CN1740324A - 制备基因工程固定化酶n-糖酰胺酶的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法,即利用基因工程技术将N-糖酰胺酶与酵母性凝集因子相融合,锚定在甲醇营养型酵母细胞表面,获得一种利用细胞作为载体固定化的N-糖酰胺酶。本发明的方法在固定化过程中酶活性不下降,制得的固定化酶稳定性高,可以重复利用、省去了纯化,大大降低N-糖酰胺酶的生产成本,其生产的N-糖酰胺酶可广泛用于规模化的从农副产品下脚料(蛋黄粉、牛奶)中提取具有生物功能寡糖链。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定化酶的制备方法,尤其涉及一种利用基因工程技术将能完整去除糖蛋白上寡糖链的N-糖酰胺酶(包括PNGase)表面固定化在甲醇营养型酵母细胞表面以获得大量表面锚定有N-糖酰胺酶的整细胞催化器的方法。
背景技术
碳水化合物是自然界中最为丰富的有机化合物。细胞内的各种糖缀合物如糖蛋白,糖脂和糖胺等在生物体内细胞-细胞间的识别,信号传导,免疫反应,细胞分化和凋亡等许多生物过程中扮演着极其重要的角色。
N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase,EC 3.5.1.52)能够专一性的断裂糖链和蛋白之间的酰胺键,生成一个完整的糖链和蛋白,并且将蛋白上的天氡酰胺转化为天氡氨酸。由于N-糖酰胺酶能够从糖肽和糖蛋白上面完整切下N-连接的低聚糖(N-糖苷),将蛋白和糖链完全分开,这对于进行细胞表面糖结构-功能的分析、糖链对糖蛋白功能的影响和糖链结构的分析和研究具有重要意义。这些特性使N-糖酰胺酶成为糖生物学研究中广泛应用的工具酶。
然而,由于N-糖酰胺酶的大规模制备仍然十分困难,导致了N-糖苷酶的价格十分昂贵。这种情况极大地限制了对N-糖链大规模制备。尽管将糖蛋白进行降解后可以大大提高N-糖酰胺酶的活性,对N-连接的低聚糖的大规模制备仍然需要大量的N-糖苷酶。现在商业化的N-糖酰胺酶主要从脑膜炎脓杆菌中提取。提取和纯化N-糖苷酶是一个十分耗费和耗时的工作。因此,市场价格十分昂贵。目前,Glyko公司的N-糖苷酶F标价为100mU 224美元(1单位的N-糖苷酶F定义为在pH7.5和摄氏37℃下作用1小时催化60μmole的变性核糖核酸酶B所需的酶量)。现在,N-糖酰胺酶在大肠杆菌中实现了表达,重组N-糖酰胺酶会分泌到细胞膜外和细胞壁之间。表达出的N-糖酰胺酶用Ni2+柱纯化。1升的培养液中,可以得到8毫克的N-糖酰胺酶。活性为28.2mU/mg(1mU的N-糖苷酶F定义为在pH8.0和37℃下每分钟水解1μmol的卵青蛋白糖肽所需的酶量)。这样一来,生产1公斤的N-糖酰胺酶就需要125吨的培养液。但在实际上,由于表达系统的稳定性问题,这样大规模的放大几乎是不可能的。这将大大限制N-糖酰胺酶的广泛利用和N-糖链大规模制备。
发明内容:
为了克服以上缺陷,获得廉价实用的N-糖酰胺酶,本发明的目的是提供一种制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法,即利用基因工程技术将N-糖酰胺酶与酵母性凝集因子相融合,锚定在甲醇营养型酵母细胞表面,获得一种利用细胞作为载体固定化的N-糖酰胺酶。
本发明涉及的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法,由下述步骤组成;
(1)重组表达载体的构建:
克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase,EC 3.5.1.52)基因,经酶切后插入大肠杆菌载体,命名为vector-PNG;然后克隆出酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因,经酶切后插入到vector-PNG载体;与N-糖酰胺酶基因形成融合基因,载体命名为vector-PNG-A;vector-PNG-A载体经EcoR I、NotI酶切后回收小片段,插入经相同酶切的酵母表达载体,获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体命名为pPIC9k-PNG-A。
(2)重组酵母菌株的构建:
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化;电转到酵母菌株基因组中,构建重组酵母菌株;在MD平板上长出的菌落为阳性克隆;
其中,MD平板培养基配方为:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖。
(3)重组酵母菌株的培养与诱导:
挑取上述阳性克隆单菌落,接种于YPD培养基中,30℃培养12-24小时,摇床转速为240-270转/分;当发酵液浓度达OD=5-6时,按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养,温度30℃,摇床转速为240-270转/分;当发酵液浓度达OD=10-20时,5000g离心5~10分钟,收集菌体,用PBS洗涤菌体1~2次,转接到BMM液体培养基中,使发酵液浓度达OD=0.5-1.0时,诱导培养,诱导温度20℃~30℃,摇床转速为180-250转/分,每隔12小时向培养基中加入5~10ml/L量的甲醇,培养24-48小时,5000g离心5~10分钟,收集菌体,PBS洗两次,即得固定化N-糖酰胺酶;
其中PBS为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液;
其中YPD培养基配方为:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L;
其中BMM液体培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L。
在上述方法中,步骤(1)所述的N-糖酰胺酶是具有能够从糖蛋白上完整的将N-连接的寡糖链切除活性的一类酶。
其中,上述步骤(1)所述的N-糖酰胺酶优选是来源于脑膜炎脓杆菌ATCC 33958的N-糖酰胺酶F。
在上述方法中,步骤(1)所述的N-糖酰胺酶(PNGase F)基因,其阅读框中含有1062个碱基。编码一个354个氨基酸的蛋白质。前面的40个氨基酸推测为信号肽,剩余的314个氨基酸为一分子量为34779Da的蛋白[gi:148720]。
在上述方法中,步骤(1)所述的酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因是酿酒酵母性凝集因子基因[gi:171041]的C-末端基因。
在上述方法中,步骤(1)所述的大肠杆菌载体优选是具有XbaI、NotI、EcoR I酶切位点的大肠杆菌质粒pBluescriptSK(-)、pBluescriptSK(+)、pET22b之一。
其中,上述用于质粒扩增的宿主菌优选Top10、DH5α、JM109、BL21之一。
在上述方法中,步骤(1)所述的PCR扩增条件是:50μl反应体系中,10×PCR buffer5μl,MgCL2(25mmol/L)3μl,d NTP(25mmol/L)1μl,引物1、2(20pmol/L)各1μl,基因组DNA 1μl,Taq DNA聚合酶0.5U,在94℃预变性5min后按如下参数:94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸2min循环28次,最后一个循环72℃延伸10min。
在上述方法中,步骤(2)所述的电转条件优选是:1.5Kv;25μF。
在上述方法中,步骤(2)所述的酵母菌株优选是甲醇营养酵母菌株——毕赤酵母Gsl15。
在上述方法中,步骤(3)所述的YPD培养条件优选是30℃培养15~20小时,摇床转速为260转/分。
在上述方法中,步骤(3)所述的诱导温度优选是25℃,摇床转速为220转/分。
在上述方法中,步骤(3)所述的向培养基加甲醇的量优选是6-8ml/L。
本发明提及的固定化的N-糖酰胺酶的结构示意图见图1,N-糖酰胺酶通过共价键与凝集因子相结合,而凝集因子为一细胞壁外蛋白,通过共价键与葡聚糖相连,具有抗抽提、不容易脱落等特性。锚定有N-糖酰胺酶的酵母细胞可以看作一个整生物催化器,并且具有遗传性,只要培养细胞就可获得本发明的所述的固定化N-糖酰胺酶。
在本发明方法的固定化过程中酶活性不下降,制得的固定化酶稳定性高,在制备所述的固定化N-糖酰胺酶中,不需要复杂的纯化步骤,省去了酶分离纯化的支出,并且可以重复利用,极大的降低了N-糖酰胺酶的生产成本。其生产的N-糖酰胺酶可广泛用于规模化的从农副产品下脚料(蛋黄粉、牛奶)中提取具有生物功能寡糖链。
采用本发明涉及的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase F)的方法,获得的工程化N-糖酰胺酶进行酶活测定:1ml缓冲液A(0.1M乙酸钠,0.1%SDS,pH8.0)10mg糖蛋白,0.1g工程化N-糖酰胺酶细胞,25℃-40℃水浴反应12h。离心除去菌体,SDS_PAGE分析酶切效果,经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase F)作用的糖蛋白的糖链被切除,糖蛋白的分子量与原来相比减小,在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移(见附图4)。
与现有的技术相比,利用本发明的方法每升发酵液能够得到50g湿菌体,产量高,纯度大,此固定化酶生产方法简便易行,纯化步骤简单,菌体可以重复利用,并且,在此工程菌中,外源基因整合在酵母的基因组上,与大肠杆菌相比不存在基因丢失现象。本方法中使用的酵母菌发酵工艺成熟,可以大规模生产。另外,酵母被认为是无毒安全的表达体系,能够用于药物、食品等领域。
附图说明:
图1为固定化的N-糖酰胺酶的结构示意图。
图2为vector-PNG-A载体
图3为酵母重组载体pPIC9k-PNG-A
图4为固定化N-糖酰胺酶对糖蛋白核糖核酸酶B的酶切效果图
其中:1、核糖核酸酶B;2、不带N-糖酰胺酶的Gsll5;3、带有固定化N-糖酰胺酶的Gsll5。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步阐述:
实施例1:
(1)重组表达载体的构建:
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3;5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因,PCR扩增条件:50μl反应体系中,10×PCR buffer5μl,MgCL2(25mmol/L)3μl,d NTP(25mmol/L)1μl,引物1、2(20pmol/L)各1μl,基因组DNA 1μl,Taq DNA聚合酶0.5U,在94℃预变性5min后按如下参数:94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸2min循环28次,最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(+)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3;5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物,克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因,PCR扩增条件同上,经XbaI、EcoR I插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoR I位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoR I、NotI酶切后回收小片段,插入经相同酶切的pPIC9k表达载体,获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
(2)重组毕赤酵母菌株的构建:
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化;电转到毕赤酵母Gsl15菌株基因组中,构建重组酵母菌株;在MD平板上长出的菌落为阳性克隆;
其中MD平板培养基配方为:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖。
(3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导:
挑取上述阳性克隆单菌落,接种于YPD培养基中,30℃培养12小时,摇床转速为240转/分;当发酵液浓度达OD=5时,按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养,温度30℃,摇床转速为240转/分;当发酵液浓度达OD=10时,5000g离心6分钟,收集菌体,用PBS洗涤菌体1~2次,转接到BMM液体培养基中,使发酵液浓度达OD=0.5时,诱导培养,诱导温度20℃,摇床转速为180转/分,每隔12小时向培养基中加入6ml/L量的甲醇,培养30小时,5000g离心5分钟,收集菌体,PBS洗两次,即得固定化N-糖酰胺酶;
其中PBS为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L。
以糖蛋白核糖核酸酶B为底物制备寡糖链:10mg核糖核酸酶B加入1ml缓冲液(0.1M乙酸钠,0.1%SDS,pH8.0),100℃水浴5min,冷却到37℃加入上述工程化酵母细胞(固定化N-糖酰胺酶)0.1g,37℃保温12h.离心除去菌体(可重复利用),通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况;经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase F)作用的核糖核酸酶B的糖链被切除,核糖核酸酶B的分子量与原来相比减小,在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移(见附图4)。
实施例2:
(1)重组表达载体的构建:
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3;5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因,PCR扩增条件:50μl反应体系中,10×PCR buffer5μl,MgCL2(25mmol/L)3μl,d NTP(25mmol/L)1μl,引物1、2(20pmol/L)各1μl,基因组DNA 1μl,Taq DNA聚合酶0.5U,在94℃预变性5min后按如下参数:94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸2min循环28次,最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(-)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3;5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物,克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因,PCR扩增条件同上,经XbaI、EcoR I插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoR I位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoR I、NotI酶切后回收小片段,插入经相同酶切的pPIC9k表达载体,获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
(2)重组毕赤酵母菌株的构建:
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化;电转到毕赤酵母Gsll5菌株基因组中,构建重组酵母菌株;在MD平板上长出的菌落为阳性克隆;
其中MD平板培养基配方为:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖。
(3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导:
挑取上述阳性克隆单菌落,接种于YPD培养基中,30℃培养18小时,摇床转速为250转/分;当发酵液浓度达OD=5.5时,按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养,温度30℃,摇床转速为250转/分;当发酵液浓度达OD=15时,5000g离心8分钟,收集菌体,用PBS洗涤菌体2次,转接到BMM液体培养基中,使发酵液浓度达OD=0.7时,诱导培养,诱导温度25℃,摇床转速为220转/分,每隔12小时向培养基中加入8ml/L量的甲醇,培养36小时,5000g离心7分钟,收集菌体,PBS洗两次,即得固定化N-糖酰胺酶;
其中PBS为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L。
以卵清蛋白为原料制备糖链:100mg卵清蛋白溶于5mlPBS缓冲液中加入1mg木瓜蛋白酶将解卵清蛋白为糖肽。然后加热使糖肽变性,加入1g上述工程化酵母(固定化N-糖酰胺酶),37℃保温24h。通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况。;经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)作用的糖肽的糖链被切除,糖肽的分子量与原来相比减小,在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移。
实施例3:
(1)重组表达载体的构建:
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3;5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因,PCR扩增条件:50μl反应体系中,10×PCR buffer5μl,MgCL2(25mmol/L)3μl,d NTP(25mmol/L)1μl,引物1、2(20pmol/L)各1μl,基因组DNA 1μl,Taq DNA聚合酶0.5U,在94℃预变性5min后按如下参数:94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸2min循环28次,最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pET22b载体的XbaI、NotI立点命名为vector PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3;5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物,克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因,PCR扩增条件同上,经XbaI、EcoR I插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoR I位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoR I、NotI酶切后回收小片段,插入经相同酶切的pPIC9k表达载体,获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
(2)重组毕赤酵母菌株的构建:
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化;电转到毕赤酵母Gsll5菌株基因组中,构建重组酵母菌株;在MD平板上长出的菌落为阳性克隆;
其中MD平板培养基配方为:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖。
(3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导:
挑取上述阳性克隆单菌落,接种于YPD培养基中,30℃培养24小时,摇床转速为270转/分;当发酵液浓度达OD=6时,按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养,温度30℃,摇床转速为270转/分;当发酵液浓度达OD=20时,5000g离心10分钟,收集菌体,用PBS洗涤菌体2次,转接到BMM液体培养基中,使发酵液浓度达OD=1.0时,诱导培养,诱导温度30℃,摇床转速为250转/分,每隔12小时向培养基中加入10ml/L量的甲醇,培养48小时,5000g离心10分钟,收集菌体,PBS洗两次,即得固定化N-糖酰胺酶;
其中PBS为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L。
以蛋黄粉为原料制备寡糖链。取100g蛋黄粉加入500ml丙酮脱脂,加入10mg木瓜蛋白酶60℃保温1h,冷却到37℃。加入10g上述工程化酵母(固定化N-糖酰胺酶),37℃保温24h,通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况。经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase F)作用的糖肽的糖链被切除,糖肽的分子量与原来相比减小,在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移。
实施例4:
表面表达N-糖酰胺酶1(PNG1)的毕赤酵母菌株的构建
1.材料:PNG1:Genbank[gi:50593503];pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)
1)重组表达载体的构建:
以5-ATAATCTAGATTTACCATCCTCCCCACGCT-3;5-TTGGAATTCATGGGAGGTATACGAAA-3为引物从酿酒酵母中克隆出N-糖酰胺酶基因,PCR扩增条件:50μl反应体系中,10×PCRbuffer5μl,MgCL2(25mmol/L)3μl,d NTP(25mmol/L)1μl,引物1、2(20pmol/L)各1μl,基因组DNA 1μl,Taq DNA聚合酶0.5U,在94℃预变性5min后按如下参数:94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸2min循环28次,最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(+)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3;5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物,克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因,PCR扩增条件同上,经XbaI、EcoR I插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoR I位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoR I、NotI酶切后回收小片段,插入经相同酶切的pPIC9k表达载体,获得了带有N-糖酰胺酶1(PNG1)和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
2)重组毕赤酵母菌株的构建:
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化;电转到毕赤酵母Gsll5菌株基因组中,构建重组毕赤酵母菌株;在MD平板上长出的菌落为阳性克隆;
其中MD平板培养基配方为:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖。
3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导:
挑取上述阳性克隆单菌落,接种于YPD培养基中,30℃培养12小时,摇床转速为240转/分;当发酵液浓度达OD=5时,按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养,温度30℃,摇床转速为240转/分;当发酵液浓度达OD=10时,5000g离心8分钟,收集菌体,用PBS洗涤菌体1~2次,转接到BMM液体培养基中,使发酵液浓度达OD=0.5时,诱导培养,诱导温度20℃,摇床转速为180转/分,每隔12小时向培养基中加入5ml/L量的甲醇,培养36小时,5000g离心5分钟,收集菌体,PBS洗两次,即得固定化N-糖酰胺酶;
其中PBS为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L。
以蛋黄粉为原料制备寡糖链。取100g蛋黄粉加入500ml丙酮脱脂,加入10mg木瓜蛋白酶60℃保温1h,冷却到37℃。加入10g上述工程化酵母(固定化N-糖酰胺酶),37℃保温24h,通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况。经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)作用的糖肽的糖链被切除,糖肽的分子量与原来相比减小,在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移。
实施例5:
表面表达N-糖酰胺酶(NGLY1)的毕赤酵母菌株的构建
1.材料:NGLY1(来源于人基因组):Genbank[gi:21314689];pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)
1)重组表达载体的构建:
以5-ATAATCTAGATGGCGGCGGCGGCATTGGG-3;5-TTGGAATTCTCAAAGGTCACTGAATTTT-3为引物从酿酒酵母中克隆出N-糖酰胺酶基因,PCR扩增条件:50μl反应体系中,10×PCRbuffer5μl,MgCL2(25mmol/L)3μl,d NTP(25mmol/L)1μl,引物1、2(20pmol/L)各1μl,基因组DNA 1μl,Taq DNA聚合酶0.5U,在94℃预变性5min后按如下参数:94℃变性45s,56℃退火45s,72℃延伸2min循环28次,最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(-)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3;5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物,克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因,PCR扩增条件同上,经XbaI、EcoR I插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoR I位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoR I、NotI酶切后回收小片段,插入经相同酶切的pPIC9k表达载体,获得了带有N-糖酰胺酶(NGLY1)和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
2)重组毕赤酵母菌株的构建:
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化;电转到毕赤酵母Gsll5菌株基因组中,构建重组毕赤酵母菌株;在MD平板上长出的菌落为阳性克隆;
其中MD平板培养基配方为:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖。
3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导:
挑取上述阳性克隆单菌落,接种于YPD培养基中,30℃培养18小时,摇床转速为260转/分;当发酵液浓度达OD=6时,按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养,温度30℃,摇床转速为250转/分;当发酵液浓度达OD=10时,5000g离心10分钟,收集菌体,用PBS洗涤菌体2次,转接到BMM液体培养基中,使发酵液浓度达OD=0.8时,诱导培养,诱导温度25℃,摇床转速为210转/分,每隔12小时向培养基中加入8ml/L量的甲醇,培养30小时,5000g离心7分钟,收集菌体,PBS洗两次,即得固定化N-糖酰胺酶;
其中PBS为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L。
以卵清蛋白为原料制备糖链:100mg卵清蛋白溶于5mlPBS缓冲液中加入1mg木瓜蛋白酶将解卵清蛋白为糖肽。然后加热使糖肽变性,加入1g上述工程化酵母(固定化N-糖酰胺酶),37℃保温24h。通过SDS-PAGE检测糖链断裂情况。;经过固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)作用的糖肽的糖链被切除,糖肽的分子量与原来相比减小,在SDS_PAGE电泳图上可以看到切除糖链的糖蛋白条带前移。
Claims (9)
1.一种制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶(PNGase)的方法,由下述步骤组成;
(1)重组表达载体的构建:
克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase,EC 3.5.1.52)基因,经酶切后插入大肠杆菌载体,命名为vector-PNG;然后克隆出酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因,经酶切后插入到vector-PNG载体;与N-糖酰胺酶基因形成融合基因,载体命名为vector-PNG-A;vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段,插入经相同酶切的毕赤氏酵母表达载体,获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体命名为pPIC9k-PNG-A;
(2)重组酵母菌株的构建:
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化;电转到酵母菌株基因组中,构建重组酵母菌株;在MD平板上长出的菌落为阳性克隆;
其中,MD平板培养基配方为:13.4g/L酵母基本氮源;0.4mg/L生物素;20g/L葡萄糖;
(3)重组酵母菌株的培养与诱导:
挑取上述阳性克隆单菌落,接种于YPD培养基中,30℃培养12-24小时,摇床转速为240-270转/分;当发酵液浓度达OD=5-6时,按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养,温度30℃,摇床转速为240-270转/分;当发酵液浓度达OD=10-20时,5000g离心5~10分钟,收集菌体,用PBS洗涤菌体1~2次,转接到BMM液体培养基中,使发酵液浓度达OD=0.5-1.0时,诱导培养,诱导温度20℃~30℃,摇床转速为180-250转/分,每隔12小时向培养基中加入5~10ml/L量的甲醇,培养24-48小时,5000g离心5~10分钟,收集菌体,PBS洗两次,即得固定化N-糖酰胺酶;
其中PBS为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液;
其中YPD培养基配方为:10g/L酵母粉;20g/L蛋白胨;20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甘油10mL/L;
其中BMM液体培养基配方为:pH6.0,100mM磷酸盐缓冲液,酵母基本氮源13.4g/L,生物素0.4mg/L,甲醇5mL/L。
2.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法,其特征是,步骤(1)所述的N-糖酰胺酶是具有能够从糖蛋白上完整的将N-连接的寡糖链切除活性的一类酶。
3.如权利要求2所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法,其特征是,步骤(1)所述的N-糖酰胺酶是来源于脑膜炎脓杆菌ATCC 33958的N-糖酰胺酶F。
4.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法,其特征是,步骤(1)所述的大肠杆菌载体是具有XbaI、NotI、EcoRI酶切位点的大肠杆菌质粒pBluescriptSK(-)、pBluescriptSK(+)、pET22b之一。
5.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法,其特征是,步骤(2)所述的电转条件是:1.5Kv;25μF。
6.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法,其特征是,步骤(2)所述的酵母菌株是甲醇营养酵母菌株——毕赤酵母Gs115。
7.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法,其特征是,步骤(3)所述的YPD培养条件是30℃培养15~20小时,摇床转速为260转/分。
8.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法,其特征是,步骤(3)所述的诱导温度是25℃,摇床转速为220转/分。
9.如权利要求1所述的制备基因工程固定化酶N-糖酰胺酶的方法,其特征是,步骤(3)所述的向培养基加甲醇的量是6-8ml/L。
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