CN103555753A - 一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用。克隆得到的Zobellia sp.ZM-2κ-卡拉胶酶前体基因cgkZ，并将其直接插入到原核表达载体pProEX-HTa上，转化大肠杆菌BL21(DE3)内，可得到具备高胞外分泌能力的且摇瓶培养条件下胞外酶活达9.4U／mL的重组菌。该酶在最适反应温度为39℃，在35℃比较稳定；最适pH为6.0，且在该pH条件下很稳定。高效表达的κ-卡拉胶酶对κ-卡拉胶有较好的降解效果，降解κ-卡拉胶生成四糖、六糖、八糖等硫酸寡糖，具有较好的应用前景。

Description

一种胞外分泌表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及表达κ-卡拉胶酶的重组菌构建方法及其应用。

背景技术

κ-卡拉胶酶(κ-carrageenase，EC3.2.1.83)主要来源于海洋细菌，通过裂解κ-卡拉胶的β-1,4-糖苷键产生不同分子量的卡拉胶寡糖。卡拉胶酶的用途广泛，如红藻细胞壁结构分析，红藻原生质体的制备和卡拉胶寡糖的制备等。现已报道，卡拉胶寡糖及其衍生物具有很好的生物活性，如抗肿瘤、抗病毒、免疫调节、抗凝血等。因而引起人们的极大关注，现已成为医药、农业、食品等领域研究与开发的高科技竞争热点。

然而，传统的化学和物理降解方法反应条件不易控制、产物分布不均匀，根本无法进行大量高纯度寡糖的制备。因此，反应条件温和、底物专一的卡拉胶酶成为目前制约卡拉胶寡糖构效关系研究乃至进一步应用开发的主要瓶颈，获得高效的κ-卡拉胶酶产生菌和高活性的κ-卡拉胶酶具有重要的科研和应用价值。

κ-卡拉胶酶来源广泛，主要包括微生物和海洋动物。能够产生κ-卡拉胶酶的微生物大部分来自海洋细菌，已经在假单胞菌属、别单胞菌属、Zobellia菌属、噬纤维菌属、弧菌属等中检测到。为了发挥模式微生物，如大肠杆菌(Escherichia coli)等易培养、发酵工艺成熟和生产周期短的优点，利用模式微生物进行异源表达生产κ-卡拉胶酶不失为一种有效的酶改造途径。现在已经有许多蛋白在大肠杆菌中实现表达，但大多数异源表达的蛋白容易形成包涵体积聚在细胞质中，无法大规模的回收活性蛋白。

重组酶的分泌表达特别是胞外生产具有以下优点：①所表达的重组酶经特定的蛋白酶切后的氨基酸序列与天然基因序列所编码的蛋白一致，保证了蛋白的天然构象和活性。②胞外分泌的重组酶回收过程不需要细胞破碎，同时菌株自身分泌胞外蛋白量少，简化了纯化步骤。③分泌表达的重组酶在周质空间中容易形成正确的二硫键，因为周质空间提供了相对优越的氧化环境。④重组酶的胞外分泌利于发酵过程的连续化，结合高密度培养技术，过程容易放大。重组酶的分泌能力取决于宿主菌、表达载体、信号肽的类型和异源表达蛋白的种类。基于上述优点，目前通过反复实验法选择适用于特定重组酶的信号肽和异源表达宿主菌，以实现其胞外分泌表达的报道已有很多。但重组酶胞外分泌的能力大小不一。有关重组κ-卡拉胶酶胞外分泌表达的报道较少，Tohru Kobayashi等曾报道用大肠杆菌表达系统分泌表达κ-卡拉胶酶，无论是总体酶产量还是胞外酶比例都处于较低水平。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有胞外产κ-卡拉胶酶的重组菌。

本发明提供的重组菌是含有κ-卡拉胶酶前体基因的大肠杆菌。

上述κ-卡拉胶酶前体基因的编码序列如GenBank号为KC503903所示，其中包含有该κ-卡拉胶酶的原始信号肽序列。

上述κ-卡拉胶酶前体基因cgkZ是通过重组表达载体A导入大肠杆菌当中，得到重组κ-卡拉胶酶产生菌BL21-HTa-cgkZ.

上述重组表达载体A是将所述κ-卡拉胶酶前体基因cgkZ插入pProEX-HTa的多克隆位点得到的重组表达载体pProEX-HTa-cgkZ。

所述载体pProEX-HTa-cgkZ是pProEX-HTa经BamH1和XhoI双酶切得到的片段，与同样酶切得到的κ-卡拉胶酶目的片段连接得到。

上述重组菌在产κ-卡拉胶酶中的应用也属于本发明所保护的范围之内。

上述应用是指将所述的重组菌在改良LB培养基中发酵培养；所述发酵条件为20-28℃，pH为4.0-6.5，转速130-180rpm。

本发明采用大肠杆菌作为宿主菌分泌表达κ-卡拉胶酶。由于完整的蛋白质序列是κ-卡拉胶酶成熟并产生活性所必需的，因此将κ-卡拉胶酶前体编码核苷酸序列置于强启动子lac的调控之下，并将κ-卡拉胶酶原始信号肽OmpZ与表达载体连接构建分泌型表达质粒pProEX-HTa-cgkZ，导入大肠杆菌得到的重组菌BL21-HTa-cgkZ.该重组菌具备大量胞外分泌重组κ-卡拉胶酶的能力，约51％的酶可以被分泌到胞外，约33％的酶滞留在细菌壁膜间隙。得到的重组酶不需要特定的蛋白酶进行酶切就能表现出较高酶活力，在优化后的摇瓶试验条件下，重组菌BL21-HTa-cgkZ在诱导发酵28h时，发酵液中κ-卡拉胶酶的酶活达9.4U／mL。

附图说明

图1为κ-卡拉胶酶前体基因(GenBank序列号KC503903)

图2为胞外分泌型载体pProEX-HTa-cgkZ示意图。

图3重组κ-卡拉胶酶酶学性质曲线。

图4为重组菌BL21-HTa-cgkZ低温培养条件下的生长曲线和产酶曲线。

图5重组κ-卡拉胶酶酶解产物的质谱分析图谱。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、κ-卡拉胶酶胞外分泌型重组菌的构建

1、含有κ-卡拉胶基因的DNA片段的PCR扩增

用前引物5，-CGCGGATCCATGACAAAACTAAAGT-3’(BamH1)和后引物5'-CCGCTCGAGACTCCACAAGTATCTT-3’(XhoI)自Zobellia sp.ZM-2全基因组中扩增κ-卡拉胶酶全基因cgkZ。具体技术方案为：在PCR体系中加入Taq DNA聚合酶，94℃解链40s，57℃退火45s，72℃延伸2min，如此进行30个循环。

2、用限制性内切酶BamH1／XhoI分别对表达载体pProEX-HTa及目的基因片段进行双酶切，然后凝胶回收目的片段。

3、用T4DNA连接酶将κ-卡拉胶酶基因连接入表达型载体pProEX-HTa中，具体方案为：3μL酶切后的载体，9μL酶切目的基因，2μLT4DNA连接缓冲液，并加入1μL的DNA连接酶连接过夜；然后转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)，并用含有氨苄青霉素和X-gal的平板进行蓝白斑筛选；挑取阳性克隆转化子接种到含100μg／mL氨苄青霉素的液体LB液体培养基中培养12h，离心收集菌体。然后进行质粒抽提，酶切验证，并通过测序进一步确定插入的κ-卡拉胶酶基因序列的准确性，从而选取目的基因序列及插入位点正确的阳性克隆转化子。

实施例2、利用重组菌BL21-HTa-cgkZ生产高产量胞外κ-卡拉胶酶

1、种子培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氨苄青霉素100μg／mL，pH4.0-5.5。

2、发酵培养基：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaC11％，乳糖0.5％，氨苄青霉素100μg／mL，pH4.0-5.5。

3、挑取斜面菌种接种到种子培养基中37℃培养12h，按照1％的接种量，取6mL种子液接种到含600mL发酵培养基的3L的摇瓶中。23℃，130rpm振荡培养2-2.5h添加100mM的IPTG储备液至终浓度为0.9mM，同时添加1％(v／v)TritonX-100或者0.5％(w／v)Glycine，23℃继续培养36h。制作发酵过程中菌体的生长曲线，并在不同时间点测定发酵液中的酶活力，绘制重组菌不同时间段的胞外产酶曲线。

酶活力测定方法为800μL1％的κ-卡拉胶底物与200μL的酶液39℃反应5min，加1mL DNS煮沸5min，520nm测定吸光度值。酶活力单位(U)定义为：39℃，pH6.0条件下，每分钟降解κ-卡拉胶产生1μmol还原糖(以半乳糖计)所需的酶量。

实施例3重组κ-卡拉胶酶学性质分析

1、温度及温度稳定性分析：重组酶最适温度的确定方法是将酶与1％的κ-卡拉胶底物在不同的温度下(30-55℃)反应5min，测定不同实验组的酶活力，每个实验组做三个平行。并与天然的κ-卡拉胶做对照。结果表明该酶的最适反应温度为39℃，且在33-50℃范围内均表现出较好的酶活力。重组酶温度稳定性的测定方法为，将重组酶保存在不同温度下，在不同时间段取酶测定残余酶活力，绘制酶活力变化与不同温度下保藏时间的变化曲线。结果表明，该重组酶在35℃以下保温3h，酶活力没有显著下降；40℃条件下，随着保温时间的延长，酶的活力逐渐降低。

2、pH及pH稳定性分析：重组酶最适反应pH的确定是通过将酶与不同pH组成的卡拉胶底物39℃反应5min，测定不同pH条件下的酶活力，并绘制酶活力与pH的关系曲线。结果表明，该酶的最适反应pH大概在6左右，pH5-7范围内表现出较高的酶活力。重组酶pH的稳定性是通过将重组酶在不同的pH条件下孵育两个小时，测定残余酶活力，并绘制残余酶活力与pH的关系曲线。结果表明，该酶在pH6-7范围内具有较好的稳定性。

3、生化试剂对酶活力的影响：是将重组κ-卡拉胶酶与含有不同浓度的1％κ-卡拉胶反应，与蒸馏水配制的不添加任何生化试剂的对照组进行对照，结果如表1所示。一定浓度的Na⁺、tween-80、tritonX-100、DTT对酶活力有明显的促进作用；Cu²⁺、pb²⁺、SDS、EDTA对酶活力显著抑制。

表1不同浓度生化试剂对酶活力的影响

实施例4重组κ-卡拉胶酶降解卡拉胶实验

配制1％的κ-卡拉胶底物，分批添加离心除去菌体后的发酵液进行酶解。第一次按照体积比1：40(酶液：底物)添加酶液，35℃反应6h后添加相同体积的酶液，使酶与底物的最终比例为1：20，继续酶解6h。醇沉收集酶解产物-50℃冻干，将冻干样品进行ESI-MS分析。结果显示，κ-卡拉胶酶降解κ-卡拉胶得到四糖、六糖、八糖为主的三种组分，结果如图4所示。

Claims (5)

1.一种生产重组κ-卡拉胶酶的重组菌株构建方法，其特征是κ-卡拉胶酶基因cgkZ(GenBank号KC503903)通过重组表达质粒pProEX-HTa-cgkZ导入大肠杆菌BL21(DE3)；所述重组表达质粒pProEX-HTa-cgkZ是将cgkZ基因导入表达质粒pProEX-HTa的多克隆位点得到。

2.根据权利要求1所述的cgkZ基因是来源于Zobellia sp.ZM-2(菌种保藏号：(CCTCC M2013256)的κ-卡拉胶酶的前体基因。

3.根据权利要求2所述的cgkZ基因含有κ-卡拉胶酶天然信号肽序列OmpZ。

4.一种生产重组κ-卡拉胶酶的方法，是利用权利要求1中的重组菌株发酵得到κ-卡拉胶酶。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵条件为20-28℃，pH为4.0-6.5，转速130-180rpm。

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