令重量標準化。令具有0.52毫莫耳/克之官能化的4.8克(2.5毫莫耳) Fmoc-Rink-MBHA樹脂根據現有技術中已知的通用方案以哌啶-DMF處理,以便移除Fmoc基團。令2.90克Fmoc-L-Phe-OH (7.5毫莫耳;3當量)在DIPCDI (1.17毫升;7.5毫莫耳;3當量)及HOBt (1.01克;7.5毫莫耳;3當量)的存在下使用DMF作為溶劑經1小時併入去保護之樹脂上。
接著令樹脂以通用方法所述方式清洗,且重複Fmoc基團之去保護處理以偶合下一個胺基酸。遵照先前所述之方案,依序偶合4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或2.78克Fmoc-L-Met-OH (7.5毫莫耳;3當量);及接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH (7.5毫莫耳;3當量),各偶合係在1.01克HOBt (7.5毫莫耳;3當量)及1.17毫升DIPCDI (7.5毫莫耳;3當量)的存在下。如上文所述,在各胺基酸添加步驟之間進行Fmoc基團之去保護處理。
在合成後,令肽樹脂以DCM清洗(5次,每次3分鐘)且在真空下乾燥。
- 獲得Fmoc-AA1 -AA2 -AA3 -AA4 -AA5 -AA6 -AA7 -AA8 -Rink-MBHA-樹脂,其中AA1 為L-Glu;AA2 為L-Arg;AA3 為L-Ile;AA4 為L-Asn;AA5 為L-Lys;AA6 為L-Arg或L-Met;AA7 為L-Arg;及AA8 為L-Trp或L-Tyr
令重量標準化。令具有0.52毫莫耳/克之官能化的4.8克(2.5毫莫耳) Fmoc-Rink-MBHA樹脂根據現有技術中已知的通用方案以哌啶-DMF處理,以便移除Fmoc基團。令3.94克Fmoc-L-Trp(Boc)-OH或3.44克Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH (7.5毫莫耳;3當量)在DIPCDI (1.17毫升;7.5毫莫耳;3當量)及HOBt (1.01克;7.5毫莫耳;3當量)的存在下使用DMF作為溶劑經1小時併入去保護之樹脂上。
接著令樹脂以通用方法所述方式清洗,且重複Fmoc基團之去保護處理以偶合下一個胺基酸。遵照先前所述之方案,依序偶合4.86克Fmoc-Arg(Pbf)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或2.78克Fmoc-L-Met-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著3.51克Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著4.45克Fmoc-L-Asn(Trt)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著2.65克Fmoc-L-Ile-OH;接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH;及接著3.19克Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH (7.5毫莫耳;3當量),各偶合係在1.01克HOBt (7.5毫莫耳;3當量)及1.17毫升DIPCDI (7.5毫莫耳;3當量)的存在下。如上文所述,在各胺基酸添加步驟之間進行Fmoc基團之去保護處理。
在合成後,令肽樹脂以DCM清洗(5次,每次3分鐘)且在真空下乾燥。
使用上述合成程序,選擇所需之胺基酸合成下列序列:
實施例3. 移除依照實施例2合成之肽的Fmoc N端保護基
肽基樹脂之N端Fmoc基團係以DMF (1×1 min+2×10 min)中的20%之哌啶去保護(Lloyd Williams P.等人之(1997) “Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins ” CRC, Boca Raton (Fla., USA))。令肽基樹脂以DMF (5×1 min)、DCM (4×1 min)清洗且在真空下乾燥。
實施例4. 引入R1 乙醯基至依照實施例3獲得的肽基樹脂上之方法
令依照實施例2獲得的1毫莫耳(1當量)肽基樹脂在25當量DIEA的存在下使用5毫升DMF作為溶劑以25當量乙酸酐處理。使彼等處於反應狀態下30分鐘,隨後令肽基樹脂以DMF (5×1 min)、DCM (4×1 min)清洗且在真空下乾燥。
實施例5. 自依照實施例3和4獲得的肽基樹脂之聚合物載體之裂解方法
令重量標準化。令實施例2、3或4中任一者獲得的200毫克乾燥之肽基樹脂在室溫下以5毫升TFA/TIS/H2 O (90:5:5)攪拌處理2小時。收集過濾物且使用50毫升(8至10倍)冷的二乙醚沉澱。令醚溶液在減壓及室溫下蒸發至乾燥,令沉澱物再溶解於H2 O中的50%之MeCN中且凍乾。
實施例6. 依照實施例5合成及製備之肽的特徵
依照實施例5獲得的肽之HPLC分析係以使用反相管柱(150×4.6毫米,XBridge Peptide BEH C18,3.5微米,Waters,USA)、在H2 O (+0.045%之TFA)中的MeCN (+0.036%之 TFA)梯度、1.25毫升/分鐘之流速的Shimadzu設備(Kyoto,Japan)進行,且在220 nm下進行檢測。所有的肽顯示超過80%之純度。所獲得的肽之鑑定係以使用MeOH作為移動相及0.2毫升/分鐘之流速的Water ZQ 4000檢測器中之ESI-MS確定。所獲得的結果證明有效地合成在表3中包括的肽。
實施例7. 測量乙醯膽鹼釋放
在以上表3中包括的肽係照實施例2至6合成。
測試該等肽於試管內彼等調節乙醯膽鹼釋放的能力。為此,令LAN細胞接種在48槽孔培養盤上,且容許在受控條件下(37℃,5%之CO2 )達到適當的匯合,然後藉由令培養基以N-2 Supplement,GlutaMAXTM 、氯化鈉及白血病抑制因子(GIBCO,Life technologies,MA, USA)補充之Neurobasal® A培養基更換而誘導分化。一旦細胞獲取其分化形態,令彼等以下列濃度的上述之肽處理1小時:除了Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 以外,所有的肽以0.001毫克/毫升、0.005毫克/毫升和0.01毫克/毫升;而肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 以0.005毫克/毫升和0.05毫克/毫升。接著令細胞以HEPES清洗,然後藉由以外部50mM KCl溶液去極化而刺激乙醯膽鹼釋放。令未刺激之細胞與非去極化4mM KCl溶液培育。在與相應的去極化及非去極化KCl溶液培育30分鐘後,收集細胞上清液且用於以Amplex Red乙醯膽鹼檢定套組(ThermoFisher Scientific,MA, USA)測量乙醯膽鹼含量。使用細胞沉澱物以BCA蛋白質試驗檢定法測定蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質檢定套組,ThermoFisher Scientific,MA, USA) (以數據標準化為目的)。
乙醯膽鹼釋放抑制百分比係考慮以陽性對照物(以KCl刺激的未處理之細胞)為100%釋放來計算。
令獲得的結果總結於表4中:
此實驗的結果亦總結於圖1 (A)至(I)中。可自該等圖直接推論以表4中標識為積極調節乙醯膽鹼之肽顯示在所有測試之濃度下顯著地降低乙醯膽鹼釋放。另一方面,以表4中標識為不積極的肽在最低濃度下顯示中至低的抑制作用及在最高濃度下顯示完全喪失抑制作用。該等肽在測試的任何濃度下未顯示出統計學上降低的乙醯膽鹼釋放。由於此類型細胞的技術複雜性及固有的測試可變性,在低濃度下觀察到輕微抑制的事實是可預期的,但是在最高濃度下完全喪失活性清楚地顯示該等肽(Ac-SEQ ID NO: 13-NH2 和Ac-SEQ ID NO: 14-NH2 )不能抑制乙醯膽鹼的釋放。
自先前技術看出((2002),A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity , International Journal of Cosmetic Science, 24, 303-310),當使用BoNT A時,自滲透之嗜鉻細胞的胞吐作用抑制達到50%之最大值,當使用Argireline® 時,達到40%之最大值。因此,以此實施例獲得的結果證實本發明之肽的高活性,因為當直接在甚至不滲透之LAN細胞上測試乙醯膽鹼釋放抑制時,獲得20至30%之抑制值。
實施例8. 結合檢定法
下列的肽係基於實施例1之電腦模擬研究及依照實施例2至6而合成:
肽抑制Munc18與突觸融合蛋白-1,SNARE複合蛋白質之蛋白質-蛋白質交互作用的能力係藉助基於ELISA之試管內Munc18/突觸融合蛋白-1之結合檢定法進行功能性評估。簡言之,令0.1、0.5和1 mM的上述之肽與10和5 nM之彼等標靶蛋白質突觸融合蛋白-1 (經GST標籤化)在緩衝液(20 mM Hepes、150 mM NaCl、2 mM MgCl2 、2 mM DTT、0.5%之Triton-X100及0.5%之脫脂乳)中於RT下預培育3小時。同時,令經His標籤化之Munc18以100 nM結合至鎳塗佈之96槽孔盤且在RT下培育1.5小時。隨後洗去未結合之蛋白質,然後令槽孔以清洗緩衝液(PBS+0.02%之Triton-X100)中的脫脂乳阻斷額外30分鐘。接著令與肽預培育的經GST標籤化之突觸融合蛋白-1以10和5 nM添加至盤中且在RT下培育2h。令槽孔以清洗緩衝液清洗三次,然後與一次抗體(GST標籤多株抗體–Thermofisher Scientific,Massachusetts, USA)培育45分鐘。最後,在再清洗後,添加經HRP共軛之二次抗體(抗兔子-IgG-HRP – Sigma,Missouri, USA)且在RT下培育。使用TMB受質(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)產生訊號。藉由添加終止試劑終止反應。突觸融合蛋白-1蛋白質結合至Munc18蛋白質的量係藉由在450 nm下測量吸光度來分析。
令此實驗獲得的結果總結於圖2中。圖2證明所測試的兩種肽(Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 至甚至驚人的更高程度)能顯著地阻斷Munc18與突觸融合蛋白-1之間的蛋白質-蛋白質交互作用,甚至顯示以劑量-反應方式。Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 和Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 肽分別達到37%和67%之最大抑制。基於該等結果可看出本發明之肽能破壞經調節之胞吐作用及隨後的神經遞質釋放所需之蛋白質-蛋白質交互作用。
實施例9. 在骨骼肌人類肌細胞中的基因表現調節
下列的肽係基於實施例1之電腦模擬研究及依照實施例2至6而合成:
測試該等肽以評估彼等調節與人類骨骼肌肌細胞中的肌肉收縮及鬆弛有關的許多基因表現之能力(Lodish H, Berk A, Zipursky SL等人之(2000),Molecular Cell Biology , 4th edition;Section 18.3 Myosin: The Actin Motor Protein, Nueva York, W. H. Freeman;Kuo, IY, & Ehrlich, BE (2015),Signaling in Muscle Contraction , Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 7(2);RAPSN receptor associated protein of the synapse [ Homo sapiens (human) ], Gene ID in NCBI 5913;Blake DJ, Tinsley JM, Davies KE (1996),Utrophin: a structural and functional comparison to dystrophin , Brain Pathol., 6(1):37-47;Barik A, Lu Y, Sathyamurthy A等人之(2014),LRP4 Is Critical for Neuromuscular Junction Maintenance , The Journal of Neuroscience, 34(42), 13892–13905;Kim N, Stiegler AL, Cameron TO, Hallock PT等人之(2008),Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK , Cell, 135(2), 334–342;Mahavadi S, Nalli A, Kumar D等人之(2014),Increased expression of caveolin-1 is associated with upregulation of the RhoA/Rho kinase pathway and smooth muscle contraction in diabetes (1110.11), The FASEB Journal, 28:1_supplement))。為此,設計一種收縮性智慧數據基因小組。該收縮性智慧數據基因小組分析與表5中包括的肌肉收縮及鬆弛有關的基因表現。
表5. 在實施例9中分析之基因
簡言之,令人類骨骼肌肌胚細胞以1×105
個細胞/槽孔之密度以一式兩份接種在12槽孔培養盤中且維持在標準的培養條件下(37℃,95%之濕度,5%之CO2
) 48至72小時。接著以特異性分化培養基(SKM-D培養基 + 1%之抗生素-抗黴菌)誘導肌胚細胞分化成肌細胞且監測7天以上。令分化之細胞以0.05毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 5-NH2
;或以0.1毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 10-NH2
處理24小時;或以0.05和0.5毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理6小時;或以0.5毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理24小時。使用未處理之細胞作為基礎對照物。接著令細胞溶解,以RNA純化商業套組遵照製造商的指示(RNeasy小型套組,Qiagen,Netherlands)進行RNA萃取。接著令RNA以nanodrop量化,調整濃度且使用市售套組(高容量cDNA反轉錄套組,Thermofisher Scientific,USA)處置以進行反轉錄至cDNA。使用所得cDNA執行RTqPCR (即時定量聚合酶連鎖反應),該執行係使用taqman技術及一組經設計以靶向與表4中述及之肌肉收縮性有關的特定基因之探針。
令此實驗的結果總結於圖3(A)至(D)中。可以該等圖看出當人類肌細胞以肽Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 處理時,則觀察到UTRN、ACTA1、TNNC1、RAPSN、SCN3A和MYH1之調降。以肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 處理肌細胞導致SCN3A、UTRN、ACTA1、TNNC1、CALM3、CAV1、CACNB1、LRP4和MYH1之調降(經6小時處理)連同RAPSN之調降,及ATP2A之調升(經24小時處理)。最後,以肽Ac-SEQ ID NO: 10-NH2 處理肌細胞導致UTRN、TNNC1、SCN3A CHRNA1和CACNB1之調降。
上述基因之調降可以不同的方式影響正常的肌肉收縮功能:乙醯膽鹼結合在肌肉細胞表面上所需之RAPSN、CHRNA1、UTRN和LRP4可影響神經遞質誘導之膜去極化及細胞骨架穩定性;作為電壓閘控通道之SCN3A和CACNB1可影響膜電位的激發傳遞;涉及Ca2+ 運輸之SLN可影響細胞內鈣積聚;及MYH1、TNNC1和ACTA1可影響細胞骨架完整性及驅動收縮之動力衝擊。因此,以此實施例獲得及顯示於圖3中的結果證明本發明之肽調節肌肉收縮-鬆弛的能力,有助於增加肌肉鬆弛。
實施例10. 鈣動員檢定法
肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 係依照實施例2至6合成。
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 減少在人類骨骼肌細胞上的鈣動員之潛力係於試管內以Fluo-4 NW鈣檢定套組(ThermoFisher Scientific,MA USA)評估。簡言之,令人類骨骼肌肌胚細胞以1×104 個細胞/槽孔之密度以一式五份接種在透明底部的黑色96槽孔盤中且維持在標準的培養條件下(37℃,95%之濕度,5%之CO2 ) 48至72小時。接著以特異性分化培養基(SKM-D培養基 + 1%之a/a)誘導肌胚細胞分化成肌細胞且監測7天以上。令分化之細胞以無細胞毒性濃度的肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (0.01毫克/毫升、0.05毫克/毫升和0.1毫克/毫升)處理額外48小時。
一旦培育完成,令細胞培養基以100微升染料負載溶液替換,且令盤保持在培育箱中30分鐘。接著在使用FLUOstar Omega儀器(BMG Labtech,Germany)測量鈣前,令染料溶液以檢定緩衝液替換。為了進行適當的動力學測量,設定10秒之預刺激階段以測定在藉由添加60 mM KCl以誘導鈣離子內流前的基線訊號。設定在90秒之刺激後階段,在494/516nm下(激發/發射)以每0.1秒讀數。
執行下列的步驟用於數據分析:1)計算各條件的平均動力學曲線;2)在以KCl刺激後測定各曲線之最大螢光訊號;3)計算相對於基線而增加的倍數變化;4)以各條件(各肽濃度)獲得的結果相對於以對照物(未處理之細胞)獲得的一個結果進行標準化。
令此實驗獲得的結果總結於圖4中且反映本發明之肽(以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)以劑量依賴方式減少鈣離子內流之潛力(在0.01毫克/毫升、0.05毫克/毫升和0.1毫克/毫升下分別為-6%、-20%和-30%)。此減少的鈣離子內流對細胞收縮性具有衝擊,有利於肌肉鬆弛。
可自上文實施例直接推論本發明之肽有效地干擾或抑制複合物Munc18-突觸融合蛋白-1的形成,因此容許調節(抑制)神經元胞吐作用。另外,該等肽提供在肌細胞上誘導或促進彼等鬆弛(肌肉鬆弛)之直接效應。因此,本發明之肽解決現有技術中存在的上述問題。
實施例11. 減少肌凝蛋白重鏈蛋白
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 減少在人類骨骼肌細胞中的蛋白質肌凝蛋白重鏈表現之潛力係於試管內使用對抗此蛋白質之特異性抗體(Biotechne,USA),繼而以二次螢光抗體(Thermofisher,USA)之免疫螢光評估。簡言之,令人類骨骼肌肌胚細胞以3×104 個細胞/平方公分之密度在SKM-M培養基(Tebu-Bio,France)中接種在蓋玻片上且在標準的培養條件下(37℃,95%之濕度,5%之CO2 )經隔夜培育。接著以特異性分化培養基(骨骼肌細胞分化培養基,SKM-D培養基)誘導肌胚細胞分化成肌細胞且監測7天以上。令分化之細胞以無細胞毒性濃度的肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (0.05毫克/毫升和0.5毫克/毫升)處理額外48小時。
一旦培育完成,令細胞以4%之PFA固定且使用0.1% (v/v)之Triton (Sigma,USA)滲透。接著令肌凝蛋白在室溫下以0.5毫克/毫升之肌凝蛋白重鏈抗體經2h期間染色。在適當的清洗後,令肌動蛋白以50微克/毫升之毒蠅虎蕈鹼(紅色)(Sigma,USA)經1h標記,且在清洗後,令細胞以4微克/毫升之二次抗體山羊抗小鼠igG經1h染色。最後,令核以3.5 微克/毫升之Hoescht標識物(Sigma,USA)經10分鐘染色。
使用5x和10x物鏡獲取顯微影像。各條件使用三次重複物且使用相同的設置獲取各蓋玻片的三至四個視野影像。
影像係使用Image J軟體分析。立刻調整閾值以選擇肌凝蛋白且測量平均螢光。陽性細胞數目係使用DAPI染色計數。令肌凝蛋白平均螢光強度除以肌凝蛋白陽性細胞數目。最後,令所有數據標準化如下以獲得與未處理之細胞相比的肌凝蛋白%:相對於對照物之% = (在處理之槽孔中的每一細胞之螢光/在未處理之槽孔中的每一細胞之螢光)×100。
令此實驗獲得的結果總結於圖5(A)、5(B)和6中且反映本發明之肽(如以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)以劑量依賴方式減少肌凝蛋白重鏈蛋白含量之潛力(在圖6中,在0.05毫克/毫升和0.5毫克/毫升下分別為-26%和-38%)。此減少的肌凝蛋白重鏈蛋白含量對細胞收縮性具有衝擊,有利於肌肉鬆弛。
可自上文實施例直接推論本發明之肽有效地提供在肌細胞上誘導或促進彼等鬆弛(肌肉鬆弛)之直接效應。
實施例12. 收縮頻率
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 調節收縮頻率之潛力係於試管內使用人類肌細胞及衍生自hiPSC共培養物之運動神經元評估,該評估係藉助於治療前及後(在治療後的每一確立之時間點)以InCell 2200自動化顯微鏡紀錄在60秒期間之局部化收縮肌纖維的活體影像視頻。
令人類肌細胞以1×106 個細胞之密度於T75平方公分燒瓶中培養,且接著轉移至96槽孔盤進行分化。令衍生自hiPSC之運動神經元轉移至含有在分化培養基中的肌細胞之96槽孔盤上。令共培養物維持10天以產生神經元與肌纖維之接合。在5天內觀察到自發性收縮。
接著令共培養物以對照培養基(基礎)、1 µM α-金環蛇毒素、作為定標參考物的0.5毫克/毫升之乙醯基六肽-8及0.05或0.1毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 處理。紀錄在處理前於60秒期間的共培養物之影片及再記錄在培育30分鐘後於60秒期間的共培養物之影片。令培養盤以化合物再培育1小時30分鐘(共培育2小時),且再紀錄於60秒期間的共培養物之影片。令培養盤以化合物再培育總共24小時,且在培育結束時再紀錄於60秒期間之影片。最後,洗出化合物且自該洗出化合物起24小時後進行最後一次記錄以評定最終的肌肉收縮回復(回復)。
計算在各培育前及後的收縮頻率。各培養條件分析6個槽孔。
令此實驗獲得的結果總結於圖7中且反映本發明之肽(如以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)在僅30分鐘後誘導及重要的劑量依賴性降低肌肉收縮頻率之潛力(相對於未處理之基礎細胞,在0.05和0.1毫克/毫升下分別為25%和18%之肌肉收縮),在24小時培育期間維持該頻率(在0.05和0.1毫克/毫升下分別為23%和10%)。洗出此化合物容許部分的肌肉收縮頻率回復,其在0.05毫克/毫升濃度下更好(在0.05和0.1毫克/毫升下分別為65%和35%)。
使用0.5毫克/毫升之定標(乙醯基六肽-8)在30分鐘後誘導部分的肌肉收縮頻率抑制(18%之肌肉收縮頻率),但是此效應隨著更長時間的培育而減弱(在24小時後45%),且在洗出後,頻率完全恢復(100%)。
可自上文實施例直接推論本發明之肽在神經元與肌纖維形成接合期間有效地提供肌肉收縮之直接效應,促進彼等鬆弛(肌肉鬆弛)。
實施例13. 胞吐作用水平及延遲
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 調節來自神經胚細胞瘤細胞系的含有神經遞質之囊泡的胞吐作用之潛力係於試管內使用SH-SY5Y細胞評估,該評估係藉由使用具有20x物鏡及氙燈之Zeiss axiovert 200倒置型落射螢光顯微鏡之螢光成像。
令SH-SY5Y細胞(Sigma,USA)在T25燒瓶中於補充培養基(DMEM/F12,Gibco,USA)中培養。令大於90%之匯合的細胞以1毫升0.5% (v/v)之胰蛋白酶-EDTA進行胰蛋白酶化。接下來添加5毫升該補充培養基且測定細胞濃度。令細胞以15 x 104 個細胞/槽孔在補充培養基(Gibco,USA)中接種在24槽孔盤的經聚離胺酸塗佈之12毫米經處理之蓋玻片上,且在常規條件下(37℃,5%之CO2 )培育。在24小時細胞接種後,令細胞使用脂染胺TM 3000 (Invitrogen,USA)遵照製造商的指示以胞吐作用報導子轉染。報導子構築體含有由血管腔內特異性蛋白質及pH敏感性螢光蛋白組成之融合蛋白。
在48小時蛋白質表現後,令用於胞吐作用監測之細胞在37℃及5%之CO2 下以0.01毫克/毫升之Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 肽或1毫克/毫升之定標的乙醯基六肽-8培育1小時。使用未處理之細胞作為基礎對照物。接著令細胞以100nM PMA預處理15分鐘且以12.5 µM離子黴素連同PMA (100nM)刺激5分鐘(總刺激:20分鐘)。在刺激方案的最後10分鐘進行螢光成像。胞吐作用報導子之螢光訊號係使用483-512 nm之激發濾波器及525-530 nm之發射濾波器監測。使用Aquacosmos軟體以ORCA-ER CCD照相機每5秒擷取影像,歷經10分鐘。
未處理之細胞係以具有n=16個蓋玻片的N=4個獨立實驗檢定(測量483個細胞),經乙醯基六肽-8處理之細胞係以具有n=10個蓋玻片的N=3個獨立實驗檢定(測量328個細胞),及經Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 處理之細胞係以具有n=8個蓋玻片的N=3個獨立實驗檢定(測量240個細胞)。選擇細胞以個別監測螢光強度及時程。使用以離子黴素添加誘發之螢光峰量化胞吐作用,該量化係藉由使用GraphPad軟體計算曲線下面積(AUC)。定義且分析兩個參數:
- 胞吐作用水平:個別細胞之總峰面積係自AUC分析獲得,且以基線標準化,該基線經定義為注射離子黴素前的3個週期之螢光強度。
- 胞吐作用延遲:個別細胞之反應時間(分鐘)係自AUC分析以離子黴素注射(Y)與起始峰(第一X)之間的時段獲得。
螢光值係基於各實驗相對於未處理之細胞進一步標準化成變化百分比:(經處理之細胞的胞吐作用水平/未處理之細胞的胞吐作用水平)×100及(經處理之細胞的反應時間/未處理之細胞的反應時間)×100。
胞吐作用監測參數之分析:數據代表相對於未處理之細胞標準化之胞吐作用水平及胞吐作用延遲百分比。數據係以平均 ± SEM表示:未處理之細胞的數據係自N=4個獨立實驗,n=16次複製而獲得(測量483個細胞);乙醯基六肽-8的數據係自N=3個獨立實驗,n=10次複製而獲得(測量328個細胞);Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 的數據係自N=3個獨立實驗,n=8次複製而獲得(測量240個細胞)。
令此實驗獲得的結果總結於圖8和9中且反映本發明之肽(如以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)降低(圖8)及延遲(圖9)含有以神經元釋放之乙醯膽鹼的囊泡之胞吐作用的潛力,該乙醯膽鹼係由通過特異性膽鹼受體激活肌肉收縮之神經元釋放。
在人類神經胚細胞瘤細胞系SH-SY5Y中,以0.01毫克/毫升之Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 培育1小時顯著地延遲胞吐作用反應時間(24%之延遲)及降低胞吐作用水平(-14%),但是以1毫克/毫升之乙醯基六肽-8培育1小時顯著地延遲胞吐作用反應(67%之延遲)而未改變胞吐作用水平(7%)。
可自上文實施例直接推論本發明之肽係藉由降低由神經元釋放至用於肌肉收縮之突觸空間的乙醯膽鹼囊泡水平及延遲該胞吐作用而對肌肉收縮有效地提供間接效應。
實施例14. 生產膠原蛋白
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 調節生產作為皮膚緊緻之潛在改善劑的膠原蛋白I型之潛力係於試管內使用人類皮膚纖維母細胞評估。
令細胞以1×104 個細胞/槽孔接種在96槽孔盤中且維持在標準的培養條件下(37℃,95%之濕度,5%之CO2 ) 24小時。在24小時培預後,移除培養基且令含有0.01、0.05或0.1毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 的新培養基添加至槽孔濃度中。持續處理24小時或48小時,且在檢定結束時收集細胞培養基。使用僅以培養基處理之細胞用作基礎對照物(未處理之細胞)。
在處理24及48小時後,由細胞生產及釋放之膠原蛋白I型的量(重新的(ex-novo)膠原蛋白I型合成)係於細胞培養基中藉助於ELISA檢定法測量。令試驗項目的結果與基礎對照物條件(未處理之細胞)相比。處理係在三個不同的實驗階段以一式三份執行。
膠原蛋白I型合成的測定係藉助於競爭性ELISA方法進行。令樣品添加至以抗體預塗佈之酵素槽孔中,接著添加以山葵過氧化酶(HRP)標記之識別抗原;在37℃下培育1小時後,二者皆與固相抗原競爭且形成免疫複合物。在以磷酸鹽緩衝液清洗後,合併之HRP催化四甲基聯苯胺(TMB)成為藍色且在酸的作用下變成黃色;其在450 nm波長下具有吸收峰且其吸光度與樣品之抗原密度呈負相關性。以微量盤讀取機讀取盤。
定量測定係使用由標準的膠原蛋白I型的已知濃度及生長濃度組成之校準曲線。結果係以50微升細胞培養基中的膠原蛋白I型濃度(微克/毫升)表示。
對三個不同的實驗階段的每一測定執行三次試驗。計算陰性對照物與樣品之間的膠原蛋白I型含量之變化%,且獲得肽增加膠原蛋白I型合成之功效的直接指數。
令此實驗獲得的結果總結於圖10(A)和10(B)中且反映本發明之肽(如以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)誘導由人類皮膚纖維母細胞生產膠原蛋白I型之潛力。
Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 肽顯著地提升由纖維母細胞生產膠原蛋白I型,在24小時後以0.01、0.05和0.1毫克/毫升分別提升9%、31%和37.5%,及在48小時後以0.01、0.05和0.1毫克/毫升分別提升16%、29.5%和56.5%。
可自上文實施例直接推論本發明之肽有效地提供改善皮膚的緊緻度和特性之強大效應。
用於胺基酸之縮寫係遵照1983 IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature recommendations outlined in Eur. J. Biochem. (1984) 138:937。
Ac,乙醯基;Ala,丙胺酸;Arg,精胺酸;Asn,天冬醯胺酸;Asp,天冬胺酸;Boc,三級丁氧基羰基;C-端,羧基端;DCM,二氯甲烷;DIEA,N,N′-二異丙基乙胺;DIPCDI,N,N′-二異丙基碳二醯亞胺;DMF,N,N-二甲基甲醯胺;equiv,當量;ESI-MS,電噴霧離子化質譜法;Fmoc,9-茀基甲氧基羰基;Glu,麩胺酸;hiPSC,人類誘導性多能幹細胞;His,組胺酸;HOBt,1-羥基苯并三唑;HPLC,高性能液相層析術;HRP,山葵過氧化酶;Ile,異白胺酸;INCI,化妝品成分之國際命名;MBHA,對-甲基二苯甲胺;Leu,白胺酸;Lys,離胺酸;Me,甲基;MeCN,乙睛;MeOH,甲醇;Met,甲硫胺酸;N-端,胺基端;Palm,棕櫚醯基;Pbf,2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺醯基;PFA,三聚甲醛;PMA,佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯;Phe,苯基丙胺酸;PMSF,苯基甲烷磺醯基;RT,室溫;tBu,三級丁基;Thr,蘇胺酸;TFA,三氟乙酸;TIS,三異丙基矽烷;TMB,四甲基聯苯胺;Trt,三苯基甲基或三苯甲基;Trp,色胺酸;Tyr,酪胺酸。
關於實施例中包括的化學合成程序,應注意所有的合成方法皆在裝有多孔聚乙烯盤的聚丙烯注射器或裝有多孔盤的Pyrex® 反應器中進行。所有的試劑及溶劑皆為合成品質,且在沒有任何額外處理下使用。溶劑及可溶性試劑係以抽氣移除。Fmoc基團係以哌啶-DMF (2:8,v/v)(至少1×1 min,2×10min,5毫升/克樹脂)移除(Lloyd Williams P.等人之Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins , CRC, 1997, Boca Raton (Fla., USA))。在去保護、偶合及再去保護階段之間的清洗係以DMF (3×1 min)及DCM (3×1 min)進行,每次使用10毫升溶劑/克樹脂。偶合反應係以3毫升溶劑/克樹脂執行。偶合控制係進行茚三酮試驗來執行(Kaiser E.等人之Anal. Biochem., 1970, 34: 595598)。所有的合成反應及清洗係在RT下進行。
實施例1. 經由電腦模擬(In silico)測定干擾Mync18-突觸融合蛋白-1之交互作用的肽
在此實驗中,目的為產生對Munc18與突觸融合蛋白-1之交互作用區域具有親和力及/或特異性之電腦模擬肽,且因此能競爭、干擾及破壞該兩種蛋白質之間的交互作用及/或結合。
由於Munc18-突觸融合蛋白-1複合物的結構為已知的且以2.6 A解析度(蛋白質數據庫參考號3C98)取得,因此產生此交互作用的三維結構模型且選擇表1中包括的Munc18之交互作用片段。
基於該標靶片段,令作為設計第一步的野生型肽(被認為是100%之結合肽)突變成聚-Ala (被認為是非結合肽0%),且所有的位置被視為獨立的。令每一個別位置突變成20個天然胺基酸,而其他位置保留為Ala。測定在片段與複合物的其餘部分之間的理論結合能,以評定在不同的位置上以突變誘發改進之交互作用。結合能之製表及標準化得到評分矩陣,其顯示胺基酸殘基如何適當地裝配在肽之給定位置。使用該等矩陣提出及建構出推定抑制Munc18-突觸融合蛋白-1複合物形成之肽的分級列表。
在實驗的第二步驟中,令列表之肽在複合物上模式化,但同時使肽中的所有位置突變。以此方式確保將肽中的相鄰位置之間的交互作用或不相容性納入考慮中。再評估肽-複合物交互作用之結合能,且根據此結合能進行肽的重新分級。接著令可能高於100%或低於0%之結合能與100%之結合劑(野生型)及0%之結合劑(聚Ala肽)相比。選擇且提出用於進一步研究及驗證之最好的肽(參見表2)。
實施例2. 肽之合成及製備
-獲得Fmoc-AA1 -AA2 -AA3 -AA4 -AA5 -AA6 -Rink-MBHA-樹脂,其中AA1 為L-His;AA2 為L-Ile或L-Ala;AA3 為L-Leu或L-Met;AA4 為L-Asp或L-Arg;AA5 為L-Met、L-Trp或L-Phe;且AA6 為L-Trp
令重量標準化。令具有0.52毫莫耳/克之官能化的4.8克(2.5毫莫耳) Fmoc-Rink-MBHA樹脂根據現有技術中已知的通用方案以哌啶-DMF處理,以便移除Fmoc基團。令3.94克Fmoc-L-Trp(Boc)-OH (7.5毫莫耳;3當量)在DIPCDI (1.17毫升;7.5毫莫耳;3當量)及HOBt (1.01克;7.5毫莫耳;3當量)的存在下使用DMF作為溶劑經1小時併入去保護之樹脂上。
接著令樹脂以現有技術中已知的通用方法所述方式清洗,且重複Fmoc基團之去保護處理以偶合下一個胺基酸。遵照先前所述之方案,依序偶合2.90克Fmoc-Phe-OH、2.78克Fmoc-L-Met-OH或3.94克Fmoc-L-Trp(Boc)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或3.08克Fmoc-L-Asp(tBu)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著2.65克Fmoc-L-Leu-OH或2.78克Fmoc-L-Met-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著2.33克Fmoc-L-Ala-OH或2.65克Fmoc-L-Ile-OH (7.5毫莫耳;3當量);及接著4.64克Fmoc-L-His(Trt)-OH (7.5毫莫耳;3當量),各偶合係在1.01克HOBt (7.5毫莫耳;3當量)及1.17毫升DIPCDI (7.5毫莫耳;3當量)的存在下。如上文所述,在各胺基酸添加步驟之間執行Fmoc基團之去保護處理。
在合成後,令肽樹脂以DCM清洗(5次,每次3分鐘)且在真空下乾燥。
- 獲得Fmoc-AA1 -AA2 -AA3 -AA4 -Rink-MBHA-樹脂,其中AA1 為L-Arg;AA2 為L-Arg或L-Met;AA3 為L-Arg及AA4 為L-Phe
令重量標準化。令具有0.52毫莫耳/克之官能化的4.8克(2.5毫莫耳) Fmoc-Rink-MBHA樹脂根據現有技術中已知的通用方案以哌啶-DMF處理,以便移除Fmoc基團。令2.90克Fmoc-L-Phe-OH (7.5毫莫耳;3當量)在DIPCDI (1.17毫升;7.5毫莫耳;3當量)及HOBt (1.01克;7.5毫莫耳;3當量)的存在下使用DMF作為溶劑經1小時併入去保護之樹脂上。
接著令樹脂以通用方法所述方式清洗,且重複Fmoc基團之去保護處理以偶合下一個胺基酸。遵照先前所述之方案,依序偶合4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或2.78克Fmoc-L-Met-OH (7.5毫莫耳;3當量);及接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH (7.5毫莫耳;3當量),各偶合係在1.01克HOBt (7.5毫莫耳;3當量)及1.17毫升DIPCDI (7.5毫莫耳;3當量)的存在下。如上文所述,在各胺基酸添加步驟之間進行Fmoc基團之去保護處理。
在合成後,令肽樹脂以DCM清洗(5次,每次3分鐘)且在真空下乾燥。
- 獲得Fmoc-AA1 -AA2 -AA3 -AA4 -AA5 -AA6 -AA7 -AA8 -Rink-MBHA-樹脂,其中AA1 為L-Glu;AA2 為L-Arg;AA3 為L-Ile;AA4 為L-Asn;AA5 為L-Lys;AA6 為L-Arg或L-Met;AA7 為L-Arg;及AA8 為L-Trp或L-Tyr
令重量標準化。令具有0.52毫莫耳/克之官能化的4.8克(2.5毫莫耳) Fmoc-Rink-MBHA樹脂根據現有技術中已知的通用方案以哌啶-DMF處理,以便移除Fmoc基團。令3.94克Fmoc-L-Trp(Boc)-OH或3.44克Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH (7.5毫莫耳;3當量)在DIPCDI (1.17毫升;7.5毫莫耳;3當量)及HOBt (1.01克;7.5毫莫耳;3當量)的存在下使用DMF作為溶劑經1小時併入去保護之樹脂上。
接著令樹脂以通用方法所述方式清洗,且重複Fmoc基團之去保護處理以偶合下一個胺基酸。遵照先前所述之方案,依序偶合4.86克Fmoc-Arg(Pbf)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或2.78克Fmoc-L-Met-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著3.51克Fmoc-L-Lys(Boc)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著4.45克Fmoc-L-Asn(Trt)-OH (7.5毫莫耳;3當量);接著2.65克Fmoc-L-Ile-OH;接著4.86克Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH;及接著3.19克Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH (7.5毫莫耳;3當量),各偶合係在1.01克HOBt (7.5毫莫耳;3當量)及1.17毫升DIPCDI (7.5毫莫耳;3當量)的存在下。如上文所述,在各胺基酸添加步驟之間進行Fmoc基團之去保護處理。
在合成後,令肽樹脂以DCM清洗(5次,每次3分鐘)且在真空下乾燥。
使用上述合成程序,選擇所需之胺基酸合成下列序列:
實施例3. 移除依照實施例2合成之肽的Fmoc N端保護基
肽基樹脂之N端Fmoc基團係以DMF (1×1 min+2×10 min)中的20%之哌啶去保護(Lloyd Williams P.等人之(1997) “Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins ” CRC, Boca Raton (Fla., USA))。令肽基樹脂以DMF (5×1 min)、DCM (4×1 min)清洗且在真空下乾燥。
實施例4. 引入R1 乙醯基至依照實施例3獲得的肽基樹脂上之方法
令依照實施例2獲得的1毫莫耳(1當量)肽基樹脂在25當量DIEA的存在下使用5毫升DMF作為溶劑以25當量乙酸酐處理。使彼等處於反應狀態下30分鐘,隨後令肽基樹脂以DMF (5×1 min)、DCM (4×1 min)清洗且在真空下乾燥。
實施例5. 自依照實施例3和4獲得的肽基樹脂之聚合物載體之裂解方法
令重量標準化。令實施例2、3或4中任一者獲得的200毫克乾燥之肽基樹脂在室溫下以5毫升TFA/TIS/H2 O (90:5:5)攪拌處理2小時。收集過濾物且使用50毫升(8至10倍)冷的二乙醚沉澱。令醚溶液在減壓及室溫下蒸發至乾燥,令沉澱物再溶解於H2 O中的50%之MeCN中且凍乾。
實施例6. 依照實施例5合成及製備之肽的特徵
依照實施例5獲得的肽之HPLC分析係以使用反相管柱(150×4.6毫米,XBridge Peptide BEH C18,3.5微米,Waters,USA)、在H2 O (+0.045%之TFA)中的MeCN (+0.036%之 TFA)梯度、1.25毫升/分鐘之流速的Shimadzu設備(Kyoto,Japan)進行,且在220 nm下進行檢測。所有的肽顯示超過80%之純度。所獲得的肽之鑑定係以使用MeOH作為移動相及0.2毫升/分鐘之流速的Water ZQ 4000檢測器中之ESI-MS確定。所獲得的結果證明有效地合成在表3中包括的肽。
實施例7. 測量乙醯膽鹼釋放
在以上表3中包括的肽係照實施例2至6合成。
測試該等肽於試管內彼等調節乙醯膽鹼釋放的能力。為此,令LAN細胞接種在48槽孔培養盤上,且容許在受控條件下(37℃,5%之CO2 )達到適當的匯合,然後藉由令培養基以N-2 Supplement,GlutaMAXTM 、氯化鈉及白血病抑制因子(GIBCO,Life technologies,MA, USA)補充之Neurobasal® A培養基更換而誘導分化。一旦細胞獲取其分化形態,令彼等以下列濃度的上述之肽處理1小時:除了Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 以外,所有的肽以0.001毫克/毫升、0.005毫克/毫升和0.01毫克/毫升;而肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 以0.005毫克/毫升和0.05毫克/毫升。接著令細胞以HEPES清洗,然後藉由以外部50mM KCl溶液去極化而刺激乙醯膽鹼釋放。令未刺激之細胞與非去極化4mM KCl溶液培育。在與相應的去極化及非去極化KCl溶液培育30分鐘後,收集細胞上清液且用於以Amplex Red乙醯膽鹼檢定套組(ThermoFisher Scientific,MA, USA)測量乙醯膽鹼含量。使用細胞沉澱物以BCA蛋白質試驗檢定法測定蛋白質含量(Pierce BCA蛋白質檢定套組,ThermoFisher Scientific,MA, USA) (以數據標準化為目的)。
乙醯膽鹼釋放抑制百分比係考慮以陽性對照物(以KCl刺激的未處理之細胞)為100%釋放來計算。
令獲得的結果總結於表4中:
此實驗的結果亦總結於圖1 (A)至(I)中。可自該等圖直接推論以表4中標識為積極調節乙醯膽鹼之肽顯示在所有測試之濃度下顯著地降低乙醯膽鹼釋放。另一方面,以表4中標識為不積極的肽在最低濃度下顯示中至低的抑制作用及在最高濃度下顯示完全喪失抑制作用。該等肽在測試的任何濃度下未顯示出統計學上降低的乙醯膽鹼釋放。由於此類型細胞的技術複雜性及固有的測試可變性,在低濃度下觀察到輕微抑制的事實是可預期的,但是在最高濃度下完全喪失活性清楚地顯示該等肽(Ac-SEQ ID NO: 13-NH2 和Ac-SEQ ID NO: 14-NH2 )不能抑制乙醯膽鹼的釋放。
自先前技術看出((2002),A synthetic hexapeptide (Argireline) with antiwrinkle activity , International Journal of Cosmetic Science, 24, 303-310),當使用BoNT A時,自滲透之嗜鉻細胞的胞吐作用抑制達到50%之最大值,當使用Argireline® 時,達到40%之最大值。因此,以此實施例獲得的結果證實本發明之肽的高活性,因為當直接在甚至不滲透之LAN細胞上測試乙醯膽鹼釋放抑制時,獲得20至30%之抑制值。
實施例8. 結合檢定法
下列的肽係基於實施例1之電腦模擬研究及依照實施例2至6而合成:
肽抑制Munc18與突觸融合蛋白-1,SNARE複合蛋白質之蛋白質-蛋白質交互作用的能力係藉助基於ELISA之試管內Munc18/突觸融合蛋白-1之結合檢定法進行功能性評估。簡言之,令0.1、0.5和1 mM的上述之肽與10和5 nM之彼等標靶蛋白質突觸融合蛋白-1 (經GST標籤化)在緩衝液(20 mM Hepes、150 mM NaCl、2 mM MgCl2 、2 mM DTT、0.5%之Triton-X100及0.5%之脫脂乳)中於RT下預培育3小時。同時,令經His標籤化之Munc18以100 nM結合至鎳塗佈之96槽孔盤且在RT下培育1.5小時。隨後洗去未結合之蛋白質,然後令槽孔以清洗緩衝液(PBS+0.02%之Triton-X100)中的脫脂乳阻斷額外30分鐘。接著令與肽預培育的經GST標籤化之突觸融合蛋白-1以10和5 nM添加至盤中且在RT下培育2h。令槽孔以清洗緩衝液清洗三次,然後與一次抗體(GST標籤多株抗體–Thermofisher Scientific,Massachusetts, USA)培育45分鐘。最後,在再清洗後,添加經HRP共軛之二次抗體(抗兔子-IgG-HRP – Sigma,Missouri, USA)且在RT下培育。使用TMB受質(3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺)產生訊號。藉由添加終止試劑終止反應。突觸融合蛋白-1蛋白質結合至Munc18蛋白質的量係藉由在450 nm下測量吸光度來分析。
令此實驗獲得的結果總結於圖2中。圖2證明所測試的兩種肽(Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 至甚至驚人的更高程度)能顯著地阻斷Munc18與突觸融合蛋白-1之間的蛋白質-蛋白質交互作用,甚至顯示以劑量-反應方式。Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 和Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 肽分別達到37%和67%之最大抑制。基於該等結果可看出本發明之肽能破壞經調節之胞吐作用及隨後的神經遞質釋放所需之蛋白質-蛋白質交互作用。
實施例9. 在骨骼肌人類肌細胞中的基因表現調節
下列的肽係基於實施例1之電腦模擬研究及依照實施例2至6而合成:
測試該等肽以評估彼等調節與人類骨骼肌肌細胞中的肌肉收縮及鬆弛有關的許多基因表現之能力(Lodish H, Berk A, Zipursky SL等人之(2000),Molecular Cell Biology , 4th edition;Section 18.3 Myosin: The Actin Motor Protein, Nueva York, W. H. Freeman;Kuo, IY, & Ehrlich, BE (2015),Signaling in Muscle Contraction , Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 7(2);RAPSN receptor associated protein of the synapse [ Homo sapiens (human) ], Gene ID in NCBI 5913;Blake DJ, Tinsley JM, Davies KE (1996),Utrophin: a structural and functional comparison to dystrophin , Brain Pathol., 6(1):37-47;Barik A, Lu Y, Sathyamurthy A等人之(2014),LRP4 Is Critical for Neuromuscular Junction Maintenance , The Journal of Neuroscience, 34(42), 13892–13905;Kim N, Stiegler AL, Cameron TO, Hallock PT等人之(2008),Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK , Cell, 135(2), 334–342;Mahavadi S, Nalli A, Kumar D等人之(2014),Increased expression of caveolin-1 is associated with upregulation of the RhoA/Rho kinase pathway and smooth muscle contraction in diabetes (1110.11), The FASEB Journal, 28:1_supplement))。為此,設計一種收縮性智慧數據基因小組。該收縮性智慧數據基因小組分析與表5中包括的肌肉收縮及鬆弛有關的基因表現。
表5. 在實施例9中分析之基因
令此實驗的結果總結於圖3(A)至(D)中。可以該等圖看出當人類肌細胞以肽Ac-SEQ ID NO: 5-NH2 處理時,則觀察到UTRN、ACTA1、TNNC1、RAPSN、SCN3A和MYH1之調降。以肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 處理肌細胞導致SCN3A、UTRN、ACTA1、TNNC1、CALM3、CAV1、CACNB1、LRP4和MYH1之調降(經6小時處理)連同RAPSN之調降,及ATP2A之調升(經24小時處理)。最後,以肽Ac-SEQ ID NO: 10-NH2 處理肌細胞導致UTRN、TNNC1、SCN3A CHRNA1和CACNB1之調降。
上述基因之調降可以不同的方式影響正常的肌肉收縮功能:乙醯膽鹼結合在肌肉細胞表面上所需之RAPSN、CHRNA1、UTRN和LRP4可影響神經遞質誘導之膜去極化及細胞骨架穩定性;作為電壓閘控通道之SCN3A和CACNB1可影響膜電位的激發傳遞;涉及Ca2+ 運輸之SLN可影響細胞內鈣積聚;及MYH1、TNNC1和ACTA1可影響細胞骨架完整性及驅動收縮之動力衝擊。因此,以此實施例獲得及顯示於圖3中的結果證明本發明之肽調節肌肉收縮-鬆弛的能力,有助於增加肌肉鬆弛。
實施例10. 鈣動員檢定法
肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 係依照實施例2至6合成。
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 減少在人類骨骼肌細胞上的鈣動員之潛力係於試管內以Fluo-4 NW鈣檢定套組(ThermoFisher Scientific,MA USA)評估。簡言之,令人類骨骼肌肌胚細胞以1×104 個細胞/槽孔之密度以一式五份接種在透明底部的黑色96槽孔盤中且維持在標準的培養條件下(37℃,95%之濕度,5%之CO2 ) 48至72小時。接著以特異性分化培養基(SKM-D培養基 + 1%之a/a)誘導肌胚細胞分化成肌細胞且監測7天以上。令分化之細胞以無細胞毒性濃度的肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (0.01毫克/毫升、0.05毫克/毫升和0.1毫克/毫升)處理額外48小時。
一旦培育完成,令細胞培養基以100微升染料負載溶液替換,且令盤保持在培育箱中30分鐘。接著在使用FLUOstar Omega儀器(BMG Labtech,Germany)測量鈣前,令染料溶液以檢定緩衝液替換。為了進行適當的動力學測量,設定10秒之預刺激階段以測定在藉由添加60 mM KCl以誘導鈣離子內流前的基線訊號。設定在90秒之刺激後階段,在494/516nm下(激發/發射)以每0.1秒讀數。
執行下列的步驟用於數據分析:1)計算各條件的平均動力學曲線;2)在以KCl刺激後測定各曲線之最大螢光訊號;3)計算相對於基線而增加的倍數變化;4)以各條件(各肽濃度)獲得的結果相對於以對照物(未處理之細胞)獲得的一個結果進行標準化。
令此實驗獲得的結果總結於圖4中且反映本發明之肽(以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)以劑量依賴方式減少鈣離子內流之潛力(在0.01毫克/毫升、0.05毫克/毫升和0.1毫克/毫升下分別為-6%、-20%和-30%)。此減少的鈣離子內流對細胞收縮性具有衝擊,有利於肌肉鬆弛。
可自上文實施例直接推論本發明之肽有效地干擾或抑制複合物Munc18-突觸融合蛋白-1的形成,因此容許調節(抑制)神經元胞吐作用。另外,該等肽提供在肌細胞上誘導或促進彼等鬆弛(肌肉鬆弛)之直接效應。因此,本發明之肽解決現有技術中存在的上述問題。
實施例11. 減少肌凝蛋白重鏈蛋白
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 減少在人類骨骼肌細胞中的蛋白質肌凝蛋白重鏈表現之潛力係於試管內使用對抗此蛋白質之特異性抗體(Biotechne,USA),繼而以二次螢光抗體(Thermofisher,USA)之免疫螢光評估。簡言之,令人類骨骼肌肌胚細胞以3×104 個細胞/平方公分之密度在SKM-M培養基(Tebu-Bio,France)中接種在蓋玻片上且在標準的培養條件下(37℃,95%之濕度,5%之CO2 )經隔夜培育。接著以特異性分化培養基(骨骼肌細胞分化培養基,SKM-D培養基)誘導肌胚細胞分化成肌細胞且監測7天以上。令分化之細胞以無細胞毒性濃度的肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 (0.05毫克/毫升和0.5毫克/毫升)處理額外48小時。
一旦培育完成,令細胞以4%之PFA固定且使用0.1% (v/v)之Triton (Sigma,USA)滲透。接著令肌凝蛋白在室溫下以0.5毫克/毫升之肌凝蛋白重鏈抗體經2h期間染色。在適當的清洗後,令肌動蛋白以50微克/毫升之毒蠅虎蕈鹼(紅色)(Sigma,USA)經1h標記,且在清洗後,令細胞以4微克/毫升之二次抗體山羊抗小鼠igG經1h染色。最後,令核以3.5 微克/毫升之Hoescht標識物(Sigma,USA)經10分鐘染色。
使用5x和10x物鏡獲取顯微影像。各條件使用三次重複物且使用相同的設置獲取各蓋玻片的三至四個視野影像。
影像係使用Image J軟體分析。立刻調整閾值以選擇肌凝蛋白且測量平均螢光。陽性細胞數目係使用DAPI染色計數。令肌凝蛋白平均螢光強度除以肌凝蛋白陽性細胞數目。最後,令所有數據標準化如下以獲得與未處理之細胞相比的肌凝蛋白%:相對於對照物之% = (在處理之槽孔中的每一細胞之螢光/在未處理之槽孔中的每一細胞之螢光)×100。
令此實驗獲得的結果總結於圖5(A)、5(B)和6中且反映本發明之肽(如以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)以劑量依賴方式減少肌凝蛋白重鏈蛋白含量之潛力(在圖6中,在0.05毫克/毫升和0.5毫克/毫升下分別為-26%和-38%)。此減少的肌凝蛋白重鏈蛋白含量對細胞收縮性具有衝擊,有利於肌肉鬆弛。
可自上文實施例直接推論本發明之肽有效地提供在肌細胞上誘導或促進彼等鬆弛(肌肉鬆弛)之直接效應。
實施例12. 收縮頻率
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 調節收縮頻率之潛力係於試管內使用人類肌細胞及衍生自hiPSC共培養物之運動神經元評估,該評估係藉助於治療前及後(在治療後的每一確立之時間點)以InCell 2200自動化顯微鏡紀錄在60秒期間之局部化收縮肌纖維的活體影像視頻。
令人類肌細胞以1×106 個細胞之密度於T75平方公分燒瓶中培養,且接著轉移至96槽孔盤進行分化。令衍生自hiPSC之運動神經元轉移至含有在分化培養基中的肌細胞之96槽孔盤上。令共培養物維持10天以產生神經元與肌纖維之接合。在5天內觀察到自發性收縮。
接著令共培養物以對照培養基(基礎)、1 µM α-金環蛇毒素、作為定標參考物的0.5毫克/毫升之乙醯基六肽-8及0.05或0.1毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 處理。紀錄在處理前於60秒期間的共培養物之影片及再記錄在培育30分鐘後於60秒期間的共培養物之影片。令培養盤以化合物再培育1小時30分鐘(共培育2小時),且再紀錄於60秒期間的共培養物之影片。令培養盤以化合物再培育總共24小時,且在培育結束時再紀錄於60秒期間之影片。最後,洗出化合物且自該洗出化合物起24小時後進行最後一次記錄以評定最終的肌肉收縮回復(回復)。
計算在各培育前及後的收縮頻率。各培養條件分析6個槽孔。
令此實驗獲得的結果總結於圖7中且反映本發明之肽(如以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)在僅30分鐘後誘導及重要的劑量依賴性降低肌肉收縮頻率之潛力(相對於未處理之基礎細胞,在0.05和0.1毫克/毫升下分別為25%和18%之肌肉收縮),在24小時培育期間維持該頻率(在0.05和0.1毫克/毫升下分別為23%和10%)。洗出此化合物容許部分的肌肉收縮頻率回復,其在0.05毫克/毫升濃度下更好(在0.05和0.1毫克/毫升下分別為65%和35%)。
使用0.5毫克/毫升之定標(乙醯基六肽-8)在30分鐘後誘導部分的肌肉收縮頻率抑制(18%之肌肉收縮頻率),但是此效應隨著更長時間的培育而減弱(在24小時後45%),且在洗出後,頻率完全恢復(100%)。
可自上文實施例直接推論本發明之肽在神經元與肌纖維形成接合期間有效地提供肌肉收縮之直接效應,促進彼等鬆弛(肌肉鬆弛)。
實施例13. 胞吐作用水平及延遲
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 調節來自神經胚細胞瘤細胞系的含有神經遞質之囊泡的胞吐作用之潛力係於試管內使用SH-SY5Y細胞評估,該評估係藉由使用具有20x物鏡及氙燈之Zeiss axiovert 200倒置型落射螢光顯微鏡之螢光成像。
令SH-SY5Y細胞(Sigma,USA)在T25燒瓶中於補充培養基(DMEM/F12,Gibco,USA)中培養。令大於90%之匯合的細胞以1毫升0.5% (v/v)之胰蛋白酶-EDTA進行胰蛋白酶化。接下來添加5毫升該補充培養基且測定細胞濃度。令細胞以15 x 104 個細胞/槽孔在補充培養基(Gibco,USA)中接種在24槽孔盤的經聚離胺酸塗佈之12毫米經處理之蓋玻片上,且在常規條件下(37℃,5%之CO2 )培育。在24小時細胞接種後,令細胞使用脂染胺TM 3000 (Invitrogen,USA)遵照製造商的指示以胞吐作用報導子轉染。報導子構築體含有由血管腔內特異性蛋白質及pH敏感性螢光蛋白組成之融合蛋白。
在48小時蛋白質表現後,令用於胞吐作用監測之細胞在37℃及5%之CO2 下以0.01毫克/毫升之Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 肽或1毫克/毫升之定標的乙醯基六肽-8培育1小時。使用未處理之細胞作為基礎對照物。接著令細胞以100nM PMA預處理15分鐘且以12.5 µM離子黴素連同PMA (100nM)刺激5分鐘(總刺激:20分鐘)。在刺激方案的最後10分鐘進行螢光成像。胞吐作用報導子之螢光訊號係使用483-512 nm之激發濾波器及525-530 nm之發射濾波器監測。使用Aquacosmos軟體以ORCA-ER CCD照相機每5秒擷取影像,歷經10分鐘。
未處理之細胞係以具有n=16個蓋玻片的N=4個獨立實驗檢定(測量483個細胞),經乙醯基六肽-8處理之細胞係以具有n=10個蓋玻片的N=3個獨立實驗檢定(測量328個細胞),及經Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 處理之細胞係以具有n=8個蓋玻片的N=3個獨立實驗檢定(測量240個細胞)。選擇細胞以個別監測螢光強度及時程。使用以離子黴素添加誘發之螢光峰量化胞吐作用,該量化係藉由使用GraphPad軟體計算曲線下面積(AUC)。定義且分析兩個參數:
- 胞吐作用水平:個別細胞之總峰面積係自AUC分析獲得,且以基線標準化,該基線經定義為注射離子黴素前的3個週期之螢光強度。
- 胞吐作用延遲:個別細胞之反應時間(分鐘)係自AUC分析以離子黴素注射(Y)與起始峰(第一X)之間的時段獲得。
螢光值係基於各實驗相對於未處理之細胞進一步標準化成變化百分比:(經處理之細胞的胞吐作用水平/未處理之細胞的胞吐作用水平)×100及(經處理之細胞的反應時間/未處理之細胞的反應時間)×100。
胞吐作用監測參數之分析:數據代表相對於未處理之細胞標準化之胞吐作用水平及胞吐作用延遲百分比。數據係以平均 ± SEM表示:未處理之細胞的數據係自N=4個獨立實驗,n=16次複製而獲得(測量483個細胞);乙醯基六肽-8的數據係自N=3個獨立實驗,n=10次複製而獲得(測量328個細胞);Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 的數據係自N=3個獨立實驗,n=8次複製而獲得(測量240個細胞)。
令此實驗獲得的結果總結於圖8和9中且反映本發明之肽(如以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)降低(圖8)及延遲(圖9)含有以神經元釋放之乙醯膽鹼的囊泡之胞吐作用的潛力,該乙醯膽鹼係由通過特異性膽鹼受體激活肌肉收縮之神經元釋放。
在人類神經胚細胞瘤細胞系SH-SY5Y中,以0.01毫克/毫升之Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 培育1小時顯著地延遲胞吐作用反應時間(24%之延遲)及降低胞吐作用水平(-14%),但是以1毫克/毫升之乙醯基六肽-8培育1小時顯著地延遲胞吐作用反應(67%之延遲)而未改變胞吐作用水平(7%)。
可自上文實施例直接推論本發明之肽係藉由降低由神經元釋放至用於肌肉收縮之突觸空間的乙醯膽鹼囊泡水平及延遲該胞吐作用而對肌肉收縮有效地提供間接效應。
實施例14. 生產膠原蛋白
該肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 調節生產作為皮膚緊緻之潛在改善劑的膠原蛋白I型之潛力係於試管內使用人類皮膚纖維母細胞評估。
令細胞以1×104 個細胞/槽孔接種在96槽孔盤中且維持在標準的培養條件下(37℃,95%之濕度,5%之CO2 ) 24小時。在24小時培預後,移除培養基且令含有0.01、0.05或0.1毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 的新培養基添加至槽孔濃度中。持續處理24小時或48小時,且在檢定結束時收集細胞培養基。使用僅以培養基處理之細胞用作基礎對照物(未處理之細胞)。
在處理24及48小時後,由細胞生產及釋放之膠原蛋白I型的量(重新的(ex-novo)膠原蛋白I型合成)係於細胞培養基中藉助於ELISA檢定法測量。令試驗項目的結果與基礎對照物條件(未處理之細胞)相比。處理係在三個不同的實驗階段以一式三份執行。
膠原蛋白I型合成的測定係藉助於競爭性ELISA方法進行。令樣品添加至以抗體預塗佈之酵素槽孔中,接著添加以山葵過氧化酶(HRP)標記之識別抗原;在37℃下培育1小時後,二者皆與固相抗原競爭且形成免疫複合物。在以磷酸鹽緩衝液清洗後,合併之HRP催化四甲基聯苯胺(TMB)成為藍色且在酸的作用下變成黃色;其在450 nm波長下具有吸收峰且其吸光度與樣品之抗原密度呈負相關性。以微量盤讀取機讀取盤。
定量測定係使用由標準的膠原蛋白I型的已知濃度及生長濃度組成之校準曲線。結果係以50微升細胞培養基中的膠原蛋白I型濃度(微克/毫升)表示。
對三個不同的實驗階段的每一測定執行三次試驗。計算陰性對照物與樣品之間的膠原蛋白I型含量之變化%,且獲得肽增加膠原蛋白I型合成之功效的直接指數。
令此實驗獲得的結果總結於圖10(A)和10(B)中且反映本發明之肽(如以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 為實例)誘導由人類皮膚纖維母細胞生產膠原蛋白I型之潛力。
Ac-SEQ ID NO: 8-NH2 肽顯著地提升由纖維母細胞生產膠原蛋白I型,在24小時後以0.01、0.05和0.1毫克/毫升分別提升9%、31%和37.5%,及在48小時後以0.01、0.05和0.1毫克/毫升分別提升16%、29.5%和56.5%。
可自上文實施例直接推論本發明之肽有效地提供改善皮膚的緊緻度和特性之強大效應。
圖1顯示與陽性對照物相比,藉由以經分析之肽處理的LAN細胞於試管內之乙醯膽鹼釋放百分比(亦即令陽性對照樣品的乙醯膽鹼釋放百分比固定為100%,且接著與其餘的樣品進行比較)。圖1顯示以下列肽獲得的結果:Ac-SEQ ID NO: 5-NH2
(A)、Ac-SEQ ID NO: 6-NH2
(B)、Ac-SEQ ID NO: 7-NH2
(C)、Ac-SEQ ID NO: 8 -NH2
(D)、Ac-SEQ ID NO: 9-NH2
(E)、Ac-SEQ ID NO: 10-NH2
(F)、Ac-SEQ ID NO: 11-NH2
(G)、Ac-SEQ ID NO: 13-NH2
(H)和Ac-SEQ ID NO:14-NH2
(I)。除了Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
(D)以外,所有的肽係以0.001毫克/毫升、0.005毫克/毫升和0.01毫克/毫升之濃度測試;而肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
(D)係以0.005毫克/毫升和0.05毫克/毫升測試。在圖1(D)之x軸上自左到右的直列相應於:基礎狀態(未處理之細胞)、陽性對照物(以50 mM KCl處理之細胞)、以100 nM毒素(依照Ibañez C., Blanes-Mira C., Fernández-Ballester G., Planells-Cases R., and Ferrer-Montiel A., (2004)Modulation of botulinum neurotoxin A catalytic domain stability by tyrosine phosphorylation
, FEBS Letters 578, 121–127生產的肉毒桿菌神經毒素A輕鏈(BoNT A LC))處理之細胞、以0.1 µM棕櫚醯基-Argireline®
(棕櫚醯基-乙醯基六肽-8®
)處理之細胞及以0.005毫克/毫升和0.05毫克/毫升的相應肽處理之細胞。另一方面,在圖1(A)至1(C)及1(E)至1(I)之x軸上自左到右的直列相應於:基礎狀態(未處理之細胞)、陽性對照物(以50 mM KCl處理之細胞)、以100 nM毒素(BoNT A LC)處理之細胞及以0.001毫克/毫升、0.005毫克/毫升和0.01毫克/毫升的相應肽處理之細胞。圖1(A)至1(I)之y軸顯示乙醯膽鹼釋放百分比(相對於陽性對照物)。
圖2顯示相對於代表100%結合之對照物(未處理)的複合物Munc18-突觸融合蛋白-1之結合百分比。在圖2中,可觀察到肽Ac-SEQ ID NO:8-NH2
(A)和Ac-SEQ ID NO: 5-NH2
(B)抑制複合物Munc18-突觸融合蛋白-1形成的能力。在圖2(A)和2(B)二者之x軸上自左到右的直列相應於:第一組直列(左組直列)的對照物及以Munc18 100 nM:突觸融合蛋白-1 10 nM之比的0.1、0.5和1 mM濃度之相應肽及第二組直列(右組直列)的對照物及以Munc18 100 nM:突觸融合蛋白-1 5 nM之比的0.1、0.5和1 mM濃度之相應肽。兩個圖之y軸顯示複合物形成百分比,以未處理獲得的訊號為100%。
圖3顯示以本發明之肽處理所誘導之人類骨骼肌細胞的基因表現輪廓之調節。圖3(A)顯示以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理所獲得的結果(以0.05和0.5毫克/毫升之濃度,6小時期間),其中自上到下的橫條係指下列基因:SCN3A (電壓閘控鈉離子通道α亞單元3)、UTRN (上調肌營養不良蛋白(Utrophin))、ACTA1 (肌動蛋白α 1)、TNNC1 (肌鈣蛋白C1)、CALM3 (調鈣素3)、CAV1 (窖蛋白(Caveolin) 1)、CACNB1 (電壓閘控鉀離子通道輔助亞單元β 1)、LRP4 (LDL受體相關蛋白4)和MYH1 (肌凝蛋白重鏈1)。在圖3(A)中,以基因MHY1、LRP4、CACNB1和UTRN顯示的結果相應於以0.05毫克/毫升之處理,而其餘相應於以0.5毫克/毫升之處理。圖3(B)顯示以0.5毫克/毫升濃度之Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
經24小時期間處理所獲得的結果,其中自上到下的橫條係指下列基因:RAPSN (突觸之受體相關蛋白)和ATP2A (ATPase肌質網/內質網Ca2+
運輸)。圖3(C)顯示以Ac-SEQ ID NO: 5-NH2
(以0.05毫克/毫升濃度及24小時期間)處理所獲得的結果,其中自上到下的橫條係指下列基因:UTRN (上調肌營養不良蛋白)、ACTA1 (肌動蛋白α 1)、TNNC1 (肌鈣蛋白C1)、RAPSN (突觸之受體相關蛋白)、SCN3A (電壓閘控鈉離子通道α亞單元3)和MYH1。圖3(D)顯示以Ac-SEQ ID NO: 10-NH2
(以0.1毫克/毫升濃度及24小時期間)處理所獲得的結果,其中自上到下的橫條係指下列基因:UTRN (上調肌營養不良蛋白)、TNNC1 (肌鈣蛋白C1)、SCN3A (電壓閘控鈉離子通道α亞單元3)、CHRNA1 (菸鹼型乙醯膽鹼受體α 1亞單元)和CACNB1 (電壓閘控鉀離子通道輔助亞單元β 1)。在這四個例子中,x軸係指相對於基礎狀態的倍數變化。負倍數變化係指基因表現調降,而正倍數變化係指調升。
圖4顯示相對於固定為100%之對照物(以60 mM KCl刺激的未處理之樣品),在以肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理且以60 mM KCl刺激後降低在人類骨骼肌肌細胞上的鈣離子內流。在x軸上自左到右的直列相應於:對照物及0.01、0.05和0.1毫克/毫升之肽濃度。y軸顯示相對於固定為100%訊號之對照物而降低的鈣訊號百分比。
圖5顯示肌凝蛋白重鏈蛋白在以未處理之初代人類骨骼肌細胞上(圖5(A))及以0.05毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理之初代人類骨骼肌細胞上(圖5(B))的表現水平之代表性影像。相對於未處理之細胞,以0.05毫克/毫升之肽處理之初代人類骨骼肌細胞觀察到減少的肌凝蛋白重鏈蛋白含量,與圖5(A)相比,該減少可看作為圖5B中丟失的著色或訊號。
圖6顯示相對於固定為100%之基礎對照物(未處理之細胞),在以肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理後減少在初代人類骨骼肌細胞上之肌凝蛋白重鏈蛋白含量。在x軸上自左到右的直列相應於未處理之細胞及0.05和0.5毫克/毫升之肽濃度。Y軸顯示相對於固定為100%訊號之基礎對照物的肌凝蛋白重鏈蛋白含量(以每一處理組中觀察到的肌凝蛋白重鏈蛋白之螢光訊號為基礎,其係藉助於平均細胞螢光測量)。
圖7顯示相對於固定為100%之基礎對照物(未處理之細胞),在以肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
、作為定標對照物的乙醯基六肽-8或作為抑制之陽性對照物的α-金環蛇毒素處理後於人類運動神經元及人類骨骼肌細胞共培養物上觀察到的收縮頻率調節。具有正方形的線代表未處理之細胞(基礎對照物)的收縮頻率。具有十字形的線代表以收縮抑制之陽性對照物α-金環蛇毒素的收縮頻率。具有菱形的線代表以0.5毫克/毫升之定標的乙醯基六肽-8的收縮頻率。具有圓形的線代表以0.1毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
的收縮頻率;及具有三角形的線代表以0.05毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
的收縮頻率。X軸相應於不同的活性物之處理長度,且標出不同的時間點:T0、T30 min、T2 h、T24 h和回復。T0相應於以上述之化合物處理前的收縮;T30 min相應於處理30分鐘;T2 h相應於處理2小時;T24h相應於處理24小時;及回復相應於在移除所有的化合物後培育24小時。Y軸顯示相對於固定為100%訊號之基礎對照物(未處理之細胞)的收縮頻率百分比。
圖8顯示相對於固定為100%的未處理之細胞的基礎對照物,在以肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
或定標的乙醯基六肽-8處理後降低在人類神經胚細胞瘤細胞系上的胞吐作用。在x軸上自左到右的直列相應於未處理之細胞、1毫克/毫升之乙醯基六肽-8處理之細胞和以0.01毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理之細胞。Y軸顯示相對於固定為100%水平之基礎對照物而相應於胞吐作用水平的螢光訊號百分比。
圖9顯示相對於固定為100%的未處理之細胞的基礎對照物,在以肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
或定標的乙醯基六肽-8處理後延遲在人類神經胚細胞瘤細胞系上的胞吐作用時間。在x軸上自左到右的直列相應於未處理之細胞、1毫克/毫升之乙醯基六肽-8和0.01毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
。Y軸顯示相對於固定在100%水平之基礎對照物而相應於胞吐作用延遲的反應時間百分比。
圖10顯示相對於固定為100%的基礎對照物(未處理之細胞),在以Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理後以初代人類皮膚纖維母細胞生產之膠原蛋白I型:在開始處理後24h (圖10(A))及在開始處理後48h (圖10(B))。在x軸上自左到右的直列相應於:基礎對照物(未處理之細胞)及分別以0.01、0.05或0.1毫克/毫升之肽Ac-SEQ ID NO: 8-NH2
處理之細胞。Y軸顯示相對於固定在100%水平之對照物而增加的膠原蛋白I型蛋白質合成百分比。
Claims (18)
- 一種能干擾Munc18-突觸融合蛋白(Syntaxin)-1複合物交互作用之肽、其可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或彼等之混合物,該肽的特徵在於其係與SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4競爭。
- 根據申請專利範圍第1項之肽,其序列為SEQ ID NO: 3及/或SEQ ID NO: 4。
- 根據申請專利範圍第1項之肽,其具有式(I)之序列: 彼等之化妝品及醫藥上可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或上述之混合物,其中: AA1 係選自具有正荷電側鏈或極性未荷電側鏈之胺基酸群組; AA2 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組; AA3 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組; AA4 係選自具有荷電側鏈之胺基酸群組; AA5 係選自具有非極性疏水性側鏈或芳族側鏈之胺基酸群組; AA6 為W; R1 係選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之芳烷基和R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈;且 R2 係選自H、-NR3 R4 -、-OR3 和-SR3 ,其中R3 和R4 係獨立地選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、和經取代或未經取代之芳烷基。
- 根據申請專利範圍第3項之肽,其中 AA1 為H; AA2 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組; AA3 係選自具有非極性疏水性側鏈之胺基酸群組; AA4 係選自具有荷電側鏈之胺基酸群組; AA5 係選自M或具有芳族側鏈之胺基酸群組;且 AA6 為Trp。
- 根據申請專利範圍第3項之肽,其中 AA1 為His; AA2 係選自Ala和Ile之群組; AA3 係選自Leu和Met之群組; AA4 係選自Arg和Asp之群組; AA5 係選自Met、Phe和Trp之群組;且 AA6 為Trp。
- 根據申請專利範圍第3至5項中任一項之肽,其中該式(I)之肽為:
- 根據申請專利範圍第3至5項中任一項之肽,其中該式(I)之肽為:
- 根據申請專利範圍第1項之肽,其具有式(II)之序列: 彼等之化妝品及醫藥上可接受的異構物、鹽、溶劑合物及/或衍生物及/或上述之混合物,其中: AA1 係選自具有正荷電側鏈之胺基酸群組; AA2 為任何胺基酸; AA3 係選自具有正荷電側鏈之胺基酸群組; AA4 係選自具有芳族側鏈之胺基酸群組; R1 係選自His、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、經取代或未經取代之芳烷基和R5 -CO-,其中R5 係選自由下列者所構成之群組:經取代或未經取代之C1 -C24 烷基、經取代或未經取代之C2 -C24 烯基、經取代或未經取代之C2 -C24 炔基、經取代或未經取代之C3 -C24 環烷基、經取代或未經取代之C5 -C24 環烯基、經取代或未經取代之C8 -C24 環炔基、經取代或未經取代之C6 -C30 芳基、經取代或未經取代之C7 -C24 芳烷基、經取代或未經取代之3至10員的雜環基環、和經取代或未經取代之2至24個碳原子與1至3個非碳的原子之雜芳基烷基、及1至6個碳原子的烷基鏈;且 R2 係選自H、-NR3 R4 -、-OR3 和-SR3 ,其中R3 和R4 係獨立地選自H、經取代或未經取代之非環狀脂族基、經取代或未經取代之脂環基、經取代或未經取代之雜環基、經取代或未經取代之雜芳基烷基、經取代或未經取代之芳基、和經取代或未經取代之芳烷基。
- 根據申請專利範圍第8項之肽,其中 AA1 係選自Lys、Arg和His之群組; AA2 為任何胺基酸; AA3 係選自Lys、Arg和His之群組;且 AA4 係選自Phe、Tyr和Trp之群組。
- 根據申請專利範圍第9項之肽,其中 AA1 係選自Arg之群組; AA2 為任何胺基酸; AA3 係選自Arg之群組;且 AA4 係選自Phe之群組。
- 根據申請專利範圍第8至10項中任一項之肽,其中該式(II)之肽為:
- 根據申請專利範圍第8至10項中任一項之肽,其中該式(II)之肽為:
- 一種組成物,其包含根據申請專利範圍第1至12項中任一項之肽。
- 根據申請專利範圍第1至5及8至10項中任一項之肽或根據申請專利範圍第13項之組成物,其係用於作為藥劑。
- 根據申請專利範圍第1至5及8至10項中任一項之肽,其係用於預防及/或治療神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患。
- 根據申請專利範圍第15項之肽,其中該神經元胞吐作用及/或肌肉收縮性疾患為老年性失智症、阿茲海默氏症相關性失智症、AIDS相關性失智症、癲癇症、肌萎縮性硬化症、多發性/脊髓側索硬化症、肥大細胞增多症、慢性偏頭痛、緊張不全及/或焦慮症疾患。
- 根據申請專利範圍第15項之肽,其中該肌肉收縮性疾患為肌僵直、肌緊張性營養障礙、先天性肌僵直、帕金森氏症、繼發性帕金森氏症、亨汀頓氏症(Huntington disease)、痙攣或遲發性不自主運動(TD)。
- 一種根據申請專利範圍第1至12項中任一項之肽或根據申請專利範圍第13項之組成物於製備化妝品的用途,該化妝品係用於預防、減少及/或消除個體的皮膚老化及/或表情標誌。
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