CN112040969A - 用于化妆品和医药的肽和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够干扰复合物Munc18‑突触融合蛋白1形成的肽家族，因此可用于预防和/或治疗神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍；并预防、减少和/或消除皮肤老化和/或表情纹迹。

Description

用于化妆品和医药的肽和组合物
本发明涉及分子生物学领域，更准确地涉及应用于化妆品和药物的分子生物学，甚至更确切地涉及能够调节Munc18和突触融合蛋白1(Syntaxin-1)之间的结合或相互作用并因此调节与SNARE复合物的结合的肽和包含所述肽的组合物。由于这种活性，本发明的肽和组合物能够调节突触小泡融合和肌肉收缩性。因此，所述肽和组合物可有效治疗与上述方面的调节有关的病况(例如，肌肉松弛)，并且可用于化妆品(抗皱活性和抗多汗症活性)和药物(神经和/或肌肉收缩障碍)。
SNARE复合物和突触小泡融合的异常调节尤其会导致异常的肌肉收缩松弛，这在化妆品和医学中都非常相关。
一方面，皱纹(例如面部表情皱纹)的形成基础或机理是向内拖动皮肤的肌肉张力。这种肌肉张力是神经活动过度导致相应肌肉无力的结果。所述神经活动过度继而以刺激肌肉纤维的神经递质的不受控制和过度的释放为特征。
另一方面，导致肌肉收缩-松弛的改变的神经活动过度(如上所述，其特征是由于刺激肌肉纤维的神经递质的不受控制和过度的释放)也是几种已知疾病的基础，例如，老年性痴呆、阿尔茨海默氏相关性痴呆、AIDS相关性痴呆、癫痫、肌萎缩性硬化或多发性/侧索硬化(Jabbari B,(2018)Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach,Springer,Cham；Jankovic J,(2004)Botulinum toxin in clinicalpractice,J NeurolNeurosurg Psychiatry,75:951–957)。
与如上所述类似地，SNARE复合物和突触小泡融合中的异常(其导致神经元胞吐作用的失调)不仅会导致肌肉的过度激活或兴奋，还会导致其他结构或器官(例如腺体)的过度激活或兴奋。因此，所述情况还导致与肌肉收缩无关的美容和医学方面的改变(本发明的肽和组合物对其有用)，例如多汗症(汗腺的过度激活或兴奋)(Jabbari B,(2018)Botulinum Toxin Treatment in Clinical Medicine A Disease-Oriented Approach,Springer,Cham.；Luvisetto S,Gazerani P,Cianchetti C,Pavone F,(2015)BotulinumToxin Type A as a Therapeutic Agent against Headache and Related Disorders,Toxins(Basel),Sep；7(9):3818–3844.；Molderings GJ,Haenisch B,Brettner S等人,(2016)Pharmacological treatment options for mast cell activation disease,ArchPharmacol.2016；389:671–694.；
Figure BDA0002611949380000021
E,ArcC,(2016),Use of Botulinum Neurotoxinin Ophthalmology,Turk J Ophthalmol.Dec；46(6):282–290.；Schlereth T,DieterichM,Birklein F(2009),Hyperhidrosis--causes and treatment of enhanced sweating,DtschArzteblInt.Jan；106(3):32-7)。
神经递质释放是由于突触前囊泡融合引起的，众所周知，这是由不同蛋白质之间的复杂相互作用所控制的，这些蛋白质负责将带有神经递质的囊泡靠近突触前膜，将所述囊泡配置好位置以使其分泌，允许膜融合以进行分泌和分解产生的复合物以允许其回收。所有这些过程，包括参与蛋白的组装和拆卸，都需要严格控制，因为任何类型的失调都可能导致具有美观和/或健康影响两者的改变。
调节神经元胞吐作用的分子有助于缓解肌肉紧张，并因此防止、减少和/或消除皱纹(优选面部皱纹)和/或预防、改善或治愈与异常或失调的神经元胞吐作用有关的疾病。
在这方面，传统上认为，突触前囊泡(装载有神经递质，优选乙酰胆碱)融合是由SNARE蛋白(即神经元膜中的突触融合蛋白1和SNAP-25；以及囊泡膜中的小突触泡蛋白(synaptobrevin)或VAMP)驱动或控制的。因此，认为SNARE蛋白复合物形成了控制神经分泌的关键靶标。
在这方面，已经产生了几种针对SNARE蛋白复合物的治疗和美容方法，如例如：
-肉毒杆菌毒素：它们被广泛用于减少和/或消除表情皱纹，尤其是血清型A(
Figure BDA0002611949380000022
Cosmetic，Allergan Inc.)。所述肉毒杆菌毒素是局部注射的且其麻痹效果是可逆的，平均持续时间为6个月，因此需要重复注射。已知引发针对肉毒杆菌制剂的免疫反应而导致治疗功效丧失的风险。肉毒杆菌毒素的其他血清型，例如B、F和E，也被考虑用来解决此问题，但是所述血清型也有引发免疫反应的风险。在分子水平上，肉毒杆菌毒素是降解参与钙离子激活的胞吐机制的神经元蛋白的蛋白酶。例如，肉毒杆菌毒素A截短了神经元SNAP-25蛋白。
-在现有技术中还已知某些源自形成SNARE复合物的蛋白质序列的肽可抑制神经元胞吐作用，如例如：源自SNAP-25氨基和羧基结构域的肽(参见例如，PCT专利申请WO97/34620，欧洲专利EP1180524B1和欧洲专利EP2123673B1)和衍生自小突触泡蛋白或突触融合蛋白的肽(参见例如PCT专利申请WO97/34620；Blanes-Mira,C.,Clemente,J.,Jodas,G.,Gil,A.,Fernandez-Ballester,G.,Ponsati,B.,Gutierrez,L.,Perez-Paya,E.,Ferrer-Montiel,A.A synthetic hexapeptide(Argireline)with antiwrinkleactivity.International Journal of Cosmetic Science,(2002),24,303-310)。
然而，仍然需要寻找其他或替代的分子来干扰突触神经递质释放的机制并对其进行抑制，从而抑制神经元胞吐作用，并因此尤其提供肌肉松弛或腺体过度刺激的消耗以及相应的化妆品和药物效果。
最近的研究提出了对突触神经递质释放的更复杂的调节，其中除了SNARE蛋白复合物之外，其他蛋白(例如Munc13和Munc18)将在过程的调节以及允许膜融合中都发挥重要作用。(Rizo,J和Südhof,T.C.(2012)The Membrane Fusion Enigma:SNAREs,Sec1/Munc18Proteins,and Their Accomplices–Guilty as Charged？；Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,28:279-308)。从这个意义上说，Munc18(SEQ ID NO：1)和突触融合蛋白1(SEQ ID NO：2)之间的相互作用已被描述为重要的和必不可少的，对于SNARE复合物的产生和膜的融合都是如此。一方面，Munc18与突触融合蛋白1的Habc-结构域相互作用，从而使所述Munc18稳定并进行适当的运输。另一方面，Munc18与突触融合蛋白1的N肽的相互作用对于Munc18与SNARE复合物的相互作用和膜的融合是必需的(Zhou,P.等人(2013)Syntaxin-1N-peptide and Habc-domain perform distinct essential functions in synaptic vesicle fusion；TheEMBO Journal,32:159-171；Rizo,J和Südhof,T.C.(2012)The Membrane Fusion Enigma:SNAREs,Sec1/Munc18 Proteins,and Their Accomplices–Guilty as Charged？；Annu.Rev.Cell Dev.Biol.,28:279-308)。
经过广泛而详尽的研究，本发明的发明人惊奇地发现，与位于Munc18和突触融合蛋白1之间相互作用表面中的特定序列竞争的肽允许干扰或抑制所述复合物Munc18-突触融合蛋白1，并因此抑制神经递质释放(优选是乙酰胆碱和CGRP(降钙素基因相关肽))和抑制肌肉收缩(通过抑制神经元胞吐作用间接进行，也可以直接在肌肉细胞中提供作用)。令人惊讶地发现，与位于Munc18和突触融合蛋白1之间相互作用表面中的其他序列竞争的肽没有提供上述效果。因此，本发明的发明人发现与Munc18的SEQ ID NO：3(对应于Munc18即SEQ ID NO：1的位置46至51)和/或SEQ ID NO：4(对应于Munc18即SEQ ID NO：1的位置63至66)竞争的肽比与位于Munc18和突触融合蛋白1之间相互作用表面中的其他序列竞争的肽更有利于干扰Munc18和突触融合蛋白1之间的相互作用。所述肽(本发明的肽)已经显示出对Munc18和突触融合蛋白1之间相互作用的有效干扰。此外，这些肽还显示出直接的肌肉松弛作用，因为它们具有直接作用于肌肉细胞的能力，即通过调节参与肌肉收缩的基因和调节钙动员来作用于突触后侧，像在其他肽中发现的那样(Schagen,S.K.(2017)Topicaltreatments with effective anti-aging results,Cosmetics,4,16；PCT专利申请WO2006047900)。因此，在突触前侧和突触后侧均显示出作用，其通过有效抑制神经元中乙酰胆碱的释放，以及调节基因表达和减少肌肉细胞上的钙动员。因此，本发明的肽解决了上述问题，并且可用于治疗与神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性的失调有关的美容上的纹迹(cosmetic sign)和疾病。
发明人不知道有任何现有技术提供了干扰Munc18和突触融合蛋白1之间的相互作用以抑制神经递质释放(并因此抑制神经元胞吐作用)和肌肉收缩性的分子。
在第一方面，本发明涉及一种能够通过与Munc18和突触融合蛋白1之间的相互作用表面的特定区域竞争来干扰Munc18-突触融合蛋白1复合物相互作用的肽。更准确地，本发明的肽与序列均位于Munc18中的、在其与突触融合蛋白1相互作用的表面中的SEQ IDNO：3和/或SEQ ID NO：4竞争。
在第二方面，本发明涉及包含本发明的肽(本发明的一种肽或其组合)的组合物。
在进一步的方面，本发明涉及本发明的组合物或肽用作药物，更准确地，用于预防、改善和/或治疗神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍，甚至更准确地用于预防、改善和/或治疗与SNARE复合物形成失调、横纹肌收缩失调、乙酰胆碱和/或CGRP释放失调和/或Ca2+通道激活失调有关的疾病。
在第四方面，本发明涉及用于预防、改善和/或治疗神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍的方法，甚至更准确地用于预防、改善和/或治疗与SNARE复合物形成失调、横纹肌收缩失调、乙酰胆碱和/或CGRP释放失调和/或Ca2+通道激活失调有关的疾病，包括将本发明的肽或组合物给予有此需要的受试者。
此外，本发明的第五方面涉及本发明的肽或组合物作为化妆品用于预防、减少和/或消除受试者中与神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性的失调有关的美容上的纹迹，更具体地皮肤衰老或表情纹迹的用途。
在第六方面，本发明涉及本发明的肽或组合物用于预防、减少和/或消除与受试者中神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性的失调有关的美容上的纹迹，更具体地皮肤老化或表情纹迹的美容用途。
在第七方面，本发明涉及一种在有此需要的受试者中预防、减少和/或消除与神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性失调有关的美容上的纹迹(更具体地，皮肤衰老或表情纹迹)的方法，其特征在于其包括使用本发明的肽或组合物。
如本文所用，术语“非环脂肪族基团”(non-cyclic aliphatic group)及其复数具有现有技术中所述术语的一般含义。因此，这些术语指的是，例如且不限于，直链或支链烷基、烯基和炔基基团。
如本文所用，术语“烷基基团”及其复数是指饱和的直链或支链基团，其具有1至24个，优选1至16个，更优选1至14个，甚至更优选1至12个，甚至仍更优选1、2、3、4、5或6个碳原子，并且通过单键与分子的其余部分键合，包括例如且不限于，甲基，乙基，异丙基，正丙基，异丙基，异丁基，叔丁基，正丁基，仲丁基，正戊基，正己基，庚基，辛基，癸基，十二烷基，月桂基，十六烷基，十八烷基，戊基，2-乙基己基，2-甲基丁基，5-甲基己基和类似基团。烷基基团可以任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“烯基基团”及其复数是指以下直链或支链基团，其具有2至24个，优选2至16个，更优选2至14个，甚至更优选2至12个，甚至仍更优选地2、3、4、5或6个碳原子，具有一个或多个碳-碳双键，优选具有1、2或3个碳-碳双键(共轭或非共轭的)，其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于乙烯基、油烯基、亚油基和类似基团。烯基基团可以任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“炔基基团”及其复数是指以下直链或支链基团，其具有2至24个，优选2至16个，更优选2至14个，甚至更优选2至12个，甚至仍更优选地2、3、4、5或6个碳原子，具有一个或多个碳-碳三键，优选具有1、2或3个碳-碳三键(共轭或非共轭的)，其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，3-丁炔基，戊炔基(pentinyl)例如1-戊炔基，和类似基团。炔基基团可任选被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“脂环族基团”及其复数具有现有技术中所述术语的一般含义。因此，这些术语用于指例如且不限于环烷基或环烯基或环炔基基团。
如本文所用，术语“环烷基”及其复数是指饱和的单环或多环脂肪族基团，其具有3至24个，优选3至16个，更优选3至14个，甚至更优选3至12个，甚至仍更优选3、4、5或6个碳原子，并且其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，甲基环己基，二甲基环己基，八氢茚(octahydroindene,)，十氢萘，十二氢-非那烯(phenalene)，金刚烷基(adamantyl)和类似基团，并且可以任选地被一个或多个基团取代，例如烷基，卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“环烯基”及其复数是指以下非芳族单环或多环脂肪族基团，其具有5至24个，优选5至16个，更优选5至14个，甚至更优选5至12个，甚至仍更优选5或6个碳原子，具有一个或多个碳-碳双键，优选具有1、2或3个碳-碳双键(共轭或非共轭的)，其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于环戊-1-烯-1-基和类似基团，并且其可以任选地被一个或多个基团取代例如烷基，卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“环炔基”及其复数是指以下非芳族单环或多环脂肪族基团，其具有8至24个，优选地8至16个，更优选地8至14个，甚至更优选地8至12个，甚至仍更优选8或9个碳原子，具有一个或多个碳-碳三键，优选具有1、2或3个碳-碳三键(共轭或非共轭的)，并且其通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于环辛-2-炔-1-基和类似基团，并且其可以任选地被一个或多个基团取代，例如烷基，卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“芳基基团”及其复数是指芳香族基团，其具有6至30个，优选6至18个，更优选6至10个，甚至更优选6或10个碳原子，其包括1、2、3或4个芳香环，由碳-碳键结合或稠合，并通过单键与分子的其余部分结合，包括例如且不限于苯基，萘基，二苯基，茚基，菲基或蒽基等。芳基基团可任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“芳烷基基团”及其复数是指被芳基基团取代的烷基，其具有7至24个碳原子且包括例如且不限于-(CH2)1-6-苯基、-(CH2)1-6-(1-萘基)、-(CH2)1-6-(2-萘基)、-(CH2)1-6-CH(苯基)2和类似基团。芳烷基可任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“杂环基”及其复数是指3-10元杂环或烃环，其中一个或多个环原子，优选1、2或3个环原子是不同于碳的元素，比如氮、氧或硫，且可以是饱和或不饱和的。为了本发明的目的，杂环基可以是环状，单环，双环或三环系统，其可以包括稠合环系；且氮、碳或硫原子可任选地在杂环基中被氧化；氮原子可任选被季铵化；且杂环基可以是部分或全部饱和的，或者可以是芳香族的。逐渐优选地，术语杂环涉及5或6元环。杂环基团可以任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文所用，术语“杂芳基烷基基团”及其复数是指被经取代或未取代的芳香族杂环基取代的烷基基团，该烷基基团具有1至6个碳原子，并且该芳香族杂环基具有2至24个碳原子和1-3个碳原子以外的原子，且包括例如且不限于-(CH2)1-6-咪唑基、-(CH2)1-6-三唑基、-(CH2)1-6-噻吩基、-(CH2)1-6-呋喃基、-(CH2)1-6-吡咯烷基和类似基团。杂芳基烷基基团可任选地被一个或多个取代基取代，例如卤素，羟基，烷氧基，羧基，羰基，氰基，酰基，烷氧基-羰基，氨基，硝基，巯基和硫代烷氧基。
如本文件所用，术语“卤代”或“卤素”是指氟、氯、溴或碘，并且其阴离子称为卤化物。
如本文所用，术语“衍生物”及其复数是指化妆品上可接受的化合物(即可用于化妆品制备的衍生自目标化合物的)以及化妆品上不可接受的衍生物(因为这些可能用于制备化妆品上可接受的衍生物)两者。术语“衍生物”及其复数也指药学上可接受的化合物(即可用于制备药物的衍生自目标化合物的)以及药学上不可接受的衍生物(因为这些可能用于制备药学上可接受的衍生物)两者。
如本文件中所用，术语“盐”及其复数是指现有技术中已知那些中的任何类型的盐，例如卤化物盐，羟基酸盐(例如含氧酸盐，酸盐，碱性盐和复盐)，羟基盐，混合盐，含氧盐或其他水合盐。该术语包括化妆品和/或药学上可接受的盐以及化妆品和/或药学上不可接受的盐，因为后者可能可用于制备化妆品和/或药学上可接受的盐。
如本文件中所用，术语“异构体”及其复数是指光学异构体，对映异构体，立体异构体或非对映异构体。单独的对映异构体或非对映异构体以及它们的混合物可以通过现有技术中已知的常规技术来分离。
如本文所用，术语“溶剂化物”及其复数是指现有技术中已知的任意溶剂化物，例如极性、非极性或两亲性溶剂化物，并且包括当施用或应用于目标受试者(直接或间接)时提供目标化合物(本发明的一种或多种肽)的任何化妆品可接受的溶剂化物。优选地，溶剂化物是水合物，与醇例如甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇的溶剂化物，与酯例如乙酸乙酯的溶剂化物，与醚例如甲醚、乙醚或THF(四氢呋喃)的溶剂化物，或与DMF(二甲基甲酰胺)的溶剂化物，更优选地是水合物或与醇如乙醇的溶剂化物。
另外，如本文所用，术语“氨基酸”及其复数包括通过遗传密码编码的氨基酸以及非编码的氨基酸，无论它们是否为天然的以及它们是否为D-和L-氨基酸。非编码的氨基酸的实例是但不限于瓜氨酸，鸟氨酸，肌氨酸，锁链素，正缬氨酸，4-氨基丁酸，2-氨基丁酸，2-氨基异丁酸，6-氨基己酸，1-萘基丙氨酸，2-萘基丙氨酸，2-氨基苯甲酸，4-氨基苯甲酸，4-氯苯丙氨酸，2,3-二氨基丙酸，2,4-二氨基丁酸，环丝氨酸，肉碱，半胱氨酸，青霉胺，焦谷氨酸，噻吩基丙氨酸，羟脯氨酸，别-异亮氨酸，别-苏氨酸，异哌啶酸(isonipecotic acid)，异丝氨酸，苯甘氨酸，他汀类，β-丙氨酸，正亮氨酸，N-甲基氨基酸，α-氨基酸和β-氨基酸等及其衍生物。然而，其他非天然氨基酸在现有技术中是已知的(例如，参见D.C.Roberts和F.Vellaccio的“Unusual amino acids in peptide synthesis”,The Peptides,Vol.5(1983),Chapter VI,Gross E.和Meienhofer J.,Eds.,Academic Press,New York,USA)。
如本文所用，“表情皱纹”是由负责引起面部皮肤上的面部表情的面部肌肉的收缩所施加的应力导致的皱纹。所述皱纹通常位于前额上、眉毛之间的间隔中、嘴周围和/或眼睛周围。
如前所述，在第一方面，本发明涉及能够干扰Munc18-突触融合蛋白1复合物相互作用的肽，其特征在于它与SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4竞争，所述肽的可接受的异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物和/或其混合物。
涵盖本发明的肽中使用或存在的氨基酸是L-氨基酸、D-氨基酸或其组合。在一个优选的实施方案中，本发明的肽中使用或存在的氨基酸是L-氨基酸。
优选地，上述异构体是立体异构体。涵盖所述立体异构体是对映异构体或非对映异构体。因此，在本发明的优选实施方案中，该肽是外消旋混合物、非对映异构混合物、纯的对映异构体或纯的非对映异构体。
涵盖本发明的肽包含在其N末端和/或其C末端结合的至少一个模块。所述至少一个模块可以通过现有技术中已知的任何方式，优选共价地与肽结合。在一个优选的实施方案中，该肽包含一个与其N末端共价结合的模块和一个与其C末端共价结合的模块。
在一个实施方案中，至少一个N末端模块(优选地，一个N末端模块)选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R5-CO-，其中R5选自由以下形成的基团：取代或未取代的C1-C24烷基，取代或未取代的C2-C24烯基，取代或未取代的C2-C24炔基，取代或未取代的C3-C24环烷基，取代或未取代的C5-C24环烯基，取代或未取代的C8-C24环炔基，取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基，以及取代或未取代的具有2到24个碳原子和1-3个碳原子以外的原子和1-6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基。更优选地，至少一个N端模块(优选地，一个N端模块)选自H或R5-CO-，其中R5选自由以下形成的基团：取代或未取代的C1-C24烷基，取代或未取代的C2-C24烯基，取代或未取代的C2-C24炔基，取代或未取代的C3-C24环烷基，取代或未取代的C5-C24环烯基，取代或未取代的C8-C24环炔基，取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基环，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1至3个除碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基。甚至更优选地，至少一个N末端模块(优选地，一个N末端模块)选自H，乙酰基(下文中为Ac)，叔丁酰基，己酰基，2-甲基己酰基，环己烷羧基，辛酰基，癸酰基，月桂酰基肉豆蔻酰基，棕榈酰基(以下称为Pal)，硬脂酰基，油酰基和亚油酰基。在最优选的实施方案中，至少一个N端模块(优选地，一个N端模块)是Ac。
在一个实施方案中，至少一个C末端模块(优选地，一个C末端模块)选自H，-NR3R4-，-OR3和-SR3，其中R3和R4独立地选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基团，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基以及取代或未取代的芳烷基。在最优选的实施方案中，至少一个C末端模块(优选一个C末端模块)是NH2。
因此，更优选地，本发明的肽包含一个与N末端结合的模块和一个与C末端结合的模块，其中与N末端结合的模块为Ac且与C末端结合的模块是NH2。
在一个实施方案中，本发明的肽的序列为SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4(如上所述，所述肽可包含与N末端结合的至少一个模块和/或与它的C末端结合的至少一个模块，更优选地，它包含一个与N末端结合的模块和一个与C末端结合的模块，其中与N末端结合的模块是Ac而与C末端结合的模块是NH2)。涵盖本发明的肽具有与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有至少70％同一性，甚至更优选与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有80％同一性，甚至更优选与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有90％的同一性，甚至更优选与SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：4具有95％的同一性；且甚至更优选与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4具有99％的同一性的序列。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽的序列依照式(I)：
R1-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-R2
(I)
其化妆品和药学上可接受的异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物及其混合物，其中：
AA1选自具有带正电荷的侧链或极性不带电荷的侧链的氨基酸的组；
AA2选自具有非极性疏水性侧链的氨基酸的组；
AA3选自具有非极性疏水性侧链的氨基酸的组；
AA4选自具有带电侧链的氨基酸的组；
AA5选自具有非极性疏水性侧链或芳香族侧链的氨基酸的组；
AA6是Trp；
R1选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R5-CO-，其中R5选自由以下形成的基团：取代或未取代的C1-C24烷基，取代或未取代的C2-C24烯基，取代或未取代的C2-C24炔基，取代或未取代的C3-C24环烷基，取代或未取代的C5-C24环烯基，取代或未取代的C8-C24环炔基，取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基环，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1-3个碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基；和
R2选自H，-NR3R4-，-OR3和-SR3，其中R3和R4独立地选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基团，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，以及取代或未取代的芳烷基。
更优选地，在该优选的实施方案中，在式(I)中：
AA1是His；
AA2选自具有非极性疏水性侧链的氨基酸的组；
AA3选自具有非极性疏水性侧链的氨基酸的组；
AA4选自具有带电侧链的氨基酸的组；
AA5选自Met或具有芳族侧链的氨基酸的组；和
AA6是Trp。
更优选地，在该优选的实施方案中，在式(I)中：
AA1是His；
AA2选自Gly，Ala，Val，Leu，Met和Ile的组；
AA3选自Gly，Ala，Val，Leu，Met和Ile的组；
AA4选自Lys，Arg，His，Asp和Glu的组；
AA5选自Met，Phe，Tyr和Trp的组；和
AA6是Trp。
更优选地，在该优选的实施方案中，在式(I)中：
AA1是His；
AA2选自Ala和Ile的组；
AA3选自Leu和Met的组；
AA4选自Arg和Asp的组；
AA5选自Met，Phe和Trp的组；和
AA6是Trp。
甚至更优选地，在该优选的实施方案中，根据本发明的肽的序列为：
-R1-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：5-R2)；
-R1-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：6-R2)；
-R1-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：7-R2)；
-R1-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：8-R2)；和/或
-R1-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：9-R2)。
R1优选地选自H或R5-CO-，其中R5选自由以下形成的基团：取代或未取代的C1-C24烷基，取代或未取代的C2-C24烯基，取代或未取代的C2-C24炔基，取代或未取代的C3-C24环烷基，取代或未取代的C5-C24环烯基，取代或未取代的C8-C24环炔基，取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基环，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1-3个碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基。甚至更优选地，R1选自H，乙酰基(下文为Ac)，叔丁酰基，己酰基，2-甲基己酰基，环己烷羧基，辛酰基，癸酰基，月桂酰基肉豆蔻酰基，棕榈酰基(下文称为Pal)，硬脂酰基，油酰基和亚油酰基。甚至更优选地，R1是Ac。
优选地，R2是NH2。
因此，更优选地，R1是Ac且R2是NH2。
因此，在该优选的实施方案中，优选地，根据本发明的肽的序列为：
-Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO:5-NH2)；
-Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO:6-NH2)；
-Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO:7-NH2)；
-Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO:8-NH2)；和/或
-Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO:9-NH2)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的肽的序列依照式(II)：
R1-AA1-AA2-AA3-AA4-R2
(II)
其化妆品和药学上可接受的异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物及其
混合物，其中：
AA1选自具有带正电的侧链的氨基酸的组；
AA2是任意氨基酸；
AA3选自具有带正电的侧链的氨基酸的组；
AA4选自具有芳香族侧链的氨基酸的组；
R1选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R5-CO-，其中R5选自由以下形成的基团：取代或未取代的C1-C24烷基，取代或未取代的C2-C24烯基，取代或未取代的C2-C24炔基，取代或未取代的C3-C24环烷基，取代或未取代的C5-C24环烯基，取代或未取代的C8-C24环炔基，取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基环，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1-3个碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基；和
R2选自H，-NR3R4-，-OR3和-SR3，其中R3和R4独立地选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基团，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，以及取代或未取代的芳烷基。
更优选地，在该优选的实施方案中，在式(II)中：
AA1选自Lys，Arg和His的组；
AA2是任意氨基酸；
AA3选自Lys，Arg和His的组；和
AA4选自Phe，Tyr和Trp的组。
更优选地，在该优选的实施方案中，在式(II)中：
AA1选自Arg的组；
AA2是任意氨基酸；
AA3选自Arg的组；和
AA4选自Phe的组。
甚至更优选地，在该优选的实施方案中，根据本发明的肽的序列为：
-R1-Arg-Arg-Arg-Phe-R2(R1-SEQ ID NO:10-R2)；和/或
-R1-Arg-Met-Arg-Phe-R2(R1-SEQ ID NO:11-R2)。
R1优选地选自H或R5-CO-，其中R5选自由以下形成的基团：取代或未取代的C1-C24烷基，取代或未取代的C2-C24烯基，取代或未取代的C2-C24炔基，取代或未取代的C3-C24环烷基，取代或未取代的C5-C24环烯基，取代或未取代的C8-C24环炔基，取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3至10元的杂环基环，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1-3个碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基。甚至更优选地，R1选自H，乙酰基Ac，叔丁酰基，己酰基，2-甲基己酰基，环己烷羧基，辛酰基，癸酰基，月桂酰基肉豆蔻酰基，Pal，硬脂酰基，油酰基和亚油酰基。甚至更优选地，R1是Ac。
优选地，R2是NH2。
因此，更优选地，R1是Ac且R2是NH2。
因此，在这个优选的实施方案中，根据本发明的肽的序列是：
-Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH2(AC-SEQ ID NO:10-NH2)；和/或
-Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH2(AC-SEQ ID NO:11-NH2)。
本发明的肽可以通过现有技术中已知的任何手段合成和产生。例如，它们可以通过化学合成(优选地，通过固相肽合成)，在细胞培养物中表达所述肽或通过在植物或动物中转基因产生来合成和产生。另外，本发明的肽可以通过现有技术中已知的任何手段纯化。
从下面包括的实例中明显的是，本发明的肽提供了对Munc18和突触融合蛋白1之间相互作用的有效干扰，从而在突触前水平上导致对乙酰胆碱释放的抑制，并因此抑制肌肉收缩。同样，如可从以下包括的实例中得出的，本发明的肽通过直接在肌肉细胞中诱导肌肉松弛而在突触后水平上具有直接作用。因此，本发明的肽解决了上述问题，并提供了能够治疗(预防、减少和/或消除)与神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性的失调有关的美学上的纹迹和/或疾病的另外或备选的肽。
在第二方面，本发明涉及包含至少一种根据本发明的肽的组合物。
涵盖本发明的组合物包含本发明的一种类型的肽或本发明的不同肽的组合或混合物。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物是化妆品组合物。
本发明的化妆品组合物包含本发明的至少一种肽的化妆品有效量。更优选地，本发明的化妆品组合物包含0.0001％至0.05％(m/v)的至少一种本发明的肽，更优选地，0.0005％至0.005％(m/v)的至少一种本发明的肽，且甚至更优选0.05％-0.001％(m/v)的至少一种本发明的肽。
由于本发明的肽的活性(即，抑制Munc18和突触融合蛋白1之间的相互作用，并因此抑制神经递质的释放和调节肌肉收缩)，本发明的化妆品组合物提供预防、减少和/或消除皮肤老化和/或表情纹迹(优选皱纹)。更准确地，本发明的化妆品组合物提供预防、减少和/或消除面部表情皱纹，更优选地，额头皱纹，眉毛之间的间隔中的皱纹和/或嘴周围和/或眼睛周围的皱纹和细纹。
涵盖本发明的化妆品组合物还包含至少一种另外的化妆品成分。所述另外的化妆品成分可以是至少一种赋形剂和/或至少一种另外的化妆品活性成分。
另外的化妆品成分包括在现有技术中通常使用的那些，如例如，佐剂例如稳定剂，增溶剂，维生素，着色剂和香料；载体；和/或其他化妆品活性成分。
所述另外的化妆品成分必须与其余的组合物组分，特别是与本发明的组合物中包含的本发明的肽在物理和化学上相容。同样，所述另外的化妆品成分的性质不能不可接受地改变本发明的肽和组合物的益处。所述另外的化妆品成分可以是合成或天然来源的，如例如植物提取物，或者它们可以源自生物发酵工艺(参见，例如CTFACosmetic IngredientHandbook，第11版(2006))。
涵盖上述另外的化妆品成分包括通常在组合物中用于以下的那些成分：护理，清洁皮肤和/或头发；和/或除臭剂和/或乳霜以防止多汗症；如例如，抑制黑色素合成的试剂，增白或脱色剂，抗衰老剂，抑制NO-合酶的试剂，抗氧化剂，抗大气污染剂和/或自由基捕获剂，抗糖化剂，乳化剂，润肤剂，有机溶剂，液体推进剂，皮肤调理剂(如例如润湿剂)，保湿物质，α羟基酸，增湿剂，维生素，色素或着色剂，染料，胶凝聚合物，增稠剂，表面活性剂，柔软剂，其他抗皱剂，能够减少或消除眼袋的试剂，去角质剂，抗微生物剂，抗真菌剂，杀菌剂，刺激皮肤或表皮大分子合成的试剂和/或能够防止或抑制其降解的试剂，如例如刺激胶原蛋白合成的试剂，刺激弹性蛋白合成的试剂，促进层粘连蛋白合成的试剂，抑制胶原蛋白降解的试剂，抑制弹性蛋白降解的试剂，刺激成纤维细胞增殖的试剂，刺激角质形成细胞增殖的试剂，刺激角质形成细胞分化的试剂，刺激脂质合成和角质层成分(神经酰胺，脂肪酸等)合成的试剂，真皮松弛(dermorelaxing)剂，刺激糖胺聚糖合成的试剂，DNA修复剂，DNA保护剂，刺激蛋白体活性的试剂，抗瘙痒剂，治疗敏感性皮肤的试剂，重紧致(reaffirming)剂，收敛剂，皮脂产生调节剂，刺激脂肪分解的试剂，抗脂肪团剂，镇静剂(calming agent)，消炎剂，作用于毛细血管循环和/或微循环的试剂，作用于细胞线粒体的试剂，旨在改善真皮-表皮连接的试剂，防腐剂，香料，螯合剂，植物提取物，精油，海洋提取物，源自生物发酵工艺的试剂，矿物盐，细胞提取物和/或太阳过滤器(有活性地抗紫外线A和B的有机或矿物光防护剂)。
在一个实施方案中，至少一种另外的化妆品成分是化妆品活性成分或物质，其可以发挥与上文针对本发明的肽所公开的相同、相似、互补或不同的化妆品活性。涵盖本发明的化妆品组合物包含其他抗皱或抗衰老剂，例如胶原蛋白，弹性蛋白，生长因子，透明质酸增强剂，屏障功能剂，照亮剂，刺激胶原蛋白I、III、IV和/或VI和层粘连蛋白的表达和/或合成的试剂；刺激糖胺聚糖或透明质酸合成的试剂；刺激弹性蛋白和其他弹性纤维相关蛋白的表达和/或合成的试剂；抑制胶原蛋白和/或弹性纤维降解的试剂；刺激线粒体相关蛋白(例如sirtuins和顺乌头酸酶)表达和/或合成的试剂；刺激粘着斑蛋白表达和/或合成的试剂；刺激角质形成细胞和/或成纤维细胞增殖和/或分化的试剂；抗氧化剂；抗大气污染剂和/或自由基捕获剂；抗糖化剂；排毒剂；减少时间老化、环境老化和炎症老化的试剂；以及降低黑色素生成和/或抑制酪氨酸酶的试剂和/或刺激脂质合成和表皮成分(角蛋白)更特别是角质层成分(角蛋白、神经酰胺、丝聚蛋白、兜甲蛋白(loricrin)和SPRR1B)的合成的试剂。更优选地，至少一种另外的化妆品成分是
Figure BDA0002611949380000181
(乙酰六肽-8)，
Figure BDA0002611949380000182
(五肽-3)，
Figure BDA0002611949380000183
(乙酰六肽-30)，Syn-
Figure BDA0002611949380000184
(三肽-3)或其组合。
另外，本发明的化妆品组合物(或本发明的肽)可以以现有技术中通常使用的任何形式配制为例如溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、霜剂、粉末、喷雾剂、洗剂、油、搽剂、精华液(serum)、摩丝(mousse)、软膏、棒或笔状，包括“免洗”和“冲洗”配方。本发明的化妆品组合物还可以通过现有技术中已知的技术掺入不同类型的固体附件中，例如小毛巾、水凝胶、粘合性(或非粘合性)贴剂或面膜，或者它可以掺入不同的彩妆系列产品中，例如遮瑕膏，彩妆粉底液，洗剂或卸妆洗剂等。
还涵盖如本文所公开的本发明的化妆品组合物或本发明的肽也可以掺入化妆品持续释放系统和/或载体中，例如脂质体，毫米颗粒，微米颗粒和纳米颗粒，以及在海绵，囊泡，胶束，毫米球，微米球，纳米球，脂质球，毫米胶囊，微米胶囊和纳米胶囊中，以及在微乳剂和纳米乳剂中，目的是使活性成分具有更大的穿透性。
在一个优选的实施方案中，本发明的化妆品组合物适合或适应于通过电离子透入施用，更优选地，施用在受试者的面部和/或身体中，更优选地，施用在受试者的面部、颈部、手和/或腋窝中，甚至更优选在受试者(优选人)的面部和/或颈部中。
在另一个优选的实施方案中，本发明的化妆品组合物适合于或适应于通过皮下注射施用，更优选地，施用在受试者的面部和/或身体中，更优选地，在受试者的面部、颈部、手和/或腋窝中，甚至更优选在受试者(优选人)的面部和/或颈部中。
在最优选的实施方案中，本发明的化妆品组合物适合于或适应于局部施用(更优选以乳膏的形式)，更优选在受试者的面部和/或身体中施用，更优选地，在受试者的面部、颈部、手和/或腋窝中，甚至更优选在受试者(优选人)的面部和/或颈部中。
在另一个优选的实施方案中，本发明的组合物是药物组合物。
涵盖本发明的组合物包含一种类型的本发明的肽或本发明的不同肽的组合或混合物。
本发明的药物组合物包含本发明的至少一种肽的药学有效量。
由于本发明的肽的活性(即，抑制神经递质的释放和调节肌肉的收缩)，本发明的药物组合物提供了对与神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍相关的疾病的预防和/或治疗，更准确地说是用于预防和/或治疗与SNARE复合物形成失调、横纹肌收缩失调、乙酰胆碱和/或CGRP释放失调和/或Ca2+通道激活失调有关的疾病，优选老年性痴呆、阿尔茨海默氏相关性痴呆、AIDS相关性痴呆、癫痫、肌萎缩性硬化、多发性/侧索硬化、慢性偏头痛、肥大细胞增多症、张力失常或焦虑症。
本发明的药物组合物还提供治疗肌强直、肌强直性营养不良、先天性肌强直、帕金森病、继发性帕金森病、亨廷顿病、痉挛状态、迟发性运动障碍(TD)或张力失常(眼睑痉挛、Meige综合征、手抽筋、肢体张力失常或斜视)。
所述药物组合物可以是现有技术中已知的适合于所选途径的任何形式。涵盖本发明的药物组合物适合于或适应于通过现有技术中已知的任何方式和任何途径给药(例如，皮下，肌肉内，静脉内或口服；在后一种情况下，例如，以盐水溶液和/或可生物降解材料的形式，例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯和/或胆固醇的聚合物)。
涵盖本发明的药物组合物还包含至少一种另外的药物成分。所述另外的药物成分可以是至少一种赋形剂和/或至少一种另外的药物活性成分。涵盖至少一种另外的药物活性成分是苯二氮卓，氯硝西泮,劳拉西泮，地西泮，巴氯芬，抗胆碱能药，苯海索(Trihexyphenidyl)，苯扎托品，多巴胺消耗剂，四苯喹嗪，氯氮平或其组合。
在第三方面，如上所述，本发明涉及根据本发明(即根据上文所述)的肽或组合物用于药物。
如上所述并且可直接从以下包括的实例得到的，本发明的肽(以及因此包含它们的组合物)能够抑制乙酰胆碱的释放和肌肉收缩，因此，由于所述活性，它们可用作药物。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽或组合物用于预防和/或治疗(优选治疗)神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍。
肌肉收缩性障碍优选是肌肉过度收缩性。
优选地，神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍是与SNARE复合物形成、横纹肌收缩、乙酰胆碱和/或CGRP释放、和/或Ca 2+通道活化的失调有关的疾病。
更优选地，神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍选自老年性痴呆、阿尔茨海默氏相关性痴呆、AIDS相关性痴呆、癫痫、肌萎缩性硬化、多发性/侧索硬化、肥大细胞增多症、慢性偏头痛、张力失常或焦虑症。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明的肽或组合物用于预防和/或治疗老年性痴呆、阿尔茨海默氏相关性痴呆、AIDS相关性痴呆、癫痫、肌萎缩性硬化、多发性/侧索硬化、肥大细胞增多症、慢性偏头痛、张力失常或焦虑症。关于所述疾病，老年性痴呆、阿尔茨海默氏相关性痴呆、AIDS相关性痴呆、癫痫、肌萎缩性硬化、多发性/侧索硬化、慢性偏头痛和焦虑症是神经元胞吐作用障碍。另一方面，张力失常是一种肌肉收缩性障碍。
优选地，张力失常选自眼睑痉挛、Meige综合征、手抽筋、肢体张力失常或斜视。
在另一个优选的实施方案中，本发明的肽或组合物用于预防和/或治疗肌强直、肌强直性营养不良、先天性肌强直、帕金森病、继发性帕金森病、亨廷顿病、痉挛状态或迟发性运动障碍(TD)。所述疾病是肌肉收缩性障碍。
优选地，以治疗有效量使用本发明的肽或组合物。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽和组合物用于哺乳动物，更优选用于人类。
在一个优选的实施方案中，该组合物是根据上文所述的药物组合物。
本发明的肽或组合物可以通过现有技术中已知的任何方式或通过任何途径使用。在任何情况下，所述肽或组合物都将适应于所选的方式和/或途径(例如，皮下、肌肉内、静脉内或口服；在后一种情况下，例如以盐水溶液和/或生物可降解材料的形式，例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯和/或胆固醇的聚合物)。
在第四方面，本发明涉及用于预防和/或治疗(优选地，治疗)神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍的方法，其包括将本发明的肽或组合物给予需要其的受试者。
肌肉收缩性障碍优选是肌肉过度收缩性。
优选地，神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍是与SNARE复合物形成失调、横纹肌收缩失调、乙酰胆碱和/或CGRP释放失调和/或Ca2+通道激活失调相关的疾病。
更优选地，神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍选自老年性痴呆、阿尔茨海默氏相关性痴呆、AIDS相关性痴呆、癫痫、肌萎缩性硬化、多发性/侧索硬化、肥大细胞增多症、慢性偏头痛、张力失常或焦虑症。
关于所述疾病，老年性痴呆、阿尔茨海默氏相关性痴呆、AIDS相关性痴呆、癫痫、肌萎缩性硬化、多发性/侧索硬化、慢性偏头痛和焦虑症是神经元胞吐作用障碍。另一方面，张力失常是一种肌肉收缩性障碍。
优选地，张力失常选自眼睑痉挛、Meige综合征、手抽筋、肢体张力失常或斜视。
在另一个优选的实施方案中，神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍是选自肌强直、肌强直性营养不良、先天性肌强直、帕金森病、继发性帕金森病、亨廷顿病、痉挛状态或迟发性运动障碍(TD)的肌肉收缩性障碍。
优选地，以治疗有效量使用本发明的肽或组合物。
在一个优选的实施方案中，需要本发明的治疗方法的受试者是哺乳动物，更优选地是人。
在一个优选的实施方案中，所述组合物是根据上文所述的药物组合物。
本发明的肽或组合物可以通过现有技术中已知的任何方式或通过任何途径使用。在任何情况下，肽或组合物都将适应于所选的方式和/或途径(例如，皮下，肌肉内，静脉内或口服；在后一种情况下，例如以盐水溶液和/或生物可降解材料的形式，例如聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)聚乳酸-乙醇酸共聚物、聚己内酯和/或胆固醇的聚合物)。
如上所述，在第五方面，本发明涉及本发明的肽或化妆品组合物作为化妆品以预防、减少和/或消除与受试者中神经元胞吐作用失调和/或肌肉收缩性失调有关的纹迹的用途。
显然，上述纹迹是美容方面的纹迹。
肌肉收缩性失调优选是肌肉过度收缩。
优选地，与神经元胞吐作用失调和/或肌肉过度收缩有关的美容方面的纹迹是皮肤老化和/或表情纹迹。
皮肤衰老的美容上的纹迹优选是皱纹。
在最优选的实施方案中，皮肤老化和/或表情纹迹是面部皱纹(优选表情纹迹)和/或面部不对称。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽或化妆品组合物通过电离子透入应用，更优选地，应用在受试者的面部和/或身体中，更优选地，在受试者面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选在受试者(优选地，人)的面部和/或颈部。
在另一个优选的实施方案中，本发明的肽或化妆品组合物通过皮下注射施用，更优选地，施用在受试者的面部和/或身体中，更优选地，在受试者的面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选在受试者(优选人)的面部和/或颈部。
在最优选的实施方案中，将本发明的肽或化妆品组合物局部施用(更优选以乳膏形式)，更优选施用于受试者的面部和/或身体，更优选施用于受试者的面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选受试者(优选人)的面部和/或颈部。
优选地，受试者是哺乳动物，甚至更优选地是人。
另外，在用作本发明的化妆品时，以化妆品有效量使用本发明的肽或化妆品组合物。更优选地，本发明的肽的使用浓度为0.0001％至0.05％(m/v)，更优选为0.0005％至0.005％(m/v)，甚至更优选为0.05％-0.001％(m/v)。
涵盖如上所述的本发明的化妆品组合物还包含至少一种另外的化妆品成分。所述另外的化妆品成分可以是至少一种赋形剂和/或至少一种另外的化妆品活性成分，其可以是如上所说明的。还涵盖将本发明的肽与至少一种根据上文所述的另外的化妆品成分组合使用。
另外，本发明的肽和本发明的化妆品组合物可以以现有技术中通常使用的任何形式配制为例如溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、霜剂、粉剂、喷雾剂、洗剂、油剂、搽剂、精华液、摩丝、软膏、棒或笔状，包括“免洗”和“冲洗”的配方。本发明的肽和化妆品组合物还可以通过现有技术中已知的技术掺入不同类型的固体附件，例如小毛巾，水凝胶，粘合性(或非粘合性)贴剂或面膜中，或它可以掺入不同的彩妆系产品，例如遮瑕膏、彩妆粉底液、洗剂或卸妆洗剂等中。
还涵盖如本文所公开的本发明的化妆品组合物或本发明的肽也可以掺入化妆品持续释放系统和/或载体中，例如脂质体，毫米颗粒、微米颗粒和纳米颗粒，以及海绵，囊泡，胶束，毫米球、微米球、纳米球，脂质球，毫米胶囊、微米胶囊和纳米胶囊中，以及在微乳剂和纳米乳剂中，目的是使活性成分具有更大的穿透性。
在第六方面，本发明涉及本发明的肽或化妆品组合物(即，如上所说明的)的化妆品用途，以预防、减少和/或消除与受试者的神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性失调有关的纹迹。
显然，上述纹迹是美容上的纹迹。
肌肉收缩性失调优选是肌肉过度收缩性。
优选地，与神经元胞吐作用失调和/或肌肉过度收缩有关的美容上的纹迹是皮肤老化和/或表情纹迹。
皮肤衰老的美容上的纹迹优选是皱纹。
在最优选的实施方案中，皮肤老化和/或表情纹迹是表情面部皱纹(优选表情皱纹)和/或面部不对称。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽或化妆品组合物通过电离子透入施用，更优选地，施用在受试者的面部和/或身体中，更优选地，在受试者的面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选在受试者的面部和/或颈部。
在另一个优选的实施方案中，本发明的肽或化妆品组合物通过皮下注射施用，更优选地，在受试者的面部和/或身体中，更优选地，在受试者的面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选在受试者的面部和/或颈部。
在优选的实施方案中，将本发明的肽或化妆品组合物局部施用(更优选以乳膏形式)，更优选施用于受试者的面部和/或身体，更优选施用于受试者的面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选在受试者(优选人)的面部和/或颈部。
优选地，受试者是哺乳动物，甚至更优选地是人。
另外，在本发明的化妆品用途中，以化妆品有效量使用本发明的肽或化妆品组合物。更优选地，本发明的肽的使用浓度为0.0001％至0.05％(m/v)，更优选为0.0005％至0.005％(m/v)，甚至更优选为0.05％-0.001％(m/v)。
涵盖如上所述的本发明的化妆品组合物还包含至少一种另外的化妆品成分。所述另外的化妆品成分可以是至少一种赋形剂和/或至少一种另外的化妆品活性成分，其可以是如上所说明的。还涵盖将本发明的肽与至少一种根据上文所述的另外的化妆品成分组合使用。
另外，本发明的肽和本发明的化妆品组合物可以以现有技术中通常使用的任何形式配制为例如溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、霜剂、粉剂、喷雾剂、洗剂、油剂、搽剂、精华液、摩丝、软膏、棒或笔状，包括“免洗”和“冲洗”的配方。本发明的肽和化妆品组合物还可以通过现有技术中已知的技术掺入不同类型的固体附件，例如小毛巾，水凝胶，粘性(或非粘性)贴剂或面膜中，或它可以掺入不同的彩妆系产品，例如遮瑕膏，彩妆粉底液，洗剂或卸妆洗剂等中。
还涵盖如本文所公开的本发明的化妆品组合物或本发明的肽也可以掺入化妆品持续释放系统和/或载体中，例如脂质体，毫米颗粒、微米颗粒和纳米颗粒，以及海绵，囊泡，胶束，毫米球、微米球、纳米球，脂质球，毫米胶囊、微米胶囊和纳米胶囊中，以及在微乳剂和纳米乳剂中，目的是使活性成分具有更大的穿透性。
如上所述，在第七方面，本发明涉及一种在有此需要的受试者中预防和/或减少与神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性失调有关的纹迹的方法，其特征在于它包括使用根据本发明的肽或化妆品组合物。
上述纹迹是美容上的纹迹。
肌肉收缩性失调优选是肌肉过度收缩。
优选地，与神经元胞吐作用失调和/或肌肉过度收缩有关的美容上的纹迹是皮肤老化和/或表情纹迹。
优选地，皮肤老化的美容上的纹迹是皱纹。
在最优选的实施方案中，皮肤衰老和/或表情纹迹是面部皱纹(优选表情皱纹)和/或面部不对称。
在一个优选的实施方案中，本发明的肽或化妆品组合物通过电离子透入施用，更优选地，施用在在受试者的面部和/或身体中，更优选地，在受试者的面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选在受试者(优选地，人)的面部和/或颈部。
在另一个优选的实施方案中，本发明的肽或化妆品组合物通过皮下注射施用，更优选地，在受试者的面部和/或身体中，更优选地，在受试者的面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选在受试者(优选人)的面部和/或颈部。
在最优选的实施方案中，将本发明的肽或化妆品组合物局部施用(更优选以乳膏形式)，更优选施用于受试者的面部和/或身体，更优选施用于受试者的面部、颈部、手和/或腋窝，甚至更优选施用于受试者(优选人)的面部和/或颈部。
优选地，受试者是哺乳动物，甚至更优选地是人。
另外，在本发明的方法中，以化妆品有效量使用本发明的肽或化妆品组合物。更优选地，本发明的肽的使用浓度为0.0001％至0.05％(m/v)，更优选为0.0005％至0.005％(m/v)，甚至更优选为0.05％-0.001％(m/v)。
涵盖如上所述的本发明的化妆品组合物还包含至少一种另外的化妆品成分。所述另外的化妆品成分可以是至少一种赋形剂和/或至少一种另外的化妆品活性成分，其可以是如上所说明的。还涵盖将本发明的肽与至少一种根据上文所述的另外的化妆品成分组合使用。
另外，本发明的肽和本发明的化妆品组合物可以以现有技术中通常使用的任何形式配制为例如溶液、悬浮液、乳剂、糊剂、凝胶、霜剂、粉剂、喷雾剂、洗剂、油剂、搽剂、精华液、摩丝、软膏、棒或笔状，包括“免洗”和“冲洗”的配方。本发明的肽和化妆品组合物还可以通过现有技术中已知的技术掺入不同类型的固体附件，例如小毛巾、水凝胶、粘性(或非粘性)贴剂或面膜中，或它可以掺入不同的彩妆系产品中，例如遮瑕膏，彩妆粉底液，洗剂或卸妆洗剂等。
还涵盖如本文所公开的本发明的化妆品组合物或本发明的肽也可以掺入化妆品持续释放系统和/或载体中，例如脂质体，毫米颗粒、微米颗粒和纳米颗粒，以及海绵，囊泡，胶束，毫米球、微米球、纳米球，脂质球，毫米胶囊、微米胶囊和纳米胶囊中，以及在微乳剂和纳米乳剂中，目的是使活性成分具有更大的穿透性。
为了更好地理解，下面参考附图(以示例的方式呈现)并参考示例性和非限制性实例来更详细地描述本发明。
图1显示了与阳性对照相比，用分析的肽处理过的LAN细胞在体外释放乙酰胆碱的百分比(这是将阳性对照样品的乙酰胆碱释放的百分比作为100％，然后与其余的样品进行比较)。图1显示了对于以下肽获得的结果：Ac-SEQ ID NO：5-NH2(A)，Ac-SEQ ID NO：6-NH2(B)，Ac-SEQ ID NO：7-NH2(C)，Ac-SEQ ID NO：8-NH2(D)，Ac-SEQ ID NO：9-NH2(E)，Ac-SEQID NO：10-NH2(F)，Ac-SEQ ID NO：11-NH2(G)，Ac-SEQ ID NO：13-NH2(H)和Ac-SEQ ID NO：14-NH2(I)。除Ac-SEQ ID NO：8-NH2(D)外，所有肽测试的浓度均为0.001mg/mL，0.005mg/mL和0.01mg/mL；而肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2(D)测试的浓度为0.005mg/mL和0.05mg/mL。对于图1(D)，x轴从左到右的柱对应于：基础状态(未经处理的细胞)，阳性对照(经50mM KCl处理的细胞)，经100nM毒素(肉毒杆菌神经毒素A轻链(BoNT ALC)，根据
Figure BDA0002611949380000271
C.,Blanes-MiraC.,Fernández-Ballester G.,Planells-Cases R.,和Ferrer-Montiel A.,(2004)Modulation of botulinum neurotoxin A catalytic domain stability by tyrosinephosphorylation,FEBS Letters 578,121–127产生)处理的细胞，用0.1μMPalmitoyl-
Figure BDA0002611949380000272
(棕榈酰-乙酰基六肽-
Figure BDA0002611949380000273
)处理的细胞，以及用0.005mg/mL和0.05mg/mL的相应肽处理的细胞。类似地，对于图1(A)到1(C)和1(E)到1(I)，x轴上从左到右的柱对应于：基础状态(未经处理的细胞)，阳性对照(用50mMKCl处理的细胞)，用100nM毒素(BoNT ALC)处理的细胞和用0.001mg/mL、0.005mg/mL和0.01mg/mL的相应肽处理的细胞。对于图1(A)至1(I)，y轴显示乙酰胆碱释放的百分比(相对于阳性对照)。
图2显示了相对于代表100％的结合的对照(未处理)，复合物Munc18-突触融合蛋白1的结合百分比。在图2中，可以观察到肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2(A)和Ac-SEQ ID NO：5-NH2(B)抑制复合物Munc18-突触融合蛋白1形成的能力。图2(A)和2(B)的x轴上从左到右的柱对应于：对于第一组的柱(左侧柱的组)为对照以及浓度为0.1、0.5和1mM的相应肽，以Munc18100nM：突触融合蛋白110nM的比率，而对于第二组的柱(右侧柱的组)为对照以及浓度为0.1、0.5和1mM的相应肽，以Munc18 100nM:突触融合蛋白15nM的比率。两个图的y轴均显示复合物的形成百分比，100％是未经任何处理获得的信号。
图3显示了用本发明的肽处理诱导的人骨骼肌细胞基因表达谱的调节。图3(A)显示了用Ac-SEQ ID NO：8-NH2(在0.05和0.5mg/mL的浓度下，在6小时期间)处理所获得的结果，其中，条从上至下是指以下基因：SCN3A(钠电压门控通道Alpha亚基3)，UTRN(Utrophin)，ACTA1(肌动蛋白α1)，TNNC1(肌钙蛋白C1)，CALM3(钙调蛋白3)，CAV1(小窝蛋白1)，CACNB1(钙电压门控通道辅助亚基Beta 1)，LRP4(LDL受体相关蛋白4)和MYH1(肌球蛋白重链1)。在图3(A)中，显示的基因MHY1，LRP4，CACNB1和UTRN的结果对应于0.05mg/mL的处理，而其余结果对应于0.5mg/mL的处理。图3(B)显示了在24小时期间用浓度为0.5mg/mL的Ac-SEQ ID NO：8-NH2处理所获得的结果，其中条从上至下指的是以下基因：RAPSN(突触的受体相关蛋白)和ATP2A(ATPase的肌浆/内质网Ca2+转运)。图3(C)显示了用Ac-SEQ ID NO：5-NH2(浓度为0.05mg/mL并在24小时期间)处理的结果，其中，条从上至下表示以下基因：UTRN(Utrophin)，ACTA1(肌动蛋白α1)，TNNC1(肌钙蛋白C1)，RAPSN(突触的受体相关蛋白)，SCN3A(钠电压门控通道Alpha亚基3)和MYH1。图3(D)显示了用Ac-SEQ ID NO：10-NH2(浓度为0.1mg/mL并在24小时期间)处理的结果，其中，条从上至下表示以下基因：UTRN(Utrophin)，TNNC1(肌钙蛋白C1)，SCN3A(钠电压门控通道Alpha亚基3)，CHRNA1(胆碱能受体烟碱α1亚基)和CACNB1(钙电压门控通道辅助亚基Beta 1)。在这四种情况中，x轴表示相对于基础状态的倍数变化。负倍数变化是指基因表达的下调，而正倍数变化是指上调。
图4显示相对于作为100％的对照(用60mM KCl刺激的未处理样品)，用肽Ac-SEQID NO：8-NH2处理和用60mM KCl刺激后，人骨骼肌细胞上钙流入的减少。x轴上从左到右的柱对应于：对照以及肽浓度为0.01、0.05和0.1mg/mL。y轴显示相对于对照(作为100％信号)的钙信号减少的百分比。
图5显示了肌球蛋白重链蛋白在未经处理的原代人骨骼肌细胞(图5(A))和用0.05mg/mL肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2(图5(B))处理的原代人骨骼肌细胞上表达水平的代表性图像。相对于未处理的细胞，在用0.05mg/mL肽处理的原代人骨骼肌细胞中观察到了肌球蛋白重链蛋白水平的降低，其可以视为图5B中的染色或信号与图5(A)相比的降低。
图6显示了相对于作为100％的基础对照(未经处理的细胞)，在用肽Ac-SEQ IDNO：8-NH2处理后，原代人骨骼肌细胞上肌球蛋白重链蛋白水平的降低。在X轴上从左到右的柱对应于未处理的细胞以及肽浓度为0.05和0.5mg/ml。Y轴显示相对于基础对照(作为100％信号)的肌球蛋白重链蛋白的水平(基于每个处理组中观察到的肌球蛋白重链蛋白的荧光信号，如通过平均细胞荧光测量的)。
图7显示在用肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2，乙酰基六肽-8(作为基准对照)或α-银环蛇毒素(作为抑制的阳性对照)处理后，与作为100％的基础对照(未处理的细胞)相比，在人运动神经元和人骨骼肌细胞共培养物上观察到的对收缩频率的调节。带有正方形的线代表未处理的细胞(基础对照)的收缩频率。带有十字的线表示通过收缩抑制的阳性对照α-银环蛇毒素的收缩频率。带有菱形的线表示基准乙酰基六肽-8在0.5mg/ml时的收缩频率。带圆圈的线代表肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2在0.1mg/ml时的收缩频率；而带有三角形的线代表肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2在0.05mg/ml时的收缩频率。X轴对应于不同活性物的处理时间，并且指出了不同的时间点：T0，T30min，T2h，T24h和恢复。T0对应于用上述化合物处理之前的收缩；T30min对应于30分钟处理；T2h对应于2h处理；T24h对应于24h处理，而恢复对应于除去所有化合物后的24h孵育。Y轴显示相对于作为100％信号的基础对照(未处理的细胞)的收缩频率百分比。
图8显示相对于未处理细胞的基础对照(作为100％)，用肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2或基准乙酰基六肽-8处理后，人神经母细胞瘤细胞系上胞吐作用的降低。在X轴上从左到右的柱对应于未处理的细胞，用1mg/ml乙酰基六肽-8处理的细胞和用0.01mg/ml肽Ac-SEQ IDNO：8-NH2处理的细胞。Y轴显示相对于基础对照(作为100％水平)，对应于胞吐作用水平的荧光信号百分比。
图9显示了相对于未处理细胞的基础对照(作为100％)，在用肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2或基准乙酰基六肽-8处理后，人神经母细胞瘤细胞系上胞吐作用的时间延迟。在X轴上从左到右的柱对应于未处理的细胞，1mg/ml乙酰基六肽-8和0.01mg/ml肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2。Y轴显示相对于基础对照(作为100％水平)，对应于胞吐作用延迟的响应时间百分比。
图10显示了相对于作为100％的基础对照(未处理的细胞)，在用肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2处理后，在处理开始后的24h时(图10(A))和在处理开始后的48h时(图10(B))，原代人真皮成纤维细胞的I型胶原蛋白产生。X轴上从左到右的柱对应于：基础对照(未处理的细胞)和分别用0.01、0.05或0.1mg/ml肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2处理的细胞。Y轴显示相对于对照(作为100％水平)的I型胶原蛋白合成的增加百分比。
实施例
缩写：
氨基酸的缩写遵循Eur.J.Biochem.(1984)138:937中列出的1983IUPAC-IUB生化命名联合委员会的建议。
Ac，乙酰基；Ala，丙氨酸；Arg，精氨酸；Asn，天冬酰胺；Asp，天冬氨酸；Boc，叔丁氧基羰基；C末端，羧基末端；DCM，二氯甲烷；DIEA，N,N’-二异丙基乙胺；DIPCDI，N,N’-二异丙基碳二亚胺；DMF，N,N-二甲基甲酰胺；equiv，当量；ESI-MS，电喷雾电离质谱；Fmoc，9-芴基甲氧基羰基；Glu，谷氨酸；hiPSC，人诱导多能干细胞；His，组氨酸；HOBt，1-羟基苯并三唑；HPLC，高效液相色谱；HRP，辣根过氧化物酶；Ile，异亮氨酸；INCI，化妆品成分国际命名法；MBHA，对甲基二苯甲胺；Leu，亮氨酸；Lys，赖氨酸；Me，甲基；MeCN，乙腈；MeOH，甲醇；Met，甲硫氨酸；N末端，氨基末端；Palm，棕榈酰；Pbf，2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基；PFA，多聚甲醛；PMA，佛波醇12-肉豆蔻酸13-乙酸酯；Phe，苯丙氨酸；PMSF，苯甲磺酰基；RT，室温；tBu，叔丁基；Thr，苏氨酸；TFA，三氟乙酸；TIS，三异丙基硅烷；TMB，四甲基联苯胺；Trt，三苯基甲基或三苯甲基；Trp，色氨酸；Tyr，酪氨酸。
关于实施例中包括的化学合成程序，应注意的是，所有合成过程均在装有多孔聚乙烯盘的聚丙烯注射器或装有多孔板的
Figure BDA0002611949380000311
反应器中进行。所有试剂和溶剂均为合成质量，无需任何其他处理即可使用。通过抽吸除去溶剂和可溶性试剂。用哌啶-DMF(2:8，v/v)(至少1×1分钟，2×10分钟，5mL/g树脂)除去Fmoc基团(Lloyd Williams P.等人,Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins,CRC,1997,BocaRaton(Fla.,USA))。脱保护、偶联和再次脱保护阶段之间的洗涤用DMF(3×1分钟)和DCM(3×1分钟)每次使用10ml溶剂/g树脂进行。用3ml溶剂/g树脂进行偶联反应。通过进行茚三酮测试来进行偶联的控制(Kaiser E.等人,Anal.Biochem.,1970,34:595598)。所有合成反应和洗涤均在室温进行。
实施例1.干扰Mync18-突触融合蛋白1相互作用的肽的计算机确定
在该实验中，目的是产生计算机肽，其对Munc18和突触融合蛋白1的相互作用区域具有亲和力和/或特异性，因此，其能够竞争、干扰和破坏所述两种蛋白质之间的相互作用和/或结合。
由于Munc18-突触融合蛋白1复合物的结构是已知的且可获得2.6A分辨率下的(Protein Data Bank参考编号3C98)，因此生成了这种相互作用的三维结构模型，并选择了表1中包含的Munc18的相互作用片段。
表1.通过计算机研究选择的Munc18与突触融合蛋白1的相互作用片段。
Figure BDA0002611949380000321
在所述靶片段的基础上，作为设计的第一步，将野生型肽(被认为是100％结合肽)突变为聚Ala(被认为是非结合肽0％)，并且所有位置在处理时视为独立。每个单独的位置突变为20种天然氨基酸，而其他位置仍为Ala。确定片段与复合物其余部分之间的理论结合能，以评估在不同位置诱变对相互作用的改善。结合能的列表和标准化产生得分矩阵，该得分矩阵显示氨基酸残基在肽的给定位置上的符合程度。这些矩阵用于提出和建立假定抑制Munc18-突触融合蛋白1复合物形成的肽的排序表。
在实验的第二步中，在复合物上对肽列表进行建模，但同时突变了肽中的所有位置。以这种方式确保了考虑了肽中相邻位置之间的相互作用或不相容性。再次评估肽-复合物相互作用的结合能，并根据该结合能对肽进行重新排序。然后将可能高于100％或低于0％的结合能与100％结合(野生型)和0％结合(聚Ala肽)进行比较。选择了最佳的肽，并建议进一步研究和验证(见表2)。
表2.选择用于进一步研究和验证的计算机研究的肽。
Figure BDA0002611949380000331
Figure BDA0002611949380000341
实施例2.肽的合成和制备。
-获得Fmoc-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-Rink-MBHA-树脂，其中AA1是L-His；AA2是L- Ile或L-Ala；AA3为L-Leu或L-Met；AA4是L-Asp或L-Arg；AA5是L-Met，L-Trp或L-Phe；且AA6是 L-Trp。
将重量标准化。根据现有技术中已知的描述的通用方案，用哌啶-DMF处理4.8g(2.5mmol)的官能度为0.52mmol/g的Fmoc-Rink-MBHA树脂，以除去Fmoc基团。在DIPCDI(1.17mL；7.5mmol；3当量)和HOBt(1.01g；7.5mmol；和3当量)的存在下，用DMF作为溶剂将3.94g的Fmoc-L-Trp(Boc)-OH(7.5mmol；3当量)掺入脱保护的树脂上达1小时。
然后如现有技术中已知的一般方法中描述的洗涤所述树脂，并重复Fmoc基团的脱保护处理以偶联下一个氨基酸。按照先前描述的方案，将2.90g Fmoc-Phe-OH，2.78g Fmoc-L-Met-OH或3.94g Fmoc-L-Trp(Boc)-OH(7.5mmol；3当量)；随后4.86g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或3.08g Fmoc-L-Asp(tBu)-OH(7.5mmol；3当量)；随后2.65g Fmoc-L-Leu-OH或2.78gFmoc-L-Met-OH(7.5mmol；3当量)；随后是2.33g Fmoc-L-Ala-OH或2.65g Fmoc-L-Ile-OH(7.5mmol；3当量)，以及随后是4.64g Fmoc-L-His(Trt)-OH(7.5mmol；3当量)顺序地偶联，每个偶联在1.01g HOBt(7.5mmol；3当量)和1.17mL DIPCDI(7.5mmol；3当量)的存在下。如上所述，在每个氨基酸添加步骤之间，进行Fmoc基团的脱保护处理。
合成后，将肽树脂用DCM洗涤(5次，每次3分钟)，并在真空下干燥。
-获得Fmoc-AA1-AA2-AA3-AA4-Rink-MBHA-树脂，其中AA1是L-Arg；AA2为L-Arg或L- Met；AA3 是L-Arg，且AA 4 是L-Phe。
将重量标准化。根据现有技术中描述的一般方案，用哌啶-DMF处理4.8g(2.5mmol)的官能度为0.52mmol/g的Fmoc-Rink-MBHA树脂，以除去Fmoc基团。在DIPCDI(1.17mL；7.5mmol；3当量)和HOBt(1.01g；7.5mmol；3当量)的存在下，用DMF作溶剂将2.90g Fmoc-L-Phe-OH(7.5mmol；3当量)掺入脱保护的树脂上达一小时。
然后按照通用方法中描述的洗涤所述树脂，并重复Fmoc基团的脱保护处理以偶联下一个氨基酸。按照先前描述的方案，将4.86g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol；3当量)；随后是4.86g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或2.78g Fmoc-L-Met-OH(7.5mmol；3当量)，以及然后是4.86g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol；3当量)顺序地偶联，每个偶联在1.01g HOBt(7.5mmol；3当量)和1.17mL DIPCDI(7.5mmol；3当量)的存在下。如上所述，在每个氨基酸添加步骤之间进行Fmoc基团的脱保护处理。
合成后，将肽树脂用DCM洗涤(5次，每次3分钟)，并在真空下干燥。
-获得Fmoc-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7-AA8-Rink-MBHA-树脂，其中AA1是L-Glu； AA2为L-Arg；AA3是L-Ile；AA4是L-Asn；AA5是L-Lys；AA6为L-Arg或L-Met；AA7是L-Arg，AA8是 L-Trp或L-Tyr。
将重量标准化。根据现有技术中已知的描述的通用方案，用哌啶-DMF处理4.8g(2.5mmol)的官能度为0.52mmol/g的Fmoc-Rink-MBHA树脂，以除去Fmoc基团。在DIPCDI(1.17mL；7.5mmol；3当量)和HOBt(1.01g；7.5mmol；3当量)存在下，使用DMF作为溶剂将3.94g Fmoc-L-Trp(Boc)-OH或3.44g Fmoc-L-Tyr(tBu)-OH(7.5mmol；3当量)掺入脱保护的树脂中达1小时。
然后按照通用方法描述的洗涤所述树脂，并重复Fmoc基团的脱保护处理以偶联下一个氨基酸。按照先前描述的方案，将4.86g Fmoc-Arg(Pbf)-OH(7.5mmol；3当量)；随后4.86g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH或2.78g Fmoc-L-Met-OH(7.5mmol；3当量)；随后3.51g Fmoc-L-Lys(Boc)-OH(7.5mmol；3当量)；随后4.45g Fmoc-L-Asn(Trt)-OH(7.5mmol；3当量)；随后2.65g Fmoc-L-Ile-OH；随后4.86g Fmoc-L-Arg(Pbf)-OH和随后3.19g Fmoc-L-Glu(OtBu)-OH(7.5mmol；3当量)依次偶联，每个偶联均在1.01g HOBt(7.5mmol；3当量)和1.17mLDIPCDI(7.5mmol；3当量)存在下进行。如上所述，在每个氨基酸添加步骤之间，进行了Fmoc基团的脱保护处理。
合成后，将肽树脂用DCM洗涤(5次，每次3分钟)，并在真空下干燥。
使用上述合成程序，并根据需要选择氨基酸，合成了以下序列：
His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp(SEQ ID NO：5)；
His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp(SEQ ID NO：6)；
His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO：7)；
His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp(SEQ ID NO：8)；
His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO：9)；
Arg-Arg-Arg-Phe(SEQ ID NO：10)；
Arg-Met-Arg-Phe(SEQ ID NO：11)；
Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Arg-Arg-Trp(SEQ ID NO：13)；和
Glu-Arg-Ile-Asn-Lys-Met-Arg-Tyr(SEQ ID NO：14)。
实施例3.去除根据实施例2合成的肽的Fmoc N末端保护基团。
肽基树脂的N末端Fmoc基团在DMF中用20％哌啶脱保护(1×1分钟+2×10分钟)(Lloyd Williams P.等人(1997)“Chemical Approaches to the Synthesis of Peptidesand Proteins”CRC,Boca Raton(Fla.,USA))。用DMF(5×1分钟)、DCM(4×1分钟)洗涤肽基树脂，并在真空下干燥。
实施例4.将R1乙酰基基团引入到根据实施例3获得的肽基树脂上的过程。
在25当量的DIEA存在下，使用5mL的DMF作为溶剂，用25当量的乙酸酐处理根据实施例2获得的1mmol(1当量)的肽基树脂。将它们反应30分钟，然后将肽基树脂用DMF(5×1分钟)、DCM(4×1分钟)洗涤，并在真空下干燥。
实施例5.根据实施例3和4获得的肽基树脂的聚合支持物的切割过程。
将重量标准化。在室温下用5mL的TFA/TIS/H2O(90∶5∶5)将200mg从实施例2、3或4中任一获得的干燥的肽基树脂搅拌处理2小时。收集滤液，并用50mL(8至10倍)冷二乙醚沉淀。在减压和室温下将醚溶液蒸发至干燥，将沉淀物重新溶解在水溶50％MeCN中并冻干。
实施例6.根据实施例5合成和制备的肽的表征。
用Shimadzu设备(日本京都)，使用反相柱(150x4.6mm，XBridge Peptide BEHC18，3.5μm，Waters，USA)在水中(+0.045％TFA)的MeCN梯度(+0.036％TFA)中以1.25mL/min的流速进行按照实施例5获得的肽的HPLC分析，并在220nm进行检测。所有肽均显示超过80％的纯度。通过ESI-MS在Water ZQ 4000检测器中使用MeOH作为流动相，以流速为0.2mL/min来确认获得的肽的身份。获得的结果表明，表3中包括的肽被有效地合成。
表3.合成的最终肽。
Figure BDA0002611949380000371
Figure BDA0002611949380000381
实施例7.乙酰胆碱释放的测量。
根据实施例2至6合成上表3中包括的肽。
测试了所述肽在体外调节乙酰胆碱释放的能力。为此，将LAN细胞接种在48孔培养板上，并在受控条件下(37℃，5％CO2)达到合适的汇合度，然后通过用
Figure BDA0002611949380000382
A培养基代替培养基来诱导分化，所述
Figure BDA0002611949380000383
A培养基补充有N-2补充剂、GlutaMAXTM、氯化胆碱和白血病抑制因子(GIBCO，Life Technologies，MA，美国)。一旦细胞获得其分化形态，就用上述肽以下列浓度处理1小时：除Ac-SEQ ID NO：8-NH2以外的所有肽，以0.001mg/mL，0.005mg/mL和0.01mg/mL；和肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2，以0.005mg/mL和0.05mg/mL。然后用HEPES洗涤细胞，接着通过用外部50mM KCl溶液去极化来刺激乙酰胆碱释放。非刺激的细胞与非去极化的4mM KCl溶液一起孵育。与相应的去极化或非去极化KCl溶液孵育30分钟后，收集细胞上清液，并用Amplex Red乙酰胆碱测定试剂盒(ThermoFisher Scientific，MA，USA)测量乙酰胆碱水平。将细胞沉淀用于通过BCA蛋白质测试测定法(Pierce BCA蛋白质测定试剂盒，ThermoFisher Scientific，MA，USA)确定蛋白质含量(用于数据归一化目的)。
将阳性对照(未处理的经KCl刺激的细胞)考虑为100％释放，计算了乙酰胆碱释放抑制的百分比。
表4汇总了获得的结果：
表4.实施例7中获得的结果汇总。
肽 结果
Ac-SEQ ID NO:5-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中有活性
Ac-SEQ ID NO:6-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中有活性
Ac-SEQ ID NO:7-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中有活性
Ac-SEQ ID NO:8-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中有活性
Ac-SEQ ID NO:9-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中有活性
Ac-SEQ ID NO:10-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中有活性
Ac-SEQ ID NO:11-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中有活性
Ac-SEQ ID NO:13-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中无活性
Ac-SEQ ID NO:14-NH<sub>2</sub> 在乙酰胆碱释放的调节中无活性
该实验的结果也总结在图1(A)至(I)中。如可直接从所述附图得出的，表4中标记为对乙酰胆碱的调节有活性的肽在所有测试浓度下均显示乙酰胆碱释放的显著降低。另一方面，在表4中标记为无活性的肽在最低浓度下显示中到低度抑制，而在最高浓度下显示完全失去抑制。在任何测试浓度下，所述肽均未显示乙酰胆碱释放的统计学降低。由于这种细胞的技术复杂性和测试固有的变异性，因此在低浓度下观察到了轻微的抑制这一事实是预期内的，但是在最高浓度下活性完全丧失清楚地表明了这些肽(Ac-SEQ ID NO：13-NH2和Ac-SEQ ID NO：14-NH2)不能抑制乙酰胆碱的释放。
如从现有技术中所见(Blanes-Mira C.,Clemente J.,Jodas G.,等人(2002),Asynthetic hexapeptide(Argireline)with antiwrinkle activity,InternationalJournal of Cosmetic Science,24,303-310)，使用BoNT A时透化的嗜铬细胞的胞吐作用抑制达到最大值50％，或者使用
Figure BDA0002611949380000401
时达到40％。因此，在该实施例中获得的结果证明了本发明的肽的高活性，因为当直接在LAN细胞上测试乙酰胆碱释放的抑制时，甚至未透化就获得了20-30％的抑制值。
实施例8.结合测定
基于实施例1的计算机研究并根据实施例2至6合成以下肽：
Ac-SEQ ID NO：5-NH2
Ac-SEQ ID NO：8-NH2
功能性评估了所述肽抑制Munc18与突触融合蛋白1(一种SNARE复合体蛋白)的蛋白-蛋白相互作用的能力，其通过基于ELISA的体外Munc18/突触融合蛋白1结合测定法。简言之，将0.1、0.5和1mM的上述肽与10和5nM的其靶蛋白突触融合蛋白1(带GST标签)在缓冲液(20mM Hepes,150mM NaCl,2mM MgCl2,2mM DTT,0.5％Triton-X100和0.5％脱脂奶)中在RT预孵育3小时。同时，使带His标签的Munc18以100nM结合于用镍包被的96孔板并在RT孵育1.5小时。随后洗掉未结合的蛋白，接着用脱脂奶在洗涤缓冲液(PBS+0.02％Triton-X100)中将孔再封闭30分钟。然后向板以10和5nM添加与肽预孵育的带GST标签的突触融合蛋白1，并在RT孵育2h。用洗涤缓冲液将孔洗涤三次，接着与一抗(GST标签多克隆抗体–Thermofisher Scientific,Massachusetts,USA)孵育45分钟。最后，在再次洗涤后，添加缀合有HRP的二抗(抗兔IgG-HRP–Sigma,Missouri,USA)，并在RT孵育。使用TMB底物(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)产生信号。通过加入Stop Reagent停止反应。通过测量450nm的吸光度来分析突触融合蛋白1蛋白与Munc18蛋白的结合量。
该实验中获得的结果汇总在图2中。图2证明测试的两种肽(Ac-SEQ ID NO:5-NH2甚至达到令人惊讶地更高的程度)均能显著阻断Munc18与突触融合蛋白1之间的蛋白-蛋白相互作用，甚至显示以剂量-应答方式。对于Ac-SEQ ID NO:8-NH2和Ac-SEQ ID NO:5-NH2肽最大抑制分别达到37％和67％。基于这些结果，可以看出本发明的肽能够如受调节的胞吐作用所需要的破坏蛋白-蛋白相互作用和随后的神经递质释放。
实施例9.骨骼肌人肌细胞中的基因表达调节
基于实施例1的计算机研究并根据实施例2至6合成以下肽：
Ac-SEQ ID NO：5-NH2
Ac-SEQ ID NO：8-NH2
Ac-SEQ ID NO：10-NH2
测试了所述肽以评估其调节人骨骼肌肌细胞中与肌肉收缩和松弛有关的几种基因的表达的能力(Lodish H,Berk A,Zipursky SL,等人(2000),Molecular Cell Biology,4th edition；Section 18.3Myosin:The Actin Motor Protein,Nueva York,W.H.Freeman；Kuo,IY,&Ehrlich,BE(2015),Signaling in Muscle Contraction,ColdSpring Harbor Perspectives in Biology,7(2)；RAPSN receptor associated proteinof the synapse[Homo sapiens(human)],Gene ID in NCBI 5913；Blake DJ,Tinsley JM,Davies KE(1996),Utrophin:a structural and functional comparison todystrophin,Brain Pathol.,6(1):37-47；Barik A,Lu Y,Sathyamurthy A,等人(2014),LRP4 Is Critical for Neuromuscular Junction Maintenance,The Journal ofNeuroscience,34(42),13892–13905；Kim N,Stiegler AL,Cameron TO,Hallock PT,等人(2008),Lrp4 is a Receptor for Agrin and Forms a Complex with MuSK,Cell,135(2),334–342；Mahavadi S,Nalli A,Kumar D,等人(2014),Increased expression ofcaveolin-1is associated with upregulation of the RhoA/Rho kinase pathway andsmooth muscle contraction in diabetes(1110.11),The FASEB Journal,28:1_supplement))。为此，设计了一种收缩性智能数据基因面板。所述收缩性智能数据基因面板分析了表5中包含的与肌肉收缩和松弛相关的基因的表达。
表5.实施例9中分析的基因
符号 基因名
MYH1 肌球蛋白重链
SCN3A 钠电压门控通道Alpha亚基3
RAPSN 突触的受体相关蛋白
TNNC 1 肌钙蛋白C1
ACTA 1 肌动蛋白
UTRN Utrophin
CACNB1 钙电压门控通道辅助亚基Beta 1
CHRNA1 烟碱性乙酰胆碱受体Alpha亚基1
CALM3 钙调蛋白3
CAV1 小窝蛋白1
LRP4 LDL受体相关蛋白4
简言之，将人骨骼肌成肌细胞一式两份地以1x 105细胞/孔的密度接种在12孔培养板中，并在标准培养条件(37℃，95％湿度，5％CO2)下保持48-72h。然后用特定分化培养基(SKM-D培养基+1％抗生素-抗真菌剂)诱导成肌细胞向肌细胞的分化，并再监测7天。将分化的细胞用0.05mg/mL的肽Ac-SEQ ID NO：5-NH2处理；或用0.1mg/mL的肽Ac-SEQ ID NO：10-NH2处理24小时；或用0.05和0.5mg/mL的肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2处理6h；或用0.5mg/mL肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2处理24h。未处理的细胞用作基础对照。然后按照制造商的说明(RNeasy mini kit，Qiagen，荷兰)，使用RNA纯化商业试剂盒裂解细胞以提取RNA。然后通过nanodrop定量RNA，调节浓度，并处理以使用市售试剂盒(High-Capacity cDNA ReverseTranscription试剂盒，Thermofisher Scientific，美国)逆转录成cDNA。将所得cDNA用于实施RTqPCR(实时定量聚合酶链反应)，其使用taqman技术和设计为靶向与肌肉收缩性相关的特定基因(表4中提到的)设计的一组探针。
该实验的结果总结在图3(A)至(D)中。在所述图中可以看出，当用肽Ac-SEQ IDNO：5-NH2处理人肌细胞时，观察到UTRN，ACTA1，TNNC1，RAPSN，SCN3A和MYH1的下调。用肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2处理肌细胞对于6小时处理导致SCN3A，UTRN，ACTA1，TNNC1，CALM3，CAV1，CACNB1，LRP4和MYH1下调，并且对于24小时处理导致RAPSN的下调和ATP2A的上调。最后，用肽Ac-SEQ ID NO：10-NH2处理肌细胞导致UTRN，TNNC1，SCN3A CHRNA1和CACNB1的下调。
上述基因的下调可能以不同方式影响正常的肌肉收缩功能：乙酰胆碱在肌肉细胞表面结合所需的RAPSN，CHRNA1，UTRN和LRP4，可能会影响神经递质引起的膜去极化和细胞骨架的稳定性；SCN3A和CACNB1，作为电压门控通道，可能会影响膜电位和激发传输；参与Ca2+转运的SLN可能会影响细胞内钙的积累；以及MYH1，TNNC1和ACTAA1可能会影响细胞骨架完整性和驱动收缩的能量冲击。因此，在该实施例中获得和如图3所示的结果证明了本发明的肽调节肌肉收缩-松弛的能力，有助于增加肌肉的松弛。
实施例10.钙动员测定
根据实施例2至6合成肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2。
用Fluo-4 NW钙测定试剂盒(ThermoFisher Scientific，MA USA)在体外评估了所述肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2降低人骨骼肌细胞上的钙动员的潜力。简而言之，将人骨骼肌成肌细胞一式五份接种在黑色96孔板中，底部透明，密度为1x 104个细胞/孔，并在标准培养条件(37℃，95％湿度，5％CO2)下保持48-72h。然后用特定分化培养基(SKM-D培养基+1％a/a)诱导成肌细胞分化为肌细胞，并再监测7天。用非细胞毒性浓度的肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2(0.01mg/mL，0.05mg/mL和0.1mg/mL)再处理分化的细胞48小时。
一旦孵育结束，将细胞培养基替换为100μl染料上样溶液，并将平板在培养箱中放置30分钟。然后在使用FLUOstar Omega仪器(德国BMG Labtech)进行钙测量之前，用测定缓冲液代替染料溶液。为了进行适当的动力学测量，设置10秒钟的刺激前阶段，以确定在通过添加60mM KCl诱导钙流入之前的基线信号。刺激后阶段设置为90秒，每0.1秒在494/516nm(激发/发射)处读数。
进行以下步骤进行数据分析：1)计算每种条件的平均动力学曲线；2)确定用KCl刺激后每个曲线的最大荧光信号；3)计算相对于基线的倍数变化增加；4)将每种条件(每种肽浓度)获得的结果相对于对照(未处理的细胞)获得的结果标准化。
在该实验中获得的结果总结在图4中，反映了本发明的肽(以Ac-SEQ ID NO：8-NH2为例)以剂量依赖性方式(在0.01mg/mL，0.05mg/mL和0.1mg/mL分别为-6％,-20％和-30％)减少钙流入的潜力。这种钙流入的减少对细胞收缩性有影响，有利于肌肉松弛。
如可以直接从上述实施例得出的，本发明的肽有效地干扰或抑制了复合物Munc18-突触融合蛋白1的形成，因此，可以调节(抑制)神经元胞吐作用。另外，所述肽对肌肉细胞提供直接作用，诱导或有助于其松弛(肌肉松弛)。因此，本发明的肽解决了现有技术中存在的上述问题。
实施例11.肌球蛋白重链蛋白减少
在体外通过免疫荧光法评估了所述肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2降低人骨骼肌细胞中蛋白质肌球蛋白重链表达的潜力，其使用针对该蛋白质的特异性抗体(Biotechne，USA)和随后的荧光二抗(Thermofisher，美国)。简而言之，将人骨骼肌成肌细胞以3x 104个细胞/cm2的密度接种到SKM-M培养基(法国Tebu-Bio)中的盖玻片上，并在标准培养条件(37℃，95％湿度，5％CO2)下孵育过夜。然后用特定分化培养基(骨骼肌细胞分化培养基，SKM-D培养基)诱导成肌细胞分化为肌细胞，并再监测7天。用非细胞毒性浓度的肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2(0.05mg/mL和0.5mg/mL)另外处理分化的细胞48小时。
一旦孵育结束，将细胞用4％PFA固定并使用0.1％(v/v)Triton(Sigma，美国)进行透化。然后在室温2小时期间用0.5mg/ml肌球蛋白重链抗体对肌球蛋白染色。正确洗涤后，肌动蛋白用50μg/ml鬼笔环肽(红色)(美国Sigma公司)标记1h，且洗涤后将细胞用4μg/ml的二抗山羊抗小鼠igG染色1h。最后，用3.5μg/ml的Hoescht标记物将细胞核染色10分钟(Sigma，美国)。
使用5倍和10倍物镜获取显微图像。每种条件一式三份，并使用相同的设置获取每个盖玻片的三至四个视野的图像。
使用Image J软件分析图像。简言之，调整阈值以选择肌球蛋白并测量平均荧光。使用DAPI染色计数阳性细胞的数目。将肌球蛋白的平均荧光强度除以肌球蛋白阳性细胞的数目。最后，将所有数据如下标准化以获得与未处理的细胞相比的肌球蛋白的％：相对于对照的％＝(经处理的孔中的每细胞荧光/未经处理的孔中的每细胞荧光)×100。
在该实验中获得的结果总结在图5(A)、5(B)和6中，并反映了本发明的肽(以Ac-SEQ ID NO：8-NH2为例)以剂量依赖方式(图6中0.05mg/mL和0.5mg/mL时分别为-26％和-38％)减少肌球蛋白重链蛋白水平的潜力。这种肌球蛋白重链蛋白水平的降低对细胞收缩性有影响，有利于肌肉松弛。
从上述实施例可以直接得出，本发明的肽有效地对肌肉细胞提供直接作用，诱导或有助于其松弛(肌肉松弛)。
实施例12.收缩频率
使用人肌肉细胞和源自hiPSC共培养物的运动神经元在体外评估了所述肽Ac-SEQID NO：8-NH2调节收缩频率的潜力，其通过用InCell2200自动显微镜在处理前和处理后(处理后，在每个建立的时间点)的60秒钟期间记录局部的收缩性肌肉纤维的实时成像视频。
将人肌肉细胞在T75 cm2烧瓶中以1x 106个细胞的密度培养，然后转移至96孔板进行分化。将源自hiPSC的运动神经元转移至含有肌肉细胞(在分化培养基中)的96孔板上。维持共培养10天，以产生与肌纤维的神经元连接。在5天期间观察到自发性收缩。
然后用对照培养基(基础)，1μMα-银环蛇毒素，0.5mg/mL乙酰基六肽-8(作为基准参考)和0.05或0.1mg/mL肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2处理共培养物。在处理前60秒钟期间记录共培养的视频，孵育30分钟后，在60秒钟期间再次记录视频。将培养板与化合物再次孵育1h30min(总共孵育2h)，并在60秒期间再次记录共培养物的视频。将培养板与化合物再次孵育总共24h，并在孵育结束时在60秒期间再次记录视频。最后，将化合物洗出，并从化合物的所述洗出24小时后进行最后记录，以评估肌肉收缩的最终恢复(恢复)。
在每次孵育之前和之后计算收缩频率。对于每种培养条件，分析了6个孔。
在该实验中获得的结果总结在图7中，并反映了本发明的肽(以Ac-SEQ ID NO：8-NH2为例)在仅仅30分钟后(相对于基础的未处理细胞，在0.05和0.1mg/mL时肌肉收缩频率分别为25％和18％)诱导肌肉收缩频率的重要的剂量依赖性降低的潜力，其在24小时孵育期间保持(0.05和0.1mg/mL时分别为23％和10％)。洗掉该化合物可使肌肉收缩频率部分恢复，在0.05mg/mL的浓度更好(在0.05和0.1mg/mL分别为65％和35％)。
以0.5mg/mL使用的基准(乙酰基六肽-8)在30分钟后诱导了肌肉收缩频率的部分抑制(18％的肌肉收缩频率)，但随着孵育的延长这种作用减弱了(24小时后为45％)，且在洗掉后频率完全恢复(100％)。
如可以直接从以上实例得到的，本发明的肽有效地在与肌肉纤维形成神经元连接的过程中对肌肉收缩提供直接作用，有助于它们的松弛(肌肉松弛)。
实施例13.胞吐作用水平和延迟
使用SH-SY5Y细胞在体外评估了所述肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2调节含有神经递质的囊泡从神经母细胞瘤细胞系的胞吐作用的潜力，其使用具有20倍物镜和氙气灯的Zeissaxiovert 200倒置落射荧光显微镜通过荧光成像进行。
SH-SY5Y细胞(Sigma，美国)在T25烧瓶中的补充培养基(DMEM/F12，Gibco，美国)中培养。超过90％汇合后，用1ml 0.5％(v/v)胰蛋白酶-EDTA胰蛋白酶消化细胞。接下来，添加5mL的所述补充培养基并确定细胞浓度。将细胞在补充培养基(Gibco，美国)中以15x 104个细胞/孔接种到24孔板中的聚赖氨酸包被的12mm经处理盖玻片上，并在常规条件(37℃，5％CO2)下孵育。细胞接种24小时后，按照制造商的说明使用lipofectamineTM 3000(美国，Invitrogen)用胞吐作用报告物转染细胞。报告物构建体包含由管腔内特异性蛋白和pH敏感荧光蛋白组成的融合蛋白。
为了监测胞吐作用，蛋白质表达48小时后，将细胞与0.01mg/mL的Ac-SEQ ID NO：8-NH2肽或1mg/mL的基准乙酰基六肽-8在37℃和5％CO2下孵育1h。未处理的细胞用作基础对照。然后，将细胞用100nM PMA预处理15分钟，并用12.5μM离子霉素和PMA(100nM)刺激5分钟(总刺激时间：20分钟)。在刺激方案的最后10分钟进行荧光成像。使用483-512nm激发滤光片和525-530nm发射滤光片监测胞吐作用报告物的荧光信号。使用Aquacosmos软件每5秒用ORCA-ER CCD相机捕获图像达到10分钟。
在N＝4个独立实验中使用n＝16个盖玻片测定未处理的细胞(测量了483个细胞)，在N＝3个独立实验中使用n＝10个盖玻片测定乙酰六肽-8处理的细胞(测量了328个细胞)，和在N＝3个独立实验中使用n＝8个盖玻片测定Ac-SEQID NO：8-NH2处理的细胞(测量了240个细胞)。选择细胞以个别地监测荧光强度和时程。通过使用GraphPad软件计算曲线下面积(AUC)，将通过添加离子霉素引起的荧光峰用于量化胞吐作用。定义并分析了两个参数：
-胞吐作用水平：对于单个细胞，从AUC分析获得总峰面积并通过基线标准化，该基线定义为注射离子霉素前3个循环的荧光强度。
-胞吐作用延迟：对于单个细胞，从AUC分析获得了响应时间(min)，其为离子霉素注射(Y)和峰起始(第一X)之间的时间框。
荧光值进一步标准化为相对于每个实验中未处理细胞的变化百分比，其为：(经处理细胞的胞吐水平/未处理细胞的胞吐水平)×100和(经处理细胞的响应时间/未处理细胞的响应时间)x 100。
对于胞吐作用监测参数的分析：数据表示针对胞吐水平和胞吐延迟相对于未处理细胞进行标准化的百分比。数据表示为平均值±SEM；对于未处理的细胞，数据是从N＝4个独立实验n＝16个重复中获得的(测量了483个细胞)；对于乙酰基六肽-8处理的细胞，N＝3个独立实验，n＝10个重复(测量了328个细胞)；对于Ac-SEQ ID NO：8-NH2处理的细胞，N＝3个独立实验，n＝8个重复(测量了240个细胞)。
在该实验中获得的结果总结在图8和9中，并反映了本发明的肽(以Ac-SEQ ID NO：8-NH2为例)减少(图8)和延迟(图9)神经元释放的含乙酰胆碱囊泡的胞吐作用的潜力，该囊泡经由特定的乙酰胆碱受体激活肌肉收缩。
在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中，Ac-SEQ ID NO：8-NH2以0.01mg/mL孵育1小时显著延迟了胞吐作用响应时间(延迟24％)并降低了胞吐作用水平(-14％)，而乙酰基六肽-8以1mg/mL孵育1小时显著延迟了胞吐作用响应(延迟67％)而没有改变胞吐作用水平(7％)。
如可以直接从上述实施例得到的，本发明的肽通过降低神经元释放到突触空间用于肌肉收缩的乙酰胆碱囊泡的水平并延迟所述胞吐作用而有效地对肌肉收缩提供间接作用。
实施例14.胶原蛋白产生
使用人皮肤成纤维细胞在体外评估了所述肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2调节I型胶原蛋白产生作为皮肤紧致的潜在改善者的潜力。
将细胞以1x 104个细胞/孔的密度接种在96孔板中，并在标准培养条件(37℃，95％湿度，5％CO2)下保持24h。孵育24小时后，除去培养基并将含有0.01、0.05或0.1mg/mL的肽Ac-SEQ ID NO：8-NH2的新培养基添加至孔浓度。处理持续24小时或48小时，并且在测定结束时收集细胞培养基。仅用培养基处理的细胞用作基础对照(未处理的细胞)。
处理24和48小时后，通过ELISA测定法在细胞培养基中测量细胞产生和释放的I型胶原蛋白的量(从头(ex-novo)I型新胶原合成)。将测试项目的结果与基础对照条件(未处理的细胞)进行比较。在三个不同的实验阶段中一式三份进行处理。
I型胶原合成的测定通过竞争性ELISA法进行。将样品添加到预先用抗体包被的酶孔中，然后添加用辣根过氧化物酶(HRP)标记的识别抗原；在37℃孵育1小时后，它们都与固相抗原竞争并形成免疫复合物。用磷酸盐缓冲溶液洗涤后，联合的HRP将四甲基联苯胺(TMB)催化为蓝色，并在酸的作用下变为黄色；它在450nm波长处有一个吸收峰，且其吸收度与样品的抗原密度呈负相关。通过微板读数器读取板。
定量测定使用校准曲线，该校准曲线由已知的和增加浓度的标准I型胶原蛋白组成。结果表示为50μL细胞培养基中I型胶原蛋白浓度(μg/ml)。
在三个不同的实验阶段中每种测定均进行了三个试验。计算阴性对照和样品之间I型胶原蛋白含量的％变化，并且获得该肽增加I型胶原蛋白合成的功效的直接指标。
在该实验中获得的结果总结在图10(A)和10(B)中，并反映了本发明的肽(以Ac-SEQ ID NO：8-NH2为例)诱导人皮肤成纤维细胞产生I型胶原蛋白的潜力。
Ac-SEQ ID NO：8-NH2肽显著促进了成纤维细胞产生I型胶原蛋白，在0.01、0.05和0.1mg/mL 24小时后分别提高了9％、31％和37.5％，且在0.01、0.05和0.1mg/mL 48小时后分别提高了16％、29.5％和56.5％。
如可以直接从上述实施例得到的，本发明的肽有效地提供了较强效果并改善了皮肤的紧致度和质量。
序列表
<110> Lipotrue S.L.
<120> 用于化妆品和医药的肽和组合物
<130> 2019-791
<150> EP 18382118.0
<151> 2018-02-27
<150> EP 18382126.3
<151> 2018-02-28
<160> 14
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 594
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> Munc18
<400> 1
Met Ala Pro Ile Gly Leu Lys Ala Val Val Gly Glu Lys Ile Met His
1 5 10 15
Asp Val Ile Lys Lys Val Lys Lys Lys Gly Glu Trp Lys Val Leu Val
20 25 30
Val Asp Gln Leu Ser Met Arg Met Leu Ser Ser Cys Cys Lys Met Thr
35 40 45
Asp Ile Met Thr Glu Gly Ile Thr Ile Val Glu Asp Ile Asn Lys Arg
50 55 60
Arg Glu Pro Leu Pro Ser Leu Glu Ala Val Tyr Leu Ile Thr Pro Ser
65 70 75 80
Glu Lys Ser Val His Ser Leu Ile Ser Asp Phe Lys Asp Pro Pro Thr
85 90 95
Ala Lys Tyr Arg Ala Ala His Val Phe Phe Thr Asp Ser Cys Pro Asp
100 105 110
Ala Leu Phe Asn Glu Leu Val Lys Ser Arg Ala Ala Lys Val Ile Lys
115 120 125
Thr Leu Thr Glu Ile Asn Ile Ala Phe Leu Pro Tyr Glu Ser Gln Val
130 135 140
Tyr Ser Leu Asp Ser Ala Asp Ser Phe Gln Ser Phe Tyr Ser Pro His
145 150 155 160
Lys Ala Gln Met Lys Asn Pro Ile Leu Glu Arg Leu Ala Glu Gln Ile
165 170 175
Ala Thr Leu Cys Ala Thr Leu Lys Glu Tyr Pro Ala Val Arg Tyr Arg
180 185 190
Gly Glu Tyr Lys Asp Asn Ala Leu Leu Ala Gln Leu Ile Gln Asp Lys
195 200 205
Leu Asp Ala Tyr Lys Ala Asp Asp Pro Thr Met Gly Glu Gly Pro Asp
210 215 220
Lys Ala Arg Ser Gln Leu Leu Ile Leu Asp Arg Gly Phe Asp Pro Ser
225 230 235 240
Ser Pro Val Leu His Glu Leu Thr Phe Gln Ala Met Ser Tyr Asp Leu
245 250 255
Leu Pro Ile Glu Asn Asp Val Tyr Lys Tyr Glu Thr Ser Gly Ile Gly
260 265 270
Glu Ala Arg Val Lys Glu Val Leu Leu Asp Glu Asp Asp Asp Leu Trp
275 280 285
Ile Ala Leu Arg His Lys His Ile Ala Glu Val Ser Gln Glu Val Thr
290 295 300
Arg Ser Leu Lys Asp Phe Ser Ser Ser Lys Arg Met Asn Thr Gly Glu
305 310 315 320
Lys Thr Thr Met Arg Asp Leu Ser Gln Met Leu Lys Lys Met Pro Gln
325 330 335
Tyr Gln Lys Glu Leu Ser Lys Tyr Ser Thr His Leu His Leu Ala Glu
340 345 350
Asp Cys Met Lys His Tyr Gln Gly Thr Val Asp Lys Leu Cys Arg Val
355 360 365
Glu Gln Asp Leu Ala Met Gly Thr Asp Ala Glu Gly Glu Lys Ile Lys
370 375 380
Asp Pro Met Arg Ala Ile Val Pro Ile Leu Leu Asp Ala Asn Val Ser
385 390 395 400
Thr Tyr Asp Lys Ile Arg Ile Ile Leu Leu Tyr Ile Phe Leu Lys Asn
405 410 415
Gly Ile Thr Glu Glu Asn Leu Asn Lys Leu Ile Gln His Ala Gln Ile
420 425 430
Pro Pro Glu Asp Ser Glu Ile Ile Thr Asn Met Ala His Leu Gly Val
435 440 445
Pro Ile Val Thr Asp Ser Thr Leu Arg Arg Arg Ser Lys Pro Glu Arg
450 455 460
Lys Glu Arg Ile Ser Glu Gln Thr Tyr Gln Leu Ser Arg Trp Thr Pro
465 470 475 480
Ile Ile Lys Asp Ile Met Glu Asp Thr Ile Glu Asp Lys Leu Asp Thr
485 490 495
Lys His Tyr Pro Tyr Ile Ser Thr Arg Ser Ser Ala Ser Phe Ser Thr
500 505 510
Thr Ala Val Ser Ala Arg Tyr Gly His Trp His Lys Asn Lys Ala Pro
515 520 525
Gly Glu Tyr Arg Ser Gly Pro Arg Leu Ile Ile Phe Ile Leu Gly Gly
530 535 540
Val Ser Leu Asn Glu Met Arg Cys Ala Tyr Glu Val Thr Gln Ala Asn
545 550 555 560
Gly Lys Trp Glu Val Leu Ile Gly Ser Thr His Ile Leu Thr Pro Gln
565 570 575
Lys Leu Leu Asp Thr Leu Lys Lys Leu Asn Lys Thr Asp Glu Glu Ile
580 585 590
Ser Ser
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> 突触融合蛋白1
<400> 2
Met Lys Asp Arg Thr Gln Glu Leu Arg Thr Ala Lys Asp Ser Asp Asp
1 5 10 15
Asp Asp Asp Val Ala Val Thr Val Asp Arg Asp Arg Phe Met Asp Glu
20 25 30
Phe Phe Glu Gln Val Glu Glu Ile Arg Gly Phe Ile Asp Lys Ile Ala
35 40 45
Glu Asn Val Glu Glu Val Lys Arg Lys His Ser Ala Ile Leu Ala Ser
50 55 60
Pro Asn Pro Asp Glu Lys Thr Lys Glu Glu Leu Glu Glu Leu Met Ser
65 70 75 80
Asp Ile Lys Lys Thr Ala Asn Lys Val Arg Ser Lys Leu Lys Ser Ile
85 90 95
Glu Gln Ser Ile Glu Gln Glu Glu Gly Leu Asn Arg Ser Ser Ala Asp
100 105 110
Leu Arg Ile Arg Lys Thr Gln His Ser Thr Leu Ser Arg Lys Phe Val
115 120 125
Glu Val Met Ser Glu Tyr Asn Ala Thr Gln Ser Asp Tyr Arg Glu Arg
130 135 140
Cys Lys Gly Arg Ile Gln Arg Gln Leu Glu Ile Thr Gly Arg Thr Thr
145 150 155 160
Thr Ser Glu Glu Leu Glu Asp Met Leu Glu Ser Gly Asn Pro Ala Ile
165 170 175
Phe Ala Ser Gly Ile Ile Met Asp Ser Ser Ile Ser Lys Gln Ala Leu
180 185 190
Ser Glu Ile Glu Thr Arg His Ser Glu Ile Ile Lys Leu Glu Asn Ser
195 200 205
Ile Arg Glu Leu His Asp Met Phe Met Asp Met Ala Met Leu Val Glu
210 215 220
Ser Gln Gly Glu Met Ile Asp Arg Ile Glu Tyr Asn Val Glu His Ala
225 230 235 240
Val Asp Tyr Val Glu Arg Ala Val Ser Asp Thr Lys Lys Ala Val Lys
245 250 255
Tyr Gln Ser Lys Ala Arg Arg Lys Lys Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys
260 265 270
Val Ile Leu Gly Ile Val Ile Ala Ser Thr Val Gly Gly Ile Phe Ala
275 280 285
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> Munc18位置46至51
<400> 3
Lys Met Thr Asp Ile Met
1 5
<210> 4
<211> 4
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> Munc18位置63至66
<400> 4
Lys Arg Arg Glu
1
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的肽
<400> 5
His Ile Leu Asp Met Trp
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 6
His Ile Met Asp Phe Trp
1 5
<210> 7
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的肽
<400> 7
His Ile Leu Asp Trp Trp
1 5
<210> 8
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 8
His Ala Leu Arg Phe Trp
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的肽
<400> 9
His Ile Met Asp Trp Trp
1 5
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的肽
<400> 10
Arg Arg Arg Phe
1
<210> 11
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的肽
<400> 11
Arg Met Arg Phe
1
<210> 12
<211> 8
<212> PRT
<213> 人
<220>
<223> Munc18位置59至66
<400> 12
Glu Asp Ile Asn Lys Arg Arg Glu
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的肽
<400> 13
Glu Arg Ile Asn Lys Arg Arg Trp
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工合成的肽
<400> 14
Glu Arg Ile Asn Lys Met Arg Tyr
1 5

Claims (18)

1.能够干扰Munc18-突触融合蛋白1复合物相互作用的肽，其可接受的异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物和/或其混合物，所述肽的特征在于其与SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4竞争。
2.根据权利要求1的肽，其特征在于，其序列是SEQ ID NO：3和/或SEQ ID NO：4。
3.根据权利要求1的肽，所述肽的特征在于其具有根据式(I)的序列：R1-AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-R2
它们的化妆品和药学上可接受的异构体、盐、溶剂化物和/或衍生物及其混合物，其中：
AA1选自具有带正电荷的侧链或极性不带电荷的侧链的氨基酸的组；AA2选自具有非极性疏水性侧链的氨基酸的组；
AA3选自具有非极性疏水性侧链的氨基酸的组；
AA4选自具有带电荷侧链的氨基酸的组；
AA5选自具有非极性疏水性侧链或芳香族侧链的氨基酸的组；
AA6是W；
R1选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R5-CO-，其中R5选自由以下形成的基团：取代或未取代的C1-C24烷基，取代或未取代的C2-C24烯基，取代或未取代的C2-C24炔基，取代或未取代的C3-C24环烷基，取代或未取代的C5-C24环烯基，取代或未取代的C8-C24环炔基，取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3至10元环的杂环基，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1-3个碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基；和
R2选自H，-NR3R4-，-OR3和-SR3，其中R3和R4独立地选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基团，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，以及取代或未取代的芳烷基。
4.根据权利要求3的肽，其特征在于，
AA1是H；
AA2选自具有非极性疏水性侧链的氨基酸的组；
AA3选自具有非极性疏水性侧链的氨基酸的组；
AA4选自具有带电荷侧链的氨基酸的组；
AA5选自M或具有芳族侧链的氨基酸的组；和
AA6是Trp。
5.根据权利要求3或4的肽，其特征在于，
AA1是His；
AA2选自Ala和Ile的组；
AA3选自Leu和Met的组；
AA4选自Arg和Asp的组；
AA5选自Met、Phe和Trp的组；和
AA6是Trp。
6.根据权利要求3至5中任一项的肽，其特征在于式(I)的肽为：
R1-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：5-R2)；
R1-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：6-R2)；
R1-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：7-R2)；
R1-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：8-R2)；和/或
R1-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-R2(R1-SEQ ID NO：9-R2)。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的肽，其特征在于，式(I)的肽为：
Ac-His-Ile-Leu-Asp-Met-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO：5-NH2)；
Ac-His-Ile-Met-Asp-Phe-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO：6-NH2)；
Ac-His-Ile-Leu-Asp-Trp-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO：7-NH2)；
Ac-His-Ala-Leu-Arg-Phe-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO：8-NH2)；和/或
Ac-His-Ile-Met-Asp-Trp-Trp-NH2(Ac-SEQ ID NO：9-NH2)。
8.根据权利要求1的肽，其特征在于其具有根据式(II)的序列：
R1-AA1-AA2-AA3-AA4-R2
它们的化妆品和药学上可接受的异构体，盐，溶剂化物和/或衍生物及其混合物，其中：
AA1选自具有带正电的侧链的氨基酸的组；
AA2是任意氨基酸；
AA3选自具有带正电的侧链的氨基酸的组；
AA4选自具有芳族侧链的氨基酸的组；
R1选自His，取代或未取代的非环状脂肪族基，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳烷基，取代或未取代的芳基，取代或未取代的芳烷基和R5-CO-，其中R5选自由以下形成的基团：取代或未取代的C1-C24烷基，取代或未取代的C2-C24烯基，取代或未取代的C2-C24炔基，取代或未取代的C3-C24环烷基，取代或未取代的C5-C24环烯基，取代或未取代的C8-C24环炔基，取代或未取代的C6-C30芳基，取代或未取代的C7-C24芳烷基，取代或未取代的3至10元环的杂环基，以及取代或未取代的具有2至24个碳原子和1-3个碳以外的原子和1至6个碳原子的烷基链的杂芳基烷基；和
R2选自H，-NR3R4-，-OR3和-SR3，其中R3和R4独立地选自H，取代或未取代的非环状脂肪族基团，取代或未取代的脂环基，取代或未取代的杂环基，取代或未取代的杂芳基烷基，取代或未取代的芳基，以及取代或未取代的芳烷基。
9.根据权利要求8的肽，其特征在于，
AA1选自Lys、Arg和His的组；
AA2是任意氨基酸；
AA3选自Lys、Arg和His的组；和
AA4选自Phe、Tyr和Trp的组。
10.根据权利要求8或9所述的肽，其特征在于，
AA1选自Arg的组；
AA2是任意氨基酸；
AA3选自Arg的组；和
AA4选自Phe的组。
11.根据权利要求8至10中任一项所述的肽，其特征在于，式(II)的肽为：
R1-Arg-Arg-Arg-Phe-R2(R1-SEQ ID NO：10-R2)；和/或
R1-Arg-Met-Arg-Phe-R2(R1-SEQ ID NO：11-R2)。
12.根据权利要求8至11中任一项的肽，其特征在于式(II)的肽为：
Ac-Arg-Arg-Arg-Phe-NH2(Ac-SEQ ID NO：10-NH2)；和/或
Ac-Arg-Met-Arg-Phe-NH2(Ac-SEQ ID NO：11-NH2)。
13.包含根据权利要求1至12中任一项的肽的组合物。
14.根据权利要求1至12中任一项的肽或根据权利要求13的组合物，其用作药物。
15.根据权利要求1至12中任一项的肽或根据权利要求13的组合物，其用于预防和/或治疗神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍。
16.根据权利要求15的用途的肽或组合物，其特征在于神经元胞吐作用和/或肌肉收缩性障碍是老年性痴呆、阿尔兹海默氏相关性痴呆、AIDS相关性痴呆、癫痫、肌萎缩性硬化、多发性/侧索硬化、肥大细胞增多症、慢性偏头痛、张力失常和/或焦虑症。
17.根据权利要求15的用途的肽或组合物，其特征在于，所述肌肉收缩性障碍是肌强直、肌强直性营养不良、先天性肌强直、帕金森病、继发性帕金森症、亨廷顿病、痉挛状态或迟发性运动障碍(TD)。
18.根据权利要求1至12中任一项所述的肽或根据权利要求13所述的组合物作为化妆品用于预防、减少和/或消除受试者的皮肤老化和/或表情纹迹(sign)的用途。
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