CN104593346A - 一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用 - Google Patents

一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用。一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQ ID No：1所示的全部或部分氨基酸序列。经过序列结构分析，显示该酶为噬菌体中的能够裂解细菌细胞壁的裂解酶，经试验证实，该氨基酸序列形成的蛋白具有较好的杀菌活性。本发明的内溶素通过市场上已有的适合表达载体表达、纯化后，体外对副溶血弧菌表现出显著的杀菌效果，可用于副溶血弧菌抑菌剂的制备。

Description

一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用。
背景技术
副溶血性弧菌是革兰氏阴性多形态杆菌或稍弯曲弧菌，为二级有害微生物，隶属弧菌科中的弧菌属，它是一种人畜共患病菌，广泛存在于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼类、贝类等海产品之中。随着抗生素的大量和长期使用，在食品和环境中，日趋严重的耐药型副溶血弧菌已影响人类感染副溶血弧菌疾病的治疗，能否研究出新型的生物抑菌剂来替代化学抗生素是目前科研人员面临的一个挑战。
噬菌体内溶素是一类能够裂解细菌细胞壁的裂解酶。尽管在1957年噬菌体内溶素裂解细菌的能力就被首次报道，但直到2001年Nelson等才证实纯化的重组内溶素可以作为抗菌剂有效控制大鼠感染A族链球菌。到目前为止，内溶素已被用来防控和检测食品中的食源性致病菌如金黄色葡萄球菌、李斯特菌和梭状芽孢杆菌。与使用小分子抗生素用于抗菌治疗或预防相比，专一性的内溶素不易导致抗性菌株的快速出现。在细菌耐药性日益严重的现在，尤其在市场对新型抗菌剂的需求空前提高，内溶素不易产生抗性且裂解专一性的特点，使其作为新型抗菌剂具有一定的优势。
虽然国内利用基因工程技术构建内溶素生产菌株的工作已经有了一定的进展，但是在研究和生产过程中存在的重要的问题是，制备的内溶素大多数都集中在革兰氏阳性细菌的防治和检测，对于革兰氏阴性细菌尤其是副溶血弧菌的防控研究仍较少。所以，针对副溶血弧菌的耐药性日趋严重及相关内溶素缺乏的问题，本发明开发出能够高效裂解副溶血弧菌的内溶素或内溶素基因。
发明内容
本发明提供一种来自副溶血弧菌噬菌体的具有显著抑菌效果的内溶素。
本发明还提供所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQ ID No：1所示的全部或部分氨基酸序列。经过序列结构分析，显示该酶为噬菌体中的能够裂解细菌细胞壁的裂解酶，经试验证实，该氨基酸序列形成的蛋白具有较好的杀菌活性。
编码所述的内溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
含有所述的基因的表达载体、工程菌或细胞系。
所述原核细胞表达载体为pET-28a(+)。
所述工程菌为大肠杆菌Rosseta(DE3)。
一种所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。目前尚未有文献公开过能够裂解副溶血弧菌细胞壁的裂解酶，而本发明的内溶素具有该功能，对副溶血弧菌具有有效的杀菌活性。
本发明的有益效果是：本发明的内溶素通过市场上已有的适合表达载体表达、纯化后，体外对副溶血弧菌表现出显著的杀菌效果，可用于副溶血弧菌抑菌剂的制备。
附图说明
图1为内溶素蛋白进行结构域分析预测图；
图2为内溶素蛋白在大肠杆菌中高效表达图谱；
图3为内溶素蛋白裂解副溶血弧菌ATCC17802的吸光值变化图谱；
图4为内溶素蛋白裂解副溶血弧菌ATCC17802的浊度变化图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
本发明试验涉及的菌株：副溶血弧菌VP17802(保藏号为ATCC17802)，购买于美国ATCC中心，副溶血弧菌VIB304、副溶血弧菌VIB461、副溶血弧菌VIB800和副溶血弧菌VPl4-90、VP1.2、VP2.1、VP3.2、VP4.1均保存在中国海洋大学食品安全实验室。
本发明涉及的副溶血弧菌噬菌体，该噬菌体VPp1保存于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉、武汉大学，保藏编号：CCTCC NO：M2013030，保藏日期为2013年1月20日，分类学命名：副溶血弧菌噬菌体VPp1(Vibrio parahaemolyticus phage VPp1)。
2216E培养基，青岛海博生物技术有限责任公司；
LB液体培养基，北京陆桥技术有限责任公司；
质粒pET 28a和大肠杆菌Rosetta(DE3)，北京康为世纪公司；
Ni Sepharose TM 6Fast Flow填料，美国GE公司；
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，北京索莱宝科技有限公司。
实施例1：内溶素蛋白功能预测
本发明人从污水中分离出一株副溶血弧菌的烈性噬菌体VPp1。经全基因组测序和分析，鉴定该噬菌体gp32编码的蛋白在氨基酸序列上与果胶杆菌噬菌体溶菌酶有32％的相似度。使用InterProScan软件对gp32编码的蛋白LysVPp1进行结构域预测分析。结构域预测结果如图1所示，LysVPp1的120-209氨基酸区间为高度保守的功能区域，属于Lysozyme domain家族(IPR023346)。该家族能够裂解原核细胞细胞壁肽聚糖中糖苷键。
实施例2：内溶素在大肠杆菌中的高效表达
1、重组质粒的构建
根据内溶素基因序列(SEQ ID No：2)，设计引物，上游引物：CGGGATCCATGGATGATGGCTTACTAACTGATA(SEQ ID No：3)，下游引物：CCGCTCGAGTCATAAAGGTAATCTCCCTGCCTCA(SEQ ID No：4)，在上下游引物端分别设定限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ。利用PCR进行内溶素基因扩增，将25μL PCR回收产物克隆入pET-28a载体的多克隆位点BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之间，得到重组质粒，转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)中。挑取单克隆至LB液体培养基中过夜振荡培养，提取质粒作为模板进行PCR鉴定，结果表明质粒中具有SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，将该基因表达的蛋白命名为LysVPp1，该基因编码SEQ ID No：1所示的氨基酸残基序列。将鉴定正确的重组质粒命名为pET-28a-LysVPp1。
2、重组蛋白的制备
重组质粒命名为pET-28a-LysVPp1转化大肠杆菌Rosetta(DE3)，筛选得到可表达内溶素的工程菌Rosetta(LysVPp1)，接种单菌落于10mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃，150r/min，过夜振荡培养，次日，按照1:100的比例将菌液加入到新鲜的900mL LB液体培养基(含50μg/mL卡那霉素)中，37℃培养3h，加入IPTG(至终浓度为1mmol/L)，在37℃条件下进行诱导表达，150r/min振荡培养4h后，3381g、4℃条件下离心15min获得细胞。每300mL菌液所得的细胞沉淀悬于30mL缓冲液(20mmol/L pH 8.0NaH2PO3，含500mmol/L NaCl)，充分混匀后，用超声波破碎仪进行破碎，离心去除不溶性细胞碎片，上清液过0.22μm无菌滤膜，获得粗酶液。采用Ni Sepharose TM 6Fast Flow进行纯化，利用10kD超滤离心管进行脱盐处理获得纯度较高的重组蛋白。结果如图2所示，重组蛋白LysVPp1得到高效表达。图2中泳道M为蛋白标准分子量，泳道1、2分别为未经IPTG诱导和经诱导的Rosetta(LysVPp1)的细菌总蛋白，泳道3、4分别为超声破碎后上清和沉淀，泳道5为超滤浓缩脱盐后的融合蛋白。
实施例3：以副溶血弧菌ATCC17802为靶细菌测试内溶素LysVPp1抑菌效果
挑取副溶血弧菌ATCC17802单菌落至300mL2216E培养基中，过夜培养，菌体离心，用100mM EDTA复融，5min,细胞离心用纯水清洗两次，然后-80℃保存，测定活性之前，将细菌沉淀用20mmol/L pH 8.0NaH2PO3，含0.1％Triton X-100复融。将100μL重组蛋白LysVPp1溶液(100μg/mL)加入到900μL细菌复融液中，37℃培养至裂解效果明显。将缓冲液和溶菌酶(100μg/mL)作为空白组和阳性对照组分别同细菌复融液混合，相同条件下培养，用酶标仪测定OD450值，吸光值的下降反映细菌被裂解。
结果如图3所示，重组蛋白LysVPp1试验组和阳性对照组的吸光值在5min内迅速降低，并且，LysVPp1溶液将细菌的浊度在10min内降低约0.39，溶菌酶溶液降低0.25左右。通过图4所示，37℃培养15min后，LysVPp1试验组和阳性对照组的菌液明显比空白组澄清。证明通过克隆表达获得的内溶素LysVPp1具有体外抗菌活性。
实施例4：以不同血清型副溶血弧菌和大肠杆菌为靶细菌测定内溶素LysVPp1抑菌效果
挑取副溶血弧菌ATCC17802单菌落至300mL2216E培养基中，过夜培养，菌体离心，用100mM EDTA复融，5min,细胞离心用纯水清洗两次，然后-80℃保存，测定活性之前，将细菌沉淀用20mmol/L pH 8.0NaH2PO3，含0.1％Triton X-100复融。将100μL重组蛋白LysVPp1溶液(100μg/mL)加入到900μL细菌复融液中，37℃培养30min，测定OD450值。LysVPP1酶活力值＝Δ450nm(LysVPp1实验组降低值)-Δ450nm(缓冲液空白组降低值)。
以副溶血弧菌ATCC17802为抑菌阳性标准，检测LysVPp1对多株菌株的抑菌活性，表1所示，LysVPp1能够裂解其余5种不同血清型的副溶血弧菌。
表1内溶素LysVPp1抑菌效果分析
a相对裂解活性：LysVPP1对细菌的裂解值/LysVPP1对ATCC17802的裂解值：+，0～1；++，1；
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (6)

1. 一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素，其氨基酸序列为SEQ ID No：1所示的全部或部分氨基酸序列。
2. 编码权利要求1所述的内溶素的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No：2所示。
3. 含有权利要求2所述的基因的表达载体、工程菌或细胞系。
4. 根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述原核细胞表达载体为pET-28a (+)。
5. 根据权利要求3所述的工程菌，其特征在于：所述工程菌为大肠杆菌Rosseta (DE3)。
6. 一种权利要求1所述的内溶素在制备抑菌剂中的应用。
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