CN110452895B

CN110452895B - 一种来源于噬菌体的溶菌酶及其基因与应用

Info

Publication number: CN110452895B
Application number: CN201910656504.1A
Authority: CN
Inventors: 金敏; 郭讯; 易志伟; 产竹华; 陈兴麟; 曾润颖
Original assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Third Institute of Oceanography MNR
Current assignee: China Ocean Mineral Resources R & D Association (china's Ocean Affairs Administration); Third Institute of Oceanography MNR
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2019-07-19
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2039-07-19
Also published as: CN110452895A

Abstract

本发明涉及一种来源于噬菌体的溶菌酶及其基因与应用，该溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。编码所述溶菌酶的基因来自于采集自深海的噬菌体WP3，本发明对该酶进行了异源表达与纯化，经检测，该酶的最适温度为40℃，在20℃‑60℃范围内能保持50％以上的活力，具有较宽的作用温度范围；最适pH值为6.0，在pH 4.0‑10.0范围内能保持50％以上的活力，具有广泛的作用pH范围。本发明提供的溶菌酶具有广谱的杀菌活性，能高效杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌，为研制溶菌酶型抗菌产品提供了优异的基因资源和酶资源，具有广泛的应用前景。

Description

一种来源于噬菌体的溶菌酶及其基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种来源于噬菌体的溶菌酶及其基因与应用。

背景技术

近年来由于抗生素的滥用，导致环境中和人体内的抗生素抗性细菌越来越多。传统的抗生素不能杀灭具有抗生素抗性的细菌，因此亟需寻找可以替代抗生素的新型抗菌药物。目前，由于噬菌体具有特异高效杀灭宿主菌的特性，使其成为开发新型生物杀菌制剂的热点之一。

噬菌体是一种能感染细菌等微生物的病毒，如同其他病毒，噬菌体是一种专性寄生生物，它必须依赖宿主细胞来实现自身的生存和繁殖。当噬菌体感染宿主菌时，噬菌体会将DNA等遗传物质注入到宿主菌内，并利用宿主菌的DNA复制、蛋白表达系统进行自身的复制。当生存环境恶劣时，噬菌体就会大量表达溶菌酶等蛋白来裂解宿主，以便释放子代噬菌体寻找新的宿主。噬菌体溶菌酶是由双链DNA噬菌体在裂解生活周期末期在宿主菌体内产生的酶，除单链DNA的丝状噬菌体外，大多数噬菌体依靠溶菌酶降解宿主菌的细胞壁从而释放子代噬菌体。溶菌酶可以降解细菌细胞壁的肽聚糖，导致细菌体内渗透压不平衡而裂解。

噬菌体溶菌酶具有裂解细菌效率高，不易产生耐药菌株，不会导致细菌抗性和毒力基因传播等优点，为研究者开发新型抗菌药物特别是能杀灭抗生素耐药细菌的生物制剂提供了广阔的发展前景。近年来随着研究者对噬菌体溶菌酶研究和应用的重视，越来越多的溶菌酶已经通过原核表达系统等方法进行制备和纯化，并且应用于医药、食品保鲜、水产养殖等方面。

然而，现有噬菌体溶菌酶的种类较少，且大部分存在作用温度范围较窄、作用pH范围较窄等不足，本领域人员一直致力于寻找新的具有优良生物活性的噬菌体溶菌酶。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来源于噬菌体的溶菌酶及其基因与应用，该溶菌酶的基因(本发明将该基因命名为lysK1)来自深海噬菌体，该溶菌酶的作用pH和温度范围较广，热稳定性较好，且具有广谱的杀菌活性，能高效杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌，在医药、食品保鲜、水产养殖等方面都具有良好的应用前景。

为此，第一方面，本发明提供一种溶菌酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明提供一种基因，其编码所述溶菌酶。

进一步，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

第三方面，本发明提供一种核酸构建体，其包含本发明所述的基因。

第四方面，本发明提供一种细胞，其表达本发明所述的溶菌酶，和/或包含本发明所述的基因或核酸构建体。

进一步，所述细胞可为原核细胞或真核细胞。

进一步，所述细胞包括但不限于：大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸杆菌细胞、放线菌细胞、酵母菌细胞或藻类细胞等。

第五方面，本发明提供一种生产溶菌酶的方法，其包括以下步骤：在允许表达所述溶菌酶的条件下培养本发明所述的细胞；和从所得培养物中纯化溶菌酶。

第六方面，本发明提供所述溶菌酶在制备用于预防、抑制或治疗细菌感染的产品中的应用。

进一步，所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。在具体的实施方式中，所述细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、恶臭假单胞菌和太平洋火色杆菌。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种来源于噬菌体的溶菌酶，该酶具有广谱的杀菌活性，能高效杀灭多种革兰氏阳性和阴性细菌。本发明提供的溶菌酶的最适pH值为6.0，在pH 4.0-10.0范围内能保持50％以上活力；最适作用温度为40℃，在20℃-60℃的范围内能保持50％以上的活力，具有较宽的作用温度范围，且具有极佳的热稳定性。本发明实现了对所述溶菌酶的异源表达和纯化，避免了噬菌体的其他可能导致毒性或抗性的基因在细菌中传播，且本发明提供的溶菌酶与已知的溶菌酶蛋白序列相似性极低，为研制溶菌酶型抗菌产品提供了优异的基因资源和酶资源，具有广泛的应用前景。

附图说明

通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：

图1为纯化后的LysK1蛋白的SDS-PAGE图；

图2为温度对lysK1蛋白的相对酶活的影响；

图3为pH对lysK1蛋白的相对酶活的影响；

图4为lysK1蛋白的热稳定性检测结果。

具体实施方式

下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。

除非另外定义，本公开中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

实施例1lysK1基因的获取

本实施例所用的噬菌体分离自西太平洋深度2800m的海水，该噬菌体为长尾噬菌体phage WP3(噬菌体WP3)。利用引物F(5’-ATCGGATCCATGAGCCCGACTGTAAGCGCCA-3’)和引物R(5’-GGACTCGAGTCAGATCTTCGGTCCCTCAGCCT-3’)PCR扩增该深海噬菌体的lysK1基因片段，同时在其上下游分别引入BamH1和Xho1酶切位点。所述lysK1基因的CDS(Coding sequence，编码序列)全长为1221bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码406个氨基酸。

实施例2lysK1基因的克隆表达

将实施例1得到的lysK1基因片段连接至pET28a载体的BamH1和Xho1酶切位点之间，获得pET28a-lysK1重组载体；将获得的pET28a-lysK1重组载体转化至大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于含有10mg/ml卡那霉素以及10％琼胶的LB固体培养平板上，37℃下培养24小时；将阳性克隆菌株接种至含有10mg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜；将过夜培养的阳性克隆菌株以1:100的稀释比例接种到500ml的LB液体培养基中(含有10mg/ml卡那霉素)，37℃，200rpm震荡培养至OD₆₀₀达到0.6，加入终浓度为1mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在18℃下经12h进行LysK1溶菌酶的诱导表达。

实施例3LysK1蛋白的分离纯化

15000rpm离心收集实施例2诱导表达得到的菌体，PBS清洗三次后，用裂解缓冲液(0.3mol/L NaCl，10mmol/L咪唑，50mmol/L NaH₂PO₄，pH 8.0)重悬菌体。利用超声破碎法(功率80％，5s/5s脉冲循环)在冰上对菌体进行破碎裂解，15000rpm高速离心，收集上清液；将收集得到的上清液与Ni-NTA Agarose旋转混匀30min，按照Ni-NTA Agarose试剂盒(QIAGEN)说明书进行lysK1溶菌酶的纯化，即得到LysK1蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，进行SDS-PAGE电泳分析，电泳检测结果见图1，第1和第2泳道即为纯化后的重组LysK1蛋白，其大小与预计分子量一致(48.5kD)。

实施例4抑菌试验

分别将金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)和太平洋火色杆菌(Flammeovirga pacifica)复苏，挑取单菌落于LB液体培养基中37℃，200rpm过夜培养8h，分别取适量菌液用PBS缓冲液稀释至OD₆₀₀为0.1-0.2，使其菌液浓度达到10⁸cfu/mL。

分别取上述稀释后的200μL菌液在LB固体培养基上均匀涂布，放上灭菌牛津杯，在牛津杯中分别加入200μL实施例3制备得到的LysK1蛋白(浓度为1mg/mL)，在37℃恒温培养箱中培养12h观察并测量抑菌圈大小。

由抑菌结果可知，重组溶菌酶lysK1具有广谱的杀菌活性，对多种革兰氏阳性和革兰氏阴性菌都具有较好的抑菌效果，其中对革兰氏阳性细菌的抑菌效果比革兰氏阴性细菌的抑菌效果要好。

选择金黄色葡萄球菌为底物，按照上述方法测定LysK1蛋白在不同pH值(pH＝4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0)和不同温度(20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃)下的相对酶活，结果见图2和图3，由图2可知溶菌酶lysK1的最适作用温度为40℃，在20℃-60℃范围内能保持50％以上的活力，具有较宽的作用温度范围。溶菌酶lysK1的最适作用pH值为6.0，在pH 4.0-10.0范围内能保持50％以上的活力，具有广泛的作用pH范围。

热稳定性测试：将LysK1蛋白溶液分别置于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃条件下保温2h后，再按上述方法检测其相对酶活性，将未经保温处理的酶的相对酶活定义为100％。检测结果见图4所示，由图4可知，LysK1蛋白具有良好的热稳定性，在60℃下保温2h后仍维持40％以上的相对酶活。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

中国大洋矿产资源研究开发协会（中国大洋事务管理局）

<120> 一种来源于噬菌体的溶菌酶及其基因与应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 406

<212> PRT

<213> 噬菌体 WP3(phage WP3)

<400> 1

Met Ser Pro Thr Val Ser Ala Ile Gly Met Ala Leu Asn Ile Glu Tyr

1 5 10 15

Glu Arg Pro Pro Leu Gly Leu Asn Leu Glu Ala His Gln Asp Thr Ala

20 25 30

Gly Asn Trp Gln Ile Gly Asp Gly Leu Thr Ser Leu Pro Asp Gly Thr

35 40 45

Lys Val Gly Pro Gly Met Ser Leu Thr Pro Ala Glu Tyr Ala Ala Ala

50 55 60

Ser Asn Glu Thr Leu Arg Lys Phe Glu Ala Gly Val Leu Arg Leu Val

65 70 75 80

Ser Lys Asp Val Gln Leu Asn Gln Tyr Gln Phe Asp Ala Leu Val Phe

85 90 95

Leu Ala Trp Asn Ile Gly Leu Ala Ala Phe Glu Asp Ser Thr Val Leu

100 105 110

Ser Met Val Asn Ala Glu Arg Trp Glu Asp Ala Ala Tyr His Phe Gly

115 120 125

Asp Trp Val Tyr Ala Thr Val Glu Asn Asp Phe Asn Ala Asp Gly Thr

130 135 140

Val Arg Gly Thr Ala Lys Tyr Gly Pro Asp Gly Val Leu Leu Ala Lys

145 150 155 160

Gly Gln Ile Trp Lys Arg Ala Tyr Arg Gly Leu Ala Arg Arg His Met

165 170 175

Ala Glu Ala Cys Leu Ser Leu Gly Phe Asp Trp Arg Asp Ala Cys His

180 185 190

Glu Asp Ala Ile Glu Leu Glu Ser Val Ser Glu Lys Thr Asp Tyr Gly

195 200 205

Trp Arg Asp Arg Val Thr Tyr Lys Thr Pro Trp Ala Asp Val Leu Arg

210 215 220

Val Ala Arg Glu His Pro Leu Pro Ala Pro Lys Met Leu Gly Glu Lys

225 230 235 240

Glu Ala Val Met Gly Lys Thr Leu Val Leu Pro Glu Asn Trp Asp Asp

245 250 255

Leu Thr Ala Asp Gln Gln Thr Ala Trp Leu Asn Asn Asp Gln Thr Ala

260 265 270

Lys Leu Lys Ala Lys Ser Thr Ala Gly Val Val Val Pro Lys Lys Ala

275 280 285

Ile Ile Glu Thr Pro Asn Leu Lys Pro Gly Ala Pro Ala Lys Pro Leu

290 295 300

Glu Glu Ser Lys Ser Ala Asn Gly Leu Ala Lys Lys Lys Ala Gly Glu

305 310 315 320

Glu Ser Leu Lys Val Ser Ala Ile Val Ser Gly Val Thr Ala Thr Thr

325 330 335

Ala Val Val Arg Glu Val Thr Gly Ala Ala Lys Ala Ala Thr Glu Thr

340 345 350

Ala Thr Asp Ala Thr Gly Phe Val Leu Gly Phe Thr Leu Gln Gln Leu

355 360 365

Met Ile Ile Gly Ile Ile Ile Gly Ile Gly Thr Leu Ala Val Gly Ala

370 375 380

Phe Arg Trp Trp Val Gly Arg Asn Met Leu Trp Glu Gly Arg Gln Glu

385 390 395 400

Ala Glu Gly Pro Lys Ile

405

<210> 2

<211> 1221

<212> DNA

<213> 噬菌体 WP3(phage WP3)

<400> 2

atgagcccga ctgtaagcgc cattgggatg gccctgaata tcgaatatga gcgcccaccc 60

ttggggctga accttgaggc gcatcaggac acagcgggga attggcagat cggagacggg 120

ctgacgtctc tgccggatgg cacaaaggtc gggccgggta tgagcctgac gccggctgag 180

tatgcggccg catcgaatga gaccttgcgc aagttcgagg cgggggtcct gcggctggtc 240

tccaaggatg tgcagctcaa ccagtaccag ttcgatgccc tggtatttct tgcatggaat 300

atcgggctgg ccgcgttcga ggactcgacc gtcctgagca tggtcaatgc cgagcgctgg 360

gaggatgccg cctatcactt cggggattgg gtgtatgcga ccgtggagaa tgatttcaat 420

gcggatggca cggtgcgtgg taccgcgaag tatgggccgg acggagttct gctcgccaag 480

ggtcagatat ggaagcgcgc ctatcgcggt ctggcccggc gccacatggc ggaagcctgc 540

ctgtcgctgg gttttgactg gcgtgacgcc tgccatgaag acgccatcga actcgaatcc 600

gtgtccgaaa agacggatta tggctggcgg gatcgggtga cttacaagac gccgtgggca 660

gatgtgctga gggttgcgcg tgagcatccc ctgcctgcac cgaagatgct gggtgagaag 720

gaggctgtaa tgggcaagac actggtgctg ccggaaaact gggatgacct gactgcggat 780

cagcagacgg catggctgaa caatgaccag accgcgaagc tgaaagcgaa atcaactgcg 840

ggcgttgttg tcccgaagaa ggcgatcatc gagacgccaa acctcaagcc tggcgctccg 900

gccaagccgc tggaagaatc gaagtcggca aacgggctgg cgaagaagaa ggctggcgag 960

gaatcgctca aggtcagcgc cattgtgagt ggcgtcacgg cgacaactgc cgtggtgcgc 1020

gaggtgacgg gcgcagcaaa ggcggccact gaaaccgcga cggacgcaac cgggttcgtt 1080

ctggggttca cgctccagca gctcatgatt atcggcatca tcattggcat aggcacgctc 1140

gctgtgggcg ctttccgctg gtgggtcggc cgcaacatgc tctgggaagg gcgccaagag 1200

gctgagggac cgaagatctg a 1221

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atcggatcca tgagcccgac tgtaagcgcc a 31

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggactcgagt cagatcttcg gtccctcagc ct 32

Claims

1.一种溶菌酶，其特征在于，所述溶菌酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的溶菌酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包含权利要求2或3所述的基因。

5.一种细胞，其特征在于，所述细胞表达权利要求1所述的溶菌酶，和/或包含权利要求2或3所述的基因或权利要求4所述的核酸构建体。

6.如权利要求5所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括原核细胞、真核细胞。

7.如权利要求6所述细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌细胞、枯草芽孢杆菌细胞、乳酸杆菌细胞、放线菌细胞、酵母菌细胞或藻类细胞。

8.一种生产溶菌酶的方法，其特征在于包括以下步骤：在允许表达权利要求1所述溶菌酶的条件下培养权利要求5-7任一项所述的细胞；和从所得培养物中纯化溶菌酶。

9.权利要求1所述溶菌酶在制备用于预防、抑制或治疗细菌感染的产品中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。