CN103690942A - 一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗及其制备方法。所述疫苗蛋白基因具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列，其编码的疫苗蛋白具有序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列。本发明的亚单位疫苗与油乳佐剂混合，通过腹腔注射途径免疫鱼后能有效刺激特异抗体的产生，能高效提高免疫鱼抵御迟缓爱德华氏菌的感染，可用于控制鱼类迟缓爱德华氏菌病。

Description

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗及其制备与应用

技术领域

本发明涉及免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗及其制备与应用。 

背景技术

迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）是一种革兰氏阴性杆菌，能感染鱼类、两栖类、爬行类和哺乳类。该菌是淡水和海水养殖鱼类和野生鱼类的重要病原菌之一，引起出血性败血症，造成世界范围鱼类养殖的重大经济损失。在我国，迟缓爱德华氏菌不仅感染甲鱼、鳗鲡、罗非鱼等淡水养殖品种，还感染鲈鱼、牙鲆、大菱鲆、舌鳎、美国红鱼、大黄鱼、石斑鱼、真鲷等重要海水养殖品种，对我国水产养殖危害巨大。当前迟缓爱德华氏菌病的防治主要依靠抗生素类药物，由于抗生素带来的生态、环境以及食品安全等的不良影响，其在水产养殖的应用在国内外受到很多限制。免疫防治是国际上普遍认可的安全有效的防治疾病的方法，国内外已针对迟缓爱德华氏菌病开展了多种疫苗研制，包括灭活疫苗、亚单位疫苗、弱毒疫苗、核酸疫苗以及载体疫苗，但目前尚未有商业化疫苗。亚单位疫苗是利用病原体的蛋白成分研制的一种疫苗，能够激发宿主强烈的特异性免疫应答，因而一直是医学和畜牧兽医界的重点研发领域。 

发明内容

本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗及其制备与应用方法。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为： 

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，疫苗蛋白基因具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。 

疫苗蛋白基因编码蛋白为具有序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列。 

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备, 

1）质粒pETD的构建：以迟缓爱德华氏菌LSE40的基因组DNA为模板，用引物EDF和EDR进行PCR扩增，产物纯化后用BamHI/HindIII双酶切，回收579bp片断；同时将质粒pET30用BamHI/HindIII双酶切，回收5.4kb片断；将上述回收的两个DNA片断用T₄DNA连接酶连接，连接液转化感受态大肠杆菌DH5α后涂布含卡那霉素的LB固体培养基，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETB； 

所述引物为：EDF：5’-GCGCGGATCCGACGACTATCGACAGCGGCAG-3’和EDR：5’-GCGCAAGCTTGGACATGCGTACGCTGCT-3’； 

2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将质粒pETD转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，筛选得到携带pETD的菌株BL21/pETD；将BL21/pETD在含卡那 霉素的LB液体培养基于37℃培养12-16小时，所得培养液按体积比1:100的比例转接新鲜的LB液体培养基，于37℃培养OD₆₀₀至0.5-0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol，并继续培养3-5小时，离心收集菌体并悬浮于PBS中，用超声波裂解菌液至澄清；将裂解液离心并回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得具有序列表SEQ ID No.1碱基序列编码的氨基酸序列的亚单位疫苗蛋白。 

将上述所得的亚单位疫苗蛋白在PBS稀释至200-300μg/ml，之后将稀释的疫苗蛋白与油乳佐剂等体积混合。 

一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的应用，所述疫苗用于制备抵抗迟缓爱德华氏菌侵染的疫苗。 

将所述油乳疫苗腹腔注射于鱼内，14天后加强免疫一次，免疫鱼即可产生针对疫苗蛋白的特异性抗体，并获得抵抗迟缓爱德华氏菌侵染的能力。 

本发明所具有的优点为：本发明所得的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗能诱导鱼体产生高的特异性免疫应答反应，获得高的免疫保护率。此外，本发明应用方法简单，配以油乳佐剂即具有高效免疫增强作用。 

附图说明

图1为本发明亚单位疫苗蛋白在大肠杆菌的诱导表达及纯化疫苗蛋白的SDS-PAGE电泳图。其中，1为蛋白分子量标准，2为未加IPTG诱导的细菌，3加入IPTG诱导的细菌，4为经镍凝胶柱回收的蛋白。 

图2为本发明亚单位疫苗蛋白在大肠杆菌的诱导表达及纯化疫苗蛋白的免疫印迹图。其中，1为未加IPTG诱导的细菌，2为加入IPTG诱导的细菌，3为经镍凝胶柱回收的蛋白。 

具体实施方式

现参照下列实施例对本发明作进一步说明，实施例对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。 

实施例1 

迟缓爱德华氏菌疫苗表达载体的构建方法： 

步骤1）质粒pGMTD的构建：以迟缓爱德华氏菌LSE40(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号：CGMCC No.7199，分类学命名为迟缓爱德华氏菌Edwardsiella tarda，保藏日期：2013年1月23日，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的基因组DNA为模板，用引物EDF(5’-GCGCGGATCCGACGACTATCGACAGCGGCAG-3’,下划线碱基为BamHI限制性内切酶为点）和EDR(5’-GCGCAAGCTTGGACATGCGTACGCTGCT-3’，下划线碱基为HindIII限制性内切酶为点)进行PCR扩增（PCR仪购自Takara公司，型号TP600）。PCR反应体系体积为25μL：10×PCR缓冲溶液2.5μL，0.2mM dNTP各0.5μL，1.5mMMgCl₂2.0μL，0.5μM引物EDF和0.5μM引物EDR各0.5μL，30ng LSE40基因组DNA1.0μL，5U/μL Taq酶0.25μL，无菌双蒸水17.75μL；PCR条件 为：95℃预变性1min，然后95℃30s,55℃30s，72℃1min,30个循环后在72℃延伸反应10min。PCR产物用DNA产物纯化试剂盒（Takara，大连）纯化回收，与PCR克隆载体pGMT（克隆载体pGMT试剂盒购自天根生化科技有限公司，北京）于16℃连接过夜，连接液转化感受态大肠杆菌DH5α后，在含50μg/ml卡那霉素、40μg/ml5-溴-4－氯-3-吲哚-β-Ｄ-乳糖苷(Xal)和24μg/ml异丙基-β-Ｄ-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固体平板上培养，筛选白色转化子，提取质粒，送上海博亚生物科技有限公司测序，所得序列具有序列表SEQ ID No.1的碱基序列，所得质粒即为pGMTD。 

步骤2）质粒pETD的构建：将步骤1）所得pGMTD质粒用HindIII/BamH进行双酶切，用DNA产物纯化试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）回收600bp片断；同时将质粒pET30（Ｎovagen，美国）用HindIII/BamHI双酶切，回收5.4kb片断。将上述回收的两个DNA片断用T₄DNA连接酶(Takara公司，大连）在16℃连接过夜后，连接液转化感受态大肠杆菌DH5α，在含50μg/ml卡那霉素的LB固体培养基上培养，筛选转化子，提取质粒，即为质粒pETD。 

所述LB固体培养组成成分：蛋白胨1.0g，酵母粉0.5ｇ，氯化钠1.0g，琼脂粉1.5g，将各组分混合溶解后，用蒸馏水定容至100ｍｌ，调节pH7.2。 

实施例2 

迟缓爱德华氏菌疫苗蛋白的制备方法： 

将所得质粒pETD转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)（天根生化科技有限公司，北京），在含有50μg／ml卡那霉素的LB固体培养基上培养，筛选阳性菌落，将其命名为BL21/pETD。将BL21/pETD培养在含有50μg／ml卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃下培养12-16小时，而后按照体积比为1︰100的比例转接种于100ml含有50μg／ml卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，于37℃下转速120rpm培养至OD₆₀₀为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，继续培养4-6小时，之后在5000g、4℃条件下离心10min，收集菌体悬浮于5-10ml PBS，所得菌悬液用超声波裂解细菌直至菌悬液澄清（200w，超声5s，间隔15s，20-30min）。所得澄清菌液在10000g、4℃条件下离心30min，回收上清，将上清用镍琼脂糖柱(Qiagen，上海)回收蛋白。所得蛋白产物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺浓度为12%），电泳条件为：在电压8v/cm下电泳30-35min，而后在电压8v/cm下电泳2-2.5小时），得到一条分子量约为23kD的蛋白带（图1），其分子量与疫苗蛋白的分子量大小一致。由于表达的蛋白带有His标签，用His抗体（天根生化科技有限公司，北京）进行免疫印迹杂交，结果显示回收的蛋白能与His抗体特异性结合(图2），说明回收蛋白含有His标签。上述结果表明回收得到的蛋白即为序列表SEQ ID No.2所示碱基序列的疫苗抗原蛋白。 

所述PBS组成成分：磷酸二氢钾（KH₂PO₄）0.27g,磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)1.42g,氯化钠（NaCl）8g，氯化钾0.2g，将上述成分溶解于双蒸水，定容至1000ml。 

实施例3 

迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的应用： 

步骤1)油乳疫苗制备。将92%(体积比)10号白油、6%(体积比)司本-80和2%(体积比)硬脂酸铝（加热融化）混合均匀，即为油乳佐剂。将上述实施例2纯化的疫苗蛋白在PBS中稀释200μg/ml；将稀释后的疫苗蛋白与油乳佐剂等体积混合均匀，即为油乳疫苗。 

步骤2）亚单位疫苗的免疫应用。体重为10-12g的试验大菱鲆暂养于1000L水族箱，配以流动循环水处理和净化系统，养殖水温维持16-18℃。暂养1周后，随机分3组至500L试验水族箱，每组50尾鱼，继续暂养1周。试验水族箱每天上下午各换水一次，换水量为1/2，维持水温16-18℃。暂养结束后，组1和组2作为对照组，分别腹腔注射100μl在步骤1）制备的PBS和油乳佐剂，组3作为实验组，腹腔注射100μl在步骤1）制备的油乳疫苗。在第一次注射后2周，按照第一次的剂量和方法进行第二次注射。 

步骤3）免疫鱼血清抗体效价分析。步骤2）的各组实验鱼在二次注射后2周，随机各取5尾从尾静脉取血，制备血清并测定针对疫苗蛋白的抗体效价，测定方法参考肖鹏等方法（参考文献：肖鹏,莫照兰,邹玉霞,王波,徐永立,张培军.2007.鳗弧菌油乳化二价口服疫苗免疫养殖大菱鲆的免疫应答及免疫效果的研究。高技术通讯,17(9):979-885），得到的各组效价分别为：组1=1:5.6±5.8,组2=1:3.2±1.1,组3=1:1433.6±560.9。因此，所得亚单位疫苗能够强烈刺激大菱鲆产生特异性抗体。 

步骤4）亚单位疫苗免疫保护效果分析。取活的迟缓爱德华氏菌LSE40株细胞用无菌PBS缓冲溶液悬浮至浓度为1×10⁷cfu/ml，即为攻毒菌液。步骤2）的各组实验鱼在二次注射后2周，各组取鱼40尾，每尾腹部肌肉注射100μl上述攻毒菌液。14天后，统计各组鱼的累积死亡数为：组1=40尾，组2=16尾，组3=11尾。根据各组死亡鱼百分率计算相对免疫保护效率（RPS），计算公式为：RPS=100×(1-疫苗免疫组鱼的总死亡百分率/PBS对照组鱼的总死亡百分率)。结果给出亚单位疫苗的免疫保护率为72.5%。因此，所得亚单位疫苗能够有效地保护大菱鲆抵抗迟缓爱德华氏菌的感染。 

SEQ ID No.1 

ATGACGACTATCGACAGCGGCAGCCACGGTGTTAACGGCATTACCCCACCGGACGGCCATCGTTACGTTTCACAGGATCGCGGCGGCGACGCCATCGGCCAGCTGAATGAGCTGATGGTTCAGCTTGGAGAGCTGTTTGGGAAGCTGCGCGATGTGCTGCGCCAGTATCAACAGACGCAGCAAAGCAACGCGTTCAAGATGCAAAAAACAGCGTATGACACCCGCGTGGACGCCATCGATAAAGACTTTCAGGCCAAGCAGGCCCAGGCTATCGCGCAAATCCTCGGCGGCATCGCCCAGACCTTTGGCGGGGCGTTCGG AGAAGAGGCGCATACCATTAGCAACGGCGTTAACAGCATGACGCAGGGGATTGTCGGCGTCGGCTATGTCAATGACATGTCGCGTCAGTCGCAGGAGGAGCAGGCGCTGTCCGAATATCAGCACGGCCTGGCCGAGCAGCAGCTTAAGCGGGCGGATGAAACGCTGGAAAAGGCGCTCAAGATCTCCGGCGATCTGCGCGAGATACTGACCACCCTGAATCAGGCCCACGAACGTATCGCCAGCAGCGTACGCATGTCC 

序列特征： 

长度：579碱基对 

类型：核酸 

链型：双链 

拓扑结构：线性 

分子类型：DNA 

特异性名称：EseD CDS(1-579) 

最初来源：迟缓爱德华氏菌LSE40 

SEQ ID No.2 

MTTIDSGSHGVNGITPPDGHRYVSQDRGGDAIGQLNELMVQLGELFGKLRDVLRQYQQTQQSNAFKMQKTAYDTRVDAIDKDFQAKQAQAIAQILGGIAQTFGGAFGEEAHTISNGVNSMTQGIVGVGYVNDMSRQSQEEQALSEYQHGLAEQQLKRADETLEKALKISGDLREILTTLNQAHERIASSVRMS 

序列特征： 

长度：193 

类型：氨基酸序列 

链型：单链 

拓扑结构：线性 

分子类型：蛋白质 

特异性名称：Protein EseD 

最初来源：迟缓爱德华氏菌LSE40 。

Claims (5)

1.一种迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于：疫苗蛋白基因具有序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。

2.按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗，其特征在于：疫苗蛋白基因编码蛋白为具有序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列。

3.一种按权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备,其特征在于：

1）质粒pETD的构建：以迟缓爱德华氏菌LSE40的基因组DNA为模板，用引物EDF和EDR进行PCR扩增，产物纯化后用BamHI/HindIII双酶切，回收579bp片断；同时将质粒pET30用BamHI/HindIII双酶切，回收5.4kb片断；将上述回收的两个DNA片断用T₄DNA连接酶连接，连接液转化感受态大肠杆菌DH5α后涂布含卡那霉素的LB固体培养基，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETB；

所述引物为：EDF：5’-GCGCGGATCCGACGACTATCGACAGCGGCAG-3’和EDR：5’-GCGCAAGCTTGGACATGCGTACGCTGCT-3’；

2）疫苗蛋白的诱导表达和纯化：将质粒pETD转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，筛选得到携带pETD的菌株BL21/pETD；将BL21/pETD在含卡那霉素的LB液体培养基于37℃培养12-16小时，所得培养液按体积比1:100的比例转接新鲜的LB液体培养基，于37℃培养OD₆₀₀至0.5-0.8，加入IPTG至终浓度为1mmol，并继续培养3-5小时，离心收集菌体并悬浮于PBS中，用超声波裂解菌液至澄清；将裂解液离心并回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得具有序列表SEQ ID No.1碱基序列编码的氨基酸序列的亚单位疫苗蛋白。

4.按权利要求3所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的制备，其特征在于：将上述所得的亚单位疫苗蛋白在PBS稀释至200-300μg/ml，之后将稀释的疫苗蛋白与油乳佐剂等体积混合。

5.一种权利要求1所述的迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的应用，其特征在于：所述疫苗用于制备抵抗迟缓爱德华氏菌侵染的疫苗。

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