CN1876817A

CN1876817A - 一种人肿瘤坏死因子TNF－α突变体的生产方法

Info

Publication number: CN1876817A
Application number: CN 200510026652
Authority: CN
Inventors: 孙九如; 任军; 黄阳滨; 丰涛; 蒋剑
Original assignee: Shanghai Newsummit Biopharma Co Ltd
Current assignee: Shanghai Newsummit Biopharma Co Ltd
Priority date: 2005-06-10
Filing date: 2005-06-10
Publication date: 2006-12-13

Abstract

本发明提供了一种人肿瘤坏死因子TNF－α突变体的生产方法，以及有关的表达载体与工程细胞构建、表达和纯化的工艺。优化后的人肿瘤坏死因子TNF－α突变体蛋白基因非常适合在毕赤酵母中表达，同时通过发酵与纯化工艺优化，提高了表达量和纯化得率，具有表达高、稳定性好，生产工艺简便的优点。本发明可高效、简便、低成本的获得人肿瘤坏死因子TNF－α突变体。

Description

一种人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种人肿瘤坏死因子TNF-α突变体序列，及其生产方法，以及有关的表达载体与工程细胞的构建、重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的表达和纯化工艺。

背景技术

人肿瘤坏死因子α(human tumornecrosis factor-α，hTNF-α)，又称恶液质素，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，是杀伤肿瘤细胞活性最强的一种细胞因子。

人的TNF-α基因长约2.76kb，由4个外显子和3个内含子组成，人TNF-α前体由233个氨基酸残基组成，含76个氨基酸残基的信号肽，切除信号肽后成熟型TNF-α为157氨基酸残基，分子量为17kDa，非糖基化蛋白，第69位和101位两个半胱氨酸形成分子内二硫键。TNE-α发挥生物学效应的天然形式是同源的三聚体。

TNF-α在免疫和非免疫系统中发挥着重要的作用，具有抗感染、抗肿瘤、调节睡眠和促进发育等作用，其中最引人注目的是，它能特异性的杀死肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞增殖，而不损伤正常细胞，可能是至今所知抗癌剂中作用最强的。尤其是在和干扰素等其它抗肿瘤细胞因子合用时，能发挥出更好的效果，因此，TNF-α是有希望的天然抗癌因子之一。而且它还可刺激其他细胞因子合成。

然而目前国内外普遍使用的是用大肠杆菌生产的基因工程重组产品，由于大肠杆菌含有内毒素，而且重组蛋白往往形成包涵体，下游工艺复杂，成本较高而其活性往往偏低。

本发明系统提供了一种高效生产重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的方法。通过优化编码重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的核苷酸序列，采用新型毕赤酵母表达体系胞内表达人肿瘤坏死因子TNF-α突变体，通过优化改进发酵工艺，提高重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的表达水平，同时简便纯化工艺，获得高表达、高得率、高活性、极具产业化价值的重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效简便的生产重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的方法。

本发明的另一目的就是提供重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白的编码序列以及用于该方法的表达载体及工程细胞。

在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有95％以上相同性。

在另一优选例中，所述的核苷酸序列含有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求1所述的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是pPIC9K/nhTNF-α。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，整合有权利要求3所述的表达载体。

在另一优选例中，所述的工程细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)。

在本发明的另一优选例中，所述的毕赤酵母宿主细胞的基因组中整合有2-30拷贝的人肿瘤坏死因子TNF-α突变体基因编码序列。

在本发明的另一优选例中，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。

在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白的方法，该方法包括步骤：

a)在适合的表达条件下，培养如权利要求3所述的宿主细胞，从而胞内表达出人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白；较佳地，所述的宿主细胞是毕赤酵母。

b)分离纯化出表达的人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白。在本发明的另一优选例中，所述的步骤(a)的培养条件包括：

培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD600为40-200，诱导时间为12-100hr，发酵及诱导温度保持在25-32℃，微量元素的量为0.1-2ml/L，诱导期的pH值为3-10，诱导期甲醇浓度控制在0.1-5％。

在本发明的另一优选例中，诱导过程还可以添加酪蛋白水解物(CA)、蛋白胨(peptone)、胰蛋白胨(Tryptone)、精氨酸等作为保护剂。

在本发明的另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤：

(i)对发酵菌体超声或高压破碎后，离心获得上清；

(ii)通过盐析和/或超滤进行初步纯化后，或直接层析纯化，所述的层析选自：阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合。

在本发明的另一优选例中，菌体破碎后上清经SP Sepharose阳离子交换柱以及Q Sepharose阴离子交换柱以后得到纯度大于95％、得率在50％以上的纯品。

附图说明

图1是pPIC9k/nhTNF-α表达质粒的构建路线图。

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，通过基因编码序列的优化设计，将优化后的人肿瘤坏死因子TNF-α突变体编码序列(SEQ ID NO：1)转入甲醇利用型毕赤酵母(P.pastoris)，从而实现了人肿瘤坏死因子TNF-α突变体高效表达，并且优化了发酵与纯化工艺。在此基础上完成了本发明。

本发明根据人肿瘤坏死因子TNF-α天然成熟肽序列，对其进行改造，N端缺失7个氨基酸，将Pro⁸Ser⁹Asp¹⁰换成ArgLysArg，将C末端157位的Leu换成Phe，突变后氨基酸序列见SEQ ID NO：2，然后按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，全基因合成重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白的编码序列，将该基因克隆到pUC19中测序验证后，用分子克隆的常规方法，克隆入表达载体pPIC9K，转化、整合入P.pastoris宿主细胞染色体，通过施加抗生素筛选出多拷贝整合的转化细胞，进而筛选出高表达工程细胞。摇瓶试验表明，诱导24小时后，表达蛋白占总蛋白30％以上，表达水平1g/L以上。根据其消耗甲醇的速度，判断此工程细胞株为Mut+。

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。在本发明中，工程菌表达的重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。例如，合适的培养基包括(但不限于)以下组成：

(1)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，总浓度0.1-3％；无机氮源如氨水或NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄等铵盐，浓度0-1.5％。

(2)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg²⁺盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-10；Mg²⁺盐0-5mM。

(3)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。

(4)根据M9培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。

(5)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳地，碳源选自下组：甘油浓度为0.1-3％；乳糖浓度为0.1-3％；葡萄糖浓度为0.1-1.5％。

为大规模获得重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体，需要在发酵罐中进行表达培养。本发明研究了中试发酵工艺，优化后的表达水平达到10g/L：

在发酵表达后，对表达的重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白进行分离。通常，发酵样品先以离心方式获得菌体。然后超声破碎，离心获得上清，然后进行初步纯化和层析包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

经不同层析过程比较，优化的纯化方法包括：

1.对发酵菌体通过超声和/或高压方式破菌后，离心获得上清；

2.通过超滤进行初步纯化后，或直接通过阴阳离子交换层析方法，从而得到纯度达到95％的纯品。

纯品纯度95％以上，得率约4g/L发酵液。

用MTT法对纯品的细胞毒活性进行了检测，以50％细胞死亡为1IU，其比活性约6.8X10⁷IU/mg。

纯化后重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体可用常规技术制成各种剂型。

在本发明的一个实例中，构建了生产重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的P.pastoris酵母表达工程细胞，甲醇诱导，胞内高水平表达。

在本发明的另一个实例中，经过发酵工艺的优化，进一步提高了重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的表达量。

在本发明的另一个实例中，通过优化纯化工艺，纯化后可得到纯品4g/L。

纯化后原液加入适当辅料，制成重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明，该粉针剂稳定。

中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体纯品4g，比活约5×10⁷IU/mg。适合产业化生产。

本发明的优点在于：

(1)优化后的重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白基因非常适合在毕赤酵母中表达，具有高表达、高稳定的特点。

(2)通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平达到10g/L。

(3)优化了纯化工艺，回收率高。由于简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使得大规模生产重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体成为可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1表达质粒的构建和高表达工程菌株的获得

根据人肿瘤坏死因子TNF-α天然成熟肽氨基酸序列，对其进行改造，N端缺失7个氨基酸，将Pro⁸Ser⁹Asp¹⁰换成ArgLysArg，将C末端157位的Leu换成Phe，突变后氨基酸序列见SEQ ID NO：2，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的条件下，全基因合成编码人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白的目的基因序列，将该基因序列克隆到pUC19中并测序验证。

表达载体构建方法见图1。通过PCR扩增得到目的人肿瘤坏死因子TNF-α基因，用BamHI+EcoRI双酶切(MBI，2*Tango^TM，37℃)PCR产物及pPIC9k质粒(购自Invitrogen公司)。将两个片段用T4DNA连接酶进行连接，连接产物转化进入大肠杆菌DH5α(购自Promega公司)，在含有氨苄青霉素的LB平板上挑选克隆，小量制备质粒，通过双酶切/PCR鉴定筛选出阳性克隆，再经测序验证。获得含有人肿瘤坏死因子TNF-α的重组质粒pPIC9K/hTNF-α(人肿瘤坏死因子α)。

表达质粒pPIC9K/hTNF-α经测序验证后，用Sal I酶切线性化，电穿孔法转化进入毕赤酵母GS115(购自Promega公司)，涂于MD平板上于30℃培养至有转化子长出，再用点种法鉴定酵母转化子的G418抗性。依次用含G418浓度为1、2、3、4mg/mL的平板筛选高G418抗性转化子，并进行小摇表达筛选得到TNF-α高表达的工程酵母菌株。根据其消耗甲醇的速度，判断此工程细胞株为Mut+。

实施例2不同诱导时间对表达水平的影响

取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于50ml培养基的500ml三角烧瓶中(每个条件有副管)，培养24hr左右，1％甲醇诱导，每隔12小时取样，同时测定OD。共诱导120hr。诱导前、诱导不同时间样品检测SDS-PAGE。

实验结果表明：在摇瓶水平表达TNF-α的最佳诱导时间在24-96hr之间，最佳诱导时间在36-72hr。

实施例3诱导阶段添加不同蛋白保护剂对表达水平的影响

取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于250ml BMGY的1L三角烧瓶中，培养4~8hr左右，上罐发酵，pH 5.0、温度20℃、D0＞35％，待溶氧上升后以10~15转度流加50％甘油。待甘油耗尽，溶氧再次上升后用100％甲醇以转速1开始诱导，逐渐提速。诱导阶段将浓度为10％的CA、Peptone和Tryptone各300ml流加入罐(5L发酵罐，发酵上清3L)，诱导48hr结束。样品检测SDS-PAGE和蛋白含量以确定诱导阶段的最佳蛋白保护剂。

实施例4重组人肿瘤坏死因子TNF-α突变体纯化

将高表达菌株扩大体积进行培养并诱导48h，4℃下5000rpm离心10分钟，获得发酵菌体，对菌体超声破碎，离心所得含有表达产物的上清液先经过SPSepharose FF阳离子交换柱，然后再上Q Sepharose FF阴离子交换柱，以盐浓度梯度的缓冲液洗脱，收集目的蛋白的洗脱峰。

经过以上纯化工艺，最后可得蛋白纯品4g/L，纯度95％以上。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海新生源医药研究有限公司

<120>一种人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的生产方法

<160>2

<210>1

<211>453

<212>DNA

<213>人工序列

<221>misc_feature

<222>(1)…(453)

<223>优化的人肿瘤坏死因子TNF-α突变体基因

<400>1

atgagaaaaa gaaagcctgt agcccatgtt gtagcaaacc ctcaagctga ggggcagctc 60

cagtggctga accgccgggc caatgccctc ctggccaatg gcgtggagct gagagataac 120

cagctggtgg tgccatcaga gggcctgtac ctcatctact cccaggtcct cttcaagggc 180

caaggctgcc cctccaccca tgtgctcctc acccacacca tcagccgcat cgccgtctcc 240

taccagacca aggtcaacct cctctctgcc atcaagagcc cctgccagag ggagacccca 300

gagggggctg aggccaagcc ctggtatgag cccatctatc tgggaggggt cttccagctg 360

gagaagggtg accgactcag cgctgagatc aatcggcccg actatctcga ctttgccgag 420

tctgggcagg tctactttgg tatcattgcc ttc 453

<210>2

<211>151

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Met Arg Lys Arg Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

1 5 10

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn

15 20 25

Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

30 35 40

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

45 50 55

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

60 65 70

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys

7 80

Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu

85 90 95

Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile

100 105 110

Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu

115 120 125

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu

130 135 140

Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Phe

145 150 151

Claims

1.一种人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列编码区与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有95％以上相同性。

2.一种表达载体，其特征在于，所述的表达载体含有权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种工程细胞，其特征在于，它整合有权利要求2所述的表达载体。

4.如权利要求3所述的工程细胞，其特征在于，它是毕赤酵母。

5.一种生产人肿瘤坏死因子TNF-α突变体的方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(a)在适合的表达条件下，培养如权利要求3所述的工程细胞，从而表达出人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白；

(b)分离纯化出表达的人肿瘤坏死因子TNF-α突变体蛋白。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(a)所示的表达条件为：诱导时间为12-120小时，较佳的为24-100小时；诱导pH为3-10，较佳的为5-7。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(b)所示的表达条件为：

(1).发酵菌体超声破碎或压榨后离心，获得含有目的蛋白的上清液；

(2).通过简单的离子交换层析等简单步骤，即可获得纯度在95％以上的纯品。