CN1793324A - 利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法 - Google Patents
利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1793324A CN1793324A CN 200510045207 CN200510045207A CN1793324A CN 1793324 A CN1793324 A CN 1793324A CN 200510045207 CN200510045207 CN 200510045207 CN 200510045207 A CN200510045207 A CN 200510045207A CN 1793324 A CN1793324 A CN 1793324A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- yeast
- expression
- human interferon
- glycosylation
- ifn
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法。本发明应用重组DNA技术在甲醇酵母细胞如巴斯德毕赤酵母细胞中生产基因重组人干扰素β并进行糖基化改造的方法，获得既具有真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，又不具有抗原性的干扰素β蛋白。本发明还涉及适合甲醇酵母表达的人干扰素β改构基因的设计；表达载体的构建；基因组中至少稳定地整合有一个拷贝改构干扰素β基因的甲醇酵母工程菌；工程菌的基因表达；糖基化改造等方面。本发明方法可实现干扰素β高效表达及糖链改造，且分离工艺简便。所产生的干扰素β不具有酵母蛋白的N－糖基化，若作为蛋白药物不会在人体内产生免疫源性；也不会因为过糖基化使表达蛋白失去活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种用基因工程技术生产干扰素的方法，尤其涉及利用酵母表达、生产及对人干扰素-β进行糖基化改造的方法。
背景技术
干扰素β(interferonβ，简称IFNβ)是由成纤维细胞受病毒感染或诱生剂诱导产生的细胞因子，具有抗病毒、免疫调节和抗增殖的作用。
以往所用的干扰素是采用特定的诱生剂诱导人白细胞，经提取后制成，此为血源性干扰素。血源性干扰素容易被全血中的病毒污染，从而威胁使用者的健康；并且血源性干扰素提取纯度低，比活性低，生产成本高。
与传统方法相比，用基因工程技术生产干扰素的成本比血制品下降约1万倍。并具有无污染、安全性高、纯度高、比活性高、成本低、疗效确切等优点。
目前生产、使用的IFNβ产品有三种：(1)天然人IFNβ，由刺激后的人成纤维细胞产生，但这种方法产生的干扰素易受全血病毒的感染，且提出纯度低、活性低、生产成本高，限制了在临床上的使用。(2)大肠杆菌表达的重组突变型IFNβ，其肽链N端第17位的半胱氨酸被替换为丝氨酸，该蛋白是非糖基化蛋白，1993年美国FDA批准Chiron公司的Betaseron上市销售，主要用于治疗多发性硬化症。(3)瑞士雪兰诺公司生产的干扰素β-1a(商品名：Rebif)，由CHO产生，其氨基酸序列与人IFNβ完全一致，为天然形式的糖基化蛋白。
最近十多年来，酵母作为一个基因工程表达系统受到广泛研究和应用。但是酵母细胞内的糖基化过程与高等哺乳动物细胞内的糖基化有一定的差别。酵母细胞内的糖基化主要为高甘露糖性糖基化，并存在过糖基化现象。具有酵母糖基化的蛋白作为治疗药物，在人体内常常具有抗原性，研究表明此抗原性是由酵母细胞内的糖基化过程与高等哺乳动物细胞内的糖基化差异引起的。另外，在毕赤酵母表达体系表达异源蛋白一般存在过糖基化现象，蛋白的高度糖基化可以使一些外源蛋白(如：酶)降低酶活，甚至丧失酶活。常常表达出无功能蛋白。
国内市场目前还没有我国自行研制并拥有自主知识产权的IFNβ产品。利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的工作至今未见报道。
本项目通过利用毕赤酵母(Picha pastoris)生产干扰素β，并利用外切糖苷酶如N-糖酰安酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC3.5.1.52)对其糖链结构进行改造，使生产出的人干扰素β蛋白没有免疫原性。
发明内容
本发明的目的是获得一个既具有真核生物的蛋白翻译后修饰和加工，又不具有抗原性的干扰素β蛋白。本发明提供了一种利用酵母表达、生产人干扰素-β并对其进行糖基化改造的方法。
本发明涉及的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β，由下述步骤组成；
(1)重组表达载体的构建：
克隆出人IFNβ基因，通过PCR方法将IFNβ基因起始密码子ATG前增加KR＝AAAAGA序列，以提高Kex2蛋白酶的酶切作用，避免毕赤酵母分泌表达外源基因时存在信号肽切割不完全，使重组蛋白N端带有信号肽氨基酸序列的情况。同时末端Arg的碱基CGA设计为毕赤酵母喜好密码子AGA，以提高IFNβ在毕赤酵母中的表达。完成分子水平基因改造后将基因构建到酵母表达载体中。
干扰素β基因，基因库：Genbank[gi：50593016]。
(2)重组酵母菌株的转化：
用SalI将重组载体pPIC9kIFNβ线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；
其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；
通过G418抗生素筛选出高拷贝的阳性菌株。
(3)人干扰素-β蛋白在酵母中诱导表达：
将上述阳性菌株，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为230-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分，培养28～35小时；5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20-30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，培养24-96小时。
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液；
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；
其中，上述重组阳性克隆工程菌株可以通过离心、过滤去除。
(4)重组蛋白提取及纯化
选用蓝谱(blue sepharose 6 fast flow affinity chromatography column)，直接将酵母菌株的上清液进行重组蛋白的纯化。
(5)对重组蛋白进行表面糖链的改造
选用外切糖苷酶如N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagineamidase(PNGase，EC 3.5.1.52)对所得重组蛋白进行糖基化改造。
步骤(1)所述的IFNβ是具有IFNβ活性的干扰素β类似物。
优选的，步骤(1)所述的酵母表达载体为pPIC9k、pA0815、pPIC3.5k、pPIC9等酵母表达载体及在此基础上改造后的表达载体。
优选的，步骤(2)所述的电转条件是：1.5Kv；25μF。
优选的，步骤(2)所述的酵母菌株是甲醇营养酵母菌株——毕赤酵母Gs115。
优选的，步骤(3)所述诱导温度是20℃，摇床转速为230转/分。每隔12小时向培养基加甲醇的量为8ml/L。
优选的，步骤(5)所述外切糖苷酶可以是N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC 3.5.1.52)。更优选的，所述N-糖酰胺酶(Peptide-N-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase(PNGase，EC 3.5.1.52)为PNG1或PNGaseF。
本发明涉及的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β方法，通过重组酵母菌株表达的人干扰素-β蛋白具有真核翻译修饰后加工过程，与天然的人干扰素-β蛋白相比具有相同的构象，只是去掉了糖链，作为治疗药物在人体内不具有抗原性，但具有生物活性。
附图说明
图1是实施例1的重组酵母菌株的PCR筛选电泳图。1：DNA分子量标记五(marker)；2：阴性对照(以GS115为模板)；3：阳性对照(以转化前质粒为模板)；4-8：所挑单克隆，沸水煮20min，离心，取上清作模板PCR.
图2是实施例1的重组酵母菌株中诱导表达IFNβ的SDS-PAGE电泳图。
1：蓝谱(blue sepharose Fast Flow)纯化rHuIFNβ；2-5：96h，72h，48h，24h收集上清；6：低分子量蛋白质标记物(marker).
图3是实施例1的重组酵母菌株中诱导表达IFNβ的Western-blot检测图。证实所表达的蛋白是IFNβ。1：pPIC9k-GS115表达上清液；2：IFNβ-pPIC9k-GS115表达上清液.
图4是实施例1的纯化后IFNβ蛋白经PNG1消化后的SDS-PAGE分析，重组干扰素β蛋白的糖链部分完全被切除。1：PNG1消化IFNβ(箭头所指为PNG1酶)；2-3：纯化IFNβ；4：低分子量蛋白质marker.
表1是实施例1的纯化后IFNβ蛋白经PNG1消化后的生物活性检测分析。
对纯化的IFNβ及PNG1酶糖链修饰后的IFNβ通过细胞病变法分别进行生物活性检测。检测结果如下表所示。结果表明，糖苷酶修饰后的重组干扰素β蛋白也具有生物活性。
表1.生物活性检测结果
| 未进行糖基化修饰的IFN-β(i.u./ml) | PNG1修饰后的IFN-β(i.u./ml) |
| 1.157×103 | 0.993×103 |
具体实施方式
下列实施例是对本发明的进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施例1：
利用N-糖酰胺酶PNG1对毕赤酵母菌株中表达生产的人干扰素-β进行糖基化改造。
1、材料：PNG1：Genbank[gi：50593503]，干扰素β基因：Genbank[gi：50593016]、pPIC9K载体(Invitrogen Ltd.)、毕赤氏酵母GS115菌株(Invitrogen Ltd.)
2、方法：
(1)重组表达载体的构建：
克隆出人IFNβ基因，通过PCR方法将IFNβ基因起始密码子ATG前增加KR＝AAAAGA序列，以提高Kex2蛋白酶的酶切作用，避免毕赤酵母分泌表达外源基因时存在信号肽切割不完全，使重组蛋白N端带有信号肽氨基酸序列的情况。同时末端Arg的碱基CGA设计为毕赤酵母喜好密码子AGA，以提高IFNβ在毕赤酵母中的表达。完成分子水平基因改造后将基因构建到毕赤酵母表达载体pPIC9k中。得重组表达载体pPIC9kIFNβ。
(2)重组酵母菌株的转化：
用SalI将重组载体pPIC9kIFNβ线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；电转条件：1.5Kv；25μF，在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；通过G418抗生素筛选出高拷贝的阳性菌株。筛选电泳图见图1。
(3)人干扰素-β蛋白在酵母中诱导表达：
将上述阳性菌株，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分，培养28～35小时；5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃，摇床转速为230转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，培养36-60小时。
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液；
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100nM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；
其中，上述重组阳性克隆工程菌株可以通过离心、过滤去除。
重组酵母菌株中诱导表达IFNβ的SDS-PAGE电泳图，见图2。
重组酵母菌株中诱导表达IFNβ的Western-blot检测图，见图3。证实所表达的蛋白是IFNβ。
(4)重组蛋白提取及纯化
选用蓝谱(blue sepharose 6 fast flow affinity chromatography column)，直接将酵母菌株的上清液进行重组蛋白的纯化。纯化后IFNβ蛋白经PNG1消化后的SDS-PAGE分析见图4。
(5)对重组蛋白进行表面糖链的改造
选用PNG1对所得重组蛋白进行糖基化改造。酶反应条件为适量PNG1酶及纯化干扰素冻干粉，40mMMES-NaOH缓冲液，pH6.6，10mMDTT共100μl反应体系于30℃2小时。SDS-PAGE检测发现，重组干扰素β蛋白的糖链部分被完全切除。活性检测表明切除糖链后的重组干扰素β蛋白具有生物活性(见表1)。
实施例2：如实施例1所述，所不同的是步骤(1)所述的酵母表达载体为pA0815，得重组表达载体pA0815IFNβ。步骤(5)所述外切糖苷酶是PNGaseF。
Claims (8)
1.一种利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，由下述步骤组成
(1)重组表达载体的构建：
克隆出人IFNβ基因，通过PCR方法将IFNβ基因起始密码子ATG前增加KR＝AAAAGA序列，以提高Kex2蛋白酶的酶切作用，避免毕赤酵母分泌表达外源基因时存在信号肽切割不完全，使重组蛋白N端带有信号肽氨基酸序列的情况；同时末端Arg的碱基CGA设计为毕赤酵母喜好密码子AGA，以提高IFNβ在毕赤酵母中的表达；完成分子水平基因改造后将基因构建到酵母表达载体中，得重组表达载体；
(2)重组酵母菌株的构建：
用SalI将重组载体pPIC9kIFNβ线性化；电转到酵母菌株基因组中，构建重组酵母菌株；在MD平板上长出的菌落为阳性克隆；其中，MD平板培养基配方为：13.4g/L酵母基本氮源；0.4mg/L生物素；20g/L葡萄糖；通过G418抗生素筛选出高拷贝的阳性菌株；
(3)人干扰素-β蛋白在酵母中诱导表达：
将上述阳性菌株，接种于YPD培养基中，30℃培养12-24小时，摇床转速为240-270转/分；当发酵液浓度达OD＝5-6时，按体积比1∶100的接种量转接到BMG培养基中培养，温度30℃，摇床转速为240-270转/分，培养28～35小时；5000g离心5～10分钟，收集菌体，用PBS洗涤菌体1～2次，转接到BMM液体培养基中，使发酵液浓度达OD＝0.5-1.0时，诱导培养，诱导温度20℃-30℃，摇床转速为180-250转/分，每隔12小时向培养基中加入5～10ml/L量的甲醇，培养24-96小时；
其中PBS为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液；
其中YPD培养基配方为：10g/L酵母粉；20g/L蛋白胨；20g/L葡萄糖；
其中BMG培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甘油10mL/L；
其中BMM液体培养基配方为：pH6.0，100mM磷酸盐缓冲液，酵母基本氮源13.4g/L，生物素0.4mg/L，甲醇5mL/L；
其中，上述重组阳性克隆工程菌株可以通过离心、过滤去除；
(4)重组蛋白提取及纯化
选用蓝谱直接将酵母菌株的上清液进行重组蛋白的纯化；
(5)对重组蛋白进行表面糖链的改造
选用外切糖苷酶对所得重组蛋白进行糖基化改造；在一定的酶反应条件下切除重组干扰素β蛋白的糖链部分。
2.如权利要求1所述的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，其特征是，步骤(1)所述的IFNβ是具有IFNβ活性的干扰素β类似物。
3.如权利要求1所述的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，其特征是，步骤(1)所述的酵母表达载体为pPIC9k、pAO815、pPIC3.5k或pPIC9酵母表达载体及在此基础上改造后的表达载体。
4.如权利要求1所述的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，其特征是，步骤(2)所述的电转条件是：1.5Kv；25μF。
5.如权利要求1所述的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，其特征是，步骤(2)所述的酵母菌株是甲醇营养酵母菌株——毕赤酵母Gs115。
6.如权利要求1所述的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，其特征是，步骤(3)所述诱导温度是20℃，摇床转速为230转/分，每隔12小时向培养基加甲醇的量为8ml/L。
7.如权利要求1所述的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，其特征是，步骤(5)所述外切糖苷酶是N-糖酰胺酶。
8.如权利要求9所述的利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素-β的方法，其特征是，所述N-糖酰胺酶为PNG1或PNGaseF。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510045207 CN1793324A (zh) | 2005-11-25 | 2005-11-25 | 利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 200510045207 CN1793324A (zh) | 2005-11-25 | 2005-11-25 | 利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1793324A true CN1793324A (zh) | 2006-06-28 |
Family
ID=36804974
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 200510045207 Pending CN1793324A (zh) | 2005-11-25 | 2005-11-25 | 利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1793324A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101343635B (zh) * | 2008-03-10 | 2010-12-08 | 高新 | 构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法 |
| CN103906840A (zh) * | 2011-06-07 | 2014-07-02 | 艾比欧公司 | 重组蛋白通过与PNGase F共表达在活体内去糖基化 |
| CN104530213A (zh) * | 2014-11-24 | 2015-04-22 | 广西大学 | 一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺 |
-
2005
- 2005-11-25 CN CN 200510045207 patent/CN1793324A/zh active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101343635B (zh) * | 2008-03-10 | 2010-12-08 | 高新 | 构建表达预定糖链修饰糖蛋白工程菌株的方法 |
| CN103906840A (zh) * | 2011-06-07 | 2014-07-02 | 艾比欧公司 | 重组蛋白通过与PNGase F共表达在活体内去糖基化 |
| CN103906840B (zh) * | 2011-06-07 | 2018-01-30 | 艾比欧公司 | 重组蛋白通过与PNGase F共表达在活体内去糖基化 |
| US11673926B2 (en) | 2011-06-07 | 2023-06-13 | Ibio, Inc. | In vivo de-glycosylation of recombinant proteins by co-expression with PNGase F |
| CN104530213A (zh) * | 2014-11-24 | 2015-04-22 | 广西大学 | 一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1032315C (zh) | 在酵母中生产乙型肝炎病毒蛋白质的方法 | |
| CN100462437C (zh) | 利用微生物制备的真菌免疫调节蛋白及其用途 | |
| CN1793324A (zh) | 利用酵母表达、生产及糖基化改造人干扰素－β的方法 | |
| CN1746302A (zh) | 利用酵母生产非n－糖基化蛋白的方法 | |
| CN1793375A (zh) | 重组人神经生长因子的酵母表达系统及制备重组人神经生长因子的方法 | |
| CN109371004B (zh) | 热稳定性提高的酸性蛋白酶Bs2688突变体K203E及其基因和应用 | |
| CN1203892C (zh) | α－干扰素水性溶液制剂 | |
| CN103102418B (zh) | 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其突变体(mG-CSF)与人血清白蛋白第三结构域(3DHSA)的融合蛋白及应用 | |
| CN103966253A (zh) | 一种高效制备重组人白细胞介素-33蛋白的方法 | |
| CN1778920A (zh) | 大菱鲆抗菌肽基因及其酵母表达载体 | |
| CN1594568A (zh) | 一种重组鸡α干扰素的生产方法及其重组载体 | |
| CN1873006A (zh) | 一种重组人胰岛素原的生产方法 | |
| CN1306030C (zh) | 一种人白细胞介素－10基因序列及含该基因序列的大肠杆菌 | |
| CN1786165A (zh) | 重组金黄色葡萄球菌肠毒素c2的制备方法 | |
| CN1916024A (zh) | 高比活人α－2b干扰素突变体序列、酵母表达质粒的构建及菌株筛选和纯化方法 | |
| CN1724663A (zh) | 以串连表达方式制备天然人胸腺素α1的方法 | |
| CN104178494A (zh) | 一种人白介素2的制备工艺及其应用 | |
| CN1268751C (zh) | 表达人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的酵母重组株及rhGM－CSF的纯化方法 | |
| CN1523040A (zh) | 人胸腺素α1与人复合干扰素的融合蛋白及其制备 | |
| CN103014015A (zh) | 编码猪γ干扰素的基因片段及其应用 | |
| CN101555485A (zh) | 重组人甲状旁腺激素(1-84)非融合表达及规模化制备方法 | |
| CN1182240C (zh) | 纤溶酶原的酵母表达系统及其纯化工艺 | |
| CN1452658A (zh) | 由遗传工程酵母生产人干扰素α的方法 | |
| CN103374557B (zh) | 一种具有甘露糖化修饰的溶菌酶及其应用 | |
| CN1869228A (zh) | 一种重组人干扰素γ的生产方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |