发明内容
本发明的目的在于提供一种金离子吸附蛋白,其包含大肠杆菌外膜蛋白A片段和金离子结合蛋白GolB片段。
所述大肠杆菌外膜蛋白A片段的DNA序列如SEQ ID NO:3所示;所述金离子结合蛋白GolB片段的DNA序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地,所述金离子吸附蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
本发明还提供上述的金离子吸附蛋白的制备方法,其特征在于,主要包含步骤:
1)从大肠杆菌基因组DNA中扩增出编码大肠杆菌外膜蛋白A片段的DNA序列;
2)从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA中扩增出编码金离子结合蛋白GolB片段的DNA序列;
3)以步骤1)和2)的扩增产物为模板,扩增出编码OmpA-GolB融合蛋白的DNA序列;
4)将步骤3)的扩增产物连接到表达载体上,转化到宿主菌进行表达,即获得所述的金离子吸附蛋白。
上述制备方法中,步骤1)中进行扩增时使用SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2所示的引物;步骤2)中进行扩增时使用SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的引物;步骤3)中进行扩增时使用SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5所示的引物。
上述制备方法中,步骤1)所述大肠杆菌外膜蛋白A片段的DNA序列如SEQ ID NO:3所示,步骤2)所述金离子结合蛋白GolB片段的DNA序列如SEQ ID NO:6所示,步骤3)所述金离子吸附蛋白的DNA序列如SEQ ID NO:7所示。
上述制备方法中,步骤4)所述表达载体为pBAD大肠杆菌表达载体。
本发明还提供一种表达上述的金离子吸附蛋白的宿主菌,该宿主菌优选为含pBAD表达载体的大肠杆菌。
本发明还提供另外一种金离子吸附蛋白,其包含金离子诱导蛋白片段和antigen43片段(SEQ ID NO:11所示)。
所述金离子诱导蛋白片段的DNA序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明还提提供上述的金离子吸附蛋白的制备方法,其主要包含步骤:
1)从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA中扩增出编码金离子诱导蛋白片段的DNA序列;
2)使用DNA限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切步骤1)的扩增产物,并将酶切片段连接到含有antigen43基因的表达载体上,转化到宿主菌进行表达,即获得所述的金离子吸附蛋白。
上述制备方法中,步骤1)中进行扩增时使用SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9所示的引物;步骤2)所述表达载体为含有antigen43基因的pSB1C3大肠杆菌表达载体。
本发明还提供一种表达上述另外一种金离子吸附蛋白的宿主菌,该宿主菌为含pSB1C3表达载体的大肠杆菌。
本发明还有一个目的是提供一种应用上述的两种宿主菌富集并回收废水中的金离子的方法,其主要包含步骤:
1)培养表达上述第一种金离子吸附蛋白的第一宿主菌;
2)培养表达上述第二种金离子吸附蛋白的第二宿主菌;
3)将步骤1)培养的第一宿主菌加入到含金离子的废水中,加入诱导剂并充分混合,静置;
4)将步骤2)培养的第二宿主菌加入步骤3)所得的混合液中,当水体中底部产生沉淀后,过滤水体,回收吸附有金离子的菌体;
5)用酶制剂处理步骤4)回收的菌体,分离得到回收的金离子;
6)处理后的菌体作为菌种循环使用,重复步骤1)至5)。
根据上述的方法,步骤3)所述的诱导剂优选是阿拉伯糖;步骤5)所述的酶制剂为木瓜蛋白酶。
本发明所述金离子吸附蛋白能够克服现有技术的三个缺点。首先,菌体在吸附金离子之后能够自动聚沉,可以通过过滤等方法回收,不会造成二次污染。第二,本发明是针对重金属性质相近的特点,选择了可高效特异吸附金离子的模型,其在存在多种重金属离子时仍能高效吸附金离子。最后,本发明是环境友好型的,不会造成环境的影响。另外,菌体采用的是非致病性的大肠杆菌,既不会对人体造成影响,甚至在自然环境下也难以生存,所以不会造成微生物污染。另外,传统的离子交换法和膜过滤法等等进行比较,本发明具备价格便宜,操作方便等的优点。
为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂,下文特举较佳实施例,并配合附图,作详细说明如下。
具体实施方式
实施例1OmpA-GolB融合蛋白的构建及鉴定
1.大肠杆菌外膜蛋白A(OmpA)片段的基因扩增
根据所需扩增目的DNA序列和碱基互配原理,设计特异引物Ompa1(SEQ ID NO:1)和Ompa2(SEQ ID NO:2),从大肠杆菌基因组DNA(NCBI中的引用位置:NC_000913)中扩增出编码大肠杆菌外膜蛋白A(OmpA)第1位至第159位氨基酸的DNA序列(SEQ ID NO:3)。
反应条件如下:
PCR反应体系: 50μl
ddH2O: 36μl
10X Pfu DNA聚合酶缓冲液: 5μl
10mM dNTP: 1μl
正向引物Ompa1 1μl
反向引物Ompa2 1μl
Pfu DNA聚合酶: 1μl
DNA模板: 5μl
PCR条件:
第一步95℃2分钟
第二步95℃0.5分钟
第三步63℃0.5分钟
第四步72℃0.5分钟
第五步重复第二步至第四步,29个循环
第六步72℃10分钟
第七步4℃保温。
回收PCR产物,备用。
2.金离子结合蛋白GolB片段的基因扩增
根据所需扩增目的DNA序列和碱基互配原理,设计特异引物Golb1(SEQ ID NO:4)和Golb2(SEQ ID NO:5)从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA(NCBI中的引用位置:NC_003197)中扩增出编码金离子结合蛋白GolB的DNA序列(SEQ ID NO:6),并在其C端加上编码FLAG-tag的序列:
反应条件如下:
PCR反应体系: 50μl
ddH2O: 36μl
10X Pfu DNA聚合酶缓冲液:5μl
10mM dNTP: 1μl
正向引物Golb1 1μl
反向引物Golb2 1μl
Pfu DNA聚合酶: 1μl
DNA模板: 5μl
PCR条件:
第一步95℃2分钟
第二步95℃0.5分钟
第三步60℃0.5分钟
第四步72℃0.5分钟
第五步重复第二步至第四步,29个循环
第六步72℃10分钟
第七步4℃保温
回收PCR产物,备用。
3.OmpA-GolB融合蛋白的基因扩增
使用特异引物Ompa1(SEQ ID NO:1)和Golb2(SEQ ID NO:5)以上述第1和2点回收的PCR产物为模板,采用重叠PCR扩增出编码用于大肠杆菌表面展示的OmpA-GolB融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO:7):
反应条件如下:
PCR反应体系: 50μl
ddH2O: 36μl
10X UltraII DNA聚合酶缓冲液: 5μl
10mM dNTP: 1μl
正向引物Ompa1 1μl
反向引物Golb2 1μl
UltraII DNA聚合酶: 1μl
DNA模板:OmpA PCR产物 0.5μl
GolB PCR产物 0.5μl
PCR条件:
第一步95℃2分钟
第二步95℃0.5分钟
第三步60℃0.5分钟
第四步72℃0.5分钟
第五步重复第二步至第四步,29个循环
第六步72℃10分钟
第七步4℃保温
回收PCR产物,备用。
4.OmpA-GolB融合蛋白表达质粒的构建及鉴定
1)使用DNA限制性内切酶NcoI和HindIII酶解上述第3点中得到的DNA片段(即SEQ ID NO:7),然后使用T4DNA连接酶插入含有可由阿拉伯糖诱导启动的araBAD启动子的大肠杆菌表达载体pBAD(由北京大学生命科学学院昌增益教授实验室葛曦博士馈赠)中,OmpA-GolB融合蛋白表达质粒构建图谱请详见图1。
反应条件:
37℃水浴10小时。
反应条件:
16℃水浴16小时。
2)OmpA-GolB融合蛋白表达质粒的提取与鉴定,结果请见图2。
实施例2Antigen43-金离子诱导基因(Gold inductive gene withantigen43)融合蛋白表达质粒的构建及鉴定
1.金离子诱导基因的扩增
使用特异引物pGolts1(SEQ ID NO:8)和pGolb2(SEQ ID NO:9)从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA(NCBI中的引用位置:NC_003197)中扩增出编码Gold inductive gene的DNA序列(SEQ ID NO:10)。
反应条件如下:
PCR反应体系: 50μl
ddH2O: 36μl
10X Pfu DNA聚合酶缓冲液:5μl
10m MdNTP: 1μl
正向引物pGolts1 1μl
反向引物pGolb2 1μl
Pfu DNA聚合酶: 1μl
DNA模板: 5μl
PCR条件:
第一步95℃ 3分钟
第二步95℃ 1分钟
第三步60℃2分钟
第四步72℃4分钟
第五步重复第二步至第四步,29个循环
第六步72℃10分钟
第七步4℃保温
回收PCR产物,备用。
2.Antigen43-金离子诱导基因(Gold inductive gene with antigen43)融合蛋白表达质粒的构建与鉴定
1)使用DNA限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切上述第1点得到的DNA片段(SEQ ID NO:10),然后使用T4DNA连接酶插入含有antigen43基因的大肠杆菌表达载体pSB1C3(由2010iGEM大赛总部馈赠)中,Antigen43-金离子诱导基因融合蛋白表达质粒构建图谱请详见图3。
反应条件:
37℃水浴10小时。
反应条件:
16℃水浴16小时。
2)Antigen43-金离子诱导基因融合蛋白表达质粒的提取与鉴定,结果请见图4。
实施例3OmpA-GolB融合蛋白、Antigen43-金离子诱导基因(Goldinductive gene with antigen43)融合蛋白转入宿主菌及宿主菌的培养
1.OmpA-GolB融合蛋白转入宿主菌
1)将用于表达OmpA-GolB融合蛋白的质粒通过化学转化方法导入大肠杆菌细胞DH10b中,通过在含有氨苄青霉素(50μg mL-1)的LB固体培养基上于37℃中培养16小时,从中筛选出阳性克隆并加以保存。
感受态细胞的热激转化和稀释涂布步骤如下:
①将连接反应的产物于感受态细胞(DH10b)中,手指轻弹混匀;
②冰浴30分钟后42℃热激95秒,快速转移至冰上;
③冰浴2分钟后每管加入事先37℃预热好的LB培养基900μl,37℃,200rpm培养1小时使其复苏;
④3000rpm离心30秒,移去0.9ml上清后,取下层0.1ml涂布相应的抗性平板,37℃培养10小时。
2)重组菌的筛选和鉴定
采用常规菌落PCR法和抽提阳性克隆的质粒后酶切鉴定法,具体可参见《TAKARA限制性内切酶采购目录和技术指南》。测序由上海生物工程技术服务公司完成。OmpA-GolB融合蛋白表达质粒测序图谱请见图5。
2.Antigen43-金离子诱导基因(Gold inductive gene with antigen43)融合蛋白转入宿主菌
1)将用于表达Antigen43-金离子诱导基因(Gold inductive gene withantigen43)融合蛋白的质粒通过化学转化方法导入大肠杆菌细胞DH10b中,通过在含有氯霉素(34μg mL-1)的LB固体培养基上于37℃中培养16小时,从中筛选出阳性克隆并加以保存。
感受态细胞的热激转化和稀释涂布步骤如下:
①将连接反应的产物于感受态细胞(DH10b)中,手指轻弹混匀;
②冰浴30分钟后42℃热激95s,快速转移至冰上;
③冰浴2分钟后每管加入事先37℃预热好的LB培养基900μl,37℃,200rpm培养1小时使其复苏;
④3000rpm离心30秒,移去0.9ml上清后,取下层0.1ml涂布相应的抗性平板,37℃培养10小时。
2)重组菌的筛选和鉴定
采用常规菌落PCR法和抽提阳性克隆的质粒后酶切鉴定法,具体可参见《TAKARA限制性内切酶采购目录和技术指南》。测序由上海生物工程技术服务公司完成。Antigen43-金离子诱导基因融合蛋白表达质粒测序图谱请见图6。
3.诱导培养
1)将用于表达OmpA-GolB融合蛋白的大肠杆菌菌种接入适量含有氨苄青霉素(50μg mL-1)的LB液体培养基中于37℃中培养过夜;将过夜培养菌液1∶100稀释入适量含有氨苄青霉素(50μg mL-1)LB液体培养基中于37℃中培养至培养液OD600=0.6,向培养液中加入终浓度为0.002%的阿拉伯糖进行诱导,培养液在37℃中继续培养过夜。
2)将用于表达Antigen43-金离子诱导基因(Gold inductive gene withantigen43)融合蛋白的大肠杆菌菌种接入适量含有氯霉素(34μg mL-1)的LB液体培养基中于37℃中培养过夜;将过夜培养菌液1∶100稀释入适量含有氯霉素(34μg mL-1)LB液体培养基中于37℃中培养过夜。
实施例4OmpA-GolB融合蛋白的金离子吸附能力的检测
1.将用于表达OmpA-GolB融合蛋白的大肠杆菌菌种接入适量含有氨苄青霉素(50μg mL-1)的LB液体培养基中于37℃中培养过夜;将过夜培养菌液1∶100稀释入适量含有氨苄青霉素(50μg mL-1)LB液体培养基中于37℃中培养至培养液OD600=0.6,向培养液中同时加入终浓度为0.002%的阿拉伯糖和终浓度为50μM的金离子进行诱导培养和金离子吸附,培养液在37℃中继续培养过夜;
2.培养过夜的细菌培养液通过离心(8000转/分钟,10min)收集后,用去离子水清洗至少3次;
3.清洗后的菌体经过真空冻干成粉末状固体,称重;
4.采用ICP-AES标准流程灰化消解后,通过电感偶和等离子体发射光谱仪对金离子结合情况进行检测。
具体检测结果请见图7,与未经改造的对照菌株相比,其对水体中金离子的吸附能力提高了近12倍,达到干重每克菌体可吸附金约2.4毫克。
实施例5菌体的分离和金离子的回收
1.吸附有金离子的大肠杆菌工程菌体细胞可通过离心(8000转/分钟,10min)的方式,从液体中分离获得;
2.从吸附有金离子的大肠杆菌工程细胞回收金离子,将离心分离得到的大肠杆菌工程菌体细胞重悬于适量含有5mg mL-1木瓜蛋白酶Papain的PBS(pH 7.4)缓冲溶液中,反应液于30℃反应3小时;
3.经过木瓜蛋白酶处理后的反应液通过离心(8000转/分钟,10min),将液体上清与可循环使用的大肠杆菌工程菌体细胞分离开来。液体上清中含有从菌体细胞上回收得到的金离子。
采用酶降解法对吸附有金离子的菌体进行处理后,金(离子)的有效回收效率可达到近40%(图8A-8B)。其在存在多种重金属离子时仍能高效吸附金离子(图9)。
实施例6金离子诱导表达Antigen43-金离子诱导基因(Gold inductivegene with antigen43)融合蛋白的大肠杆菌菌体沉聚的检测方法
1.将用于表达Antigen43-金离子诱导基因(Gold inductive gene withantigen43)融合蛋白的大肠杆菌菌种接入适量含有氯霉素(34μg mL-1)的LB液体培养基中于37℃中培养过夜;将过夜培养菌液1∶100稀释入适量含有氯霉素(34μg mL-1)LB液体培养基中于37℃中培养过夜;
2.将培养过夜的菌体用磷酸缓冲液(PBS pH 7.4)重新悬浮均匀,至OD600=1.00,加入终浓度为0.15mM的氯化钠,充分混匀;
3.向反应液中加入终浓度为50μM的金离子,随着时间的增加,反应液中的菌体会聚集沉淀下来。
本发明基于一系列能够和金离子特异结合的MerR家族蛋白:GolS和GolB蛋白,其中在宿主菌中,GolB蛋白的表达还可以通过GolS蛋白来进行调控。通过上述的示例性实施例,将GolB蛋白与细胞外膜表达蛋白相融合,并在前端加入araBAD的启动子,连接到质粒中后导入非致病性的大肠杆菌细胞体内,使得融合蛋白能够在微量阿拉伯糖的诱导下大量表达,该种蛋白的特点是能够在细菌的外膜表面上实现对金离子的高效特异性结合。因此该种经过改造后的工程菌对金离子的吸附效果很好,而且经过回收处理的菌体还可以作为菌种进行二次循环利用,其吸附效率与处理前没有显著差异。另一方面,利用GolS蛋白和antigen43抗体蛋白结合,并在两者之间加入了GolB蛋白的启动子,使得这个抗体蛋白也能够在金离子的诱导下表达使得菌体聚沉。
这样,将上述两者相结合的工程菌可以作含金工业废水的处理用:将菌液加入到废水中,在诱导剂的诱导下,菌体能够在细胞膜外大量表达GolB蛋白,将废水中的金离子结合。随后,在完成金离子的结合吸附后,细菌还能通过表达antigen43蛋白,自主性地聚集和沉淀,方便对菌体的回收。通过对菌体的酶处理和二次使用,本项发明最终能够通过生物手段实现对工业废水中重金属——金的可循环富集和回收。
虽然本发明已以较佳实施例披露如上,然其并非用以限定本发明,任何所属技术领域的技术人员,在不脱离本发明之精神和范围内,当可作些许之更动与改进,因此本发明之保护范围当视权利要求所界定者为准。