CN104313042A - 一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵生产新普鲁兰酶的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵生产新普鲁兰酶的方法，选择多粘芽孢杆菌（ paenibacilluspolymyxa ）CFCC10334作为出发菌株，基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX4T-1的物理图谱，将多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因 Npu 定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆菌BL21，表达产物ENpu5具有正常生物学活性，获取新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，在大肠杆菌中进行诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到一株具有较高酶活的基因工程菌株，最后进行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。提高了酶的稳定性、活性，降低了生产成本。

Description

一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵生产新普鲁兰酶的方法

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及利用基因工程技术重组微生物新普鲁兰酶基因，构建基因工程菌，通过重组酶在载体中的表达进行新普鲁兰酶的发酵生产。

背景技术

新普鲁兰酶(Neopullulanase，nPU, EC3.2 .1.135)属于葡萄糖苷水解酶类(Glycosyl hydrolase family)的α-淀粉水解酶族13(α-amylase family 13)中的一种，它是一个多功能复合型的淀粉水解酶，能催化淀粉的四种反应：水解α-(1→4)糖苷键、水解α-(1→6)糖苷键、α-(1→4)键的转糖苷作用、α-(1→6)键的转糖苷作用。因此，新普鲁兰酶既具有普鲁兰酶(pullulanase,PU,EC3.2.1.41)的活性，可将普鲁兰的α-(1→6)糖苷键断开，生成麦芽三糖；又具有α-淀粉酶的活性，可将普鲁兰水解生成潘糖。另外，在高糖浓度下，新普鲁兰酶还具有转α-(1→4)和α-(1→6)糖苷作用，可将葡萄糖苷的分枝连接方式在α-(1→4)和α-(1→6)中相互转换。并且新普鲁兰酶是最早发现的具有代表性的一类多功能淀粉酶(multifunctional amylase,MFA) 。

在自然界中，每种植物都能利用光合作用合成淀粉并将之存贮起来，为人类和动物提供源源不断的能量。作为最原始的贮存能源，淀粉是很重要的多糖，在食品、饮料工业中是必不可少的原材料。 在淀粉生产淀粉糖的过程中特别是在糖化过程中辅助性的加入新普鲁兰酶，能水解普通淀粉酶不能作用的α-(1→6)糖苷键，可提高淀粉糖的转化率。在以淀粉生产酒精的工艺中，添加新普鲁兰酶可将淀粉的利用率提高3%-5%；在以淀粉为原料生产低聚异麦芽糖、低聚麦芽糖和低聚果糖、甘露寡糖等的生产过程中用新普鲁兰酶替代其它转糖苷酶，可将低聚糖的转化率由原来的45%提高到60%左右，由于新普鲁兰酶能参与淀粉水解的四种反应，所以在淀粉加工业中有着重要的用途。

微生物是新普鲁兰酶的最佳来源，但由于天然菌种的产酶量低，直接用其生产出的新普鲁兰酶成本较高，从而影响了新普鲁兰酶的推广应用。随着现代分子生物学的飞速发展，采用基因工程技术手段改造产新普鲁兰酶微生物，构建新普鲁兰酶基因工程菌，提高酶产量，进而进行大规模的发酵生产，己成为世界研究的热点。

迄今为止，国内外研究的最详细的新普鲁兰酶是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌 TRS40 (Bacillus stearothermophilus TRS40)的NPL和来源于普通高温放线菌(Thermoactinomyces vulgaris R247)的TVAⅡ。除此之外，分别从海洋超适温菌(Rhodothermus marinus)，嗜碱性芽孢杆菌(Alkalophilic Bacillus)，多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)，环脂酸芽孢杆菌属(Alicyclobacillus acidocaldarius)中发现了新普鲁兰酶的存在。Takata等于1992年发现来源于嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus TRS40)中的新普鲁兰酶(neopullulanase，NPase)(EC 3.2.1.135)兼有糖苷水解酶和糖基转移酶催化活性，并且嗜热脂肪芽胞杆菌分泌的新普鲁兰酶是研究最完善的一种，其酶的基因名为nplT，分类编号1422 [NCBI] ，氨基酸序列长度为588个氨基酸。酶的底物结合位点和催化活性中心均已确定，它的三级结构分析显示为二聚体。最适温度为60～65℃，最适pH6.0，分子量约为62ku。

目前，虽有对嗜热芽孢杆菌中的新普鲁兰酶研究较为深入，但对来源于多粘芽孢杆菌的研究相对较少，且尚未实现产业化。由于多粘芽孢杆菌属于原核生物，通常都会首先利用大肠杆菌表达系统这一成熟的表达体系，进行多粘芽孢杆菌新普鲁兰酶的表达研究。大肠杆菌表达系统是最简单的一种异源表达系统，它的优点是遗传背景比较清楚，表达水平较高、易操作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因;

本发明的另一个目的在于提供一种用新普鲁兰酶基因通过克隆转化，在大肠杆菌中进行诱导表达，发酵生产新普鲁兰酶的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO 1。

一种重组表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。

一种宿主细胞，所述的宿主细胞为含有上述的核苷酸序列的原核细胞。

上述的宿主细胞为含有上述的表达载体的原核细胞。

一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆表达进行发酵生产新普鲁兰酶的方法,包括如下步骤：选择多粘芽孢杆菌（paenibacillus polymyxa）CFCC10334作为出发菌株，基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX 4T-1的物理图谱，将多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因Npu定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆菌BL21，表达产物ENpu5具有正常生物学活性，获取新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，在大肠杆菌中进行诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到一株具有较高酶活的基因工程菌株，最后进行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。

本发明中出发菌株的宿主菌是大肠杆菌BL21（购自TaKaRa大连宝生物公司），采用的出发菌菌种购于中国林业微生物菌种保藏管理中心保藏的多粘芽孢杆菌（paenibacillus polymyxa），保藏编号为CFCC10334。该菌种易得、安全性高、且培养方便，其基因组DNA也易于提取。由于多粘芽孢杆菌属于原核生物，所以本发明选择利用大肠杆菌表达系统这一成熟的表达体系，进行多粘芽孢杆菌新普鲁兰酶的表达研究。大肠杆菌表达系统是最简单的一种异源表达系统，它的优点是遗传背景比较清楚，表达水平较高、易操作，有许多菌株突变体和含强启动子的载体可供选择。

多粘类芽孢杆菌（paenibacillus polymyxa）是芽孢杆菌科（Bacillaceae）类芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌，在划入类芽胞杆菌属（paenibacillus）之前又称Bacillus polymyxa。多粘类芽孢杆菌的细胞呈直杆状，(0.5~2.5)μm×(1.2~10.0) μm，G+C含量为40%~50%；利用周生鞭毛运动，在膨大孢子囊中产生椭圆形芽孢；最适生长pH为7，最适温度为28~30℃；兼性厌氧，分解葡萄糖和其他糖类产酸，有时产气，在营养琼脂上无可溶性色素，对人或动植物没有致病性，可产生多肽抗生素、拮抗蛋白、酶、植物激素、絮凝剂等多种生物活性物质，兼有生物农药和生物菌肥的作用，已广泛应用于农业、工矿业及废水处理等领域。美国环境保护署（EPA）已将其列为可在商业上应用的微生物种类之一，我国农业部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种。

本发明中新普鲁兰酶基因的来源是多粘芽孢杆菌（paenibacillus polymyxa  CFCC10334），基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX 4T-1的物理图谱，将多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因Npu定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆菌BL21，表达产物ENpu5具有正常生物学活性。此外，根据表达载体上所带的GST标签蛋白，融合表达产物可采用GST标签柱进行纯化，同时还可能增加融合蛋白的稳定性。具体方案是对于多粘芽孢杆菌中获取的新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，最后在大肠杆菌中进行诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到了一株具有较高酶活的基因工程菌株，最后进行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。

本发明采用基因工程技术，构建新普鲁兰酶基因工程菌，即从产新普鲁兰酶的多粘芽孢杆菌中获取新普鲁兰酶基因，构建基因工程菌，通过重组酶在载体中的表达进行新普鲁兰酶的发酵生产，提高了酶的稳定性、活性，降低了生产成本。

本发明方法是发酵生产新普鲁兰酶的方法，菌种易得、安全性高、且培养方便，其基因组DNA也易于提取。

附图说明

图1为提取的细菌总DNA琼脂糖凝胶电泳结果图；

图2为多粘芽孢杆菌PCR克隆新普鲁兰酶基因片段图；

图3为新普鲁兰酶基因克隆转化大肠杆菌DH5α阳性克隆图；

图4为多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因克隆子PCR鉴定图；

图5为表达引物PCR目的基因片段图； 

图6为载体PGEX 4T-1与PCR产物图；

图7为重组新普鲁兰酶基因阳性转化子PCR鉴定图；

图8为GST-Npu基因在大肠杆菌BL21中的表达图；

图9为潘糖含量标准曲线图；

图10为基因工程菌遗传稳定性图；

图11为目的蛋白的SDS-PAGE图；

图12为纯化后的酶液于25℃保存6个月的酶活性图；

图13为纯化后的酶液于4℃保存12个月的酶活性图。

具体实施方式

下面的实施例可以进一步说明本发明，但不以任何方式限制本发明。

以下实施例所用材料，未指明的均为商购现有材料。

实施例1：

（一）多粘芽孢杆菌基因组DNA的提取：

将多粘芽孢杆菌在营养肉汤培养基中于30℃恒温恒湿培养箱中培养过夜，取0.5~2mL培养菌液（最多不超过2×10⁹个细胞），10000rpm离心30秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。

依照细菌DNA提取试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司SK1201-UNIQ-10 柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒）方法提取该菌株的基因组DNA。

按照如下操作步骤进行：

（1） 加入200μl缓冲液RB重悬细胞 ，1000rpm离心30秒，弃上清，将细胞震荡或吹打重悬于180μl缓冲液RB（革兰氏阴性菌）或者480μl 50mMNa2EDTA (pH8.0) （革兰氏阳性菌）；

（2）加入120μl溶菌酶 (20mg/ml in 10 mM Tris-HCl，pH 8.0)，混匀。37℃温育30-60分钟。12000rpm离心2分钟，弃上清后将细胞震荡或吹打重悬于180μl缓冲液RB中；

（3）加入20μl蛋白酶K（20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，在涡旋振荡器上高速连续振荡混匀25秒。在70℃放置10分钟；

（4）冷却后加入100μl异丙醇，涡旋振荡混匀，此时可能会出现絮状沉淀；

（5）将上一步混合物（包括可能有的沉淀）加入一个吸附柱AC中，（吸附柱放入收集管中），13000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液；

（6）加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃废液；

（7）加入500μl漂洗液WB（其中加入了无水乙醇），于12000rpm离心30秒，弃废液；

（8）加入500μl漂洗液WB，于12000rpm离心30秒，弃废液；

（9）将吸附柱AC放回空收集管中，于13000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应；

（10）取出吸附柱AC放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热效果更好），室温放置3-5分钟，于12000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，于12000rpm离心1分钟。洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要DNA的浓度高，可以适当减少洗脱体积，不少于50μl，过小降低DNA洗脱效率，减少DNA产量；

（11）DNA可以存放在2-8℃环境下，如果要长时间存放，可以放在零下20℃环境下。

提取的细菌总DNA琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示，图中可看到明显的DNA条带。

（二）DNA纯度检测：

取20μL基因组DNA样品，加灭菌水稀释，用紫外分光光度计测定 λ=260nm 和λ=280 nm的吸光度值，计算 OD260/OD280的比值。一般认为 OD260/OD280<1.8 表示样品中有蛋白质、多糖或多酚污染；OD260/OD280>1.9表示 RNA 含量过多；OD260/OD280=1.8~1.9，则 DNA 纯度比较高。

（三）引物的设计与合成：

利用Primer premier 5.0 软件，根据已报道的多粘芽孢杆菌中编码新普鲁兰酶基因序列（U89716.1）针对该基因开放阅读框（ORF）上游、下游保守序列设计特异引物。引物由Invitrogen公司合成。表达时选取BamHⅠ和NotⅠ作为酶切位点。

根据方法所述，分别设计新普鲁兰酶基因克隆引物，如下所示：

（四）新普鲁兰酶基因Npu的克隆

4.1PCR扩增新普鲁兰酶基因

以多粘芽孢杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，扩增反应体系见表1：

PCR扩增产物经12g/L琼脂糖凝胶检测，结果如附图2所示多粘芽孢杆菌PCR克隆新普鲁兰酶基因片段。

4.2目的基因的克隆

PCR产物经12g/L琼脂糖凝胶电泳后，参照标准DNA Marker进行扩增DNA片段大小判定，如与预计目的DNA片段大小一致，则以DNA凝胶回收试剂盒回收目的DNA片段。按TaKaRa公司的T easy Vector使用说明进行目的DNA片段的连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，划线接种在含有氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板上培养后，挑选白色菌落并接种在LB液体培养基中培养。

LB 培养基制备：称取胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，氯化钠10g 溶于950mL 去离子水中，用NaOH调pH为7.0 左右定容至1000 mL，高压灭菌20 min，制备平板时加 15 g/L 琼脂粉。

 4.2.1E.coli DH-5a感受态细胞的制备：

(1) 从37℃培养过夜的新鲜培养基上挑取E.coliDH-5a单个菌落，接种于3mL不含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃ 250 r/min振荡培养过夜；

(2) 将过夜培养的细菌按1:1000扩培至100mL LB液体培养基中，37℃，250r/min振荡培养约3h，至OD600 nm为0.45~0.6；

(3) 无菌条件下转移细菌培养物至用水遇冷的两只50mL无菌离心管中，冰浴冷却10min后于4℃ 5000 r/min离心10min；

(4) 弃去上清，加入5mL冰冷的100mmol/L CaCl₂溶液经枪头吸打后再加20mLCaCl₂溶液(两管合一)，冰浴15min后于4℃5000 r/min离心10min；

(5) 弃去上清，用25mL冰预冷的100 mmol/L CaCl₂悬浮菌体沉淀，冰浴45min后于4℃5000 r/min离心10min；

(6) 弃去上清，用5mL冰冷的1000 mmol/L 15% CaCl₂·甘油重悬，然后分装于冰冷无菌的1.5mL离心管中(550μL/管)，4℃放置12~24h后再于-70℃冻存。

4.2.2PCR产物切胶回收

通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀切割含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5 mL离心管中。(判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短)。

采用GENOMED公司JET quick，Gel Extraction spin Kit 胶回收试剂盒操作：

（1）用TAE缓冲液配制琼脂糖凝胶，对目的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。配制的琼脂糖凝胶和电泳液进行电泳，反复融化的旧凝胶与循环使用的电泳pH值较高，会降低回收效率；

（2）在紫外线下小心切下目的条带，尽量将不含有DNA片段的空白凝胶切掉，以节约溶胶液，并提高回收效率。胶的体积尽量控制在100μl（约0.1g），以免因必须加入过多溶胶液导致液体外溢。如果需要对大于100μl体积的凝胶进行回收，切成小块分多管操作；

（3）估计胶块体积（可以按胶块密度为1g/ml 将胶块在EP管中称重后计算），按100μl胶块加500μl溶胶液的比例向胶块中加入溶胶液，或55℃~65℃溶胶约10min，其间偶尔摇动至胶块完全溶解。或按100μl胶块加300μl溶胶液的比例向胶块中加入溶胶液，或55℃~65℃溶胶约10min，其间偶尔摇动，再按100μl胶块加150μl溶胶液的比例向胶块中加入异丙醇，混匀；

（4）胶块完全溶解后将溶胶转移至吸附柱中，室温12,000rpm离心30s，去掉废液；

（5） 向吸附柱中加入500μl漂洗液，12,000rpm离心30s。倒掉废液；

（6）步骤重复5，倒掉废液后空管12,000rpm离心2min以完全去除漂洗液；

（7）将吸附柱移至一个干净的1.5ml离心管中，向吸附柱膜中加入适当体积的洗脱缓冲液或去离子水，室温放置1~2分钟，12,000rpm离心2min洗脱DNA。

4.2.3连接及转化

PMD 18T 克隆载体体系：vector 0.8~1μL，buffer 5μL，模板3μL，连接酶4μL。

(1) 16℃反应2h，4℃冰箱过夜；

(2) 全量(10μL)中加入50μLDH-5a感受态细胞，冰中放置30min；

(3) 42℃加热45s后再在冰上放置1min；

(4) 加入8% μL的LB液体培养基，37℃振荡培养60 min(1.5μL) 5000r/min，2 min；

(5) 在含有X-gal，IPTG，Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单个菌落；

(6) 挑取白色单个菌落，传入5μL含Amp⁺的LB中，(10mL离心管)，Amp 1000m/2mL；

IPTG 7μL/板，X-gal 40μL/板，Amp 10μL/板；分别做3个平行；

(7) 菌液PCR检测，引物1.0μL×2，模板2μL，酶12.5μL，ddH₂O 8.5μL。通过琼脂糖凝胶电泳检测。分装1mL菌液送测序。

（五）阳性克隆子的筛选与鉴定

切胶回收目的DNA片段，链接转化大肠杆菌DH5α，新普鲁兰酶基因克隆转化大肠杆菌DH5α阳性克隆如附图3所示，挑取白斑接种于LB液体培养基（含Amp）中，菌液经PCR鉴定，在2000bp附近有一条特异性的条带，其大小与目的基因片段长度基本一致，如附图4所示。将含Npu的载体命名为PMD18T-Npu vecter，阳性克隆子命名为DH5α’ PMD18T-Npu。

（六）序列分析

测序结果表明，克隆得到的序列全长2055 bp，其中包含了1548 bp的新普鲁兰酶基因主要开放阅读框，推断的基因编码515氨基酸的蛋白质，分子量58713Da。

实施例2：新普鲁兰酶基因的大肠杆菌诱导表达

（一）PGEX 4T-1质粒的提取

参照质粒小提试剂盒说明书操作对PGEX 4T-1进行提取。

（二） PCR产物回收

通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀切割含有目的DNA片段的琼脂块，放入1.5 mL离心管中。(判定DNA片段的位置时，要尽可能使用长波长紫外光，在紫外光下照射的时间应尽可能短)。

（三）载体与PCR产物酶切

酶切反应体系如下表2：

37℃，过夜消化（12~16 h），然后75℃灭活10 min。

（四） 酶切产物的纯化

将酶切的目的片段切胶，用DNA快速纯化/回收试剂盒回收。纯化产物在4℃下连接过夜，然后转感受态细胞BL-21，将转化的细菌涂布培养含Amp的平板，37℃培养过夜。连接反应体系(20μL)：

10×T4缓冲溶液   2 μL

PGEX -4T-1        4 μL

目的片段          12 μL

T4连接酶         2 μL

从平板中挑单菌落接入5mL LB含(Amp)液体培养基中，37℃，220r振荡过夜，取菌液进行PCR扩增，筛选阳性克隆，鉴定正确的菌液，用质粒抽提试剂盒抽提质粒，用BamHⅠ和NotⅠ双酶切鉴定连接结果。

（五）目的蛋白诱导表达

(1) 将鉴定正确的重组表达质粒转化感受态细胞BL-21(感受态细胞制法同前)，涂布含Amp的LB平板，挑取单个菌落置于LB液体培养基中培养，37℃振荡培养过夜。

(2) 次日按1%的接种量转接到5mL的LB培养基(不加抗生素)中至OD为0.6～0.8时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG30℃，250r/min继续培养4~6 h。

(3) 收集菌液离心(5000 r/min,10 min)，PBS清洗3遍。

(4) 加菌体裂解液4℃过夜，反复冻融3次，超声破碎(250w，脉冲30s，间隔5s)30min。

(5) 离心收集上清(15000r/min)，加入2×SDS加样缓冲液混匀，100℃水浴10分钟，进行SDS-PAGE电泳。

(6) 电泳结束后，考马斯亮蓝R-250染色2个小时，脱色液脱色至条带清楚为止，凝胶拍照。

（六）新普鲁兰酶的分离纯化和储存稳定性

采用GST标签蛋白纯化柱进行蛋白的分离纯化。基因工程菌产生的纯化酶液于25℃保存6个月，分别在每月末进行酶活性测定，于4℃保存12个月，分别于两个月后测定酶活性。

6.1制备细胞裂解液

(1)    每100mL培养物的细胞沉淀悬于4mLPBS缓冲液中；

(2)    加入溶菌酶至最终浓度1mg/mL，冰上或冷藏放置放置30min；

(3)    用针筒将10ml 0.2%Triton X-100强行注入细胞裂解物中，剧烈震荡数次混匀；

(4)    加入DNase和RNase至终浓度5μg/mL，4℃震荡并温育10min；

(5)    4℃ 3000g(5000r/min)离心30min；

(6)    上清转移到一只新试管，加入DTT至终浓度为1mmol/L；

6.2 纯化GST融合蛋白

(1) 细胞裂解物与50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，每100mL细胞培养物加2mL树脂，于室温下轻摇30min；

(2) 混合物于4℃以500g(2100r/min)离心5min，小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE；

(3) 沉淀中加入10倍标准体积的PBS，颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白；

(4) 4℃以500g(2100r/min)离心5min，小心去掉上清并留样少许进行SDS-PAGE；

(5) 重复步骤(3)和(4)两次；

(6) 结合的GST融合蛋白用谷胱甘肽洗脱缓冲液洗脱：a. 沉淀中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温下轻轻搅动10min，洗脱树脂上结合的蛋白；b. 4℃以500g(2100r/min)离心5min，将上清液移至心新管中；c. 重复步骤a和b两次，合并三次的上清液；

(7) 10%SDS-PAGE分析每一步（细胞抽提，洗涤和洗脱）样品的蛋白质组成。

《结果与分析》

（1）原核表达载体的构建

参照原核表达引物，以细菌总DNA为模板，进行PCR扩增，获得目的基因片段，如附图5所示，分别与表达载体PGEX 4T-1进行BamHⅠ，NotⅠ双酶切，切胶回收，按照方法所述连接，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，并筛选并检测阳性转化子，从LB平板(含Amp)上挑取单菌落，进行PCR扩增，在1500bp左右出现特异性条带，如附图6所示。阳性转化子分别命名为BL21 PGEX 4T-1-Npu。

（2）诱导表达产物的SDS-PAGE电泳分析

将筛选获得的BL21 PGEX 4T-1-Npu重组工程菌诱导培养后做SDS-PAGE蛋白电泳检测，结果如附图7所示，结果显示：大约80KDa处显示特异性条带，根据Npu的蛋白的理论分子量为58KDa加上PGEX 4T-1载体中与其融合表达的、分子量为26kD的GST蛋白，理论上融合蛋白分子量约为84KDa，参见图8，因此本发明所表达的特异性蛋白与其预期理论蛋白质量基本相符。

（3）新普鲁兰酶基因表达菌的酶活测定

3.1DNS法测定新普鲁兰酶活性

阳性转化子BL21 PGEX 4T-1-Npu1~5分别接种到LB液体培养基(含Amp，终浓度为100μg/ml)中，培养12h后，加IPTG(终浓度为240μg/ml)诱导4h，将菌液分别装入50ml的离心管中4℃温度下，于10000rpm离心10min，取菌体沉淀，PBS漂洗三次，200mLPBS稀释，置于AH100B型细胞破碎机(ATS Engineering Inc)中破碎10min，于10000rpm离心10min，所得上清液即为粗酶液。酶活测定结果表明BL21 PGEX 4T-1-Npu5表达产物有新普鲁兰酶活性。Npu在大肠杆菌中具有活性的表达产物命名为ENpu5。

3.1.1潘塘标准曲线的制作：

分别吸取0.1%标准潘糖液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL，依次加入到试管中，用蒸馏水补加至2.0mL，配置成每毫升分别含有潘糖100、200、300、400、500、600、700μg的标准液。各加入DNS试剂3mL，于沸水浴中沸腾7min(样品放入重新沸腾时算起)，取出后立即加入蒸馏水10mL混匀，冷却后于550nm比色测定，用空白管溶液调零点，记录光密度值，以所得的OD₅₅₀为纵坐标，以对应的标准潘糖浓度为横坐标，绘制标准曲线，如附图9所示，获得潘糖标准曲线的方程为Y=0.00238X+0.257。

3.1.2 酶活性测定：

取1mL适当稀释后发酵液加1mL1%的普鲁兰50℃恒温反应60min，立即加入3mLDNS试剂，沸水浴7min，冷却后加蒸馏水10mL混匀，以煮沸5min的灭活酶液加1mL1%的普鲁兰糖反应30min为对照，测定OD值。 酶活性单位定义为：在50℃条件下作用60min，每分钟产生的相当于1 μg潘糖还原力的酶活力为一个酶活单位。测定构建好的重组基因工程菌与表达菌的OD值，结果见表3：

根据潘塘标准曲线，以及定义酶活，原始菌多粘芽孢杆菌的酶活为243.69U。大肠杆菌表达菌的酶活为715U，构建好的重组基因工程表达菌的酶活比原始菌多粘芽孢杆菌的酶活高2.93倍。

（2）表达菌的遗传稳定性测定：

将具有产酶活性的BL21 PGEX 4T-1-Npu5表达菌连续传代培养10代后，测定酶活，结果如附图10显示：当连续传代培养10代后，其菌株所产酶总的酶活性仍保持在714U，可见转化子表达产量非常稳定，具有较好的遗传稳定性。

（3）新普鲁兰酶的纯化和酶储存稳定性测定：

对细胞破碎后收集的粗酶液借助GST标签纯化柱进行目的蛋白的纯化，纯化后的蛋白主要为融合表达蛋白，其他蛋白较少，如附图11所示目的蛋白的SDS-PAGE图。

对纯化后的目的蛋白做酶活测定，结果见表4所示：

根据潘糖标准曲线，以及定义酶活，纯化后的蛋白酶活为7235.8U，比未纯化的酶活高10.12倍。纯化后的酶液于25℃保存6个月以后的酶活性仍保持在5427U，于4℃保存12个月后的酶活性仍保持在5390.5U，说明本发明构建的重组基因工程菌所产生的酶具有较好的稳定性，如附图12、13所示，图12为纯化后的酶液于25℃保存6个月的酶活性图，图13为纯化后的酶液于4℃保存12个月的酶活性图。

本发明制得的新普鲁兰酶（液体）经中国商业联合会食品质量监督检验测市中心（兰州）检验报告见下表：

本发明制得的新普鲁兰酶（固体）经中国商业联合会食品质量监督检验测市中心（兰州）检验报告见下表：

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>甘肃省商业科技研究所

<120>一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因及克隆表达以及发酵生产新普鲁兰酶的方法

<130>  2014

<160>  1

<170>PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  2055

<212>  DNA

<213>paenibacilluspolymyxa

<400>  1

caggcagtttgttcgacagatcaaacaataaaatcgatatttccactataatagataata60

atatcccctttttttgggtggtttttctttataatgaaggcgcacccataacaattaaag120

gagctgatatgttttgagtcgtaacaaacgcttaagaaaatgctccacgatcctgttaag180

ggtgcctatgctcacgatgttcgcctcaagtgcaatgccggagcaggatatcaacgggca    240

taagcctcggaattctgctggaagccgcgtgttttacgaaatttatatcaattcttttta300

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caaggtgatcattgacgttgttatgaatcattcacgtagggagcacccttggttcaagga      600

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caagctggctgcatccattcttttgacgttggggggtgagcggtttctctattatgggga       1200

agagatcggcatgaagggagagaagcccatgagtatcttcgagagcctatgcgctggtac    1260

aagggaggcctcggtcaaacaaagtgggaggaacccaaatacaacaaaggcgaagtatcg   1320

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atgaaaagcgtatagttgctgtgatcaattcgttaccggtaaagcaaagtattctaaaaa     1860

cgaattactgattaatgatttgaaattaaagtcttcgggagacgttgaaatgttctattc      1920

cccgcataatgaatatatcaattcttccgcgaaagtagtgctagttggtattacacccgg    1980

ttggcagcacatggaaattgcctttcgaactgccatagtaactttgaaggatcaaccagt    2040

catatgaggaagctt                                         2055

Claims (5)

1.一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO 1。

2.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求1所述的核苷酸序列的原核细胞。

4.如权利要求3所述的宿主细胞，其特征在于所述的宿主细胞为含有权利要求2所述的表达载体的原核细胞。

5.一种多粘类芽孢杆菌新普鲁兰酶基因克隆表达进行发酵生产新普鲁兰酶的方法, 其特征在于它包括如下步骤：选择多粘芽孢杆菌（paenibacillus polymyxa）CFCC10334作为出发菌株，基因工程宿主菌是大肠杆菌BL21，根据大肠杆菌表达载体质粒PGEX 4T-1的物理图谱，将多粘芽孢杆菌中新普鲁兰酶基因Npu定向插入到表达质粒中，并转化大肠杆菌BL21，表达产物ENpu5具有正常生物学活性，获取新普鲁兰酶基因，通过克隆转化，在大肠杆菌中进行诱导表达，筛选阳性表达子，并测定酶活后得到一株具有较高酶活的基因工程菌株，最后进行发酵生产得到新普鲁兰酶产品。