CN102676570B

CN102676570B - 一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体及其应用

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Publication number: CN102676570B
Application number: CN2012101252570A
Authority: CN
Inventors: 李志会; 孟红; 李鹏; 宋楠楠; 岳盈盈
Original assignee: INSTITUTE OF BASIC MEDICINE SAMS
Current assignee: INSTITUTE OF BASIC MEDICINE SAMS
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2013-11-20
Anticipated expiration: 2032-04-26
Also published as: CN102676570A

Abstract

本发明公开了一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体，载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有免疫球蛋白结合蛋白功能域编码基因。本发明还公开了含有该重组表达载体的重组枯草芽孢杆菌，其可以用于制备粘膜免疫佐剂，应用时，与抗原一起给药。本发明还提供了一种在哺乳动物中诱导对抗原的免疫应答的组合物，其至少包含一种抗原和一种有佐剂活性的重组芽孢。本发明用免疫球蛋白结合蛋白重组载体构建重组枯草芽孢杆菌口服疫苗的研究方案是“扬长避短”的一种新尝试，即通过芽孢直接展示免疫球蛋白结合蛋白与人源IgG Fc段结合将融合人源IgG Fc段的基因工程蛋白吸附在芽孢表面进行粘膜免疫。

Description

一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体，其宿主细胞，及其制备方法与应用，属于生物技术领域。

背景技术

疫苗是控制由病原引起的疾病的重要环节，机体大部分的感染发生在粘膜或由粘膜入侵机体致病，因此，粘膜途径是接种疫苗的一个良好选择。痢疾菌苗经滴鼻途径免疫小鼠能有效地激发鼻粘膜局部分泌抗原特异性IgA、IgG的升高，同时诱发远离免疫诱导部位的胃肠粘膜和生殖道粘膜分泌抗原特异性IgA、IgG升高，并诱发血清中抗原特异性IgA、IgG升高，表明共同粘膜免疫系统的存在，同时说明鼻粘膜是一个敏感有效、简便安全的免疫途径。

与其他佐剂相比细菌载体疫苗表现了众多优点：1.模仿自然感染途径，能够保证大部分粘膜表面区域接触疫苗，开发由sIgA介导的第一道防线；2.可以通过口服和鼻饲接种，方法简便易行；3.细菌能使大量的树突状细胞(Dendritic cells，DC)聚集，具有免疫佐剂的作用，不仅可以刺激机体的粘膜免疫而且可以刺激机体的全身免疫；4.诱导作用位点比较明确，安全可靠。菌体佐剂也有众多研究报道[1]。与营养型菌体比较，芽孢具有自己独特的优势：1.芽孢表达体系稳定，能抵抗多种不良因素的影响；2.芽孢被用做人及动物的食物添加剂和多种胃肠道病症的处方药及非处方药的成分，因此安全性好；3.当前已有芽孢为基础的商业化产品，生产工艺成熟；4.大部分枯草芽孢杆菌芽孢衣蛋白，包括CotA，CotB，CotC，CotD，CotF无显著的功能，缺乏其中任何一个都不会引起明显的性状改变[2]，因此有希望应用以上多个融合载体蛋白建立多价疫苗。Duc等[3]对枯草芽孢杆菌芽孢的免疫特性以及在细胞内的归宿研究显示：芽孢可诱导机体产生局部免疫和系统免疫反应，该课题组以CotB-TTFc重组芽孢口服、鼻腔免疫小鼠能产生特异性抗体。对口服免疫小鼠的抗体类型分析显示，主要为IgG、IgA和IgM，其中IgG包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IG3亚型，口服免疫后54d IgG1和IgG2b亚型水平最高；而鼻腔免疫后抗体主要为IgG1、IgG2b和IgM，口服免疫后的小鼠可抵抗致死剂量破伤风毒素攻击。Mauriello等[4]用CotC为融合表达载体蛋白展示了TTFC及LT，用其粘膜免疫小鼠也诱导了全身及粘膜特异性抗体，充分说明枯草芽孢杆菌芽孢是粘膜免疫的一个有效载体，并能成功的在其表面展示不同的抗原蛋白。并且有研究显示，芽孢表面展示抗原比芽孢萌时展示的抗原诱导能力更加有效[5]。目前活菌疫苗载体的研究主要集中与在菌体表面展示抗原的细菌展示技术，一种细菌载体一般只展示一种抗原，因此，应用免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin(Ig)-bindingproteins，BPs)与IgG Fc段结合的特性建立一种具有递呈多种蛋白抗原能力的通用型菌体免疫佐剂对促进粘膜途径疫苗的发展具有重要作用。因此本发明将葡萄球菌A蛋白(SPA)A结构域和链球菌G蛋白C1结构域融合表达展示在芽孢表面构建新型通用的粘膜免疫佐剂，将蛋白抗原结合到芽孢表面可用于接种方法中。

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发明内容

针对上述现有技术，本发明的第一个目的是提供一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体，及其制备方法。

本发明的第二个目的是提供一种含有上述表达重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体的宿主细胞。

本发明的第三个目的是提供上述的重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体或上述的宿主细胞在粘膜免疫中的用途。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体，载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有免疫球蛋白结合蛋白功能域编码基因。

所述重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及编码序列；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体，测序；

(c)将测序正确的CotB片段双酶切后连接到相同双酶切的pDG1662上，得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)全序列合成链球菌G蛋白C1功能域于载体pUC57上，得到质粒pUC57-C；

(b)PCR方法扩增金黄色葡萄球菌A蛋白A功能域序列；

(c)将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体，测序；

(d)将测序正确的A功能域片段双酶切后连接到相同双酶切的质粒pUC57-C上，得到质粒pUC57-AC，双酶切得到片段AC后连接到相同双酶切的步骤(1)得到的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-AC，即为重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体。

具体步骤如下：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及编码序列：

上游引物B1序列为：5’GAATTCgaatccgagtttcgcaagtcct3’；

下游引物B2序列为：5’AAGCTTggatgattgatcatctgaagattt3’；

位置：两端酶切位点分别为EcoR I、HindIII；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、53℃30Sec、75℃1min循环扩增30次；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD18T载体：PCR扩增产物测序正确后分别用EcoR

I和HindIII双酶切，电泳回收目的片段后，依次连接到用相同双酶切的质粒pDG1662上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR及双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)于上海博亚生物技术有限公司全序列合成链球菌G蛋白C1功能域于载体pUC57上，两端分别加入Xho I、EcoR I酶切位点，得到质粒pUC57-C；

(b)PCR方法扩增金黄色葡萄球菌A蛋白A功能域序列：

上游引物As序列为：5′-AAGCTTggtgaagctcaaaaacttaatgact3′；

下游引Aa序列为：5′-CTCGAGtaaaacgttagtgctttggctt3′；

位置：两端酶切位点分别为HindIII、Xho I；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、52℃30Sec、72℃1min循环扩增30次；

(c)将上述PCR扩增产物连接到pMD-18T载体上，测序正确后双酶切连接到步骤(a)得到的质粒pUC57-C上，得到质粒pUC57-AC，测序正确后用HindIII和BamH I双酶切，电泳回收目的片段后，连接到用相同双酶切的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒 pDG1662-CotB-AC，转换大肠杆菌DH5α，涂氯霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR及双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB-AC，即为重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体。

所述步骤(1)(a)中，扩增的枯草芽胞杆菌为BGSC NO.1A771株(可以通过正规购买渠道购买得到)。

所述制备方法，还包括以下步骤：

(3)验证枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体：

(a)扩增步骤(2)(c)中的阳性克隆的大肠杆菌DH5α，试剂盒提取质粒pDG1662-CotB-AC，Nde I酶切线性化后，电转化枯草芽孢杆菌，转化方法为：

①挑取一环孢子接种于生长培养基中，过夜培养种子液；

②将种子以1/16的接种量接种于生长培养基中，37℃摇床震荡培养，至OD600在0.85～0.95；

③冰水浴冷却培养物10min，4℃，5000×g，离心5min收集菌体，得细胞收集物；

④反复用冰冷的电击缓冲液洗涤细胞收集物4次；

⑤用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，使得细胞浓度在1～1.3×1010cfu/ml，-80℃保存；

⑥转化：转化条件为：60μl感受态细胞+1μl DNA混匀并转移到冰冷的电转化杯中，冰浴1～1.5min后，电击一次；

⑦电击完毕之后，立即加入1ml复苏培养基，7℃摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂氯霉素抗性平板筛选阳性克隆；

(b)提取枯草芽孢杆菌基因组，进行PCR鉴定，并应用抗生素抗性鉴定质粒与枯草芽孢杆菌基因组是否重组；取PCR鉴定为阳性、且质粒与枯草芽孢杆菌基因组重组者，进行下一步操作；

(c)取上述转化成功的枯草芽孢杆菌，摇菌发酵，37℃培养96h，室温静置1d，待枯草芽孢杆菌芽孢成率达95％以上时，收集芽孢，免疫荧光鉴定免疫球蛋白结合蛋白功能域是否在芽胞表面得到表达。

所述步骤(3)(a)①中的生长培养基为LB+0.5M山梨醇。

所述步骤(3)(a)②中的生长培养基为LB+0.5M山梨醇。

所述步骤(3)(a)④、⑤中的电击缓冲液为：LB+0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油。

所述步骤(3)(a)⑥中的电击条件为：25μF，200Ω，4.5～5.0ms。

所述步骤(3)(a)⑦中的复苏培养基为：LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇。

所述步骤(3)(c)中，免疫荧光鉴定目的蛋白是否得到有效表达的方法为：

①10000g离心10min收集菌体，用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次；

②用10mL SET buffer重悬沉淀，加10mg/mL溶菌酶1mL，37℃孵育1h，10000g离心得沉淀；

③用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次，PBS重悬后加人源免疫球蛋白(hIgG)37℃共孵育1h；

④用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次，PBS重悬后加FITC标记羊抗人IgG37℃共孵育1h；

⑤用10mL PBS洗沉淀3次，2min/次，PBS重悬后于荧光显微镜下观察结果，重组菌有强荧光而阴性对照无荧光，表明重组菌能特异的结合人源IgG，证明了免疫球蛋白结合蛋白功能域在芽孢表面得到了有效表达，并且具有结合人源IgG的生物活性。

一种含有上述表达重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体的重组枯草芽孢杆菌，是通过将表达重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体导入宿主细胞枯草芽孢杆菌得到的。

所述的重组枯草芽孢杆菌可以用于制备粘膜免疫佐剂，应用时，与抗原一起给药。

一种粘膜免疫佐剂，是通过以下方法得到的：培养含有表达重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白表达载体的重组枯草芽孢杆菌，得到含有芽孢的培养液，即为粘膜免疫佐剂。

一种在哺乳动物中诱导对抗原的免疫应答的组合物，其至少包含一种抗原和一种有佐剂活性的重组芽孢，所述有佐剂活性的重组芽孢是通过培养含有表达重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白表达载体的重组枯草芽孢杆菌得到的。

所述的抗原和佐剂被制剂化，以便于给药于哺乳动物的粘膜表面。

所述粘膜表面是鼻内、口或胃肠道。

所述的抗原以融合人源IgG Fc段形式制备，进一步地，抗原是人源IgG，或融合人源IgGFc段的重组蛋白。

本发明用免疫球蛋白结合蛋白重组载体构建重组枯草芽孢杆菌口服疫苗的研究方案是“扬长避短”的一种新尝试，即通过芽孢直接展示免疫球蛋白结合蛋白与人源IgGFc段结合将融合人源IgGFc段的基因工程蛋白吸附在芽孢表面进行粘膜免疫。

本发明中涉及使用的现有核苷酸序列(除引物外)均能在已发表的本领域学术刊物即 GenBank中检索而得，本领域普通技术人员均能在参考本领域教科书或实验手册的基础上完成本发明涉及的分子生物学和细胞生物学试验。

本发明的有益效果如下：

1、经济、简捷，将免疫球蛋白结合蛋白插入枯草芽孢杆菌基因组进而展示在芽孢表面可以随意扩增持续应用。

2、模块化研制，模块化组合，可以将不同的抗原与人源IgG Fc段融合表达，再与本发明制备的重组芽孢佐剂亲和结合到一起进行免疫。

综上所述，本发明枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白重组载体具有成本低、效果好等优点，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为本发明的枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白重组载体的构建示意图。

图2为本发明抗原与佐剂的作用方式示意图，其中抗原与人源IgG Fc段为融合蛋白。

图3为双酶切鉴定电泳图，其中，M泳道为Marker，A泳道为pDG1662-CotB-AC质粒酶XhoI、HindIII双酶切的A片段，B泳道为pDG1662-CotB-AC质粒用BamHI、HindIII双酶切的AB片段，C泳道为pDG1662-CotB-AC质粒用HindIII、EcoRI双酶切后的CotB片段，D泳道为XhoI、BamHI双酶切后的C片段。E泳道为EcoRI、BamHI双酶切后的CotB-AC片段。

图4PCR鉴定电泳图，其中，M泳道为Marker，A泳道为B1/B2为引物扩增的CotB片段，B泳道为B1/G2为引物扩增的CotB-AC片段，C泳道为As/G2扩增的AC片段。

图5为免疫荧光鉴定pDG1662-CotB-AC重组载体图；其中，A：重组菌株可见光图片；B：野生菌株可见光图片；C：重组菌株荧光显微镜图片可见较强的荧光；D：野生菌株荧光显微镜图片无荧光；由图可见，pDG1662-CotB-AC重组载体成功表达了免疫球蛋白结合蛋白。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1构建重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白表达载体，并进行验证

方法如下：(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的(BGSC NO.1A771株)CotB基因调控序列及编码序列(如序列表1所示)：

上游引物B1序列为：5’GAATTCgaatccgagtttcgcaagtcct3’(如序列表2所示)；

下游引物B2序列为：5’AAGCTTggatgattgatcatctgaagattt3’(如序列表3所示)；

位置：两端酶切位点分别为EcoR I、HindIII；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体(大连宝生物试剂盒)，反应体系为：5μL连接buffer+0.5μL pMD-18T载体+4.5μL目的片段；转化大肠杆菌DH5α，PCR扩增阳性的菌株送测序；

(c)测序正确的质粒用EcoR I和HindIII双酶切，电泳回收目的片段，连接到用相同双酶切的质粒pDG1662上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR既双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)于上海博亚生物技术有限公司全序列合成链球菌G蛋白C1功能域(如序列表4所示)于载体pUC57上，两端分别加入Xho I、EcoR I酶切位点，得到质粒pUC57-C；

(b)PCR方法扩增金黄色葡萄球菌A蛋白A功能域序列(如序列表5所示)：

上游引物As序列为：5′-AAGCTTggtgaagctcaaaaacttaatgact3′(如序列表6所示)；

下游引Aa序列为：5′-CTCGAGtaaaacgttagtgctttggctt3(如序列表7所示)′；

位置：两端酶切位点分别为HindIII、Xho I；

(c)将上述PCR产物连接到pMD-18T载体测序，测序正确后双酶切连接到步骤(a)得到的质粒pUC57-C上，得到质粒pUC57-AC，测序正确后用HindIII和BamH I双酶切，电泳回收目的片段后，连接到用相同双酶切的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-AC，转换大肠杆菌DH5α，涂氯霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR及双酶切鉴定(如图3所示)，从而得到质粒pDG1662-CotB-AC，即为重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体；构建示意图如图1所示；

(3)验证枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体：

(a)扩增上述阳性克隆的大肠杆菌DH5α，试剂盒提取质粒pDG1662-CotB-AC，Nde I酶切线性化后，电转化枯草芽孢杆菌，转化方法为：

①挑取一环孢子接种于生长培养基中，过夜培养种子液；

③冰水浴冷却培养物10min，4℃，5000×g，离心5min收集菌体；

④反复用冰冷的电击缓冲液洗涤细胞收集物4次；

⑤用原培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，使得细胞浓度在1～ 1.3×1010cfu/ml，-80℃保存；

(b)提取枯草芽孢杆菌基因组，进行PCR鉴定，以及应用抗生素抗性鉴定质粒与枯草芽孢杆菌基因组是否重组；取PCR鉴定为阳性(如图4所示)，且质粒与枯草芽孢杆菌基因组重组者，进行下一步操作；

(c)取上述转化成功的枯草芽孢杆菌，摇菌发酵，37℃培养96h，室温静置1d，待枯草芽孢杆菌绝大部分转变成芽孢后，收集芽孢，免疫荧光鉴定免疫球蛋白结合蛋白功能域在芽胞表面的表达，如图5所示，野生枯草芽孢杆菌菌株作为对照。

实施例2

(一)以枯草芽孢杆菌的CotB基因的启动子及部分编码序列(位置-263～825nt)为载体蛋白与免疫球蛋白结合蛋白功能域编码序列一同连接到整合质粒pDG1662(BGSCAccession：ECE113)amyE基因中间部位。

具体步骤如下：

1.以BGSC 1A771菌株基因组为模板，Taq DNA聚合酶通过PCR扩增获载体蛋白部分编码序列及其启动子

引物序列如下：

上游B1：5-GAATTCgaatccgagtttcgcaagtcct-3(含EcoRI酶切位点)；

下游B2：5-AAGCTTggatgattgatcatctgaagattt-3(含HindIII酶切位点)；

PCR扩增条件：95℃4min，(95℃30sec、53℃30sec、72℃1min)×30个循环。

结果：获得1088bp的包含CotB启动子及部分编码序列的DNA片段，进行T-A连接，测序正确后记作CotB保存。

目的序列的获得：

(a)于上海博亚生物技术有限公司全序列合成链球菌G蛋白C1功能域于载体pUC57上，两端分别加入Xho I、EcoR I酶切位点，得到质粒pUC57-C。

(b)PCR方法扩增金黄色葡萄球菌A蛋白A功能域序列：

引物序列如下：

上游引物As序列为：5′-AAGCTTggtgaagctcaaaaacttaatgact3′；

下游引Aa序列为：5′-CTCGAGtaaaacgttagtgctttggctt3′；

(目的片段长189bp)

结果：获得189bp的SPA A功能域DNA片段，进行T-A连接，测序正确后记作SPAa保存。

(c)SPAa载体双酶切连接到步骤(a)得到的质粒pUC57-C上，得到质粒pUC57-AC。

(二)含pDG1662-CotB-AC重组载体的枯草芽孢杆菌种子菌的制备

转化枯草芽孢杆菌的过程如下：

于第一天上午取一满环枯草芽孢杆菌甘油菌划LB平板，37℃培养箱培养12h。挑单菌落至3ml LB培养基中，37℃，250rmin培养过夜。第二天上午取160μl培养液转接至8mlSPI培养基中，37℃，250rmin培养至对数生长末期(约4～5h)，取0.2ml培养液至2mlSPII培养基中，37℃，100rmin培养90min，加入20ul 10mmolL EGTA，再于37℃，100rmin培养10分钟。分装成0.5ml每管，加入5ul酶切线性化的目的DNA，再于37℃，250rmin培养90分钟，取菌液涂布氯霉素抗性LB筛选平板，从而获得转免疫球蛋白结合蛋白功能域基因的枯草芽孢杆菌，抗生素抗性试验、PCR、免疫荧光鉴定后的阳性克隆即为基因组中重组入目的序列的枯草芽孢杆菌种子菌。

(SP盐：0.2％(NH4)2SO4，1.4％K2HPO4，0.6％KH2PO4，0.02％MgSO4·7H2O，0.1％柠檬酸钠；SP I培养基：SP盐溶液加入1％体积浓度为50％葡萄糖溶液，1％体积100×CAYE溶液；SPII培养基：SP I培养基加入1％体积50mmol/LCaCl2溶液，1％体积250mmol/L MgCl2溶液)

(三)种子菌的大规模液体接种扩增培养

将(二)构建的枯草芽孢杆菌种子菌复苏后涂布于氯霉素抗性LB平板，37℃培养20h，挑取单一的抗性菌落与抗性培养基中增菌培养，经PCR鉴定AC阳性的枯草芽孢杆菌再次涂抗性平板，如此反复集中培养至不低于15代时PCR鉴定AC仍为阳性的克隆作为大规模接种扩增培养的种子菌，保藏备用。

(四)枯草芽孢杆菌pDG1662-CotB-AC重组载体佐剂的制备及免疫效果试验

1.枯草芽孢杆菌pDG1662-CotB-AC重组载体佐剂具体制备过程如下：

a)配方：将种子液按1∶100接种到氯霉素抗性的LB培养液中，37℃200rpm培养3d，显微镜观察芽孢成率达95％以上时收获菌体。4℃10000g离心15min，用生理盐水洗芽孢3次。1mg/ml溶菌酶37℃孵育30min，生理盐水洗芽孢3次。可用单批原液或多批原液配置。

b)包装胶囊：按0.5g/支规格进行胶囊包装，4℃保藏，既得。

上述的枯草芽孢杆菌pDG1662-CotB-AC重组载体粘膜佐剂微生物指标：活性枯草芽孢杆菌≥2×10¹⁰cpu/ml，大肠菌群数＜30cfu/100ml，致病菌不得检出。

2.粘膜佐剂的药效验证

a)疫苗复合物制备：将本发明佐剂与人源IgG按10⁹个芽孢：15ug比例混合后4℃共孵育过夜既得。大肠杆菌不耐热肠毒素(heat labile enterotoxin，LT)对照组按10ugLT加150ugIgG混合免疫。

B)试验分组(20g雌性BALB/c小鼠32只，随机分成下述4组，每组8只)：

加佐剂IgG组、无佐剂IgG组、LT IgG阳性对照组和生理盐水对照组。

c)BALB/c小鼠滴鼻免疫试验(10¹⁰菌/只)：

加佐剂IgG组：用上述疫苗复合物制备在第0d，1d，4d，7d，11d，17d，23d，29d，35d，41d，48d滴鼻；

无佐剂IgG组：用生理盐水溶解人源IgG在第0d，1d，4d，7d，11d，17d，23d，29d，35d，41d，48d滴鼻；

生理盐水对照组：用生理盐水在第0d，1d，4d，7d，11d，17d，23d，29d，35d，41d，48d滴鼻；

LT阳性对照组：用LT与人源IgG混合150ugIgG/只，在第0d，1d，4d，7d，11d，17d，23d，29d，35d，41d，48d滴鼻；

第53d检测小鼠抗人源IgG特异性IgG、IgA抗体。

3.实验结果：

佐剂免疫组8只(100％)小鼠人源IgG、IgA抗体均为阳性，而生理盐水对照组为阴性，与无佐剂组及LT阳性对照组比较佐剂组抗体水平更高，差异具有统计学意义。结果证明本发明的重组粘膜佐剂在口服疫苗中能显著增强抗原激发的小鼠机体免疫反应，并且优于LT，并且本发明的佐剂可以与融合人源IgG Fc段的抗原轻易结合从而制备不同疫苗或多价疫苗，较好的解决了当前粘膜免疫缺乏佐剂的现状。

血清ELISA A值统计学分析_{(themean±standard error of themean(sEM))}

注：*与同组生理盐水组比较P＜0.01

#与同组无佐剂组比较P＜0.01

与同组LT对照组比较P＜0.01。

Claims

1.重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体的制备方法，其特征在于：所述重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有免疫球蛋白结合蛋白功能域编码基因，制备方法包括以下步骤：

（1）调取载体蛋白基因：

（a）PCR方法扩增SEQ ID NO.1所示的枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及部分编码序列；

（b）将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体，测序；

（c）将测序正确的CotB片段双酶切后连接到相同双酶切的pDG1662上，得到质粒pDG1662-CotB，其中，双酶切的酶切位点分别为EcoRⅠ、HindⅢ；

（2）调取目的基因及构建载体：

（a）全序列合成SEQ ID NO.4所示的链球菌G蛋白C1功能域于载体pUC57上，得到质粒pUC57-C；

（b）PCR方法扩增SEQ ID NO.5所示的金黄色葡萄球菌A蛋白A功能域序列；

（c）将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体，测序；

（d）测序正确的A功能域片段双酶切后连接到相同双酶切的质粒pUC57-C上，得到质粒pUC57-AC，经HindⅢ和BamHⅠ双酶切得到片段AC后连接到相同双酶切的步骤（1）得到的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-AC，即为重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

（1）调取载体蛋白基因：

（a）PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及部分编码序列：

上游引物B1序列为：5’GAATTCgaatccgagtttcgcaagtcct3’；

下游引物B2序列为：5’AAGCTTggatgattgatcatctgaagattt3’；

两端酶切位点分别为EcoRⅠ、HindⅢ；

（b）将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体，测序；

（c）测序正确后分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切，电泳回收目的片段后，依次连接到用相同双酶切的质粒pDG1662上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR及双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB；

（2）调取目的基因及构建载体：

（a）全序列合成链球菌G蛋白C1功能域于载体pUC57上，两端分别加入Xho Ⅰ、BamH Ⅰ酶切位点，得到质粒pUC57-C；

（b）PCR方法扩增金黄色葡萄球菌A蛋白A功能域序列：

上游引物As序列为：5'-AAGCTTggtgaagctcaaaaacttaatgact3'；

下游引Aa序列为：5'-CTCGAGtaaaacgttagtgctttggctt3'；

两端酶切位点分别为HindⅢ、XhoⅠ；

（c）将上述PCR扩增产物连接到pMD-18T载体上，测序；

（d）测序正确后双酶切将所述A功能域序列连接到步骤（a）得到的质粒pUC57-C上，得到质粒pUC57-AC，测序正确后用HindⅢ和BamHⅠ双酶切，电泳回收目的片段后，连接到用相同双酶切的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-AC，转换大肠杆菌DH5α，涂氯霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR及双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB-AC，即为重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：还包括以下步骤：

（3）验证枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体：

（a）扩增步骤（2）（d）中的阳性克隆的大肠杆菌DH5α，试剂盒提取质粒pDG1662-CotB-AC，NdeⅠ酶切线性化后，电转化枯草芽孢杆菌，转化方法为：

①挑取一环孢子接种于生长培养基中，过夜培养种子液；

④反复用冰冷的电击缓冲液洗涤细胞收集物4次；

（b）提取枯草芽孢杆菌基因组，进行PCR鉴定，并应用抗生素抗性鉴定质粒与枯草芽孢杆菌基因组是否重组；取PCR鉴定为阳性、且质粒与枯草芽孢杆菌基因组重组者，进行下一步操作；

（c）取上述转化成功的枯草芽孢杆菌，摇菌发酵，37℃培养96h，室温静置24h，待枯草芽孢杆菌芽孢成率达95%以上时，收集芽孢，免疫荧光鉴定免疫球蛋白结合蛋白功能域是否在芽胞表面得到表达。

4.利用权利要求1～3中任一项所述的重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体的制备方法得到的重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体。

5.一种含有权利要求4所述的表达重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体的重组枯草芽孢杆菌。

6.权利要求5所述的重组枯草芽孢杆菌在制备粘膜免疫佐剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述粘膜免疫佐剂与抗原联合给药。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述抗原为融合人源IgG Fc段的重组蛋白。

9.一种粘膜免疫佐剂，其特征在于：是通过以下方法得到的：培养权利要求5的重组枯草芽孢杆菌，得到含有芽孢的培养液，即为粘膜免疫佐剂。

10.一种在哺乳动物中诱导对抗原的免疫应答的组合物，其特征在于：所述组合物至少包含一种抗原和一种有佐剂活性的重组芽孢，所述有佐剂活性的重组芽孢是通过培养权利要求5的重组枯草芽孢杆菌得到的。