CN1182240C

CN1182240C - 纤溶酶原的酵母表达系统及其纯化工艺

Info

Publication number: CN1182240C
Application number: CNB031374050A
Authority: CN
Inventors: 军顾; 顾军; 邹宇飞; 郑权
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2003-06-19
Filing date: 2003-06-19
Publication date: 2004-12-29
Anticipated expiration: 2023-06-19
Also published as: CN1456662A

Abstract

本发明提供一种高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株及其获得方法，并提供了纤溶酶原Kringle5纯化工艺。本发明通过PCR扩增、连接、转化、抗性筛选等步骤，最终获得高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株。本发明所提供的纤溶酶原Kringle5纯化工艺包括离心、沉淀、过柱等步骤，其特点是操作简单、产率高。本发明所获得的产物纤溶酶原Kringle5蛋白不含非天然成分，应用时一般不会引起免疫反应。

Description

纤溶酶原的酵母表达系统及其纯化工艺

技术领域：

本发明涉及生物工程领域，具体涉及Kringle5的表达系统及其纯化工艺。

背景技术：

持续的新生血管生成是实体肿瘤的生长和转移的必要条件，新生血管为不断增殖的恶性细胞提供营养原料。根据这一特性，提出了通过抑制新生血管的生成来抗肿瘤治疗的新思路。目前已发现一些血管生成因子抑制剂，能够有效的抑制新生血管进而抑制肿瘤的生长，纤维酶原的Kringle5片段(简称K5)就是其中一个(Castellino FJ，McCance SG：The Kringle domains of human Plasminogen.CibaFoundation Symposium 212：46-65，1997)。K5是血纤维蛋白溶酶原的水解片段，是纤维酶原中第5个KringLe区。人源和鼠源纤维酶原同源，都含有5个kringle区，每个Kringle由80个氨基酸组成。Kringle 1-4区为血管抑制素(angiostatin)。近年来发现K5抑制内皮细胞增殖，而且，其抑制活性高于血管抑制素。K5还抑制内皮细胞迁移这一血管生成的重要步骤(Cao Y.，Chen A.Kringle 5 ofplasminogen is anovel inhibitor of endothelial cell growth.J.Biol.Chen.271：29461，1997；O’ReillyM.S，Holmgren et al，Angiostatin：a novel angiogensis inhibitor that mediates thesuppression of metastases by Lewis lung carcinomal.Cell，79：315.1994；SukhatmeVP：Kringle5 causes cell cycle arrest and apoptosis of endothelial cells。Biochem BiophyRes Comm Lu H，Dhanabal M，et al 285：668-673，1999)。由于其具有高效的细胞类型的选择性，以及较短的氨基酸序列，K5在治疗实体肿瘤方面具有广阔的应用前景。

目前基因重组生产K5多数是利用大肠杆菌为宿主，由于下游纯化工艺相当复杂，成本较高，此外，因原核生物不能进行重组蛋白翻译后的蛋白质折叠加工过程，产品生物活性难以保证。毕赤酵母是近年来发展起来的高效真核表达系统，由于目的基因是整合到酵母染色体上，因而能稳定表达外源蛋白(崔蕴霞，明文玉等，人重组白蛋白基因在巴斯德毕赤酵母中高效表达，微生物学报，41(2)：244-246，2001)。

在国外已有了K5这方面的专利(http：//www.patentpending.com/AMERICANPATENT and TRADEMARK LAW CENTER&http：//www.uspto.gov/United StatesPatent and Trademark Office Home Page)。国内也有关研究(陶亦敏，张颉等，人纤溶酶原Kringle5在酵母中的表达及其活性研究，生物技术通讯，13(2)：112，2002)，但所得重组K5含有非天然成分，含组氨酸尾，有引起体内免疫反应的可能；由于毕赤酵母转化子之间表达量差异很大，目前还没筛选到高表达菌株，难以满足纤溶酶原Kringle5工业生产的要求。

发明内容：

本发明针对上述问题，构建了纤溶酶原Kringle5的酵母系统，提供一种高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株及其获得方法，并提供了纤溶酶原Kringle5纯化工艺。技术方案具体如下：

1)纤溶酶原Kringle5酵母系统的构建和高效表达纤溶酶原Kringle5菌株的筛选。

a)根据K5序列设计引物，通过PCR扩增目的基因。

b)将上述PCR产物与载体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌，通过PCR检测，最后测序确认。

c)将构建正确的质粒酶切线性化后转入毕赤酵母(Pichia pastoris)，依次经过营养缺陷初筛和抗性筛选，最后PCR鉴定重组转化子。

d)将重组抗性的转化子接种到液体培养基中，培养后，将菌液离心，再将菌体转接至诱导培养基中进行表达，根据表达量的量化，确认为高效表达Kringle5蛋白的菌株。

该高效表达纤溶酶原Kringle5菌株分类命名为巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)，菌名为GS115，并于2003年5月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0930。

2)人纤溶酶原Kringle5纯化工艺

经过筛选得到的转化子接种到液体培养基上培养，然后将培养得到的菌液转接到诱导培养基上进行诱导表达，最后纯化目的蛋白。

本发明所用到的Taq酶、dNTP、T4DNA连接酶、EcoRI、XhoI、SalI均购自New England Biolabs公司，PCR引物等由上海生物工程有限公司合成，酵母基因组提取试剂盒由杭州维特洁生化公司提供，含目的基因的PET22(b)由马建新(Jian-xing Ma，Department of Ophthalmology，Medical University of South Carolina，Charleston，South Carolina 29403)提供。

附图说明：

图1.蛋白梯度照片

从右到左：

培养上清1ml，2.2ml，5ml，10ml

溶菌酶：0.2mg，0.5mg，1.0mg，2.0mg，3.0mg，4.0mg

图2.核酸照片

从左到右：

DL2000marker(100bp，250bp，750bp，1000bp，2000bp)；5’，3’AOX PCR产物；目的基因PCR产物。

图3.目的蛋白纯化图：

(1)纯化产物(2)蛋白marker(从下往上：6500，14200，20000，24000，29000，36000，45000，66000)

具体实施方式：

实施例1 Kringle5基因的扩增、重组表达载体的构建。

以含目的基因的PET22(b)为模板，根据目的基因序列，设计以下引物(即目的基因引物)：

上游引物序列表中SEQ ID NO.1，下游引物序列表中SEQ ID NO.2。

进行的目的基因扩增，其反应条件为94℃，30s，55℃，45s，72℃，45s，循环30次。在Primer 1引入了Xho I酶切位点(C|TCGAG)，在Primer 2引入了EcoRI酶切位点(G|AATTC)。

实施例2重组质粒的构建和大肠杆菌的转化

Xho I和EcoR I双酶切扩增的目的基因和PPIC9K载体，并将其连接：16℃，过夜连接(10μl目的片断，10μl空载，3μl 10XT4DNA Ligase Buffer，1μl T4DNALigase，6μl无菌水)。连接产物转化E-Coli.DH5a，给布于含氨基的LB平板。分别以目的基因引物，5’和3’AOX引物进行PCR得到270bp和750bp产物，酶切鉴定，最后用测序验证测序。结果表明载体构建正确。其中5’和3’AOX引物分别如序列表中的SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。

实施例3、重组酵母菌的转化、筛选及鉴定

将构建正确的重组质粒用SalI线性化后，用电击法转入GS115中，涂布于MD平板上，30℃培养2-3天后，用含不同浓度(0.25mg/ml，0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml，4mg/ml)G418 YPD平板筛选高拷贝数的转化子。提取转化子基因组，所用酵母基因组提取试剂盒来自杭州维特洁生化公司。以目的基因为引物PCR后经核酸电泳鉴定，得到预期的270bp条带。表明目的基因已整合到酵母染色体上。

实施例4重组蛋白的诱导表达

1)将含G418抗性的转化子接种到BMGY液体培养基中，培养至OD值6左右，离心(4000r/min，5min)，将菌体转接至诱导培养基BMMY中进行表达。每隔24h取样并补加甲醇至1％，培养5天后，离心(4000r/min，5min)，收集培养上清。取不同量的培养液上清和溶菌酶进行SDS-DAGE电泳结果表明，目的基因获得高效表达，每升培养液含目的蛋白约200mg经过疏水层分析和分子筛层析，得到目的蛋白一条带，序列见序列表中的SEQ ID NO.5所示。

实施例5重组蛋白的分离纯化

将实施例4中所收集到的上清用95％(NH₄)₂SO₄沉淀，沉淀物用0.02M PBS溶解，然后上样到Pheny Sepharose 6 Fast Flow柱(Pharmacia Biotech)上，用0.02MPBS+1.7M(NH₄)₂SO₄到0.02M PBS缓冲液进行梯度洗脱，收集目的蛋白峰，浓缩后上Sephadex G-50柱，以0.02M PBS为洗脱液，收集目的组份，冻干。

序列表

SEQ ID NO.1

序列特征：

(A)长度：27bp；(B)类型：核酸；(C)链性：单链；(D)拓补结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：

CTTCC TCGAG AAAAG AGATG TAGAG AC

SEQ ID NO.2

序列特征：

(A)长度：28bp；(B)类型：核酸；(C)链性：单链；(D)拓补结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：

TAGCG AATTC TTATC AGGCA CACTG AGG

SEQ ID NO.3

序列特征：

(A)长度：21bp；(B)类型：核酸；(C)链性：单链；(D)拓补结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：

GACTG GTTCC AATTG ACAAG C

SEQ ID NO.4

序列特征：

分子类型：寡核苷酸

序列描述：

GCAAA TGGCA TTCTG ACATC C

SEQ ID NO.5

序列特征：

(A)长度：84个氨基酸；(B)类型：氨基酸；(C)拓补结构：线性

分子类型：多肽

序列描述：

DCMFGNGKGY RGKRVTTVTG TPCQDWAAQE PHRHSIFTPE TNPRAGLEKN

YCRNPDGDVG GPWCYTTNPR KLYDYCDVPQ CAAP

Claims

1.一种高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株，其保藏编号为CGMCCNo.0930。

2.一种筛选权利要求1所述的高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株的方法，其特征是该方法包括以下步骤：

a)根据Kringle5序列设计引物，通过PCR扩增Kringle5基因；

b)将上述PCR产物与载体连接，构建重组质粒，并转化大肠杆菌；

c)将构建正确的质粒转入毕赤酵母，经过营养缺陷初筛，然后经过抗性筛选，最后鉴定重组转化子；

d)将重组的抗性转化子接种到液体培养基中培养，然后将菌液离心，再将菌体转接至诱导培养基中表达。

3.如权利要求2所述的筛选高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株方法，其特征是步骤a)中PCR所用的模板为含Kringle5蛋白基因的PET22(b)质粒，上游引物和下游引物分别为SEQ NO：1和SEQ NO：2。

4.如权利要求2所述的筛选高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株方法，其特征是步骤d)液体培养基为BMGY，诱导培养基为BMMY。

5.如权利要求2所述的筛选高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株方法，其特征是步骤d)中离心条件为4000r/min，离心时间5min。

6.一种从权利要求1所述的高效表达纤溶酶原Kringle5的毕赤酵母菌株中纯化纤溶酶原Kringle5的工艺，其特征是包括如下步骤：将诱导表达的菌液离心，取上清；(NH4)₂SO₄沉淀；PBS溶解；一次过柱；梯度洗脱缓冲液洗脱；收集目的蛋白峰；浓缩，二次过柱；再洗脱；收集目的组分，冻干。

7.如权利要求6所述的纯化纤溶酶原Kringle5工艺，其中所述离心条件为4000r/min，5min；所述(NH4)₂SO₄浓度为0.02M；一次过柱柱子为Sepharose6 Fast Flow；梯度洗脱缓冲液为0.02M PBS+1.7M(NH4)₂SO₄到0.02M PBS；二次过柱所用柱子为Sephadex G-50；洗脱液为0.02M PBS。