CN108410884A - 噬菌体Vp670穿孔素基因holA的应用 - Google Patents

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田雨顺
刘秋婷
云龙
胡超群
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Abstract

本发明公开了噬菌体Vp670穿孔素基因holA的应用。本发明的holA基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；cwlQ基因序列如SEQ ID No.3所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明首次在噬菌体Vp670中鉴定出holA为穿孔素基因，cwlQ为内溶素基因。本发明中HolA单独在细菌中表达，足以杀死细菌细胞，且宿主菌不易产生耐受性，可应用于克隆载体或自杀质粒，可大大提高阳性重组子的筛选效率，减少实验室工作量。HolA和CwlQ蛋白在菌体内共同表达，表达产物可完全裂解细菌，迫使菌体内容物大量流失，为温和裂解细菌等微生物，提取细胞内容物提供了一种有效的技术手段。

Description

噬菌体Vp670穿孔素基因holA的应用
技术领域：
本发明属于生物基因工程领域，具体涉及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)噬菌体Vp670的一个穿孔素基因(holA)和一个内溶素基因(cwlQ)的应用。
背景技术：
溶藻弧菌作为革兰氏阴性菌，对于海洋生物及人类而言是一种条件致病菌。据报道由溶藻弧菌爆发引起的流行性疾病对水产养殖业造成巨大的经济损失。一般溶藻弧菌和其它致病弧菌都是通过抗生素来进行防治，抗生素的使用带来了一系列环境及生态问题。随着超级耐药菌的出现，近年来利用噬菌体进行致病菌的生物防治重新成为研究的热点，此外开发和利用噬菌体的基因资源一直在持续进行之中。
生物技术实验中，超声破碎和溶菌酶的使用是目前裂解细菌并提取细胞内容物广泛采用的两种方法。但超声破碎细菌过程繁琐，破碎条件暴力，噪音大，且细菌破解率低，处理过程会产生大量的热，对细胞内容物活性也会产生影响，尤其是对热敏感的蛋白和核酸。溶菌酶方法成本高，且溶菌酶对于革兰氏阴性细菌细胞壁破坏很小，溶菌率低。所以，探寻一种新的经济有效细菌裂解方法显得尤为重要。
此外，微生物遗传操作中，常常需要稳定可靠的正向和反向选择标记基因。近些年来微生物学家应用细菌的毒素-抗毒素系统中的致死基因作为载体的选择标记来提高重组子筛选效率。其中以致死基因sacB、ccdB应用最为广泛。但在实际操作中，我们发现相当数量的细菌sacB基因表达代谢产物的致死性并不敏感，导致筛选中大量假阳性存在；ccdB表达产物的毒性具有广谱性，但是细菌容易对ccdB表达产物的作用位点产生突变。从而产生假阳性。因此筛选出新的具有广泛实用性和足够强烈毒性的致死基因，并应用于微生物的遗传操作十分必要。
发明内容：
本发明的目的是提供噬菌体Vp670穿孔素基因holA的应用。
本发明的holA基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；cwlQ基因序列如SEQ ID No.3所示，其编码氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明首次在噬菌体Vp670中鉴定出holA为穿孔素基因，cwlQ为内溶素基因。
将holA及cwlQ构建在穿梭表达载体中，并转化入大肠杆菌以及溶藻弧菌中，通过诱导二者表达，并统计细菌存活数量发现：诱导细菌表达HolA蛋白或HolA与CwlQ蛋白，都会抑制并完全杀死大肠杆菌和溶藻弧菌。通过电子显微镜观察诱导后的溶藻弧菌菌体形态发现：单独诱导细菌表达HolA蛋白可破坏细菌细胞膜，菌体体壁产生孔洞导致内容物流失，细胞外膜层消失，最终细胞死亡；而诱导细菌表达HolA和CwlQ蛋白后，菌体完全破裂死亡，内容物大量流出。以上结果再结合生物信息学分析表明：HolA在细胞膜上形成寡聚体围成的非特异性通道，导致细胞内容物的流出而死亡，由于HolA并非通过与菌体的关键蛋白结合来杀死细胞，因此细菌细胞不容易产生针对性的突变；HolA和CwlQ共同表达，CwlQ通过HolA形成的孔道到达肽聚糖层，破坏肽聚糖层，细胞完全裂解，内容物大量释放，细菌快速死亡。因此本发明中的holA和cwlQ在菌体内表达，可以从内部以温和的条件破坏细菌结构，迫使菌体解体，内容物流失。因此，holA和cwlQ可以用于细菌等微生物的破壁以及基因工程载体或自杀质粒的选择标记基因。
因此，本发明提供编码如下蛋白质(a)或(b)的穿孔素基因在制备菌体破壁制剂中的应用、或在克隆载体构建中的应用、或自杀质粒构建中的应用：
(a)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有穿孔素活性的由(a)衍生的蛋白质。
所述的穿孔素基因，其核苷酸序列如SED ID No.1所示。
所述的穿孔素基因与编码如下蛋白质(c)或(d)的内溶素基因联合在制备菌体破壁制剂中的应用、或在克隆载体构建中的应用、或自杀质粒构建中的应用：
(c)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d)在(c)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有穿孔素活性的由(c)衍生的蛋白质。
所述的内溶素基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
所述的在克隆载体构建中的应用、或自杀质粒构建中的应用是作为选择标记基因。
所述的穿孔素基因与内溶素基因联合是将穿孔素与内溶素基因共表达。
所述的菌体破壁制剂是细菌菌体破壁制剂，进一步优选是大肠杆菌或溶藻弧菌菌体破壁制剂。
本发明公开了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)噬菌体Vp670(又名ΦPE333)的一个穿孔素基因(holA)和一个内溶素基因(cwlQ)及其二者的应用。本发明中HolA单独在细菌中表达，足以杀死细菌细胞，且宿主菌不易产生耐受性，可应用于克隆载体或自杀质粒，可大大提高阳性重组子的筛选效率，减少实验室工作量。HolA和CwlQ蛋白在菌体内共同表达，表达产物可完全裂解细菌，迫使菌体内容物大量流失，为温和裂解细菌等微生物，提取细胞内容物提供了一种有效的技术手段。
附图说明
图1是HolA蛋白保守结构域及亲水性分析。图中：A，HolA跨膜结构域预测；B，亲水性预测显示HolA具有一个亲水的C末端。
图2是CwlQ保守结构域预测。
图3是HolA及CwlQ表达对宿主细胞存活的影响。图中：“-”，D-葡萄糖(D-Glu)封闭目标基因的表达；“+”，L-阿拉伯糖(L-Arab)诱导目标基因的表达；A,携带有不同重组质粒的大肠杆菌细胞存活计数；B，携带有不同重组质粒的溶藻弧菌细胞存活计数。
图4是诱导含有不同质粒形态的溶藻弧菌后各菌体形态电镜观察。图中：A，含有空质粒的LPN040细胞；B,表达HolA的LPN041细胞，白色箭头指示细胞表面的泡状物；C，表达HolA的LPN041细胞局部放大，白色框显示二个气泡状物；D，表达CwlQ的LPN042细胞；E，表达HolA和CwlQ的LPN043细胞；F，表达HolA和CwlQ的LPN043细胞局部放大。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而非对本发明的限制。
实施例1：holA及cwlQ生物信息学分析
噬菌体Vp670基因组由本发明人测序获得，并公布于GenBank库(KY290756.1)。Vp670基因组序列采用RAST注释(http://rast.nmpdr.org/)，分析发现orf3编码一种假想的蛋白，通过Blastp搜索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)发现，orf3编码产物与最相近的噬菌体穿孔素的氨基酸序列只有49％的一致性，但orf3编码产物具有一个噬菌体穿孔素的保守结构域，将orf3命名为holA，其序列如序列表SEQ ID No.1所示(具体为：GTGAGTGAAAAGATTGTAAAAGCAGTAGAGGTAGTCCGTGAGACTCTACCAGCAGCGCCACCTGCGGCGTATGTTGGTATGAAGTTCTACGGCATCTCTTTGCCAGATATAGTATCTATAGCTACTCTGATATACTTAGTTATACAGATTGGCTACATTCTTTATAAGTGGAGAAAGGGGATTTAA)，其表达产物命名为HolA，其氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
采用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)进行跨膜结构域预测，发现HolA具有单个跨膜结构域，C端位于细胞膜内侧(图1A)；采用ProtScale(https:// web.expasy.org/protscale/)进行亲水性分析，发现HolA的C端表现出亲水性(图1B)。HolA的这些特征与革兰氏阴性细菌噬菌体穿孔素的特征完全相符。
分析发现orf8编码一种假想蛋白，Blastp搜索发现，orf8编码产物与最相近的溶藻弧菌噬菌体A318的细胞壁水解酶具有98％的一致性，与多数细菌源细胞壁水解酶具有30-40％的一致性，因此相似性很低，orf8编码产物具有一个细胞壁水解酶保守结构域(图2)，orf8位于orf3附近，且Vp670基因组中不存在其它的细胞壁水解酶基因，因此推测orf8为内溶素基因，命名为cwlQ(其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体为：ATGTTCGTTGAAGCAATTCTATGGCTATCTCTTAATGTGCATCATGAGGCTCGTGGTGAGCCTTTCGAGTGCCAAGTAGCTGTAGCAGAAGTTACGATGCGAAGGGTATATTCTTCTTACTACCCTTCTACTGTAAAAGATGTTGTCTTGCAGCCTAAGCAGTTCTCTTGGACAATAGGTAAAGAGAATCCTGCTGACCACTCAATTATCACCTTCACTGACGCACTAGCTGCTCTTGAGGGTTATAGTAACTACTTAAGTGGTAATACGATAACTAGTACTGAACTGCACTATGCTCGTAAGGATGTAGACAACTACTGGACTCGCAAGATGCATAAGACATATGCTTGCGGCAATCATCAATTCTATGATAATGGAGGAAGACCTTGA)，其编码蛋白命名为CwlQ(其氨基酸序列如SEQ ID No.4所示)。
实施例2：构建穿孔素基因(holA)和内溶素基因(cwlQ)的表达质粒
为了探究穿孔素HolA和内溶素CwlQ的功能及二者的协同作用关系，利用质粒pBAD18-kan分别构建了仅含有cwlQ片段(其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)、仅含有holA片段(其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)和含有內溶素cwlQ与holA二基因融合片段的重组质粒。
cwlQ基因PCR扩增所用引物：
Endolysin-F:GCGAATTCGAGCTCGGTACCAGGAGGAATTCACCATGTTCGTTGAAGCAATTCT
Endolysin-R:CCAAGCTTGCATGCCTGCAGTCAAGGTCTTCCTCCATTATC
holA基因PCR扩增所用引物：
holin-F：TTACAATCTTTTCACTCACGTTCAAGGTCTTCCTCCATTATC
holin-R：GATAATGGAGGAAGACCTTGAACGTGAGTGAAAAGATTGTAA
构建含內溶素CwlQ与HolA二基因融合片段的重组质粒，需将cwlQ和holA基因序列作为模板，Endolysin-F和holin-R2作为引物进行PCR扩增，引物序列及具体反应如下：
holin-R2：CAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTAAATCCCCTTTCTCCAC
PCR酶采用TaKaRa公司的PrimeSTAR高保真预混酶。PCR反应体系为：模板2μl(50-100ng)，上下游引物各1μl，PrimeSTAR酶混合液25μl，去离子水21μl。PCR程序：98℃预变性2.5min；98℃变性10sec，56℃退火25sec，72℃延伸2min，30个循环；最后72℃延伸5min。PCR产物纯化采用PCR产物纯化试剂盒(TaKaRa)进行。
将上述3种片段与pBAD18-kan线性化质粒载体通过DNA重组酶(Vazyme)连接，具体操作步骤参照酶产品说明书。采用热激法把重组后产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中。具体方法参见大肠杆菌感受态细胞DH5α说明书(TaKaRa)。培养后，挑取平板上菌落并接种到含有Kan的LB液体培养基中培养12小时。用上游检测引物和下游检测引物进行PCR，采用1％的琼脂糖凝胶电泳检测重组情况。并将含有正确大小条带的PCR产物相对应的的菌液交送Invitrogen公司测序。
所用上游检测引物和下游检测引物序列为：
pBAD18-TF：GATTAGCGGATCCTACCTGACGC
pBAD18-TR：CTGATTTAATCTGTATCAGGCTG
扩大培养含空白质粒pBAD18-kan的菌以及含有上述正确重组质粒的3种菌，分别命名为大肠杆菌LPN027、大肠杆菌LPN028(含有holA)、大肠杆菌LPN029(含有cwlQ)、大肠杆菌LPN030(含有內溶素cwlQ与holA二基因融合片段)，采用质粒提取试剂盒(TaKaRa)分别提取4种质粒，具体步骤参照试剂盒说明书。进而获得pBAD18-kan、pBAD18-holA(holA基因插入到pBAD18-kan中)、pBAD18-cwlQ(cwlQ基因插入到pBAD18-kan中)、pBAD18-holA-cwlQ(cwlQ与holA二基因融合片段插入到pBAD18-kan中)4种质粒。
实施例3：构建穿孔素基因(holA)和内溶素基因(cwlQ)的溶藻弧菌可控表达菌
于脑心浸液培养基(BHI)中过夜培养溶藻弧菌E06333，培养温度30℃。分别将上述4种质粒(pBAD18-kan、pBAD18-holA、pBAD18-cwlQ、pBAD18-holA-cwlQ)分别电转化到溶藻弧菌E06333中，电转化的方法参加发明人已经公开专利(CN104195073A)。电击电压1.8kV，电击时间1ms。电击后细胞悬液迅速加入含0.3％D-Glu的BHI培养基(BD)中，30℃恢复培养1小时，培养液稀释10倍、100倍后分别取100μl涂布含有Kan抗性的LB平板，30℃过夜培养后，挑取菌落在含有卡那霉素(Kan)抗性的液体BHI中培养12小时。保存含有上述4种正确质粒的4种菌株，分别命名为溶藻弧菌LPN040(含pBAD18-kan)、溶藻弧菌LPN041(含pBAD18-holA)、溶藻弧菌LPN042(含pBAD18-cwlQ)、溶藻弧菌LPN043(含pBAD18-holA-cwlQ)。
实施例4：holA、cwlQ表达对大肠杆菌、溶藻弧菌存活的影响
采用含有Kan和0.3％D-Glu的液体LB培养基分别扩大培养含有上述4种质粒的溶藻弧菌和大肠杆菌细胞，直至其OD600nm达到0.6。离心并用液体LB培养基重悬洗菌，调整浓度至OD600nm达到0.5，稀释106倍，取0.1ml稀释液涂布在含有Kan(50μg/ml)和L-Arab(L-Arab，0.2％)的固体LB平板上，30℃过夜培养，用于计平板存活菌数量。
结果表明：如图3所示，单独诱导表达HolA(大肠杆菌LPN028、溶藻弧菌LPN041)或共表达HolA与CwlQ(大肠杆菌LPN030、溶藻弧菌LPN043)的平板上均无菌落长出。这表明不仅共表达HolA与CwlQ可以杀死重组细菌，单独表达的HolA也具有杀死重组菌的能力。单独诱导CwlQ表达对大肠杆菌LPN029、溶藻弧菌LPN042的生长没有影响，表达CwlQ本身在细胞内部不会产生毒害作用。
实施例5：holA、cwlQ表达对溶藻弧菌细胞结构的影响
为进一步验证HolA、CwlQ的功能，向上述实施例4中重悬的菌液中加入L-Arab(0.2％)，30℃孵育30min，孵育后电镜拍照，以不加L-Arab作为阴性对照。
电镜观察结果表明，如图4所示，含空白质粒pBAD18-kan的对照溶藻弧菌LPN040和仅含有pBAD18-cwlQ质粒的溶藻弧菌LPN042，在L-Arab诱导后菌体形态完整(图4A和D)，且二者形态无明显差别；L-Arab诱导仅含有pBAD18-holA质粒的溶藻弧菌LPN041后，可见弧菌外膜蛋白层被破坏，形态不完整(图4B)，且在菌体上形成孔洞，导致内容物流失(图4C)；L-Arab诱导含有pBAD18-holA-cwlQ质粒的溶藻弧菌LPN043后，可见菌体外膜蛋白层消失，细胞内大量颗粒物形成(图4E)，进一步，细胞完全破裂，内容物大量流失(图4F)。这表明，HolA虽然可以破坏细菌的细胞膜杀死细菌，但HolA与CwlQ的共同作用会极大加剧对细菌细胞结构的破坏程度，细胞因完全破裂，内容物大量流失而迅速死亡。
通过上述实施例，确定了噬菌体Vp670基因组中orf3(holA)和orf8(cwlQ)分别编码穿孔素和内溶素，并证明了二者的功能。holA基因可以开发成细菌遗传操作中的载体或自杀质粒的选择标记基因，而holA与cwlQ基因共同使用可以用于温和裂解微生物，提取微生物内容物成份。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 噬菌体Vp670基因holA的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 186
<212> DNA
<213> 噬菌体(Vp670)
<400> 1
gtgagtgaaa agattgtaaa agcagtagag gtagtccgtg agactctacc agcagcgcca 60
cctgcggcgt atgttggtat gaagttctac ggcatctctt tgccagatat agtatctata 120
gctactctga tatacttagt tatacagatt ggctacattc tttataagtg gagaaagggg 180
atttaa 186
<210> 2
<211> 61
<212> PRT
<213> 噬菌体(Vp670)
<400> 2
Met Ser Glu Lys Ile Val Lys Ala Val Glu Val Val Arg Glu Thr Leu
1 5 10 15
Pro Ala Ala Pro Pro Ala Ala Tyr Val Gly Met Lys Phe Tyr Gly Ile
20 25 30
Ser Leu Pro Asp Ile Val Ser Ile Ala Thr Leu Ile Tyr Leu Val Ile
35 40 45
Gln Ile Gly Tyr Ile Leu Tyr Lys Trp Arg Lys Gly Ile
50 55 60
<210> 3
<211> 390
<212> DNA
<213> 噬菌体(Vp670)
<400> 3
atgttcgttg aagcaattct atggctatct cttaatgtgc atcatgaggc tcgtggtgag 60
cctttcgagt gccaagtagc tgtagcagaa gttacgatgc gaagggtata ttcttcttac 120
tacccttcta ctgtaaaaga tgttgtcttg cagcctaagc agttctcttg gacaataggt 180
aaagagaatc ctgctgacca ctcaattatc accttcactg acgcactagc tgctcttgag 240
ggttatagta actacttaag tggtaatacg ataactagta ctgaactgca ctatgctcgt 300
aaggatgtag acaactactg gactcgcaag atgcataaga catatgcttg cggcaatcat 360
caattctatg ataatggagg aagaccttga 390
<210> 4
<211> 129
<212> PRT
<213> 噬菌体(Vp670)
<400> 4
Met Phe Val Glu Ala Ile Leu Trp Leu Ser Leu Asn Val His His Glu
1 5 10 15
Ala Arg Gly Glu Pro Phe Glu Cys Gln Val Ala Val Ala Glu Val Thr
20 25 30
Met Arg Arg Val Tyr Ser Ser Tyr Tyr Pro Ser Thr Val Lys Asp Val
35 40 45
Val Leu Gln Pro Lys Gln Phe Ser Trp Thr Ile Gly Lys Glu Asn Pro
50 55 60
Ala Asp His Ser Ile Ile Thr Phe Thr Asp Ala Leu Ala Ala Leu Glu
65 70 75 80
Gly Tyr Ser Asn Tyr Leu Ser Gly Asn Thr Ile Thr Ser Thr Glu Leu
85 90 95
His Tyr Ala Arg Lys Asp Val Asp Asn Tyr Trp Thr Arg Lys Met His
100 105 110
Lys Thr Tyr Ala Cys Gly Asn His Gln Phe Tyr Asp Asn Gly Gly Arg
115 120 125
Pro

Claims (7)

1.编码如下蛋白质(a)或(b)的穿孔素基因在制备菌体破壁制剂中的应用、或在克隆载体构建中的应用、或自杀质粒构建中的应用：
(a)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有穿孔素活性的由(a)衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的穿孔素基因，其核苷酸序列如SEDID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的穿孔素基因与编码如下蛋白质(c)或(d)的内溶素基因联合在制备菌体破壁制剂中的应用、或在克隆载体构建中的应用、或自杀质粒构建中的应用：
(c)如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(d)在(c)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有穿孔素活性的由(c)衍生的蛋白质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的内溶素基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的应用，其特征在于，所述的在克隆载体构建中的应用、或自杀质粒构建中的应用是作为选择标记基因。
6.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述的穿孔素基因与内溶素基因联合是将穿孔素基因与内溶素基因共表达。
7.根据权利要求1、2、3或4所述的应用，其特征在于，所述的细菌破壁制剂是大肠杆菌或溶藻弧菌菌体破壁制剂。
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