CN1332025C - 制备基因工程固定化酶n－糖酰胺酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法，即利用基因工程技术将N-糖酰胺酶与酵母性凝集因子相融合，锚定在甲醇营养型酵母细胞表面，获得一种利用细胞作为载体固定化的N-糖酰胺酶。本发明的方法在固定化过程中酶活性不下降，制得的固定化酶稳定性高，可以重复利用、省去了纯化，大大降低N-糖酰胺酶的生产成本，其生产的N-糖酰胺酶可广泛用于规模化的从农副产品下脚料(蛋黄粉、牛奶)中提取具有生物功能寡糖链。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化酶的制备方法，尤其涉及一种利用基因工程技术将能完整去除糖蛋白上寡糖链的N-糖酰胺酶(包括PNGase)表面固定化在甲醇营养型酵母细胞表面以获得大量表面锚定有N-糖酰胺酶的整细胞催化器的方法。
背景技术
碳水化合物是自然界中最为丰富的有机化合物。细胞内的各种糖缀合物如糖蛋白，糖脂和糖胺等在生物体内细胞-细胞间的识别，信号传导，免疫反应，细胞分化和凋亡等许多生物过程中扮演着极其重要的角色。
N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC3.5.1.52)能够专一性的断裂糖链和蛋白之间的酰胺键，生成一个完整的糖链和蛋白，并目将蛋白上的天氡酰胺转化为天氡氨酸。由于N-糖酰胺酶能够从糖肽和糖蛋白上面完整切下N-连接的低聚糖(N-糖苷)，将蛋白和糖链完全分开，这对于进行细胞表面糖结构-功能的分析、糖链对糖蛋白功能的影响和糖链结构的分析和研究具有重要意义。这些特性使N-糖酰胺酶成为糖生物学研究中广泛应用的工具酶。
然而，由于N-糖酰胺酶的大规模制备仍然十分困难，导致了N-糖苷酶的价格十分昂贵。这种情况极大地限制了对N-糖链大规模制备。尽管将糖蛋白进行降解后可以大大提高N-糖酰胺酶的活性，对N-连接的低聚糖的大规模制备仍然需要大量的N-糖苷酶。现在商业化的N-糖酰胺酶主要从脑膜炎脓杆菌中提取。提取和纯化N-糖苷酶是一个十分耗费和耗时的工作。因此，市场价格十分昂贵。目前，Glyko公司的N-糖苷酶F标价为100mU 224美元(1单位的N-糖苷酶F定义为在pH7.5和摄氏37℃下作用1小时催化60μmole的变性核糖核酸酶B所需的酶量)。现在，N-糖酰胺酶在大肠杆菌中实现了表达，重组N-糖酰胺酶会分泌到细胞膜外和细胞壁之间。表达出的N-糖酰胺酶用Ni2+柱纯化。1升的培养液中，可以得到8毫克的N-糖酰胺酶。活性为28.2mU/mg(1mU的N-糖苷酶F定义为在pH8.0和37℃下每分钟水解1μmol的卵青蛋白糖肽所需的酶量)。这样一来，生产1公斤的N-糖酰胺酶就需要125吨的培养液。但在实际上，由于表达系统的稳定性问题，这样大规模的放大几乎是不可能的。这将大大限制N-糖酰胺酶的广泛利用和N-糖链大规模制备。
发明内容：
为了克服以上缺陷，获得廉价实用的N-糖酰胺酶，本发明的目的是提供一种制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法，即利用基因工程技术将N-糖酰胺酶与酵母性凝集因子相融合，锚定在甲醇营养型酵母细胞表面，获得一种利用细胞作为载体固定化的N-糖酰胺酶。
本发明涉及的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法，由下述步骤组成；
(1)重组表达载体的构建：
克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC3.5.1.52)基因，经酶切后插入大肠杆菌载体，命名为vector-PNG；然后克隆出酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，经酶切后插入到vector-PNG载体；与N-糖酰胺酶基因形成融合基因，载体命名为vector-PNG-A；vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的酵母表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体命名为pPIC9k-PNG-A。
(2)重组酵母菌株的构建；
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
(3)重组酵母菌株的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝10-20时，5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃～30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，培养24-48小时，5000g离心5～10分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液；
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
在上述方法中，步骤(1)所述的N-糖酰胺酶是具有能够从糖蛋白上完整的将N-连接的寡糖链切除活性的一类酶。
其中，上述步骤(1)所述的N-糖酰胺酶优选是来源于脑膜炎脓杆菌ATCC 33958的N-糖酰胺酶F。
在上述方法中，步骤(1)所述的N-糖酰胺酶(PNGase F)基因，其阅读框中含有1062个碱基。编码一个354个氨基酸的蛋白质。前面的40个氨基酸推测为信号肽，剩余的314个氨基酸为一分子量为34779Da的蛋白[gi：148720]。
在上述方法中，步骤(1)所述的酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因是酿酒酵母性凝集因子基因[gi：171041]的C-末端基因。
在上述方法中，步骤(1)所述的大肠杆菌载体优选是具有XbaI、NotI、EcoRI酶切位点的大肠杆菌质粒pBluescriptSK(-)、pBluescriptSK(+)、pET22b之一。
其中，上述用于质粒扩增的宿主菌优选Top10、DH5α、JM109、BL21之一。
在上述方法中，步骤(1)所述的PCR扩增条件是：50μl反应体系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。
在上述方法中，步骤(2)所述的电转条件优选是：1.5Kv；25μF。
在上述方法中，步骤(2)所述的酵母菌株优选是甲醇营养酵母菌株——毕赤酵母Gs115。
在上述方法中，步骤(3)所述的YPD培养条件优选是30℃培养15～20小时，摇床转速为260转/分。
在上述方法中，步骤(3)所述的诱导温度优选是25℃，摇床转速为220转/分。
在上述方法中，步骤(3)所述的向培养基加甲醇的量优选是6-8ml/L。
本发明提及的固定化的N-糖酰胺酶的结构示意图见图1，N-糖酰胺酶通过共价键与凝集因子相结合，而凝集因子为一细胞壁外蛋白，通过共价键与葡聚糖相连，具有抗抽提、不容易脱落等特性。锚定有N-糖酰胺酶的酵母细胞可以看作一个整生物催化器，并且具有遗传性，只要培养细胞就可获得本发明的所述的固定化N-糖酰胺酶。
在本发明方法的固定化过程中酶活性不下降，制得的固定化酶稳定性高，在制备所述的固定化N-糖酰胺酶中，不需要复杂的纯化步骤，省去了酶分离纯化的支出，并且可以重复利用，极大的降低了N-糖酰胺酶的生产成本。其生产的N-糖酰胺酶可广泛用于规模化的从农副产品下脚料(蛋黄粉、牛奶)中提取具有生物功能寡糖链。
采用本发明涉及的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase F)的方法，获得的工程化N-糖酰胺酶进行酶活测定：1ml缓冲液A(0.1M乙酸钠，0.1％SDS，pH8.0)10mg糖蛋白，0.1g工程化N-糖酰胺酶细胞，25℃-40℃水浴反应12h。离心除去菌体，SDS_PAGE分析酶切效果，经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase F)作用的糖蛋白的糖链被切除，糖蛋白的分子量与原来相比减小，在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移(见附图4)。
与现有的技术相比，利用本发明的方法每升发酵液能够得到50g湿菌体，产量高，纯度大，此固定化酶生产方法简便易行，纯化步骤简单，菌体可以重复利用，并且，在此工程菌中，外源基因整合在酵母的基因组上，与大肠杆菌相比不存在基因丢失现象。本方法中使用的酵母菌发酵工艺成熟，可以大规模生产。另外，酵母被认为是无毒安全的表达体系，能够用于药物、食品等领域。
附图说明：
图1为固定化的N-糖酰胺酶的结构示意图。
图2为vector-PNG-A载体
图3为酵母重组载体pPIC9k-PNG-A
图4为固定化N-糖酰胺酶对糖蛋白核糖核酸酶B的酶切效果图
其中：1、核糖核酸酶B；2、不带N-糖酰胺酶的Gs115；3、带有固定化N-糖酰胺酶的Gs115。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述：
实施例1：
(1)重组表达载体的构建：
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(+)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；
5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，PCR扩增条件同上，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
(2)重组毕赤酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
(3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养12小时，摇床转速为240转/分；当发酵液浓度达OD＝5时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240转/分；当发酵液浓度达OD＝10时，5000g离心6分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5时，诱导培养，诱导温度20℃，摇床转速为180转/分，每隔12小时向培养基中加入6ml/L量的甲醇，培养30小时，5000g离心5分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
以糖蛋白核糖核酸酶B为底物制备寡糖链：10mg核糖核酸酶B加入1ml缓冲液(0.1M乙酸钠，0.1％SDS，pH8.0)，100℃水浴5min，冷却到37℃加入上述工程化酵母细胞(固定化N-糖酰胺酶)0.1g，37℃保温12h.离心除去菌体(可重复利用)，通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况；经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase F)作用的核糖核酸酶B的糖链被切除，核糖核酸酶B的分子量与原来相比减小，在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移(见附图4)。
实施例2：
(1)重组表达载体的构建：
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(-)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；
5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，PCR扩增条件同上，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经FcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
(2)重组毕赤酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
(3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养18小时，摇床转速为250转/分；当发酵液浓度达OD＝5.5时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为250转/分；当发酵液浓度达OD＝15时，5000g离心8分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.7时，诱导培养，诱导温度25℃，摇床转速为220转/分，每隔12小时向培养基中加入8ml/L量的甲醇，培养36小时，5000g离心7分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
以卵清蛋白为原料制备糖链：100mg卵清蛋白溶于5mlPBS缓冲液中加入1mg木瓜蛋白酶将解卵清蛋白为糖肽。然后加热使糖肽变性，加入1g上述工程化酵母(固定化N-糖酰胺酶)，37℃保温24h。通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况。；经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)作用的糖肽的糖链被切除，糖肽的分子量与原来相比减小，在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移。
实施例3：
(1)重组表达载体的构建：
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pET22b载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；
5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，PCR扩增条件同上，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vcctor-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
(2)重组毕赤酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
(3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养24小时，摇床转速为270转/分；当发酵液浓度达OD＝6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为270转/分；当发酵液浓度达OD＝20时，5000g离心10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝1.0时，诱导培养，诱导温度30℃，摇床转速为250转/分，每隔12小时向培养基中加入10ml/L量的甲醇，培养48小时，5000g离心10分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
以蛋黄粉为原料制备寡糖链。取100g蛋黄粉加入500ml丙酮脱脂，加入10mg木瓜蛋白酶60℃保温1h，冷却到37℃。加入10g上述工程化酵母(固定化N-糖酰胺酶)，37℃保温24h，通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况。经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase F)作用的糖肽的糖链被切除，糖肽的分子量与原来相比减小，在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移。
实施例4：
表面表达N-糖酰胺酶1(PNG1)的毕赤酵母菌株的构建
1.材料：PNG1：Genbank[gi：50593503]；pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)
1)重组表达载体的构建：
以5-ATAATCTAGATTTACCATCCTCCCCACGCT-3；5-TTGGAATTCATGGGAGGTATACGAAA-3为引物从酿酒酵母中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCRbuffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(+)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，PCR扩增条件同上，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PPNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶1(PNG1)和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
2)重组毕赤酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中，构建重组毕赤酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养12小时，摇床转速为240转/分；当发酵液浓度达OD＝5时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240转/分；当发酵液浓度达OD＝10时，5000g离心8分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5时，诱导培养，诱导温度20℃，摇床转速为180转/分，每隔12小时向培养基中加入5ml/L量的甲醇，培养36小时，5000g离心5分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
以蛋黄粉为原料制备寡糖链。取100g蛋黄粉加入500ml丙酮脱脂，加入10mg木瓜蛋白酶60℃保温1h，冷却到37℃。加入10g上述工程化酵母(固定化N-糖酰胺酶)，37℃保温24h，通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况。经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)作用的糖肽的糖链被切除，糖肽的分子量与原来相比减小，在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移。
实施例5：
表面表达N-糖酰胺酶(NGLY1)的毕赤酵母菌株的构建
1.材料：NGLY1(来源于人基因组)：Genbank[gi：21314689]；pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)
1)重组表达载体的构建：
以5-ATAATCTAGATGGCGGCGGCGGCATTGGG-3；5-TTGGAATTCTCAAAGGTCACTGAATTTT-3为引物从酿酒酵母中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCRbuffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(-)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，PCR扩增条件同上，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶(NGLY1)和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
2)重组毕赤酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中，构建重组毕赤酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养18小时，摇床转速为260转/分；当发酵液浓度达OD＝6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为250转/分；当发酵液浓度达OD＝10时，5000g离心10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.8时，诱导培养，诱导温度25℃，摇床转速为210转/分，每隔12小时向培养基中加入8ml/L量的甲醇，培养30小时，5000g离心7分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
以卵清蛋白为原料制备糖链：100mg卵清蛋白溶于5mlPBS缓冲液中加入1mg木瓜蛋白酶将解卵清蛋白为糖肽。然后加热使糖肽变性，加入1g上述工程化酵母(固定化N-糖酰胺酶)，37℃保温24h。通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况。；经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)作用的糖肽的糖链被切除，糖肽的分子量与原来相比减小，在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移。
Claims (6)
1.一种制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法，由下述步骤组成；
(1)重组表达载体的构建：
克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC 3.5.1.52)基因，经酶切后插入大肠杆菌载体pBluescriptSK(-)、pBluescriptSK(+)、pET22b之一，命名为vector-PNG；然后克隆出酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，经酶切后插入到vector-PNG载体；与N-糖酰胺酶基因形成融合基因，载体命名为vector-PNG-A；vector-PNG-A载体经EcoR I、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的毕赤氏酵母表达载体pPIC9k，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体命名为pPIC9k-PNG-A；
(2)重组毕赤氏酵母菌株Gs115的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到甲醇营养型毕赤氏酵母菌株Gs115基因组中，构建重组毕赤氏酵母菌株Gs115；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；
(3)重组毕赤氏酵母菌株Gs115的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝10-20时，5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃～30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，培养24-48小时，5000g离心5～10分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液；
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
2.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法，其特征是，步骤(1)所述的N-糖酰胺酶是来源于脑膜炎脓杆菌ATCC 33958的N-糖酰胺酶F。
3.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法，其特征是，步骤(2)所述的电转条件是：1.5Kv；25μF。
4.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法，其特征是，步骤(3)所述的YPD培养条件是30℃培养15～20小时，摇床转速为260转/分。
5.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法，其特征是，步骤(3)所述的诱导温度是25℃，摇床转速为220转/分。
6.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法，其特征是，步骤(3)所述的向培养基加甲醇的量是6-8ml/L。
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| Cloning and expression of peptide- N4-(N-acetyl-beta-D-glucosaminyl)asparagine-amidase-F in Escherichiacoli Barsomian.G.D,Johnson.T.L,Borowski.M,Denman.J,Ollington.J.F,Hirani.S,J.Biol.Chem.,Vol.265 No.12 1990 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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