CN108218970B - 一种重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种重组蛋白及其制备方法和应用，具体涉及翡翠贻贝足丝蛋白基因的体外重组表达技术及其功能鉴定，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过转录组技术和蛋白质谱技术相结合的方法制备得到一个翡翠贻贝足丝重组蛋白Pvfp6，所述翡翠贻贝足丝重组蛋白Pvfp6的氨基酸分子量为13.25kDa，等电点为6.48，该重组蛋白对重金属离子Cd具有有效的富集作用，在治理重金属或是放射性污染的水体具有潜在的应用价值。

Description

一种重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种重组蛋白及其制备方法和应用，具体涉及翡翠贻贝足丝蛋白基因的体外重组表达技术及其功能鉴定。
背景技术
重金属是对生态环境危害极大地一类污染物，因其进入环境后不能被生物降解，而往往参与食物链循环并最终在生物体内积累，破坏生物体正常生理代谢活动，危害人体健康。重金属离子很难通过化学或是物理的方法去除或是被降解，尤其是在废水中低浓度的重金属离子，一些微生物、动物或植物对重金属毒性具有独特的抗性机制，使得利用它们清除水体中的重金属离子成为一种可行的方法。越来越多的研究表明，不同的金属结合蛋白(如MT和PC)，在生物忍耐和降解过量重金属毒性机制中起着重要作用。
尤其，金属硫蛋白(MTs)是一类低分子质量的富含半胱氨酸，能够有效富集重金属离子的蛋白质，它们通过半胱氨酸残基上的巯基与重金属结合形成无毒或低毒的络合物，从而清除重金属的毒害作用。CN 101781653 A公开了一种枣树金属硫蛋白基因及其在处理重金属污染重的应用，是实现生物回收重金属和质粒重金属污染的有效手段。
还有其他的蛋白也具有富集重金属的功能，CN 102924602 A公开了一种金离子吸附蛋白及富集并回收金离子的方法，该金离子吸附蛋白包含大肠杆菌外膜蛋白A片段和金离子结合蛋白GolB片段；或者包含金离子诱导蛋白片段和antigen43片段，该金离子吸附蛋白环境友好，不会对环境造成影响，能高效吸附多种重金属中的金离子。
翡翠贻贝是营足丝附着生活的滤食性双壳软体动物，因其摄食和附着的生活方式，体内容易富集重金属等污染物，能够反映所在水域的环境变化状况，被认为是最好的检测重金属污染指标的环境指示生物。
蒋臻等在“翡翠贻贝足丝粘附蛋白Pvfp-1粘附功能及其应用的研究”的博士论文中指出，应用基因工程方法获得翡翠贻贝足蛋白Pvfp-1及其几种缺失突变体。并分析对比这些缺失突变体的粘附功能，并进而探讨其粘附机理的基础上，设计合成了同样源于Pvfp-1序列的多肽。但其翡翠贻贝足蛋白Pvfp-1并没有富集重金属的能力。
翡翠贻贝能够分泌足丝，使其附着于礁石，营固着生活，而活体贻贝足丝具有较强的富集重金属离子或放射性物质的能力，离体的足丝通过变性处理以后，依然具有较强的富集能力。因此开展翡翠贻贝足丝富集重金属机制的研究，为治理重金属污染水体寻找更科学的途径，具有十分重要的理论与实践意义。
发明内容
针对目前存在的问题，本发明提供一种重组蛋白及其制备方法和应用，利用体外重组表达技术获得了翡翠贻贝足丝Pvfp6蛋白，该重组蛋白对重金属离子Cd具有有效的富集作用，在治理重金属或是放射性污染的水体具有潜在的应用价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种重组蛋白(Pvfp6蛋白)，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
所述SEQ ID NO.1(重组Pvfp6蛋白)所示的氨基酸序列如下：MISAVCIYFFLVGQIQAGVY IPYEKPGQCP VTRGITPCVC IPENFECRFD SNCPGAMKCC DFGCGCNKRC PPVPSPLQCYYNGQYYPIGA HFPSVDGCNT CYCNDDGTVM CTLKACGYGYK.
根据本发明，所述重组Pvfp6蛋白的分子量为13.25kDa，等电点为6.48。
第二方面，本发明提供一种DNA片段，其包含编码第一方面所述重组蛋白的核苷酸序列。
根据本发明，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述SEQ ID NO.2(重组Pvfp6蛋白)所示的核苷酸序列如下：ATGATAAGTGCAGTTTGTATATATTTCTTTCTAGTCGGCCAGATACAGGCTGGTGTATACATACCATTTGAAAAACCCGGACAGTGTCCAGTCACTCGCGGTATTACACCATGCGTTTGCATACCAGAAAACTCTGAATGCAGGTTTGATTCTAACTGTCCTGGAGCCATGAAGTGTTGTGATTTTGGATGTGGCTGCAATAAGAGATGTGTTCCACCAGTGCCATCGCCTTTACAATGTTATTACAATGGACAGTACTATCCTATCGGAGCTCATTTCCCGTCTGTTGATGGATGTAATACATGTTATTGCAACGATGATGGGACCGTTATGTGTACTCTTAAAGCATGTGGTTATGGATACAAA。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有至少一个拷贝的如第二方面所述的DNA片段。
第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞含有第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)根据翡翠贻贝足丝蛋白设计引物，以全合成的翡翠贻贝足丝蛋白基因为模板进行扩增；
(2)将步骤(1)扩增得到的基因片段克隆到载体中，构建重组质粒；
(3)将重组质粒转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，然后对重组大肠杆菌诱导表达，超声破碎收获重组蛋白，透析复性后得到具有活性的翡翠贻贝足丝重组蛋白。
根据本发明，步骤(1)所述引物为SEQ ID NO.3-4所示的序列。
上游引物如SEQ ID NO.3所示，下游引物如SEQ ID NO.4所示：
上游引物(P1)：5'-GGATCCGGTGTTTACATCCC-3'，(SEQ ID NO.3)；
下游引物(P2)：5'-CTCGAGTTTGTAACCGTAAC-3'，(SEQ ID NO.4)。
根据本发明，所述翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp6基因通过密码子优化编码翡翠贻贝足丝蛋白的编码区密码子，采用的密码子优化的方法本领域技术人员可以根据需要采用本领域公知的技术进行，在此不做特殊限定，本发明采用密码子在线优化网站(http://www.jcat.de/)对Pvfp6蛋白氨基酸序列进行密码子优化，再将优化后的翡翠贻贝足丝蛋白的编码区密码子发送到北京六合华大基因科技股份有限公司合成全基因。
根据本发明，步骤(1)所述的具体扩增的反应条件为：首先94℃预变性5分钟，再94℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。
优选地，步骤(2)所述基因片段克隆到载体中连接到BamHI和XhoI克隆位点。
根据本发明，所述的载体和宿主大肠杆菌都采用本领域常规的载体和宿主细胞，本领域技术人员可以根据需要选择不同的载体和宿主细胞，在此不做特殊限定，本发明采用pET32a(+)载体和BL21(DE3)-plysS表达菌株。
根据本发明，诱导表达、超声破碎、透析复性等操作手段本领域技术人员都可以根据需要采用本领域公知的技术进行，在此不做特殊限定。
第六方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组蛋白、如第二方面所述的DNA片段、如第三方面所述的表达载体、如第四方面所述的宿主细胞在富集重金属离子中的应用。
优选地，所述重金属离子为镉。
第七方面，本发明提供一种如第一方面所述的重组蛋白、如第二方面所述的DNA片段、如第三方面所述的表达载体、如第四方面所述的宿主细胞在治理重金属和/或放射性物质污染水体中的应用。
优选地，所述重金属离子为镉。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过转录组技术和蛋白质谱技术相结合的方法制备得到一个翡翠贻贝足丝重组蛋白Pvfp6，所述翡翠贻贝足丝重组蛋白Pvfp6的氨基酸分子量为13.25kDa，等电点为6.48，该重组蛋白对重金属离子Cd具有有效的富集作用，在治理重金属或是放射性污染的水体具有潜在的应用价值。
附图说明
图1为本发明重组蛋白SDS-PAGE电泳结果图；
图2为本发明采用47.7μg的重组蛋白产物对重金属Cd富集结果；其中，
Figure GDA0002983513500000051
表示重金属溶液起始浓度，
Figure GDA0002983513500000052
表示阴性对照(32a质粒蛋白)富集后剩余浓度，
Figure GDA0002983513500000053
表示重组Pvfp6蛋白富集后剩余浓度；
图3为本发明采用78.5μg的重组蛋白产物对重金属Cd富集结果，其中，
Figure GDA0002983513500000054
表示重金属溶液起始浓度，
Figure GDA0002983513500000055
表示阴性对照(32a质粒蛋白)富集后剩余浓度，
Figure GDA0002983513500000056
表示重组Pvfp6蛋白富集后剩余浓度。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实验材料
实验所用pET32a(+)质粒由Invitrogen公司提供；
MagExtractor His-Tag试剂盒由TOYOBO公司提供；
实验中的全基因合成和测序验证均由北京六合华大基因科技股份有限公司完成。
实施例1：制备重组蛋白
本发明的翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp6基因编码区体外原核重组表达，包括下列步骤：
1)重组载体的构建
(1)通过本发明采用采用密码子在线优化网站(http://www.jcat.de/)对翡翠贻贝足丝重组蛋白Pvfp6的氨基酸序列进行密码子优化，发送北京六合华大基因科技股份有限公司合成全基因；
(2)根据合成的翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp6基因设计引物：
上游引物P1(SEQ ID NO.3)：5’-GGATCCGGTGTTTACATCCC-3’，其中下划线部分为BamHI酶切位点；
下游引物P2(SEQ ID NO.4)：5’-CTCGAGTTTGTAACCGTAAC-3’，其中下划线部分为XhoI酶切位点；
以全合成的翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp6为模板，进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系如下：
Figure GDA0002983513500000071
反应条件如下：
Figure GDA0002983513500000072
所获得PCR产物进行1.5％的琼脂糖凝胶电泳鉴定并用胶回收试剂盒回收纯化。得到的翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp6的基因，其两端序列含有BamHI和XhoI酶切位点。
(3)再用BamHI和XhoI双酶切pET32a(+)表达载体和翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp6的基因，进行连接，得到重组载体；
(4)将重组载体转化DH5α感受态细胞，挑选阳性克隆进行测序验证。
2)重组蛋白的表达
(5)提取序列正确的重组表达载体质粒，转化到表达菌BL21(DE3)-plysS大肠杆菌中，得到含有所述翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp6基因序列的阳性表达菌；
具体地，本发明使用构建好的重组载体和空载体转化表达宿主菌，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑选单克隆，接种于50mL LB液体培养基中，37℃震荡摇床中培养12-16小时，然后以1：100的比例接种200mL LB液体培养基中，37℃培养至OD＝0.5-0.7后加入IPTG，使终浓度达到1mM，继续培养4小时。4℃，4000rpm，离心15分钟，收集菌体，于-20℃冻存备用。取200μL菌液离心，弃去上清后，加入25μL水和25μL 2×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10分钟，稍离心，SDS-PAGE电泳检测表达产物。
结果如图1所示，Pvfp(Perna viridis foot protein)，Pvfp 3，Pvfp 5，Pvfp 6分别表示三种类型的足丝蛋白；A-like(Antistasin-like protein)；63380是得到的新蛋白的序列ID号；32a表示的是pET32a表达载体；从蛋白电泳结果图可以确定，得到的是翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp 6，所述翡翠贻贝足丝蛋白Pvfp6的分子量为13kDa左右。
3)重组蛋白的纯化与复性
本发明中重组蛋白纯化采用的操作步骤如下：
将回收菌体超声破碎后离心，沉淀再用TritonX-100洗涤液洗涤，再次离心去除上清，沉淀加入6M盐酸胍，并调节pH到8.0，充分溶解沉淀后将溶解液过镍亲和层析树脂，使用低浓度咪唑洗涤杂蛋白后，再用高浓度咪唑洗脱，得到目的蛋白Pvfp6。洗脱的目的蛋白液经2mM的还原谷胱甘肽、0.2mM氧化谷胱甘肽，1mM EDTA、20mM Tris-HCL、50mM NaCl、10％甘油、1％甘氨酸透析复性。
用BCA法测得透析后重组Pvfp6蛋白的浓度为159μg/mL。
实施例2：重组Pvfp6蛋白的重金属Cd富集功能
重金属Cd离子的富集实验：配置浓度为40μg/L的CdCl2溶液。40μg/L浓度实验组，取相同量的阴性对照(32a质粒蛋白)和重组Pvfp6蛋白稀释至300μL，空白对照添加300μL纯水，共设置3个平行。添加蛋白1个小时以后进行重金属检测。
结果如图2所示，从图2可以看出，32a质粒蛋白和重组Pvfp6蛋白的浓度都有所下降，重组Pvfp6蛋白的浓度下降明显，结果表明：阴性对照组(32a质粒蛋白)对重金属Cd有一定的富集功能，重组Pvfp6蛋白对重金属富集具有极显著的功能。
实施例3：重组Pvfp6蛋白的重金属Cd富集功能
重金属Cd离子的富集实验：配置浓度为80μg/L的CdCl2溶液。80μg/L浓度实验组，取相同量的阴性对照(32a质粒蛋白)和重组Pvfp6蛋白稀释至500μL，空白对照添加500μL纯水，共设置3个平行。添加蛋白1个小时以后进行重金属检测。
结果如图3所示，从图3可以看出，32a质粒蛋白和重组Pvfp6蛋白的浓度都有所下降，重组Pvfp6蛋白的浓度下降明显，结果表明：阴性对照组(32a质粒蛋白)对重金属Cd有一定的富集功能，重组Pvfp6蛋白对重金属富集具有极显著的功能。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
<110> 华大基因科技
<120> 一种重组蛋白及其制备方法和应用
<130> 2016
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工合成序列
<400> 1
Met Ile Ser Ala Val Cys Ile Tyr Phe Phe Leu Val Gly Gln Ile Gln
1 5 10 15
Ala Gly Val Tyr Ile Pro Tyr Glu Lys Pro Gly Gln Cys Pro Val Thr
20 25 30
Arg Gly Ile Thr Pro Cys Val Cys Ile Pro Glu Asn Phe Glu Cys Arg
35 40 45
Phe Asp Ser Asn Cys Pro Gly Ala Met Lys Cys Cys Asp Phe Gly Cys
50 55 60
Gly Cys Asn Lys Arg Cys Pro Pro Val Pro Ser Pro Leu Gln Cys Tyr
65 70 75 80
Tyr Asn Gly Gln Tyr Tyr Pro Ile Gly Ala His Phe Pro Ser Val Asp
85 90 95
Gly Cys Asn Thr Cys Tyr Cys Asn Asp Asp Gly Thr Val Met Cys Thr
100 105 110
Leu Lys Ala Cys Gly Tyr Gly Tyr Lys
115 120
<210> 2
<211> 366
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 2
atgataagtg cagtttgtat atatttcttt ctagtcggcc agatacaggc tggtgtatac 60
ataccatttg aaaaacccgg acagtgtcca gtcactcgcg gtattacacc atgcgtttgc 120
ataccagaaa actctgaatg caggtttgat tctaactgtc ctggagccat gaagtgttgt 180
gattttggat gtggctgcaa taagagatgt gttccaccag tgccatcgcc tttacaatgt 240
tattacaatg gacagtacta tcctatcgga gctcatttcc cgtctgttga tggatgtaat 300
acatgttatt gcaacgatga tgggaccgtt atgtgtactc ttaaagcatg tggttatgga 360
tacaaa 366
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 3
ggatccggtg tttacatccc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成序列
<400> 4
ctcgagtttg taaccgtaac 20

Claims (10)

1.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种DNA片段，其特征在于，其包含编码权利要求1所述重组蛋白的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的DNA片段，其特征在于，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有至少一个拷贝的如权利要求2或3所述的DNA片段。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体。
6.一种如权利要求1所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据翡翠贻贝足丝蛋白设计引物，以全合成的翡翠贻贝足丝蛋白基因为模板进行扩增；
(2)将步骤(1)扩增得到的基因片段克隆到载体中，构建重组质粒；
(3)将重组质粒转化大肠杆菌，得到重组大肠杆菌，然后对重组大肠杆菌诱导表达，超声破碎收获重组蛋白，透析复性后得到具有活性的翡翠贻贝足丝重组蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述引物为SEQ ID NO.3-4所示的序列。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述基因片段克隆到载体中连接到BamH I和XhoI克隆位点。
9.一种如权利要求1所述的重组蛋白、如权利要求2或3所述的DNA片段、如权利要求4所述的表达载体、如权利要求5所述的宿主细胞在富集重金属离子中的应用；
所述重金属离子为镉。
10.一种如权利要求1所述的重组蛋白、如权利要求2或3所述的DNA片段、如权利要求4所述的表达载体、如权利要求5所述的宿主细胞在治理重金属污染水体中的应用；
所述重金属为镉。
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Accelerating the design of biomimetic materials by integrating RNA-seq with proteomics and materials science;Paul A Guerette et al;《Nature biotechnology》;20130908;第31卷(第10期);908-915 *

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