CN1746302A - 利用酵母生产非n－糖基化蛋白的方法 - Google Patents
利用酵母生产非n－糖基化蛋白的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1746302A CN1746302A CN 200510044079 CN200510044079A CN1746302A CN 1746302 A CN1746302 A CN 1746302A CN 200510044079 CN200510044079 CN 200510044079 CN 200510044079 A CN200510044079 A CN 200510044079A CN 1746302 A CN1746302 A CN 1746302A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- yeast
- gene
- pngase
- protein
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用酵母生产非N－糖基化蛋白的方法，即利用分子生物学技术构建含有N－糖酰胺酶和目的蛋白基因的表达载体，并通过电转化法转入酵母菌中，N－糖酰胺酶稳定表达在酵母细胞表面，目的蛋白经分泌表达到培养介质中，在分泌和培养过程中，表面表达的N－糖酰胺酶将分泌表达的目的糖蛋白的糖链除去，从而获得经过真核表达系统分泌的非N－糖基化蛋白。利用本发明的方法获得的蛋白经过真核蛋白的后处理加工，具有正确的构像和三级结构，但不具有酵母蛋白的N－糖基化，若作为蛋白药物不会在人体内产生免疫源性；也不会因为过糖基化使表达蛋白失去活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种非N-糖基化蛋白的生产方法，尤其涉及一种利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法。
背景技术
N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC 3.5.1.52)主要存在于革兰氏阴性菌脑膜脓杆菌(Flavobacteriummeningosepticum)、酿酒酵母和一些哺乳动物细胞内，能够专一性的断裂糖链和蛋白之间的酰胺键，生成一个完整的糖链和蛋白，并且将蛋白上的天氡酰胺转化为天冬氨酸。由于N-糖酰胺酶能够从糖肽和糖蛋白上面完整切下N-连接的低聚糖(N-糖苷)，将蛋白和糖链完全分开，这对于进行细胞表面糖结构—功能的分析、糖链对糖蛋白功能的影响和糖链结构的分析和研究具有重要意义。
长期以来，人们用大肠杆菌作为宿主表达了许多蛋白，但是这一系统本身也存在着若干缺陷，主要是缺少真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，如剪切、糖基化、形成二硫键等，所表达真核蛋白不具有该蛋白的天然构像，往往不具有生物活性。酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物的易于培养、繁殖快、便于基因工程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能，有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，还能分泌外源蛋白质到培养液中，利于纯化。因此，最近十多年来，酵母作为一个基因工程表达系统受到广泛研究和应用。但是酵母细胞内的糖基化过程与高等哺乳动物细胞内的糖基化有一定的差别。酵母细胞内的糖基化主要为高甘露糖性糖基化，并存在过糖基化现象。具有酵母糖基化的蛋白作为治疗药物，在人体内常常具有抗原性，研究表明此抗原性是由酵母细胞内的糖基化过程与高等哺乳动物细胞内的糖基化差异引起的。另外，在毕赤酵母表达体系表达异源蛋白一般存在过糖基化现象，蛋白的高度糖基化可以使一些外源蛋白(如：酶)降低酶活，甚至丧失酶活。常常表达出无功能蛋白。
发明内容
为了克服以上缺陷，获得一个既具有真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，又不具有上述的抗原性的蛋白。本发明的目的是提供一种利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法。
利用本发明的方法，可以应用分子生物学技术构建含有N-糖酰胺酶和外源蛋白基因重组酵母菌株，N-糖酰胺酶稳定表达在酵母细胞表面，外源蛋白经分泌表达到培养介质中，在分泌和培养过程中，表面表达的N-糖酰胺酶将分泌表达的外源糖蛋白的糖链除去。
本发明涉及的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，由下述步骤组成；
(1)重组表达载体的构建：
克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC 3.5.1.52)基因，经酶切后插入大肠杆菌载体，命名为vector-PNG；然后克隆出酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，经酶切后插入到vector-PNG载体；与N-糖酰胺酶基因形成融合基因，载体命名为vector-PNG-A；vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的酵母表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体命名为pPIC9k-PNG-A。
(2)重组酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
(3)分泌糖蛋白的重组菌株的构建：
将糖蛋白基因插入到pPIC9K载体的α-factor信号肽下游的多克隆位点，获得了含有糖蛋白基因分泌表达载体；用SacI将含有该糖蛋白基因的pPIC9K载体线性化，利用电转化的方法将线性化的重组载体，转化到上述构建的表面表达N-糖酰胺酶的重组酵母菌株基因组中，构建成分泌表达目的蛋白的酵母重组工程菌株；通过G418抗生素筛选出阳性克隆菌株。
(4)糖蛋白在酵母中诱导表达：
将上述阳性克隆工程菌株，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分，培养28～35小时；5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃-30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，诱导温度20℃-30℃，摇床转速为180-250转/分，培养36-60小时；将N-糖酰胺酶表达于酵母细胞壁表面，同时外源糖蛋白分泌表达到培养介质中；在培养介质中，表面表达的N-糖酰胺酶将分泌表达的糖蛋白的糖链切除，生成了非N-糖基化蛋白。
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；
其中，上述重组阳性克隆工程菌株可以通过离心、过滤去除。
在上述方法中，步骤(1)所述的N-糖酰胺酶是具有能够从糖蛋白上完整的将N-连接的寡糖链切除活性的一类酶。
其中，上述步骤(1)所述的N-糖酰胺酶优选是来源于脑膜炎脓杆菌ATCC 33958的N-糖酰胺酶F。
在上述方法中，步骤(1)所述的N-糖酰胺酶(PNGase F)基因，其阅读框中含有1062个碱基。编码一个354个氨基酸的蛋白质。前面的40个氨基酸推测为信号肽，剩余的314个氨基酸为一分子量为34779Da的蛋白Genbank[gi：148720]。
在上述方法中，步骤(1)所述的酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因是酿酒酵母性凝集因子基因Genbank[gi：171041]的C-末端基因。
在上述方法中，步骤(1)所述的大肠杆菌载体优选是具有XbaI、NotI、EcoRI酶切位点的大肠杆菌质粒，如pBluescriptSK(-)、pBluescriptSK(+)、pET22b之一。
其中，上述用于质粒扩增的宿主菌优选Top10、DH5α、JM109、BL21之一。
在上述方法中，步骤(2)或(3)所述的电转条件优选是：1.5Kv；25μF。
在上述方法中，步骤(2)所述的酵母菌株优选是甲醇营养酵母菌株——毕赤酵母Gs115。
在上述方法中，步骤(3)所述的外源糖蛋白基因是干扰素基因、EPO基因、核糖核酸酶B基因之一。
在上述方法中，步骤(4)所述的YPD培养条件优选是30℃培养15～20小时，摇床转速为260转/分。
在上述方法中，步骤(4)所述的诱导温度优选是25℃，摇床转速为220转/分。
在上述方法中，步骤(4)所述的向培养基加甲醇的量优选是6-8ml/L。
采用本发明涉及的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，可以方便地构建含有N-糖酰胺酶和目的蛋白基因的表达载体，并通过电转化法转入酵母菌中，将N-糖酰胺酶稳定表达在酵母细胞表面，同时外源蛋白经分泌表达扩散到培养介质中，在所述分泌表达外源蛋白的酵母重组工程菌分泌和培养过程中，表面表达的N-糖酰胺酶将分泌表达的外源糖蛋白的糖链除去，生成了非N-糖基化蛋白。方法简便，实用，大大降低了成本，具有推广应用价值。
本发明涉及的分泌表达外源蛋白的酵母重组工程菌株接受外源基因是以整合与基因组的形式，这与大肠杆菌、酿酒酵母的独立染色体外的质粒表达体系有显著区别，不存在外源基因丢失现象。通过抗性、PCR等方法筛选出的阳性克隆，可以通过传代培养。通过该重组酵母菌株表达的真核糖蛋白具有真核翻译修饰后加工过程，与天然的糖蛋白相比具有相同的构象，只是去掉了糖链，作为治疗药物在人体内不具有抗原性，但具有生物活性。
附图说明：
图1非N-无糖基化蛋白酵母菌株示意图
图2为vector-PNG-A载体
图3为酵母重组载体pPIC9k-PNG-A
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步的阐述：
实施例1：
非N-糖基化促红细胞生成素(EPO)在毕赤酵母菌株中的生产
1、材料：EPO基因：Genbank[gi：4503588]、pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)、含有PNGaseF毕赤氏酵母GS115菌株
2、方法：
1)、表面表达N-糖酰胺酶酵母菌株的构建：
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，dNTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(+)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因(PCR扩增条件同上)，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中。电转条件：1.5Kv；25μF。以MD(13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg生物素；20g/L葡萄糖)培养筛选菌株，在MD平板上长出的菌落为阳性克隆。
2)、分泌EPO的表达菌株的构建：
将EPO基因插入到pPIC9K载体的α-factor信号肽下游的多克隆位点，获得了含有EPO基因分泌表达载体。用SacI将含有该糖蛋白基因的pPIC9K载体线性化，利用电转化的方法将线性化的重组载体转化到表面表达的PNGase F的重组毕赤酵母Gs115菌株基因组中，电转条件：1.5Kv；25μF。构建成分泌表达EPO的毕赤酵母Gs115重组工程菌株。通过G418抗生素筛选出阳性克隆菌株。
3)、重组毕赤酵母菌株的诱导表达：
挑取经过验证的阳性重组毕赤酵母Gs115菌株的单菌落，接种到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖)培养基中，30℃，260r/min培养20小时，按1∶100的接种量转接到BMG(100mM磷酸盐缓冲液，pH6.0；酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培养基中，于30℃，250r/min条件，培养30小时，5000g离心10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培养基重悬菌体，使OD＝0.5，每隔12小时向培养基中加入8ml/L量的甲醇，诱导培养，诱导温度25℃，摇床转速为220转/分，培养48小时。进行SDS-PAGE检测，在电泳图上可以看到：上述的重组菌株表达的EPO比用普通的毕赤酵母表达的EPO分子量小。
实施例2：
非N-糖基化干扰素在酵母菌株中的生产
1、材料：干扰素基因：Genbank[gi：50593016]、pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)、含有PNGase F毕赤氏酵母GS115菌株
2、方法：
1)、表面表达N-糖酰胺酶毕赤酵母菌株的构建：
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，dNTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(-)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因(PCR扩增条件同上)，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中。电转条件：1.5Kv；25μF。以MD(13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg生物素；20g/L葡萄糖)培养筛选菌株，在MD平板上长出的菌落为阳性克隆。
2)、分泌糖蛋白干扰素的表达菌株的构建：将糖蛋白干扰素基因插入到pPIC9K载体的α-factor信号肽下游的多克隆位点，获得了含有糖蛋白干扰素基因分泌表达载体。用Sac I将含有该糖蛋白基因的pPIC9K载体线性化，利用电转化的方法将线性化的重组载体转化到表面表达的PNGase F的重组菌株基因组中，电转条件：1.5Kv；25μF。构建成分泌表达干扰素的酵母重组工程菌株。通过G418抗生素筛选出阳性克隆子。
3)重组毕赤酵母菌株的诱导表达：
挑取经过验证的阳性重组毕赤酵母Gs115菌株的单菌落，接种到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖)培养基中，30℃，250r/min培养24小时，按1∶100的接种量转接到BMG(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培养基中，于30℃，250r/min条件，培养35小时，5000g离心8分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培养基重悬菌体，使OD＝0.5，每隔12小时向培养基中加入10ml/L量的甲醇，诱导培养，诱导温度28℃，摇床转速为230转/分，培养55小时。进行SDS-PAGE检测。在电泳图上可以看到上述的重组菌株表达的干扰素比用普通的毕赤酵母表达的干扰素分子量小。
实施例3：
非N-糖基化核糖核酸酶B在酵母菌株中的生产
1、材料：核糖核酸酶B基因、pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)、含有PNGase F毕赤氏酵母GS115菌株
2、方法：
1)、表面表达N-糖酰胺酶毕赤酵母菌株的构建：
以5-ATATGAATTCGCTCCGCCAGATAATACCGT-3；5-CACGTCTAGAGTTTGTAACTACCGGAG-3为引物从脑膜炎脓杆菌ATCC 33958(购自ATCC)中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCR buffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pET22b载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因(PCR扩增条件同上)，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A。用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中。电转条件：1.5Kv；25μF。在MD(13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg生物素；20g/L葡萄糖)平板上长出的菌落为阳性克隆。
2)、分泌核糖核酸酶B的表达菌株的构建：将核糖核酸酶B基因插入到pPIC9K载体的a-factor信号肽下游的多克隆位点，获得了含有糖蛋白核糖核酸酶B基因分泌表达载体。用SacI将含有该糖蛋白基因的pPIC9K载体线性化，利用电转化的方法将线性化的重组载体转化到表面表达的PNGase F的重组菌株基因组中，电转条件：1.5Kv；25μF。构建成分泌表达目的蛋白的酵母重组工程菌株。通过G418抗生素筛选出阳性克隆子。
3)重组毕赤酵母菌株的诱导表达：
挑取经过验证的阳性重组毕赤酵母Gs115菌株的单菌落，接种到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖)培养基中，30℃，260r/min培养20小时，按1∶100的接种量转接到BMG(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培养基中，于30℃，270r/min条件，培养28小时，5000g离心7分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培养基重悬菌体，使OD＝0.5，每隔12小时向培养基中加入7ml/L量的甲醇，诱导培养，诱导温度23℃，摇床转速为250转/分，培养60小时。进行SDS-PAGE检测。
在电泳图上可以看到：上述的重组菌株表达的核糖核酸酶B比用普通的毕赤酵母表达的核糖核酸酶B分子量小。
实施例4：
表面表达N-糖酰胺酶1(PNG1)的毕赤酵母菌株的构建
1.材料：PNG1：Genbank[gi：50593503]；pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)
1)重组表达载体的构建：
以5-ATAATCTAGATTTACCATCCTCCCCACGCT-3；5-TTGGAATTCATGGGAGGTATACGAAA-3为引物从酿酒酵母中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCRbuffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(+)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，PCR扩增条件同上，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶1(PNG1)和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
2)重组毕赤酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中，构建重组毕赤酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养12小时，摇床转速为240转/分；当发酵液浓度达OD＝5时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240转/分；当发酵液浓度达OD＝10时，5000g离心8分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5时，诱导培养，诱导温度20℃，摇床转速为180转/分，每隔12小时向培养基中加入5ml/L量的甲醇，培养36小时，5000g离心5分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
4)分泌糖蛋白干扰素的表达菌株的构建：将糖蛋白干扰素基因插入到pPIC9K载体的α-factor信号肽下游的多克隆位点，获得了含有糖蛋白干扰素基因分泌表达载体。用SacI将含有该糖蛋白基因的pPIC9K载体线性化，利用电转化的方法将线性化的重组载体转化到表面表达的PNGase F的重组菌株，电转条件：1.5Kv；25μF。构建成分泌表达干扰素的酵母重组工程菌株。通过G418抗生素筛选出阳性克隆子。
5)重组毕赤酵母菌株的诱导表达：
挑取经过验证的阳性重组毕赤酵母Gs115菌株的单菌落，接种到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖)培养基中，30℃，260r/min条件，培养20小时，按1∶100的接种量转接到BMG(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培养基中，于30℃，250r/min条件，培养30小时，5000g离心6分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培养基重悬菌体，使OD＝0.5，每隔12小时向培养基中加入8ml/L量的甲醇，诱导培养，诱导温度25℃，摇床转速为220转/分，培养50小时。进行SDS-PAGE检测。在电泳图上可以看到上述的重组菌株表达的干扰素比用普通的毕赤酵母表达的干扰素分子量小。
实施例5：
表面表达N-糖酰胺酶(NGLY1)的毕赤酵母菌株的构建
1.材料：NGLY1(来源于人基因组)：Genbank[gi：21314689]；pPIC9K载体(Invitrogen Ltd)
1)重组表达载体的构建：
以5-ATAATCTAGATGGCGGCGGCGGCATTGGG-3；5-TTGGAATTCTCAAAGGTCACTGAATTTT-3为引物从酿酒酵母中克隆出N-糖酰胺酶基因，PCR扩增条件：50μl反应体系中，10×PCRbuffer5μl，MgCL2(25mmol/L)3μl，d NTP(25mmol/L)1μl，引物1、2(20pmol/L)各1μl，基因组DNA 1μl，Taq DNA聚合酶0.5U，在94℃预变性5min后按如下参数：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸2min循环28次，最后一个循环72℃延伸10min。经XbaI、NotI酶切后插入pBluescriptSK(-)载体的XbaI、NotI位点命名为vector-PNG。然后以5-TGCATCTAGACGCCAAAAGCTCTTTTATCT-3；5-TCAGCGGCCGCTTTGATTATGTTCTTTCT-3为引物，克隆出酿酒酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，PCR扩增条件同上，经XbaI、EcoRI插入到vector-PNG载体的XbaI、EcoRI位点命名为vector-PNG-A(见附图2)。vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的pPIC9k表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶(NGLY1)和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体pPIC9k-PNG-A(见附图3)。
2)重组毕赤酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到毕赤酵母Gs115菌株基因组中，构建重组毕赤酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖。
3)重组毕赤酵母菌株的培养与诱导：
挑取上述阳性克隆单菌落，接种于YPD培养基中，30℃培养18小时，摇床转速为260转/分；当发酵液浓度达OD＝6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为250转/分；当发酵液浓度达OD＝10时，5000g离心10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.8时，诱导培养，诱导温度25℃，摇床转速为210转/分，每隔12小时向培养基中加入8ml/L量的甲醇，培养30小时，5000g离心5分钟，收集菌体，PBS洗两次，即得固定化N-糖酰胺酶；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液。
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖。
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L。
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L。
4)分泌糖蛋白干扰素的表达菌株的构建：将糖蛋白干扰素基因插入到pPIC9K载体的α-factor信号肽下游的多克隆位点，获得了含有糖蛋白干扰素基因分泌表达载体。用SacI将含有该糖蛋白基因的pPIC9K载体线性化，利用电转化的方法将线性化的重组载体转化到表面表达的PNGase F的重组菌株，电转条件：1.5Kv；25μF。构建成分泌表达干扰素的酵母重组工程菌株。通过6418抗生素筛选出阳性克隆子。
5)重组毕赤酵母菌株的诱导表达：
挑取经过验证的阳性重组毕赤酵母Gs115菌株的单菌落，接种到3ml的YPD(10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖)培养基中，30℃，250r/min条件，培养18小时，按1∶100的接种量转接到BMG(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L)培养基中，于30℃，260r/min条件，培养28小时，5000g离心8分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体2次，用BMM(pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L)培养基重悬菌体，使OD＝0.7，每隔12小时向培养基中加入7ml/L量的甲醇，诱导培养，诱导温度27℃，摇床转速为240转/分，培养54小时。进行SDS-PAGE检测。在电泳图上可以看到上述的重组菌株表达的干扰素比用普通的毕赤酵母表达的干扰素分子量小。
Claims (10)
1.一种利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，由下述步骤组成
(1)重组表达载体的构建：
克隆出N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC 3.5.1.52)基因，经酶切后插入大肠杆菌载体，命名为vector-PNG；然后克隆出酵母性凝集因子C-末端锚定位点基因，经酶切后插入到vector-PNG载体；与N-糖酰胺酶基因形成融合基因，载体命名为vector-PNG-A；vector-PNG-A载体经EcoRI、NotI酶切后回收小片段，插入经相同酶切的酵母表达载体，获得了带有N-糖酰胺酶和酵母性凝集因子C-末端基因的重组载体命名为pPIC9k--PNG-A；
(2)重组酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9k-PNG-A线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；
(3)分泌糖蛋白的重组菌株的构建：
将糖蛋白基因插入到pPIC9K载体的α-factor信号肽下游的多克隆位点，获得了含有糖蛋白基因分泌表达载体；用SacI将含有该糖蛋白基因的pPIC9K载体线性化，利用电转化的方法将线性化的重组载体，转化到上述构建的表面表达N-糖酰胺酶的重组酵母菌株基因组中，构建成分泌表达目的蛋白的酵母重组工程菌株；通过G418抗生素筛选出阳性克隆菌株；
(4)糖蛋白在酵母中诱导表达：
将上述阳性克隆工程菌株，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分，培养28～35小时；5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃-30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，诱导温度20℃-30℃，摇床转速为180-250转/分，培养36-60小时；将N-糖酰胺酶表达于酵母细胞壁表面，同时外源糖蛋白分泌表达到培养介质中；在培养介质中，表面表达的N-糖酰胺酶将分泌表达的糖蛋白的糖链切除，生成了非N-糖基化蛋白；
其中PBS为：pH 6.0，100mM磷酸盐缓冲液；
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；
其中BMG培养基配方为：pH 6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；
其中BMM液体培养基配方为：pH 6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；
其中，上述重组阳性克隆工程菌株可以通过离心、过滤去除。
2.如权利要求1所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(1)所述的N-糖酰胺酶是具有能够从糖蛋白上完整的将N-连接的寡糖链切除活性的一类酶。
3.如权利要求2所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(1)所述的N-糖酰胺酶是来源于脑膜炎脓杆菌ATCC 33958的N-糖酰胺酶F。
4.如权利要求1所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(1)所述的大肠杆菌载体是具有NotI、EcoR I酶切位点的大肠杆菌质粒，如：pBluescriptSK(-)、pBluescriptSK(+)、pET22b之一。
5.如权利要求1所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(2)或(3)所述的电转条件是：1.5Kv；25μF。
6.如权利要求1所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(2)所述的酵母菌株是甲醇营养酵母菌株——毕赤酵母Gs115。
7.如权利要求1所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(3)所述的外源糖蛋白基因是干扰素基因、EPO基因、核糖核酸酶B基因之一。
8.如权利要求1所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(4)所述的YPD培养条件是30℃培养15～20小时，摇床转速为260转/分。
9.如权利要求1所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(4)所述的诱导温度是25℃，摇床转速为220转/分。
10.如权利要求1所述的利用酵母生产非N-糖基化蛋白的方法，其特征是，步骤(4)所述的向培养基加甲醇的量为6-8ml/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510044079 CN1746302A (zh) | 2005-07-18 | 2005-07-18 | 利用酵母生产非n－糖基化蛋白的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510044079 CN1746302A (zh) | 2005-07-18 | 2005-07-18 | 利用酵母生产非n－糖基化蛋白的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1746302A true CN1746302A (zh) | 2006-03-15 |
Family
ID=36166015
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200510044079 Pending CN1746302A (zh) | 2005-07-18 | 2005-07-18 | 利用酵母生产非n－糖基化蛋白的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1746302A (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102242106A (zh) * | 2010-05-14 | 2011-11-16 | 浙江大学 | 一种提高谷氨酸脱羧酶活力持续性的方法 |
| CN103906840A (zh) * | 2011-06-07 | 2014-07-02 | 艾比欧公司 | 重组蛋白通过与PNGase F共表达在活体内去糖基化 |
| CN112888315A (zh) * | 2018-08-21 | 2021-06-01 | 克莱拉食品公司 | 微生物中的蛋白质糖基化的修饰 |
| WO2022147265A1 (en) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Clara Foods Co. | Surface displayed endoglycosidases |
| WO2022147257A1 (en) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Clara Foods Co. | Surface displayed endoglycosidases |
| US11518797B2 (en) | 2014-11-11 | 2022-12-06 | Clara Foods Co. | Methods and compositions for egg white protein production |
| US11800887B2 (en) | 2019-07-11 | 2023-10-31 | Clara Foods Co. | Protein compositions and consumable products thereof |
-
2005
- 2005-07-18 CN CN 200510044079 patent/CN1746302A/zh active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102242106A (zh) * | 2010-05-14 | 2011-11-16 | 浙江大学 | 一种提高谷氨酸脱羧酶活力持续性的方法 |
| CN103906840A (zh) * | 2011-06-07 | 2014-07-02 | 艾比欧公司 | 重组蛋白通过与PNGase F共表达在活体内去糖基化 |
| CN103906840B (zh) * | 2011-06-07 | 2018-01-30 | 艾比欧公司 | 重组蛋白通过与PNGase F共表达在活体内去糖基化 |
| US11673926B2 (en) | 2011-06-07 | 2023-06-13 | Ibio, Inc. | In vivo de-glycosylation of recombinant proteins by co-expression with PNGase F |
| US11518797B2 (en) | 2014-11-11 | 2022-12-06 | Clara Foods Co. | Methods and compositions for egg white protein production |
| CN112888315A (zh) * | 2018-08-21 | 2021-06-01 | 克莱拉食品公司 | 微生物中的蛋白质糖基化的修饰 |
| US11800887B2 (en) | 2019-07-11 | 2023-10-31 | Clara Foods Co. | Protein compositions and consumable products thereof |
| US11974592B1 (en) | 2019-07-11 | 2024-05-07 | Clara Foods Co. | Protein compositions and consumable products thereof |
| WO2022147265A1 (en) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Clara Foods Co. | Surface displayed endoglycosidases |
| WO2022147257A1 (en) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | Clara Foods Co. | Surface displayed endoglycosidases |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1746302A (zh) | 利用酵母生产非n－糖基化蛋白的方法 | |
| CN101307316B (zh) | 抗菌肽cad在枯草杆菌中的分泌表达及重组枯草杆菌表达系统 | |
| CN105358694B (zh) | 来自巴斯德毕赤酵母的酵母启动子 | |
| CN1827769A (zh) | 一种转基因莱茵衣藻生物反应器的构建方法 | |
| CN104762277A (zh) | 糖基化改造提高脂肪酶表达的方法、突变酶及其应用 | |
| CN1793375A (zh) | 重组人神经生长因子的酵母表达系统及制备重组人神经生长因子的方法 | |
| CN1740324A (zh) | 制备基因工程固定化酶n－糖酰胺酶的方法 | |
| CN1763175A (zh) | 甘油通道蛋白基因缺失降低甘油生成提高乙醇产量的酿酒酵母菌株及构建方法 | |
| CN102120967A (zh) | Och1基因缺陷型毕赤酵母x-33菌株的构建及应用 | |
| CN109371004B (zh) | 热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和应用 | |
| CN108070605B (zh) | 多菌灵降解酶CbmA及其编码基因和应用 | |
| CN1766098A (zh) | 一种甘露聚糖酶及其编码基因与应用 | |
| CN1873006A (zh) | 一种重组人胰岛素原的生产方法 | |
| CN111363028B (zh) | 重组人源ⅰ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法 | |
| CN1916024A (zh) | 高比活人α－2b干扰素突变体序列、酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法 | |
| CN1958797A (zh) | 南极假丝酵母脂肪酶的核苷酸序列 | |
| CN101067118A (zh) | 一种重组牛促卵泡激素在毕赤酵母中的表达 | |
| CN101067117A (zh) | 基因重组毕赤酵母生产耐高温木聚糖酶的方法 | |
| CN1455001A (zh) | 一种Exendin－4多肽的制备方法 | |
| CN1924001A (zh) | 用甲基营养酵母生产人热休克蛋白70的方法 | |
| CN109251867B (zh) | 一种酸性蛋白酶高产菌株及其应用 | |
| CN1793324A (zh) | 利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法 | |
| CN102260331A (zh) | 毕赤酵母壁蛋白Gcw34及其表面展示系统和构建方法 | |
| CN1163606C (zh) | 一种植酸酶基因序列及其在酵母中的应用 | |
| CN101928723B (zh) | 一种新的载脂蛋白a-ⅱ的制备 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C12 | Rejection of a patent application after its publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |