CN114990089B - 微型内含肽Ssa DnaH及其在表达分离六肽-8中的应用 - Google Patents

微型内含肽Ssa DnaH及其在表达分离六肽-8中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种新的微型内含肽变体Ssa DnaH，来源于盐藻菌Synechocystis salina LEGE06155，其序列如SEQ ID No.1所示，编码DNA如SEQ ID No.2所示，并利用此内含肽构建了pET28a‑DnaH‑六肽‑8表达质粒及其原核表达载体。还公开了六肽‑8的表达分离方法。本发明利用全新的内含肽DnaH自切割系统，构建了简单的六肽‑8表达氨基酸序列和系统，能够高效表达和分离六肽‑8，降低六肽‑8的生产成本，这对六肽‑8在化妆品行业的发展具有重要的应用价值。

Description

微型内含肽Ssa DnaH及其在表达分离六肽-8中的应用
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域，特别涉及一种全新的微型内含肽DnaH，可应用于六肽-8的表达分离方法。
背景技术
微型内含肽具有良好的自切割特性，对于一些分子量低、难于纯化的寡肽具有良好的分离纯化功能，寻找全新的内含肽可以有效提高寡肽的生产及纯化效率。六肽-8是一种生物活性多肽，具有安全高效的抗皱祛皱功能。一系列的研究表明，六肽-8是一种优质的祛皱化妆品原料，其抗皱活性高，副作用小，已在各个化妆品品牌中得到应用。
由于六肽-8分子量小，面临分离提纯难、成本高、操作复杂等问题，阻碍了六肽-8的大批量生产应用。因此急需开发一种简单的、低成本的六肽-8的表达分离系统。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全新的微型内含肽Ssa DnaH，并将其应用于六肽-8的表达分离纯化，通过对六肽-8的表达分离纯化，验证了全新的内含肽DnaH具有良好的自切割能力，可降低六肽-8的生产成本。
为了达到上述目的，所采取的技术解决方案如下：
一种微型内含肽Ssa DnaH，来源于盐藻菌Synechocystis salina LEGE 06155的DNA解旋酶基因(DnaH,Sequence ID:MBE9174153.1)，截取其中的382-486和762-809的氨基酸片段，其序列如SEQ ID No.1所示。其编码DNA如SEQ ID No.2所示。
本发明还公开了一种DnaH-六肽-8融合蛋白，其序列如SEQ ID No.3所示，其编码DNA如SEQ ID No.4所示。
本发明还公开了一种pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒，表达上述的DnaH-六肽-8融合蛋白。
本发明还公开了上述的DnaH-六肽-8融合蛋白的原核表达载体。
优选的，原核表达载体是将上述的pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒转化到大肠杆菌宿主菌而成。
本发明还公开了一种六肽-8的表达分离方法，其特征在于其步骤包括：
(1)构建pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒；
(2)将pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌；选出阳性克隆；
(3)培养阳性克隆，诱导六肽-8的表达；
(4)分离纯化六肽-8。
优选的，步骤(1)中构建pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒的具体方法为：
A、以质粒pET28a为模板，以pET28a-F、pET28a-R为引物，扩增出pET28a外骨架；
B、合成DnaB-六肽-8片段；
C、将pET28a外骨架与DnaB-六肽-8片段连接，获得pET28a-DnaB-六肽-8表达质粒。
优选的，步骤C具体为将pET28a外骨架与DnaB-六肽-8片段按照摩尔比1：3混匀，利用无缝克隆试剂盒，50℃处理30min，冰浴2min获得pET28a-DnaB-六肽-8表达质粒。
优选的，步骤(4)中分离纯化六肽-8具体为：离心获取诱导表达后的菌体，菌体破碎，离心取上清液，上清液使用0.22μm水洗滤膜过滤，之后挂Ni柱纯化，浓缩之后加入pH6.0的50mM磷酸缓冲液，混匀后室温放置过夜，使用3KDa分子筛收集流穿液。
本发明对于现有技术的优点为：
本发明公开了一种新的微型内含肽Ssa DnaH，利用内含肽自切割系统，构建了简单的六肽-8表达氨基酸序列和系统，能够高效表达和分离六肽-8，降低六肽-8的生产成本，这对六肽-8在化妆品行业的发展具有重要的应用价值。
附图说明
图1为pET28a-DnaH-六肽-8载体构建示意图。
图2为大肠杆菌表达六肽-8诱导OD600优化结果。M：蛋白marker(40KDa)、泳道1:0.4(OD600)、泳道2：0.6(OD600)、泳道3：0.8(OD600)、泳道4：1(OD600)、泳道5：BL21(空载)。
图3为大肠杆菌表达六肽-8诱导温度优化结果。M：蛋白marker(40KDa)、泳道1:20℃、泳道2：25℃、泳道3：30℃、泳道4：37℃。
图4大肠杆菌表达六肽-8IPTG诱导浓度优化结果。M：蛋白marker(40KDa)、泳道1:0.1mM、泳道2：0.5mM、泳道3：1mM、泳道4：2mM、泳道5：5mM、泳道6：10mM。
图5大肠杆菌表达六肽-8诱导时间优化结果。M：蛋白marker(40KDa)、泳道1:2h、泳道2：3h、泳道3：4h、泳道4：5h、泳道5：6h、泳道6：7h、泳道7：8h。
图6HPLC检测六肽-8示意图。
具体实施方式
下面通过对一种六肽-8的表达分离系统构建及验证，对本发明做进一步说明，这些具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
pET28a-DnaH-六肽-8载体的构建
通过无缝克隆的方法，将pET28a外骨架与片段DnaH-六肽-8混匀，转入大肠杆菌BL21感受态中，进行筛选，包括如下步骤：
以本实验室保存的质粒pET28a为模板，分别通过特异性引物，扩增出pET28a外骨架。以大肠杆菌DH5α为模板，扩增出DnaH。以基因合成片段六肽-8，以DnaH和六肽-8为模板扩增出DnaH-六肽-8双拷贝片段。通过无缝克隆试剂盒，将pET28a外骨架与DnaH-六肽-8双拷贝片段按照摩尔比1：3比例混匀，在50℃水浴处理20min，涂布于LB(kanR),挑取阳性克隆子进行验证及测序。构建的质粒结构如图1所示。
所用引物如表1所示。
表1引物表
Figure BDA0003663895100000031
其他条件：上下引物各20pmol。PCR反应条件为98℃2min；98℃10s；55℃30s；72℃1min。
直接合成SEQ ID No.4所示的DnaH-六肽-8融合蛋白对应的编码DNA片段，然后连接到pET28a质粒上，形成pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒。
也可以采用PCR扩增的方法合成DnaB-六肽-8融合蛋白对应的编码DNA片段，然后连接到pET28a质粒上，形成pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒。
实施例2
大肠杆菌表达六肽-8诱导OD600条件优化
通过测序无误后，挑取pET28a-DnaH-六肽-8转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基，分别按照1％的比例加入10mL LB液体，待OD600分别至0.4、0.6、0.8、1时，加入IPTG至终浓度1mM，BL21(空载)为对照，全部放入摇床37℃220rpm诱导4h，分别离心取沉淀，SDS-PAGE进行验证。结果如图2所示，OD600为0.4时蛋白表达量最大。
实施例3
大肠杆菌表达六肽-8诱导温度优化
通过测序无误后，挑取pET28a-DnaH-六肽-8转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基，分别按照1％的比例加入10mL LB液体，以上一步的最佳诱导OD600条件下，加入IPTG至终浓度1mM，分别在20℃、25℃、30℃、37℃条件下，220rpm诱导4h。分别离心取沉淀，SDS-PAGE进行验证。结果如图3所示，30℃为最佳结果。
实施例4
大肠杆菌表达六肽-8IPTG诱导浓度优化
通过测序无误后，挑取pET28a-DnaH-六肽-8转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基，分别按照1％的比例加入10mL LB液体，以上一步的最佳诱导OD600、最佳诱导温度条件下，分别加入IPTG至终浓度为0.1mM、0.5mM、1mM、2mM、5mM、10mM，220rpm诱导4h。分别离心取沉淀，SDS-PAGE进行验证。结果如图4所示，1mM为最佳结果。
实施例5
大肠杆菌表达六肽-8诱导时间优化
通过测序无误后，挑取pET28a-DnaH-六肽-8转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基，分别按照1％的比例加入10mL LB液体，以上几步的最佳诱导OD600、最佳诱导温度以及最佳诱导IPTG浓度条件下，分别在220rpm诱导2h、3h、4h、5h、6h、7h、8h。分别离心取沉淀，SDS-PAGE进行验证。结果如图5所示，4h为最佳结果。
实施例6
DnaH-六肽-8自切割分离HPLC验证
pET28a-DnaH-六肽-8转化子接种于5mL LB含kanR抗性液体培养基，分别按照1％的比例加入50mL LB液体，以上几步的最佳诱导OD600、最佳诱导温度、最佳诱导IPTG浓度以及最佳诱导时间的条件下，进行六肽-8的表达，离心取沉淀，使用高压或者超声破碎菌体，离心，上清液使用0.22μm水洗滤膜过滤，之后挂Ni柱纯化。浓缩之后加入pH 6.0的50mM磷酸缓冲液，混匀后室温放置过夜，使用3KDa分子筛收集流穿液。HPLC进行检验。结果如图6所示。
序列表
<110> 广州市乾相生物科技有限公司
<120> 微型内含肽Ssa DnaH及其在表达分离六肽-8中的应用
<141> 2022-05-23
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 153
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Ile Ser Gly Asp Ser Leu Ile Ser Leu Ala Ser Thr Gly Lys Arg Val
1 5 10 15
Ser Ile Lys Asp Leu Leu Asp Glu Lys Asp Phe Glu Ile Trp Ala Ile
20 25 30
Asn Glu Gln Thr Met Lys Leu Glu Ser Ala Lys Ile Ser His Val Phe
35 40 45
Cys Thr Gly Lys Lys Met Val Tyr Thr Leu Lys Thr Arg Leu Gly Arg
50 55 60
Thr Ile Lys Val Thr Ala Asn His Arg Phe Leu Thr Ile Asp Gly Trp
65 70 75 80
Lys Arg Leu Asp Glu Leu Ser Leu Gln Glu His Ile Ala Val Pro Arg
85 90 95
Lys Leu Glu Ser Pro Ser Leu Gln Leu Ser Pro Glu Ile Glu Lys Leu
100 105 110
Ser Gln Ser Asp Ile Tyr Trp Asp Ser Ile Val Ser Ile Thr Glu Thr
115 120 125
Gly Val Glu Glu Val Phe Asp Leu Thr Val Pro Gly Pro His Asn Phe
130 135 140
Val Ala Asn Asp Ile Ile Val His Asn
145 150
<210> 2
<211> 459
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
atatctggag atagtttaat ttcactagct tccaccggca aacgtgttag catcaaggac 60
ttgctggacg agaaggactt cgagatctgg gcaattaatg aacagaccat gaaattggag 120
agcgcgaaaa tcagccacgt gttctgcacc ggcaagaaaa tggtgtatac ccttaagact 180
cgcctgggtc gtaccattaa ggtgaccgct aatcatcgtt ttctgacgat tgatggttgg 240
aaacgcctgg acgaactgtc tctgcaagag cacatcgccg tcccgcgtaa actggaatcc 300
ccaagcctgc agctctcacc ggaaatcgag aagttgtcgc aaagcgatat ctactgggat 360
agcatcgtgt ctattaccga aacgggcgtt gaagaggttt tcgatctgac cgttccgggt 420
ccgcataact ttgtcgcgaa cgacattatt gtgcacaac 459
<210> 3
<211> 167
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 3
His His His His His His His His Ile Ser Gly Asp Ser Leu Ile Ser
1 5 10 15
Leu Ala Ser Thr Gly Lys Arg Val Ser Ile Lys Asp Leu Leu Asp Glu
20 25 30
Lys Asp Phe Glu Ile Trp Ala Ile Asn Glu Gln Thr Met Lys Leu Glu
35 40 45
Ser Ala Lys Ile Ser His Val Phe Cys Thr Gly Lys Lys Met Val Tyr
50 55 60
Thr Leu Lys Thr Arg Leu Gly Arg Thr Ile Lys Val Thr Ala Asn His
65 70 75 80
Arg Phe Leu Thr Ile Asp Gly Trp Lys Arg Leu Asp Glu Leu Ser Leu
85 90 95
Gln Glu His Ile Ala Val Pro Arg Lys Leu Glu Ser Pro Ser Leu Gln
100 105 110
Leu Ser Pro Glu Ile Glu Lys Leu Ser Gln Ser Asp Ile Tyr Trp Asp
115 120 125
Ser Ile Val Ser Ile Thr Glu Thr Gly Val Glu Glu Val Phe Asp Leu
130 135 140
Thr Val Pro Gly Pro His Asn Phe Val Ala Asn Asp Ile Ile Val His
145 150 155 160
Asn Arg Arg Gln Met Glu Glu
165
<210> 4
<211> 501
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
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<210> 5
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
tcgccagaga tagcgtgatg gtgatgatga tgatgatggc tg 42
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
cgtcgtcaga tggaagaata actcgagcac caccaccacc accac 45

Claims (12)

1.一种微型内含肽Ssa DnaH，其特征在于其序列如SEQ ID No.1所示。
2.权利要求1所述的微型内含肽Ssa DnaH的编码DNA，其特征在于其序列如SEQ IDNo.2所示。
3.权利要求1所述的微型内含肽Ssa DnaH在表达分离六肽-8中的应用。
4.一种DnaH-六肽-8融合蛋白，其特征在于序列如SEQ ID No.3所示。
5.权利要求4所述的DnaH-六肽-8融合蛋白的编码DNA，其特征在于其序列如SEQ IDNo.4所示。
6.一种pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒，其特征在于表达权利要求4所述的DnaH-六肽-8融合蛋白。
7.含有权利要求4所述的DnaH-六肽-8融合蛋白的宿主菌。
8.根据权利要求7所述的宿主菌，其特征在于将权利要求6所述的pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒转化到大肠杆菌宿主菌而成。
9.一种六肽-8的表达分离方法，其特征在于其步骤包括：
（1）构建权利要求6所述的pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒；
（2）将pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒转化到大肠杆菌宿主菌；选出阳性克隆；
（3）培养阳性克隆，诱导六肽-8的表达；
（4）分离纯化六肽-8。
10.根据权利要求9所述的六肽-8的表达分离方法，其特征在于，步骤（1）中构建pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒的具体方法为：
A、以质粒pET28a为模板，以pET28a-F、pET28a-R为引物，扩增出pET28a外骨架；
B、合成DnaH-六肽-8片段；
C、将pET28a外骨架与DnaB-六肽-8片段连接，获得pET28a-DnaB-六肽-8表达质粒。
11.根据权利要求10所述的六肽-8的表达分离方法，其特征在于，步骤C具体为将pET28a外骨架与DnaH-六肽-8片段按照摩尔比1：3混匀，利用无缝克隆试剂盒，50℃处理30min，冰浴2min获得pET28a-DnaH-六肽-8表达质粒。
12.根据权利要求9所述的六肽-8的表达分离方法，其特征在于，步骤（4）中分离纯化六肽-8具体为：离心获取诱导表达后的菌体，菌体破碎，离心取上清液，上清液使用0.22 μm水洗滤膜过滤，之后挂Ni柱纯化，浓缩之后加入pH 6.0的50 mM磷酸缓冲液，混匀后室温放置过夜，使用3 KDa分子筛收集流穿液。
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