CN110591992B

CN110591992B - 一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌及其构建和应用

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Publication number: CN110591992B
Application number: CN201910789981.5A
Authority: CN
Inventors: 吴银宝; 温馨; 王燕; 廖新俤; 曹俊超; 徐蒋然
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2039-08-26
Also published as: CN110591992A

Abstract

本发明公开一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌及其构建和应用，涉及生物工程技术领域。本发明构建的基因工程菌ETD‑1能高效降解四环素类抗生素强力霉素，在2d内对50mg/L强力霉素的降解达95.0±1.0％，在3天后强力霉素基本降解完全。相比于空载菌组和空白组，ETD‑1表达的灭活酶基因tetX 7d对强力霉素的降解率提高了25.6％和22.0％，在降解过程中无抗性基因污染风险，与传统化学降解、物理吸附和微生物修复相比较具有安全高效、适应性强、节能环保等优点，不会对环境造成抗性传播等不良影响，可广泛应用于生物修复和生态恢复工程。

Description

一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌及其构建和应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌及其构建和应用。

背景技术

随着医疗和养殖业的发展，抗生素的使用量越趋增加，使得抗生素在环境中的残留普遍存在。其中四环素类抗生素由于其价格低廉和广谱抗菌等特点，被广泛应用，四环素类抗生素主要包括金霉素(Chlortetracycline)、土霉素(Oxytocin)、强力霉素(Doxycycline)等。由于四环素类抗生素在动物体内的代谢率低，大部分随排泄进入环境中，使得环境中常被检出四环素类抗生素的残留。在环境中残留的抗生素会对环境中的微生物形成胁迫，使得微生物具有抗生素抗性，对人畜卫生健康造成威胁。因此寻求一种高效、安全的方法去除这一类环境污染物显得尤为重要。

强力霉素是由土霉素加工制成的一种长效广谱的第二代四环素类抗生素，在长期的治疗实践中被广泛应用于畜禽养殖业，由此导致的环境残留问题日益严重。由于强力霉素具有长效广谱的抗菌活性，因此利用微生物降解环境中残留的强力霉素具有挑战性。利用传统的物理化学方法去除抗生素污染效率低，安全性差，而微生物降解抗生素可能存在抗性传播的风险。因此，采用生物工程技术构建一种能高效降解四环素类抗生素又能避免抗性传播基因工程菌具有重要意义。四环素类灭活酶基因tetX是编码表达的一种含388个氨基酸、分子量为43.7kDa，在O₂和NADPH条件下能使所有的四环素类抗生素失去抗菌活性。以tetX为目的片段，构建一株高效降解四环素类抗生素的基因工程菌，可表达灭活四环素类抗生素的灭活酶，降低微生物修复抗生素污染过程中的抗性传播风险，可广泛应用于生物修复和生态恢复工程。

发明内容

为了克服现有技术中微生物降解抗生素过程的抗性传播风险，物理化学降解抗生素效率低等的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌。

本发明的另一目的在于提供上述高效降解四环素类抗生素的基因工程菌的构建方法。

本发明的再一目的在于提供上述高效降解四环素类抗生素的基因工程菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌，名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ETD-1，是将四环素类灭活酶tetX基因片段与pET28a载体连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)获得的，命名为ETD-1。

所述的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ETD-1的保藏信息：保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏日期：2018年07月05日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC NO：16060。

优选的，所述的灭活酶tetX基因片段编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述的灭活酶tetX基因片段的序列如SEQ ID NO：1所示。

优选的，本发明提供的一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

(1)以埃希氏杆菌(Escherichia sp.)基因组为模板，选取各带有BamHⅠ和NdeⅠ限制性内切酶的酶切位点的两个特异引物对四环素类灭活酶tetX基因进行PCR扩增，引物的核苷酸序列如下，下划线表示为BamHⅠ和NdeⅠ两个限制性内切酶的酶切位点序列；

上游引物F：5′-CGCGGATCCATGACAATGCGAATAGATACAG-3′；

下游引物R：5′-CCGCATATGTTATACATTTAACAATTGCT-3′；

(2)将PCR产物与pET28a载体分别用BamHⅠ和NdeⅠ进行双酶切，然后再酶连过夜，得到重组质粒pET28a-tetX；

(3)将重组质粒pET28a-tetX用热激转化到感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，然后在含有卡那霉素的培养基进行筛选，最后通过PCR和测序技术鉴定为含tetX基因的阳性重组子，即得到基因工程菌ETD-1，即大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ETD-1。

优选的，步骤(2)中所述的酶连过夜的条件为在37±1℃条件下酶连过夜。

优选的，步骤(3)中所述的含有卡那霉素的培养基为含有50～100μg/mL卡那霉素的LB培养基，进一步优选为含有50μg/mL卡那霉素的LB培养基；

进一步的，基因工程菌ETD-1诱导表达灭活酶tetX的检测，包括以下步骤：

(1)基因工程菌ETD-1以0.5～2％(优选为1％)接种于LB肉汤培养基中，在25～40℃、150～250r/min(优选37℃、180r/min)条件下培养，当菌体繁殖到菌体密度OD₆₀₀为0.4～0.6(优选为0.5)时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)进行诱导表达，在16℃～37℃(优选为37℃)下继续诱导表达培养2～12h(优选为8～10h，进一步优选为8h)分别取样以备SDS-PAGE检测；

(2)收集经诱导的基因工程菌ETD-1菌体与细菌裂解液(含1mmol/L PMSF和100μg/mL溶菌酶)按1：10的体积比混合，重悬菌体沉淀，冰上孵育20～40min(优选为30min)，并轻柔涡旋裂解细胞，冰浴中超声破碎，超声20～60min(优选为30min)至菌体完全破碎，冷冻离心，获得蛋白裂解上清液和沉淀物，将蛋白裂解上清液经Ni-IDA柱层析分离和PD-10脱盐柱脱盐，获得纯化的灭活酶tetX蛋白，经Western Blot检测。

优选的，所述的超声破碎的条件是功率650W，频率20～25kHz；

优选的，所述的冷冻离心的条件为在4℃、10,000r/min条件下离心30min；

进一步，本发明还提供一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌ETD-1在降解四环素类抗生素中的应用。

优选的，所述的高效降解四环素类抗生素的基因工程菌ETD-1在降解四环素类抗生素强力霉素中的应用。

优选的，所述的应用方法，包括如下步骤：

基因工程菌ETD-1以0.5～2％(优选为1％)接种于LB肉汤培养基中，在25～40℃、150～250r/min(优选37℃、180r/min)条件下培养，当菌体繁殖到菌体密度OD₆₀₀为0.4～0.6(优选为0.5)时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)进行诱导表达，在16℃～37℃(优选为37℃)下继续诱导表达培养2～12h(优选为8～10h，进一步优选为8h)后，加入强力霉素，在25～40℃、150～250r/min(优选37℃、180r/min)条件下培养，获得四环素类抗生素减少且无抗性基因增加的培养液，实现安全降解四环素类抗生素的目的。

优选的，所述的强力霉素的加入量为10～50mg/L；进一步优选为50mg/L；

加入强力霉素后，培养的时间为48～168h；优选为48～72h。

进一步，本发明还提供一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌ETD-1在诱导表达灭活酶tetX降解四环素类抗生素中的应用。

优选的，所述的高效降解四环素类抗生素的基因工程菌ETD-1在诱导表达灭活酶tetX降解四环素类抗生素强力霉素中的应用。

优选的，所述的应用方法，包括以下步骤：

(1)将基因工程菌ETD-1按0.5～2％(优选为1％)的体积比转接于LB肉汤培养基中，25～40℃、150～250r/min(优选37℃、180r/min)振摇培养，当OD₆₀₀值达到0.4～0.6(优选为0.5)时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在16～37℃(优选为37℃)条件下诱导表达，取菌液离心收集菌体，用PBS洗涤菌体；

优选的，所述的诱导表达的时间为2～12h；进一步优选为8～10h；更进一步优选为8h。

优选的，所述的离心的条件为经3,000～6,000r/min离心3～8min；更优选为经5,000r/min离心6min。

优选的，所述的洗涤菌体的次数为1～3次，进一步优选为3次。

(2)将离心收集的菌体与细菌裂解液(含1mmol/L PMSF和100μg/mL溶菌酶)按1：10的体积比混合，重悬菌体沉淀，冰上孵育20～40min(优选为30min)，并轻柔涡旋裂解细胞，冰浴中超声破碎，超声20～60min(优选为30min)至菌体完全破碎，冷冻离心，获得蛋白裂解上清液，取蛋白裂解上清液过滤；

优选的，所述的超声破碎的条件是功率650W，频率20～25kHz；

优选的，所述的过滤条件为过0.22μm滤膜；

(3)过滤去除杂质得到的滤液为基因工程菌ETD-1的胞内酶，用PBS补足至与步骤(1)的菌液体积相同的反应体系，加入强力霉素，pH值为7.2，在25～40℃、150～250r/min(优选37℃、180r/min)条件下振荡反应，获得四环素类抗生素减少且无抗性基因增加的培养液，实现安全降解四环素类抗生素的目的。

优选的，所述的强力霉素在反应体系中的终浓度为10～50mg/L；进一步优选为50mg/L。

优选的，所述的振荡反应的时间为24～168h；优选为96～168h。

优选的，所述的应用方法，包括以下步骤：

取上述基因工程菌ETD-1的胞内酶，按照硫酸铵分级沉淀表，分别提取出对应0％～30％、30％～35％、35％～40％、40％～45％、45％～50％、50％～55％、55％～60％、60％～70％、70％～80％硫酸铵饱和度的分级酶；将分级酶加入到PBS缓冲液中至基因工程菌ETD-1的胞内酶2倍体积，加入强力霉素，pH值为7.2，在37℃、180r/min条件下振荡反应，对强力霉素进行酶促降解。

优选的，所述的分级酶与基因工程菌ETD-1的胞内酶的体积比为1：10；

优选的，所述的强力霉素终浓度为10～50mg/L；进一步优选为10mg/L。

优选的，所述的酶促降解的时间为48～120h；进一步优选为96～120h。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明构建的基因工程菌ETD-1能高效降解四环素类抗生素强力霉素，在2d内对50mg/L强力霉素的降解达95.0±1.0％，在3天后强力霉素基本降解完全。相比于空载菌组和空白组，ETD-1表达的灭活酶基因tetX 7d对强力霉素的降解率提高了25.6％和22.0％，在降解过程中无抗性基因污染风险，与传统化学降解、物理吸附和微生物修复相比较具有安全高效、适应性强、节能环保等优点，不会对环境造成抗性传播等不良影响，可广泛应用于生物修复和生态恢复工程。

附图说明

图1是不同温度诱导条件下灭活酶基因tetX表达蛋白的SDS-PAGE检测结果图；其中A图和B图分别为16℃及37℃下诱导表达结果，泳道1～7分别为诱导表达0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h的菌液。

图2是灭活酶基因tetX表达蛋白的Western blot检测结果图；其中，泳道1～6分别为诱导表达0h、2h、4h、6h、8h、10h的菌液，7和8分别为超声破碎诱导表达8h的蛋白裂解上清液和沉淀物。

图3是基因工程菌ETD-1对强力霉素的降解效果图。

图4是基因工程菌ETD-1的胞内酶对强力霉素的降解效果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例中的方法，如无特殊说明，都为常规方法；使用的基因组抽提、质粒抽提、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按照说明书进行。

埃希氏杆菌(Escherichia sp.)来源见文献：Wen X,Wang Y,Zou Y,Ma B,Wu Y.Noevidential correlation between veterinary antibiotic degradation ability andresistance genes in microorganisms during the biodegradation ofdoxycycline.ECOTOX ENVIRON SAFE,2018,147:759～766.

实施例1：高效降解四环素类抗生素的基因工程菌的构建

本发明提供的一种高效降解强力霉素基因工程菌是将四环素类灭活酶tetX基因片段与pET28a载体连接后转入大肠杆菌BL21(DE3)获得的，命名为ETD-1。以下为具体构建方法：

(1)本发明以埃希氏杆菌(Escherichia sp.)基因组为模板，选取各带有BamHⅠ和NdeⅠ限制性内切酶的酶切位点的两个特异引物对四环素类灭活酶基因tetX进行PCR扩增，引物的核苷酸序列如下：

上游引物F：5′-CGCGGATCCATGACAATGCGAATAGATACAG-3′；(下划线表示为BamHⅠ限制性内切酶的酶切位点序列)

下游引物R：5′-CCGCATATGTTATACATTTAACAATTGCT-3′；(下划线表示为NdeⅠ限制性内切酶的酶切位点序列)

(2)将PCR产物与pET28a载体分别用BamHⅠ和NdeⅠ进行双酶切，然后再在37℃条件下酶连过夜，得到重组质粒pET28a-tetX；

(3)将重组质粒pET28a-tetX用热激转化到感受态细胞大肠杆菌BL21(DE3)中，然后在含有浓度为50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行筛选，最后通过PCR和测序技术鉴定为含tetX基因的阳性重组子，即得到基因工程菌ETD-1，即大肠埃希氏菌(Escherichia coli)ETD-1。

实施例2：基因工程菌ETD-1诱导表达灭活酶tetX

将基因工程菌ETD-1按体积比1％的比转接于1000mL的LB肉汤培养基中，37℃、180r/min振摇培养，当OD₆₀₀值达到0.5时加入IPTG(终浓度为1mmol/L)，分别取16℃和37℃条件下诱导表达0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h的菌液蛋白进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示。由结果可知，16℃条件下诱导8h后，重组蛋白开始大量表达，诱导10h表达量最高；37℃条件下诱导2h后，重组蛋白开始大量表达，诱导8h表达量最高。

取37℃条件下诱导8h的菌液经5,000r/min离心6min收集菌体。将收集的菌体与细菌裂解液(含1mmol/L PMSF和100μg/mL溶菌酶)按1：10的体积比混合，重悬菌体沉淀，冰上孵育30min，并轻柔涡旋裂解细胞，冰浴中超声破碎(功率650W，频率20～25kHz)，超声30min至菌体完全破碎，在4℃、10,000r/min条件下离心30min，获得蛋白裂解上清液和沉淀物。使用抗His标签的单克隆抗体对在37℃条件下诱导表达0h、2h、4h、6h、8h、10h的菌液(tetX蛋白)以及在37℃条件下诱导表达8h并经超声破碎获得的蛋白裂解上清液和沉淀物进行Western blot检测，结果如图2所示。Western Blot检测结果显示约为44kDa的特异性蛋白条带，经数据库对比后与tetX表达蛋白的大小相一致，结果表明目的蛋白得到正确表达。蛋白裂解上清液经Ni-IDA柱层析分离和PD-10脱盐柱脱盐，获得纯化的灭活酶tetX蛋白。

实施例3：基因工程菌ETD-1在降解四环素类抗生素中的应用

空白对照组、基因工程菌组和空载菌组分别在100mL的LB肉汤培养基中添加1％的PBS溶液、基因工程菌ETD-1和空载菌EPE，反应体系中pH值为7.2，三角瓶上用封口膜密封，瓶身用锡纸包裹避光，在37℃、180r/min条件下震荡培养，当菌体繁殖到菌体密度OD₆₀₀为0.5时，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)进行诱导表达，在37℃下继续诱导表达培养8h后，加入强力霉素(终浓度为50mg/L)继续培养，分别于0、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168h采样，用于检测强力霉素浓度、耐药基因含量等指标。

在37℃下经过168h的振荡培养，基因工程菌ETD-1对强力霉素的降解效果如图3所示。经过48h的降解过程，基因工程菌ETD-1对强力霉素的降解率达95.0±1.0％，显著高于空载菌EPE(8.8±5.1％)和对照组(38.9±8.7％)(P<0.05)。在72h后，基因工程菌ETD-1对强力霉素基本降解完全。说明基因工程菌ETD-1能高效降解强力霉素。

通过普通PCR和qPCR检测基因工程菌ETD-1降解强力霉素的过程中的四环素类抗性基因，只检出菌株中的目的基因tetX且数量整个试验过程无显著变化，说明基因工程菌ETD-1在降解强力霉素过程中并无引起抗性传播风险。

实施例4：基因工程菌ETD-1在诱导表达灭活酶tetX降解四环素类抗生素中的应用

降解体系制备的方法同实施例3，在37℃下继续诱导表达培养8h后，以5,000r/min、6min的条件离心收集菌体，用PBS洗涤菌体3次，将离心收集的菌体与细菌裂解液(含1mmol/L PMSF和100μg/mL溶菌酶)按1：10的体积比混合，重悬菌体沉淀，冰上孵育30min，并轻柔涡旋裂解细胞，冰浴中超声破碎(功率650W，频率20～25kHz)，超声30min至菌体完全破碎，在4℃、10,000r/min条件下离心30min，获得蛋白裂解上清液；蛋白裂解上清液过0.22μm滤膜去除杂质得到的滤液为基因工程菌ETD-1的胞内酶。用PBS补足100mL的反应体系，加入强力霉素(终浓度为50mg/L)，pH值为7.2，在37℃、180r/min条件下振荡反应，分别于0、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168h采样，用于检测强力霉素浓度。

如图4可见，基因工程菌ETD-1菌的胞内酶7d对强力霉素的降解率为80.5±1.2％，相比于空载菌组和空白组，降解率分别提高了25.6％和22.0％，说明基因工程菌ETD-1在诱导表达灭活酶tetX对强力霉素的降解效果最好。

实施例5：基因工程菌ETD-1分级酶对强力霉素的降解效果

根据硫酸铵分级沉淀表，分别提取出对应0％～30％、30％～35％、35％～40％、40％～45％、45％～50％、50％～55％、55％～60％、60％～70％、70％～80％硫酸铵饱和度的分级酶进行酶促降解试验。基因工程菌ETD-1的胞内酶获得的方法同实施例4，取50mL基因工程菌ETD-1的胞内酶，按照硫酸铵分级沉淀表30％的浓度缓慢加入8.8g硫酸铵粉末，缓慢摇匀，待硫酸铵溶解后，4000r/min离心得到上清液，转移到另一个离心管待用，离心剩下的沉淀加入5mL PBS缓冲液，则为未脱盐的0～30％的分级酶液；将上述步骤得到的上清继续加入1.5g硫酸铵得到35％的硫酸铵浓度，依此类推，此后需要加入的硫酸铵分别是1.55g(40％)、1.55g(45％)、1.60g(50％)、1.65g(55％)、1.65g(60％)、3.3g(70％)、3.85g(80％)。将依次得到的分级酶小心倒入透析袋，放入纯水中层析2～3d，得到脱盐后的分级酶，以上步骤均在4℃中完成。将5mL分级酶加入到PBS缓冲液中至100mL，加入强力霉素(终浓度为10mg/L)，pH值为7.2，在37℃、180r/min条件下振荡反应，分别于0、24、48、72、96和120h采样，检测细化分级酶对强力霉素的降解效果。

实验结果表明，以50％～55％、55％～60％饱和度的硫酸铵分级沉淀基因工程菌ETD-1的胞内酶，所获分级酶5d内对10mg/L强力霉素的降解率分别为55.4±5.8％、59.3±4.5％，均显著高于其它硫酸铵饱和度区间的分级酶组(P<0.05)。

综合以上试验可知，本发明构建的基因工程菌ETD-1，能高效降解第二代四环素类抗生素强力霉素，在2d内对50mg/L强力霉素的降解达95.0±1.0％，在3天后强力霉素基本降解完全。相比于空载菌组和空白组，ETD-1表达的灭活酶基因tetX 7d对强力霉素的降解率提高了25.6％和22.0％，在降解过程中无抗性基因污染风险，与传统化学降解、物理吸附和微生物修复相比较具有安全高效、适应性强、节能环保等优点，不会对环境造成抗性传播等不良影响，可广泛应用于生物修复和生态恢复工程。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种高效降解四环素类抗生素的基因工程菌及其构建和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1167

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> tetX基因的核苷酸序列

<400> 1

atgacaatgc gaatagatac agacaaacaa atgaatttac ttagtgataa gaacgttgca 60

ataattggtg gtggacccgt tggactgact atggcaaaat tattacagca aaacggcata 120

gacgtttcag tttacgaaag agacaacgac cgagaggcaa gaatttttgg tggaaccctt 180

gacctacaca aaggttcagg tcaggaagca atgaaaaaag cgggattgtt acaaacttat 240

tatgacttag ccttaccaat gggtgtaaat attgctgatg aaaaaggcaa tattttatcc 300

acaaaaaatg taaagcccga aaatcgattt gacaatcctg aaataaacag aaatgactta 360

agggctatct tgttgaatag tttagaaaac gacacggtta tttgggatag aaaacttgtt 420

atgcttgaac ctggtaagaa gaagtggaca ctaacttttg agaataaacc gagtgaaaca 480

gcagatttgg ttattcttgc caatggcggg atgtccaagg taagaaaatt tgttaccgac 540

acggaagttg aagaaacagg tactttcaat atacaagccg atattcatca accggaggtg 600

aactgtcctg gattttttca gctttgcaat ggaaaccggc taatggctgc tcatcaaggt 660

aatttattat ttgcgaatcc taataataat ggtgcattgc attttggaat aagttttaaa 720

acacctgatg aatggaaaag caaaacgcgg gtagattttc aagacagaaa tagtgtcgtt 780

gattttctcc tgaaaaaatt ttccgattgg gacgaacgct acaaagaact gattcgtttg 840

acatcatctt ttgtagggtt agcgacacga atatttccct tagataagtc ttggaaaagt 900

aagcgtccat tacccataac gatgattgga gatgctgctc atttgatgcc tccttttgca 960

ggacaaggcg taaacagtgg gttgatggat gccttgatat tgtcggataa tctgaccaat 1020

gggaaattta acagcattga agaggctatt gaaaattatg aacagcaaat gtttatctat 1080

ggcaaagaag cacaagaaga atcaactcaa aacgaaattg aaatgtttaa acccgacttt 1140

acgtttcagc aattgttaaa tgtataa 1167

<210> 2

<211> 388

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> tetX基因编码的氨基酸序列

<400> 2

Met Thr Met Arg Ile Asp Thr Asp Lys Gln Met Asn Leu Leu Ser Asp

1 5 10 15

Lys Asn Val Ala Ile Ile Gly Gly Gly Pro Val Gly Leu Thr Met Ala

20 25 30

Lys Leu Leu Gln Gln Asn Gly Ile Asp Val Ser Val Tyr Glu Arg Asp

35 40 45

Asn Asp Arg Glu Ala Arg Ile Phe Gly Gly Thr Leu Asp Leu His Lys

50 55 60

Gly Ser Gly Gln Glu Ala Met Lys Lys Ala Gly Leu Leu Gln Thr Tyr

65 70 75 80

Tyr Asp Leu Ala Leu Pro Met Gly Val Asn Ile Ala Asp Glu Lys Gly

85 90 95

Asn Ile Leu Ser Thr Lys Asn Val Lys Pro Glu Asn Arg Phe Asp Asn

100 105 110

Pro Glu Ile Asn Arg Asn Asp Leu Arg Ala Ile Leu Leu Asn Ser Leu

115 120 125

Glu Asn Asp Thr Val Ile Trp Asp Arg Lys Leu Val Met Leu Glu Pro

130 135 140

Gly Lys Lys Lys Trp Thr Leu Thr Phe Glu Asn Lys Pro Ser Glu Thr

145 150 155 160

Ala Asp Leu Val Ile Leu Ala Asn Gly Gly Met Ser Lys Val Arg Lys

165 170 175

Phe Val Thr Asp Thr Glu Val Glu Glu Thr Gly Thr Phe Asn Ile Gln

180 185 190

Ala Asp Ile His Gln Pro Glu Val Asn Cys Pro Gly Phe Phe Gln Leu

195 200 205

Cys Asn Gly Asn Arg Leu Met Ala Ala His Gln Gly Asn Leu Leu Phe

210 215 220

Ala Asn Pro Asn Asn Asn Gly Ala Leu His Phe Gly Ile Ser Phe Lys

225 230 235 240

Thr Pro Asp Glu Trp Lys Ser Lys Thr Arg Val Asp Phe Gln Asp Arg

245 250 255

Asn Ser Val Val Asp Phe Leu Leu Lys Lys Phe Ser Asp Trp Asp Glu

260 265 270

Arg Tyr Lys Glu Leu Ile Arg Leu Thr Ser Ser Phe Val Gly Leu Ala

275 280 285

Thr Arg Ile Phe Pro Leu Asp Lys Ser Trp Lys Ser Lys Arg Pro Leu

290 295 300

Pro Ile Thr Met Ile Gly Asp Ala Ala His Leu Met Pro Pro Phe Ala

305 310 315 320

Gly Gln Gly Val Asn Ser Gly Leu Met Asp Ala Leu Ile Leu Ser Asp

325 330 335

Asn Leu Thr Asn Gly Lys Phe Asn Ser Ile Glu Glu Ala Ile Glu Asn

340 345 350

Tyr Glu Gln Gln Met Phe Ile Tyr Gly Lys Glu Ala Gln Glu Glu Ser

355 360 365

Thr Gln Asn Glu Ile Glu Met Phe Lys Pro Asp Phe Thr Phe Gln Gln

370 375 380

Leu Leu Asn Val

385

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上游引物F

<400> 3

cgcggatcca tgacaatgcg aatagataca g 31

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 下游引物R

<400> 4

ccgcatatgt tatacattta acaattgct 29

Claims

1.一种高效降解强力霉素的基因工程菌，其特征在于：名称为大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ETD-1，于2018年07月05日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC NO：16060。

2.权利要求1所述的高效降解强力霉素的基因工程菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）以埃希氏杆菌（Escherichia sp.）基因组为模板，选取各带有BamHⅠ和NdeⅠ限制性内切酶的酶切位点的两个特异引物对四环素类灭活酶tetX基因进行PCR扩增，引物的核苷酸序列如下，下划线表示为BamHⅠ和NdeⅠ两个限制性内切酶的酶切位点序列；

上游引物F：5′-CGCGGATCCATGACAATGCGAATAGATACAG-3′；

下游引物R：5′-CCGCATATGTTATACATTTAACAATTGCT-3′；

（2）将PCR产物与pET28a载体分别用BamHⅠ和NdeⅠ进行双酶切，然后再酶连过夜，得到重组质粒pET28a-tetX；

（3）将重组质粒pET28a-tetX用热激转化到感受态细胞大肠杆菌BL21（DE3）中，然后在含有卡那霉素的培养基进行筛选，最后通过PCR和测序技术鉴定为含tetX基因的阳性重组子，即得到基因工程菌ETD-1，即大肠埃希氏菌（Escherichia coli）ETD-1。

3.权利要求1所述的高效降解强力霉素的基因工程菌在降解强力霉素或诱导表达灭活酶tetX降解强力霉素中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：

基因工程菌ETD-1以0.5～2%接种于LB肉汤培养基中，在25～40℃、150～250r/min条件下培养，当菌体繁殖到菌体密度OD₆₀₀为0.4～0.6时，加入终浓度为1mmol/L 的IPTG进行诱导表达，在16℃～37℃下继续诱导表达培养2～12h后，加入强力霉素，加入量为10～50mg/L，在25～40℃、150～250r/min条件下培养48～168h，获得强力霉素减少且无抗性基因增加的培养液，实现安全降解强力霉素的目的。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的继续诱导表达培养的时间为8～10h；

所述的强力霉素的加入量为50mg/L；

加入强力霉素后，培养的时间为48～72h。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将基因工程菌ETD-1按0.5～2%的体积比转接于LB肉汤培养基中，25～40℃、150～250r/min振摇培养，当OD₆₀₀值达到0.4～0.6时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG在16～37℃条件下诱导表达，取菌液离心收集菌体，用PBS洗涤菌体；

（2）将离心收集的菌体与细菌裂解液按1：10的体积比混合，重悬菌体沉淀，冰上孵育20～40 min，并轻柔涡旋裂解细胞，冰浴中超声破碎，超声20～60 min至菌体完全破碎，冷冻离心，获得蛋白裂解上清液，取蛋白裂解上清液过滤；

（3）过滤去除杂质得到的滤液为基因工程菌ETD-1的胞内酶，用PBS补足至与步骤（1）的菌液体积相同的反应体系，加入强力霉素，其在反应体系中的终浓度为10～50 mg/L，pH值为7.2，在25～40℃、150～250r/min条件下振荡反应24～168h，获得强力霉素减少且无抗性基因增加的培养液，实现安全降解强力霉素的目的。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

步骤（1）中所述的诱导表达的时间为2～12h；

步骤（1）中所述的离心的条件为经3,000～6,000 r/min离心3～8 min；

步骤（1）中所述的洗涤菌体的次数为1～3次；

步骤（2）中所述的超声破碎的条件是功率650W，频率20～25kHz；

步骤（2）中所述的冷冻离心的条件为在4 ℃、10,000 r/min条件下离心30 min；

步骤（2）中所述的过滤条件为过0.22μm滤膜；

步骤（3）中所述的强力霉素在反应体系中的终浓度为50 mg/L；

步骤（3）中所述的振荡反应的时间为96～168h。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于：包括如下步骤：

取权利要求6或7步骤（3）获得的基因工程菌ETD-1的胞内酶，按照硫酸铵分级沉淀表，分别提取出对应0%~30%、30%~35%、35%~40%、40%~45%、45%~50%、50%~55%、55%~60%、60%~70%、70%~80%硫酸铵饱和度的分级酶；将分级酶加入到PBS缓冲液中至基因工程菌ETD-1的胞内酶2倍体积，加入强力霉素，终浓度为10~50 mg/L，pH值为7.2，在37℃、180r/min条件下振荡反应，对强力霉素进行酶促降解48～120h。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

所述的分级酶与基因工程菌ETD-1的胞内酶的体积比为1：10；

所述的强力霉素终浓度为10 mg/L；

所述的酶促降解的时间为96～120h。