CN107033232A

CN107033232A - 一种低生物活性的肿瘤坏死因子α突变蛋白及其制法和用途

Info

Publication number: CN107033232A
Application number: CN201610085502.8A
Authority: CN
Inventors: 李荣秀; 张丽; 曾盼
Original assignee: SHANGHAI HENGZHEN INDUSTRIAL Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI HENGZHEN INDUSTRIAL Co Ltd
Priority date: 2016-02-04
Filing date: 2016-02-04
Publication date: 2017-08-11

Abstract

本发明提供了靶向肿瘤坏死因子α(TNF-α)疫苗制剂的重组蛋白抗原及其制备方法和用途。具体地，本发明的重组蛋白抗原包括对应于TNF-α氨基酸序列在11、31、32、86、87、95、115、119、143、145位上具有至少一个氨基酸突变和/或多个氨基酸突变组合。所述重组蛋白抗原在疫苗剂量下降低了TNF-α生物活性导致的副反应，同时保留了作为疫苗制剂的成分有效激发机体产生针对TNF-α的免疫反应及中和抗体。

Description

一种低生物活性的肿瘤坏死因子α突变蛋白及其制法和用途

技术领域

本发明属于生物和医药领域，具体地涉及低生物活性的肿瘤坏死因子α(TNF-α)突变蛋白及其制法和用途。本发明可降低靶向TNF-α的疫苗抗原蛋白在有效免疫剂量下的副作用，激发机体产生针TNF-α的中和免疫活性。

背景技术

肿瘤坏死因子-α(TNF-α)是一种主要由单核细胞或巨噬细胞产生的细胞因子，不仅能选择性地杀伤某些肿瘤细胞，而且有多种免疫调节功能[Front Immunol.2015，364(6)：2-4.]。肿瘤坏死因子作为一种重要的免疫调控分子在细胞的生长、分化以及死亡等生理和病理过程中发挥重要的作用。多种人类疾病和体内TNF-α的表达水平高有关，例如阿尔茨海默氏症、重度抑郁、肿瘤，以及类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)[Arthritis Res Ther，2005，7(6)：R1227-R1234.]、炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)[J Dig Dis，2009，10(1)：1-6.]、银屑病(psoriasis，Ps)[Mediators Inflamm，2005，2005(5)：273～275.]等自身免疫性疾病。

TNF生物抑制剂包括单克隆抗体，可以阻断TNF-α发挥生物活性和/或降低其机体水平，能有效治疗多种自身免疫性疾病[Intemational Immunology.2015.27(1)：55～58.]，但使用频繁，费用昂贵，在中国只有不到10％的患者能够长期使用。因此，研发的多种以TNF-α为靶点的主动免疫制剂已经进展到不同的阶段治疗在mTNF-α分子中引入非天然的硝基酪氨酸[Proc NatlAcad Sci U S A.2008，105(32)：11276-11280.]，引入外源的Th表位，都突破了小鼠的免疫耐受，产生的治疗性TNF中和抗体[Nature.1999.17：666-669.]，但这两种策略没有克服抗原TNF-α生物学活性在免疫时引起的副作用。2006年Le Buanec等将hTNF-α通过戊二醛化学偶联到钥孔血蓝蛋白(keyhole limpet emocyanin，KLH)上，在小鼠模型上产生了中和hTNF-α的抗体，在小鼠关节炎模型上表现出明星的治疗效果[Proc Natl Acad Sci U S A.2006.103(32)：19442-19447.]，已经进展到II期临床研究。为了降低hTNF-α生物学活性在疫苗免疫时产生的副作用，需要通过甲醛处理数天对疫苗抗原的进行变性降低hTNF-α生物学活性，从而使疫苗成份更加复杂，增加了成药的不确定性。

因此，要发展安全有效的靶向TNF-α的疫苗，需要既降低疫苗抗原TNF-α生物学活性引起的副作用，又保留TNF-α中和免疫原性。

发明内容

本发明的目的就是提供一种靶向肿瘤坏死因子的免疫应答的方法以及相关的重组蛋白和组合物(如疫苗组合物)。

在本发明的第一方面，提供一种TNF-α突变蛋白，所述突变蛋白的生物活性低于野生型TNF-α蛋白，并且所述突变蛋白具有至少一个不同于野生型TNF-α的氨基酸突变位点，并且在所述野生型TNF-α蛋白的天然序列上通过拼接、替换、缺失、和/或插入而获得的与天然序列不同的突变蛋白。

在一优选例中，所述TNF-α突变蛋白诱导产生针对所述野生型TNF-α的免疫应答。在另一优选例中，所述TNF-α突变蛋白突变位点是K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、Y119W、D143N、A145R之一和/或多突变点组合。

另一优选例中，所述TNF-α突变蛋白含Y87H和A145R突变。

在另一优选例中，所述的TNF-α蛋白来源于哺乳动物蛋白，包括：人、鼠等。

本发明的第二方面，提供一种多核苷酸，所述的多核苷酸编码第一方面所述的突变蛋白。

本发明的第三方面，提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的多核苷酸。

在一优选例中，所述的TNF-α蛋白还可包括由“接头”序列所编码的数个氨基酸序列。这些序列是因用于表达上述的TNF-α突变蛋白的表达载体而产生的。

本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有第三方面所述的表达载体，或者在基因组中整合有第二方面所述的多核苷酸。

本发明的第五方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物含有第一方面所述的突变蛋白，第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的宿主细胞以及药学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的组合物为疫苗。

本发明的第六方面，提供一种疫苗组合物，所述的组合物含有第一方面所述的突变蛋白、第二方面所述的多核苷酸或者第三方面所述的表达载体或者第四方面所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

在另一优选例中，所述的疫苗组合物还含有佐剂。

本发明的第七方面，提供第一方面所述的TNF-α突变蛋白的用途，(a)用于制备针对所述的TNF-α及其突变蛋白的抗体；和/或(b)用于制备治疗与所述TNF-α相关的疾病的药物。

在另一优选例中，所述的疾病包括：类风湿关节炎、炎症性肠炎、银屑病等。

本发明的第八方面，提供一种治疗方法，给需要的对象施用第一方面所述的突变蛋白、第五方面所述的药物组合物或第六方面的疫苗组合物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了实施例中K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、Y119W、Y87H/A145R突变蛋白及hTNF-α用L929细胞测定生物活性的结果。图1A，1B，1C为实验后L929细胞死亡率随着突变蛋白浓度变化的拟合曲线(D143N和A145R不能拟合)，图1D为拟合曲线所得hTNF-α的EC50与突变蛋白的EC50相比较的结果，以上结果显示各突变蛋白相对于hTNF-α具有的生物活性效果。

图2显示了实施例中K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、Y119W、D143N、A145R、Y87H/A145R突变蛋白及hTNF-α疫苗引发免疫反应的效果。图2中各免疫组在三次免疫后产生的针对hTNF-α的总抗体，发现带有本发明突变位点的hTNF-α突变蛋白，能有效的保留免疫原性，刺激机体产生针对hTNF-α的特异性抗体。

具体实施方式

本发明经过广泛而深入的研究，发现以野生型TNF-α突变蛋白为基础，在特定部位通过拼接、替换、缺失、和/或插入而改变氨基酸序列，可制得一类突变蛋白。所述突变蛋白不仅相较于野生型TNF-α降低生物活性，还可以有效激发机体(如哺乳动物)对所述突变蛋白的免疫应答，而且可有效地产生针对野生型TNF-α的免疫反应，包括产生抗体。在此基础上完成了本发明。

术语

如本文所用，术语“突变蛋白”指在本发明中相应于作为模板的野生型TNF-α蛋白，在以下11、31、32、86、87、95、115、119、143、145序列位点中至少有一个不同于野生型TNF-α蛋白的氨基酸序列。

如本文所用，术语“相对于”意指本发明的突变蛋白除了上述指出的位置外不再需与野生型TNF-α蛋白在位置上存在精确的同源性。因为在假定这些未特别指出的位置上(相对于野生型TNF-α氨基酸序列)发生拼接、替换、缺失、和/或插入都对突变蛋白生物活性和免疫原性不产生实质性影响的情况下已对上述情况进行了反复研究。

如本文所用，术语“K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、Y119W、D143N、A145R”所示的字母是根据单字母氨基酸密码来表示氨基酸。对于所示的每一个氨基酸变化而言，第一个字母表示野生型TNF-α中的氨基酸，第二个字母表示突变蛋白中对应的氨基酸，所用的数字表示所示的野生型氨基酸存在于野生型序列中的位置。术语“Y87H/A145R”表示同时在氨基酸序列87位和145位进行氨基酸替换，其中“/”表示同时进行氨基酸替换。

如本文所用，术语“低生物活性蛋白”是指以L929细胞法检测的生物活性低于野生型TNF-α蛋白的一系列TNF-α突变蛋白。

代表性蛋白

肿瘤坏死因子α(TNF-α)

肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha)主要由被激活的单核细胞或巨噬细胞分泌，在参与系统性炎症的同时也是引起急性期反应的细胞因子之一。

单个TNF-α分子由两个β折叠片层组成，其中每一个均为外侧亲水氨基酸丰富而内侧疏水氨基酸丰富。三个单体TNF-α组成三聚体，其中间形成了疏水氨基酸孔道，显著区别于两端极性氨基酸。单体分子的N端和C端在三聚体底部，在三聚体顶部出现单体分子的内部二硫键。三聚体形式是其生物活性的基础。

人TNF-α氨基酸序列(CAD20719)如下所示：

1 MVRSSSRTPS DKPVAHVVAN PQAEGQLQWL NRRANALLAN

41 GVELRDNQLV VPSEGLYLIY SQVLFNNFTV SFWLRVPKVS

81 ASHLEVSYQT KVNLLSAIKS PCQRETPEGA EAKPWYEPIY

121 LGGVFQLEKG DRLSAEINRP DYLDFAESGQ VYFGIIAL

组合物和施用方法

本发明还提供了一种组合物，它含有：(i)本发明的突变蛋白或本发明的可编码突变蛋白的多核苷酸，以及(ii)药学上或免疫学上可接受的赋形剂或佐剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于或存在于本发明的组合物中。因此，术语“主要由…组成”和“由…组成”包含在术语“含有”中。

本发明的组合物包括药物组合物和疫苗组合物。

本发明的组合物可以是单价的(仅含有一个突变位点或多核苷酸)，也可以是多价的(含有多个突变位点或多种单突变位点蛋白组合或多核苷酸)。

本发明的药物组合物或疫苗组合物可制备成各种常规剂型，其中包括(但并不限于)：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

(1)药物组合物

本发明的药物组合物包含(或含有)治疗有效量的本发明突变蛋白或多核苷酸。

本文所用的术语“治疗有效量”指治疗剂治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的突变蛋白。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂(例如本发明的突变蛋白)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的载体或赋形剂的充分讨论。

组合物中药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

(ii)疫苗组合物

本发明的疫苗(组合物)可以是预防性的(即预防疾病)或治疗性的(即在患病后治疗疾病)。

这些疫苗包含免疫性抗原(包括本发明突变蛋白)，并且通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。另外，抗原也可以和细菌类毒素(如白喉、破伤风、霍乱、幽门螺杆菌等病原体的类毒素)偶联。

增强免疫组合物效果的优选佐剂包括但不限于：(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)水包油型乳剂配方，例如：(a)MF59(参见WO 90/14837)，(b)SAF，和(c)Ribi^TM佐剂系统(RAS)(Ribi Immunochem，Hamilton，MT)(3)皂素佐剂；(4)Freund完全佐剂(CFA)和Freund不完全佐剂(IFA)；(5)细胞因子，如白介素(如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12等)、干扰素(如γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CFS)等；(6)细菌ADP-核糖基化毒素(如大肠杆菌热不稳定毒素LT)的脱毒变异体；以及(7)作为免疫刺激剂来增强组合物效果的其它物质。

包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物(例如，可包括抗原、药学上可接受的载体以及佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫学有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫学有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量可根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如人)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。

通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，以增强佐剂效果。

此外，本发明的疫苗组合物可以是单价的或多价疫苗。

(iii)给药途径和剂量

一旦配制成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的突变蛋白直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物或疫苗组合物的途径包括(但并不限于)：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。应以“有效量”给予突变蛋白疫苗，即突变蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。

代表性的疾病包括(但并不限于)：类风湿性关节炎、银屑病、炎症性肠炎等。

在各疫苗剂份中所选用的突变蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂的疫苗足以含有约1μg-1000mg，较佳地为1μg-100mg，更佳地10μg-50mg蛋白质。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量。可通过监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。

优选方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。

此外，本发明的疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予，或者与其他治疗剂一起给予。

本发明的主要优点在于：

(1)可有效激发机体针对hTNF-α的免疫反应且突变蛋白的生物活性低于野生型hTNF-α；

(2)低生物活性的hTNF-α突变蛋白的制备成本低，给药方便；

(3)相对于与突变蛋白化学偶联的制剂，抗原结构确切、质量可控，更安全。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件中所述的条件，或按照制造厂所建议的条件。

实验方法

方法1模板构建：根据hTNF-α的cDNA序列(基因序列号E01647)，在hTNF-α基因前端加入SUMO蛋白基因序列(基因序列号AF510519)并由上海捷瑞生物工程有限公司按照PCR合成法进行合成，通过BamH I和Nde I内切酶的酶切位点构建至pET28a载体中，得到pET28a-SUMO-TNF-α质粒。所有引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

方法2第一轮PCR扩增：用合成的pET28a-SUMO-TNF-α质粒为模板(10μmol/L，0.5μL)，以X-R(10μmol/L，1.5μL)和T7-F(10μmol/L，0.5μL)为引物，加入KOD-Plus 1μL，10×KOD-Plus Buffer 5μL，dNTPs(2mmol/L，5μL)，MgSO₄(25mmol/L，2μL)，ddH₂O补齐至反应体系50μL，进行PCR扩增出基因上片段，首先94℃预变性时间120s；随后35个反应循环：94℃变性时间15s，55℃退火时间30s，68℃延伸时间120s；最后在68℃延伸反应10min。然后以X-F和T7-R为引物，pET28a-SUMO-TNF-a为模板，按上述体系和条件进行PCR反应扩增出基因下片段(其中“X”为K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、Y119W、D143N、A145R、Y87H/A145R中的一种突变蛋白，且“X-F”和“X-R”为同一突变蛋白的引物)。两次PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V、25min)，按照Axygen凝胶回收试剂盒标准操作将大小正确的条带进行回收。

方法3第二轮PCR扩增：以回收的基因上、下片段PCR产物各0.5μL作为模板，加入T7-F(10μmol/L，1.5μL)，T7-R(10μmol/L，1.5μL)，KOD-Plus 1μL，10×KOD-Plus Buffer5μL，MgSO₄(25mmol/L，2μL)，dNTPs(2mmol/L，5μL)ddH₂O补齐至反应体系为50μL进行重叠延伸PCR反应，首先94℃预变性时间2min；随后35个反应循环：94℃变性时间15s，55℃退火时间30s，68℃延伸时间120s；最后在68℃延伸反应10min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V，25min)，然后将目的基因片段所处的琼脂糖凝胶割下，按照Axygen凝胶回收试剂盒标准操作回收。

方法4载体线性化：将pET28a空质粒(10μmol/L，5μL)，加入FAST内切酶BamH I 1μL和Nde I各1μL，10×FastDigest Buffer 5μL，ddH₂O补齐至反应体系50μL进行载体线性化，条件为37℃，4h。酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V，25min)，然后将目的片段所处的琼脂糖凝胶切下，按照Axygen凝胶回收试剂盒标准操作回收。

方法5同源重组：方法3中获得的基因片段，其上下游引物两端含有和pET28a载体相同序列的同源臂，故通过同源重组法将其整合至线性化质粒pET28a的BamH I及Nde I酶切位点之间。反应体系20μL，含2μL Exnase^TmII、4μL 5×CE II buffer、方法4中制备的线性化质粒60ng，方法3中获得的基因片段120ng，反应体系不足20μL以ddH₂O补足，所有组分轻柔混匀，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。转化步骤：取5μL反应产物加入到100μL E.Coli DH5α感受态细胞中，冰浴30min，之后42℃热激90s并立即置于冰上5min，然后加入300μL LB无抗性培养基，在37℃、180r/min振摇复苏1h，取300μL于LB固体平板(Kan 50μg/mL)涂布均匀，37℃倒置培养15h并挑取单克隆培养。按照Axygen质粒抽提试剂盒标准操作回收抽提菌液中质粒。

方法6突变质粒鉴定：加入T7-F(10μmol/L，1.5μL)，T7-R(10μmol/L，1.5μL)，KOD-Plus1μL，10×KOD-Plus Buffer 5μL，MgSO₄(25mmol/L，2μL)，dNTPs(2mmol/L，5μL)ddH₂O补齐至反应体系为50μL，首先94℃预变性时间2min；随后35个反应循环：94℃变性时间15s，55℃退火时间30s，68℃延伸时间120s；最后在68℃延伸反应10min。将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(120V，25min)，用凝胶成像仪拍照。将出现目的条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。

方法7突变蛋白诱导表达：取上述测序正确的菌种对应质粒1μL，热激法转化50μL E.Coli BL21感受态细胞，取300μL于LB固体平板(Kan 50μg/mL)涂布均匀，37℃倒置培养过夜。挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，37℃、180r/min振摇培养过夜。将过夜菌按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，37℃、200r/min振摇培养4-5h，当OD_600nm达到0.6时加入1mL的1mol/LL IPTG，25℃、180r/min振摇培养20-24h。室温8000r/min离心5min收集菌体并称重。

方法8破菌并纯化：每1g菌体充分重悬于20mL上样缓冲液(500mmol/L NaCl，20mmol/L Tris，20mmol/L Imidazole，pH 8.0)进行超声裂解。超声条件设置：超声3s，停5s，功率1％，时间10min。超声液4℃，12000r/min离心40min后取上清液备用。将Ni-IDA亲和层析柱用平衡液(500mmol/LNaCl，20mmol/LTris，pH 8.0)冲洗10个柱体积以上直至基线冲平。上清液以2mL/min流速上样，然后用洗杂液(500mmol/L NaCl，20mmol/L Tris，50mmol/L Imidazole，pH 8.0)冲洗20个柱体积至紫外峰稳定且低于20mAU，用洗脱液(500mmol/LNaCl，20mmol/L Tris，500mmol/L Imidazole，pH 8.0)洗脱蛋白，当紫外峰上升至50mAU时开始收集，并于再次下降到50mAU时停止收集。

方法9突变蛋白酶切与目的蛋白获得：将SUMO蛋白酶(2mg/mL)与蛋白洗脱液按体积比1∶100充分混匀后，于透析袋中(3.5kDa孔径，购自Thermo公司)，将透析袋置于4L PBS(0.01mol/L Na₂HPO₄，0.002mol/L KH₂PO₄，0.137mol/L NaCl，0.0027mol/L KCl，pH 7.4)中4℃透析。每隔12小时更换一次PBS(0.01mol/L Na₂HPO₄，0.002mol/L KH₂PO₄，0.137mol/LNaCl，0.0027mol/L KCl，pH 7.4)溶液，重复2次。最后一次更换溶液后第12小时检测酶切是否充分。取透析样40μL，加入10μL 5×变性还原缓冲液，充分混匀后再进行沸水浴五分钟，进行12％SDS-PAGE蛋白电泳，上样10μL，浓缩胶90V电压电泳，之后电压120V，总时间约90min，蛋白胶的制备及Running buffer配制参考Bio-Rad标准配方。考马斯亮蓝染色后确定蛋白酶切完全，再次准备过Ni-IDA亲和层析柱，AKTA连接方法与试剂配制按照方法8。以2mL/min流速上样，当紫外峰上升至40mAU时开始收集，并于再次下降到40mAU时停止收集。

方法10蛋白纯度和浓度鉴定：取流穿峰40μL并加入10μL 5×变性还原缓冲液充分混匀，进行沸水浴5min。将上述处理后样本进行SDS-PAGE电泳检测，上样10μL、分离胶浓度12％，前20min电压90V，之后电压120V，总时间约90min，蛋白胶的制备及变性还原缓冲液配制参考Bio-Rad标准配方。考马斯亮蓝染色后用凝胶成像系统内置软件分析蛋白纯度。使用BCA定量法，采用3kD孔径的超滤管进行浓缩。直至将目的蛋白浓度调节至为0.5-1mg/mL。在超净台中，将制备好的蛋白溶液每管1mL分装到1.5mL EP管中冻存在-70℃冰箱中以备后续实验使用。

方法11细胞培养与铺板：小鼠成纤维细胞L929购自中国科学院细胞库(目录号：GNM28)，采用RPMI-1640培养基于5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养。在培养至对数生长期的小鼠成纤维细胞L929中加入5mL的PBS(0.01mol/LNa₂HPO₄，0.002mol/L KH₂PO₄，0.137mol/L NaCl，0.0027mol/L KCl，pH 7.4)洗涤1次；加入0.5mL的胰酶于37℃消化2-4min，每隔1min显微镜观察是否消化完全，及时加入血清终止；以1000r/min离心5min后，吸去上清液。加入5mL的RPMI 1640培养基重悬，1000r/min离心5min后再次加入5mL的RPMI1640培养基重悬，以彻底去除胰酶；用血球计数法计数后，在超净台中以RPMI 1640培养液调整L929细胞浓度至2×10⁵个/mL，于96孔细胞培养板内加100μL L929细胞悬浮液每孔(96孔板最外围的一圈孔槽中加入PBS防止液体吸干)。置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养过夜，至细胞贴壁率达95％以上。

方法12细胞杀伤率测定：当上述96孔板的细胞贴壁率达95％以上后，将野生型的TNF-α及其突变蛋白用培养基分别稀释为1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL，加入100μL上述稀释液于对应各孔(阴性对照加100μL PBS)中，再加入终浓度为1μg/mL的放线菌素D，每个稀释度设置3个重复孔。在37℃、5％CO₂培养20小时后每孔加入20μLCCK-8染料(Cell Counting Kit，基于WST-8(化学名：2-(2-甲氧基4-硝基苯)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐的试剂盒)，37℃、5％CO₂继续培养4小时，酶标仪测定OD_450nm值。

方法13细胞实验数据处理：用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad Software公司2007年8月推出的生物统计及绘图软件)进行深入分析。依据各样品OD_450nm值，用下列公式计算hTNF-α及其点突变蛋白针对L929细胞的杀伤率：

以L929细胞杀伤率为纵坐标，而试验中所用TNF-α浓度作为横坐标作图。使用GraphPadPrism 5.0软件的“log(agonist)vs.response”方程来拟合结果得到作用曲线和半数有效浓度值(EC50)。依据所得hTNF-α及其点突变蛋白的EC50，进而求得点突变蛋的相对生物活性：

实施例1低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11Y制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11Y的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物K11Y-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_K11Y-上基因片段，用引物K11Y-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_K11Y-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_K11Y-上基因片段和hTNF_K11Y-下基因片段。

将回收的hTNF_K11Y-上基因片段和hTNF_K11Y-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的K11Y基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_K11Y基因片段。

按照方法4，用内切酶BamH I及Nde I对pET28a空质粒进行线性化处理：反应体系50μL，条件为37℃，4h，酶切产物进行凝胶电泳检测，结果显示条带位于5200bp-5500bp，符合pET28a质粒线性化后预期大小的位置，从琼脂糖凝胶回收，得到线性化的pET28a质粒。

取2μL Exnase^Tm II、4μL 5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_K11Y基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_K11Y基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_K11Y质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11Y表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_K11Y质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_K11Y洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_K11Y洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白K11Y的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_K11Y，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11Y。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11Y进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为90％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.72mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11Y储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11Y生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11Y的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_K11Y的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

K11Y-1：0.90、0.89、0.91、0.90、0.81、0.90、0.80、0.79、0.56、0.44、0.17、0.06

K11Y-2：0.91、0.87、0.86、0.87、0.85、0.86、0.82、0.71、0.63、0.44、0.17、0.08

K11Y-3：0.81、0.80、0.82、0.87、0.83、0.76、0.76、0.72、0.48、0.42、0.16、0.07

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_K11Y半数有效浓度值(EC50)为93.3ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_K11Y的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为7.48％。

实施例2低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11F制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11F的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物K11F-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_K11F-上基因片段，用引物K11F-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_K11F-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_K11F-上基因片段和hTNF_K11F-下基因片段。

将回收的hTNF_K11F-上基因片段和hTNF_K11F-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的K11F基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_K11F基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL 5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_K11F基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_K11F基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_K11F质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11F表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_K11F质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L·诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用N i-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_K11F洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_K11F洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白K11F的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_K11F，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11F。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11F进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为90％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.81mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11F储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11F生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_K11F的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_K11F的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

K11F-1：0.96、0.92、0.98、0.94、0.95、0.93、0.83、0.81、0.60、0.58、0.22、0.05

K11F-2：0.94、0.90、0.97、0.96、0.91、0.90、0.85、0.80、0.48、0.46、0.20、0.04

K11F-3：0.87、0.88、0.95、0.92、0.92、0.90、0.82、0.75、0.47、0.47、0.16、0.04

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_K11F半数有效浓度值(EC50)为80.6ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_K11F的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为8.67％。

实施例3低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R31T制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R31T的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物R31T-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_R31T-上基因片段，用引物R31T-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_R31T-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_R31T-上基因片段和hTNF_R31T-下基因片段。

将回收的hTNF_R31T-上基因片段和hTNF_R31T-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的R31T基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_R31T基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_R31T基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_R31T基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_R31T质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R31T表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_R31T质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_R31T洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_R31T洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白R31T的SUMO标签被完全酶切。用N i-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_R31T，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R31T。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R31T进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为96％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.90mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R31T储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R31T生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R31T的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_R31T的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

R31T-1：0.95、0.94、0.92、0.84、0.92、0.90、0.77、0.79、0.58、0.57、0.29、0.14

R31T-2：0.96、0.93、0.94、0.93、0.83、0.86、0.75、0.73、0.55、0.59、0.37、0.14

R31T-3：0.89、0.84、0.93、0.90、0.75、0.86、0.71、0.79、0.52、0.58、0.32、0.14

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_R31T半数有效浓度值(EC50)为92.8ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_R31T的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为7.53％。

实施例4低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R32Y制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R32Y的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物R32Y-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_R32Y-上基因片段，用引物R32Y-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_R32Y-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_R32Y-上基因片段和hTNF_R32Y-下基因片段。

将回收的hTNF_R32Y-上基因片段和hTNF_R32Y-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的R32Y基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_R32Y基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL 5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_R32Y基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_R32Y基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_R32Y质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R32Y表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_R32Y质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_R32Y洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_R32Y洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白R32Y的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_R32Y，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R32Y。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R32Y进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为90％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.89mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R32Y储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R32Y生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_R32Y的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_R32Y的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

R32Y-1：0.93、0.91、0.93、0.89、0.85、0.87、0.85、0.72、0.64、0.61、0.43、0.24

R32Y-2：0.83、0.83、0.89、0.83、0.79、0.81、0.78、0.71、0.59、0.58、0.43、0.25

R32Y-3：0.89、0.85、0.89、0.89、0.84、0.79、0.76、0.73、0.63、0.56、0.44、0.25

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_R32Y半数有效浓度值(EC50)为92.4ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_R32Y的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为7.56％。

实施例5低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S86F制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S86F的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物S86F-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_S86F-上基因片段，用引物S86F-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_S86F-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_S86F-上基因片段和hTNF_S86F-下基因片段。

将回收的hTNF_S86F-上基因片段和hTNF_S86F-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的S86F基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_S86F基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_S86F基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.ColiDH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_S86F基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_S86F质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S86F表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_S86F质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L.诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_S86F洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_S86F洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白S86F的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_S86F，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S86F。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S86F进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为90％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.70mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S86F储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S86F生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S86F的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_S86F的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

S86F-1：0.78、0.85、0.88、0.82、0.88、0.80、0.78、0.82、0.80、0.73、0.57、0.40

S86F-2：0.81、0.78、0.80、0.79、0.79、0.79、0.84、0.79、0.78、0.74、0.58、0.40

S86F-3：0.79、0.81、0.83、0.78、0.73、0.83、0.83、0.80、0.78、0.78、0.56、0.44

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_S86F半数有效浓度值(EC50)为1907ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_S86F的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为0.367％。

实施例6低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物Y87H-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_Y87H-上基因片段，用引物Y87H-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_Y87H-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_Y87H-上基因片段和hTNF_Y87H-下基因片段。

将回收的hTNF_Y87H-上基因片段和hTNF_Y87H-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的Y87H基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_Y87H基因片段。

取2μL Exnase^TmII、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_Y87H基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_Y87H基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_Y87H质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_Y87H质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_Y87H洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_Y87H洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白Y87H的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_Y87H，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为99％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.90mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_Y87H的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

Y87H-1：0.92、0.94、0.93、090、093、0.96、0.94、0.90、0.96、0.92、0.85、0.81

Y87H-2：0.87、0.86、0.94、0.93、0.93、0.88、0.95、0.89、0.92、0.92、0.89、0.80

Y87H-3：0.94、0.95、0.92、0.97、0.90、0.89、0.88、0.87、0.87、0.93、0.82、0.76

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_Y87H半数有效浓度值(EC50)为220107ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_Y87H的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为0.00317％。

实施例7低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S95F制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S95F的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物S95F-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_S95F-上基因片段，用引物S95F-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_S95F-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_S95F-上基因片段和hTNF_S95F-下基因片段。

将回收的hTNF_S95F-上基因片段和hTNF_S95F-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的S95F基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_S95F基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_S95F基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_S95F基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_S95F质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S95F表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_S95F质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_S95F洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_S95F洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白S95F的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_S95F，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S95F。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S95F进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为99％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.64mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S95F储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S95F生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_S95F的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_S95F的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

S95F-1：0.96、1.00、0.98、0.93、0.91、0.89、0.91、0.84、0.87、0.75、0.67、0.42

S95F-2：1.00、0.97、0.91、0.96、0.91、0.92、0.91、0.86、0.82、0.67、0.64、0.41

S95F-3：0.96、0.97、0.89、0.94、0.96、0.82、0.84、0.75、0.79、0.67、0.62、0.34

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_S95F半数有效浓度值(EC50)为212.2ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_S95F的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为3.29％。

实施例8低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y115F制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y115F的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物Y115F-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_Y115F-上基因片段，用引物Y115F-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_Y115F-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_Y115F-上基因片段和hTNF_Y115F-下基因片段。

将回收的hTNF_Y115F-上基因片段和hTNF_Y115F-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的Y115F基因的理论值1100bp；特异性条带通过回收，得到hTNF_Y115F基因片段。

按照方法4，用内切酶BamH I及Nde I对pET28a空质粒进行线性化处理：反应体系50μL，条件为37℃，4h，酶切产物进行凝胶电泳检测，结果显示条带位于5200bp-5500bp，符合pET28a质粒线性化后预期大小的位置，经过琼脂糖凝胶回收，得到线性化的pET28a质粒。

取2μL Exnase^Tm II、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒50ng(2μL)，hTNF_Y115F基因片段100ng(5μL)，反应体系加7μL ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_Y115F基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_Y115F质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y115F表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_Y115F质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_Y115F洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_Y115F洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白Y115F的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_Y115F，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y115F。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y115F进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为99％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.96mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y115F储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y115F生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y115F的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_Y115F的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

Y115F-1：0.92、0.96、0.95、0.96、0.90、0.92、0.86、0.83、0.76、0.67、0.38、0.17

Y115F-2：0.86、0.88、0.92、0.88、0.88、0.86、0.80、0.79、0.66、0.57、0.36、0.12

Y115F-3：0.88、0.87、0.94、0.85、0.83、0.84、0.81、0.85、0.63、0.64、0.42、0.16

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_Y115F半数有效浓度值(EC50)为228.9ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_Y115F的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为3.05％。

实施例9低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119C制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119C的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物Y119C-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_Y119C-上基因片段，用引物Y119C-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_Y119C-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_Y119C-上基因片段和hTNF_Y119C-下基因片段。

将回收的hTNF_Y119C-上基因片段和hTNF_Y119C-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的Y119C基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_Y119C基因片段。

取2μL Exnase^TmII、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_Y119C基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_Y119C基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_Y119C质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119C表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_Y119C质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎；离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_Y119C洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_Y119C洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白Y119C的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_Y119C，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119C。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119C进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为90％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.75mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119C储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119C生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119C的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_Y119C的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

Y119C-1：0.93、0.93、0.95、0.95、0.87、0.91、0.85、0.81、0.80、0.75、0.56、0.29

Y119C-2：0.93、0.86、0.90、0.88、0.92、0.85、0.81、0.74、0.76、0.72、0.50、0.26

Y119C-3：0.89、0.84、0.84、0.87、0.84、0.84、0.85、0.79、0.72、0.70、0.57、0.28

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_Y119C半数有效浓度值(EC50)为1009ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_Y119C的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为0.692％。

实施例10低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119N制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119N的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物Y119N-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_Y119N-上基因片段，用引物Y119N-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_Y119N-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_Y119N-上基因片段和hTNF_Y119N-下基因片段。

将回收的hTNF_Y119N-上基因片段和hTNF_Y119N-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的Y119N基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_Y119N基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_Y119N基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_Y119N基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_Y119N质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119N表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_Y119N质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.ColiBL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_Y119N洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_Y119N洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白Y119N的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_Y119N，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119N。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119N进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为98％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.69mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119N储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119N生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119N的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_Y119N的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

Y119N-1：0.87、0.89、0.90、0.94、0.91、0.91、0.92、0.86、0.84、0.83、0.78、0.63

Y119N-2：0.86、0.80、0.87、0.87、0.89、0.85、0.92、0.90、0.87、0.86、0.80、0.66

Y119N-3：0.90、0.84、0.88、0.91、0.84、0.88、0.84、0.88、0.82、0.80、0.73、0.63

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_Y119N半数有效浓度值(EC50)为112162ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_Y119N的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为0.00622％。

实施例11低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119G制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119G的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物Y119G-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_Y119G-上基因片段，用引物Y119G-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_Y119G-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_Y119G-上基因片段和hTNF_Y119G-下基因片段。

将回收的hTNF_Y119G-上基因片段和hTNF_Y119G-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的Y119G基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_Y119G基因片段。

取2μL Exnase^TmII、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_Y119G基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_Y119G基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_Y119G质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119G表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_Y119G质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_Y119G洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_Y119G洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白Y119G的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_Y119G，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119G。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119G进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为90％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.92mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119G储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119G生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNFY119G的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_Y119G的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

Y119G-1：0.79、0.83、0.77、0.73、0.68、0.77、0.76、0.74、0.60、0.60、0.35、-0.11

Y119G-2：0.77、0.77、0.79、0.80、0.75、0.72、0.74、0.72、0.65、0.61、0.31、-0.11

Y119G-3：0.68、0.67、0.72、0.78、0.72、0.75、0.70、0.73、0.59、0.59、0.32、-0.11

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_Y119G半数有效浓度值(EC50)为9348ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_Y119G的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为0.0747％。

实施例12低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119W制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119W的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物Y119W-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_Y119W-上基因片段，用引物Y119W-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_Y119W-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_Y119W-上基因片段和hTNF_Y119W-下基因片段。

将回收的hTNF_Y119W-上基因片段和hTNF_Y119W-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的Y119W基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_Y119W基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL 5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_Y119W基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_Y119W基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_Y119W质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119W表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_Y119W质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_Y119W洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_Y119W洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白Y119W的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_Y119W，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119W。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119W进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为97％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度1.04mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119W储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119W生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y119W的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_Y119W的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

Y119W-1：0.94、0.94、1.00、0.91、0.95、0.89、0.68、0.68、0.40、0.32、0.18、0.09

Y119W-2：0.92、0.89、0.93、0.89、0.89、0.81、0.70、0.65、0.40、0.32、0.18、0.09

Y119W-3：0.88、0.86、0.88、0.83、0.81、0.81、0.68、0.66、0.39、0.36、0.17、0.09

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_Y119W半数有效浓度值(EC50)为24.4ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_Y119W的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为28.6％。

实施例13低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H/A145R制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H/A145R的表达载体构建

按照实施例6的步骤1，得到hTNF_Y87H基因片段。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物A145R-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_Y8711/A145R-上基因片段，用引物A145R-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_Y87H/A145R-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_Y87H/A145R-上基因片段和hTNF_Y87H/A145R-下基因片段。

将回收的hTNF_Y87H/A145R-上基因片段和hTNF_Y87H/A145R-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的Y87H/A145R基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_Y87H/A145R基因片段。

取2μL Exnase^TmII、4μL5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_Y87H/A145R基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_Y87H/A145R基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_Y87H/A145R质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H/A145R表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_Y87H/A145R质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_Y87H/A145R洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_Y87H/A145R洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白Y87H/A145R的SUMO标签被完全酶切。用N i-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_Y87H/A145R，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H/A145R。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H/A145R进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为90％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.88mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H/A145R储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H/A145R生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_Y87H/A145R的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_Y87H/A145R的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

Y87H/A145R-1：0.91、0.90、0.90、0.94、0.96、0.90、0.94、0.95、0.90、0.93、0.87、0.83

Y87H/A 145R-2：0.89、0.90、0.90、0.89、0.92、0.90、0.95、0.88、0.92、0.89、0.82、0.78

Y87H/A145R-3：0.88、0.88、0.89、0.87、0.88、0.93、0.91、0.90、0.87、0.91、0.91、0.81

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_Y87H/A145R半数有效浓度值(EC50)为778299ng/mL，而野生型hTNF-α的EC50值为6.98ng/mL，突变蛋白hTNF_Y87H/A145R的生物活性相对于野生型hTNF-α的生物活性为0.000897％。

实施例14低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_D143N制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_D143N的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物D143N-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_D143N-上基因片段，用引物D143N-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_D143N-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_D143N-上基因片段和hTNF_D143N-下基因片段。

将回收的hTNF_D143N-上基因片段和hTNF_D143N-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的D143N基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_D143N基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL 5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_D143N基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_D143N基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_D143N质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_D143N表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_D143N质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_D143N洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_D143N洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白D143N的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_D143N，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_D143N。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_D143N进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为94％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.82mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_D143N储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_D143N生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNFD143N的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNF_D143N的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

D143N-1：0.86、0.92、0.94、0.88、0.86、0.83、0.87、0.90、0.87、0.88、0.85、0.88

D143N-2：0.91、0.85、0.69、0.86、0.72、0.73、0.76、0.77、0.79、0.70、0.87、0.94

D143N-3：0.89、0.83、0.87、0.84、0.82、0.84、0.84、0.89、0.80、0.92、0.88、0.88

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_D143N的L929细胞杀伤率。本组数据不能用软件内方程拟合，但从数据可知突变蛋白D143N的活性明显降低。

实施例15低生物活性人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_A145R制备

步骤1人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_A145R的表达载体构建

按照方法1，构建pET28a-SUMO-hTNF-α质粒。按照方法2，以pET28a-SUMO-hTNF-α质粒为模板，用引物A145R-R和T7-F，按照方法1进行PCR扩增hTNF_A145R-上基因片段，用引物A145R-F和T7-R进行PCR扩增hTNF_A145R-下基因片段。PCR产物按照方法2进行电泳检测和凝胶回收，得到hTNF_A145R-上基因片段和hTNF_A145R-下基因片段。

将回收的hTNF_A145R-上基因片段和hTNF_A145R-下基因片段作为模板，加入T7-F引物和T7-R引物按照方法3进行重叠PCR反应。PCR产物进行电泳检测，得到的电泳条带位置介于1000bp到1200bp之间，符合带SUMO标签的A145R基因的理论值1100bp；特异性条带从凝胶中回收，得到hTNF_A145R基因片段。

取2μL Exnase^Tm II、4μL 5×CE II buffer、线性化pET28a质粒60ng(2μL)，hTNF_A145R基因片段120ng(6μL)，反应体系加ddH₂O补足至20μL，37℃孵育30min，然后立即置于冰上5min备用。按方法5将5μL同源重组反应液和100μL E.Coli DH5α感受态细胞进行操作，然后取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，发现长出白色菌落，挑取单克隆菌落培养。抽提培养菌液中质粒，并加入含有T7-F、T7-R的体系中，按照方法6进行PCR反应并电泳检测PCR产物，发现在1000bp到1200bp之间存在特异性明亮条带，符合带SUMO蛋白基因的hTNF_A145R基因的预期大小(约1100bp)。将出现上述特异性条带的单克隆菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，序列正确，得到pET28a-SUMO-hTNF_A145R质粒。

步骤2人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_A145R表达及规模化制备

取pET28a-SUMO-hTNF_A145R质粒1μL，按照方法7热激法转化至50μL E.Coli BL21感受态细胞中，取300μL培养液涂布LB固体平板，37℃倒置培养15小时，可见白色单菌落长出，挑取单克隆接种于25mL LB培养基(Kan 50μg/mL)，培养过夜后按1∶500(v∶v)转接至2L TB培养基(Kan 50μg/mL)，按照方法7进行培养。当培养液OD_600nm达到0.6时加IPTG至终浓度0.001mol/L诱导，在25℃、180r/min振摇，再培养24h。8000r/min室温离心5min收集菌体并称重。

菌体按照方法8用上样缓冲液重悬，超声破碎，离心取上清蛋白液用Ni-IDA亲和层析柱纯化得到融合蛋白SUMO-hTNF_A145R洗脱液。

融合蛋白SUMO-hTNF_A145R洗脱液按照方法9用SUMO蛋白酶酶切、纯化、SDS-PAGE分析酶切过程。发现在电泳凝胶上17kDa和26kDa处有两条带，表明突变蛋白A145R的SUMO标签被完全酶切。用Ni-IDA亲和层析柱吸附SUMO标签和未被酶切的融合蛋白SUMO-hTNF_A145R，流穿得到人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_A145R。

再按照方法10，对人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_A145R进行纯度分析，证明蛋白条带位于17kDa处，符合预期分子量，蛋白纯度为97％，符合进行动物实验的标准。再超滤浓缩至蛋白浓度0.73mg/mL分装1mL到1.5mL EP管中，冻存-70℃冰箱中以备后续实验使用，为人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_A145R储存液。

步骤3L929细胞法检测人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_A145R生物活性

按照方法11培养小鼠成纤维细胞L929，按照方法12，制备测定人肿瘤坏死因子突变蛋白hTNF_A145R的浓度梯度1000ng/mL、500ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.1ng/mL、0.01ng/mL、0.001ng/mL、0.0001ng/mL每个稀释度设置3个重复孔，加入含小鼠成纤维细胞L929各孔中，继续培养细胞20小时、再向各孔中加入CKK-8染料，测定对应突变蛋白hTNFA145R的浓度梯度三组重复孔的OD_450nm值分别为：

A145R-1：0.94、0.93、0.97、0.94、0.92、0.91、0.93、0.93、0.94、0.90、0.94、0.91

A145R-2：0.92、0.89、0.92、0.95、0.89、0.93、0.91、0.86、0.88、0.84、0.90、0.86

A145R-3：0.83、0.87、0.89、0.91、0.84、0.88、0.84、0.87、0.84、0.83、0.89、0.77

再按照方法13，依据测定的OD_450nm值，用公式(1)计算突变蛋白hTNF_A145R的L929细胞杀伤率。本组数据不能用软件内方程拟合，但从数据可知突变蛋白D143N的活性明显降低。

实施例16动物免疫血清学检测

雌性6-8周龄的SPF级BALB/c小鼠购自维通利华北京公司，并按照AAALAC指南要求进行饲养。免疫前，以PBS(0.01mol/LNa₂HPO₄，0.002mol/L KH₂PO₄，0.137mol/LNaCl，0.0027mol/L KCl，pH 7.4)将野生型hTNF-α蛋白和hTNF-α突变蛋白K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、119W、D143N、A145R、Y87H/A145R稀释至0.5mg/mL，再与氢氧化铝佐剂按体积比1∶1进行混合至蛋白终浓度250μg/mL。挑选64只老鼠，以4只为一组随机分成16组。其中hTNF-α突变蛋白实验组有15组，分别对应于突变K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、119W、D143N、A145R、Y87H/A145R。另一组为对照，用野生型hTNF-α蛋白作为抗原。小鼠腋下淋巴结部位选取4个点进行皮下注射，每次每只小鼠200μL。

在第14天二次免疫前，观察和触摸免疫注射部位形态，发现野生型hTNF-α组小鼠有2只均出现1个包且均有1处结痂；

K11F组小鼠有2只均出现1个包，且其中1只1处脱毛及1处溃烂；

K11Y组小鼠有2只均出现2个包；

R31T组小鼠有1只1个包；

Y119G组小鼠有1只3个包；

Y119W组小鼠1只1个包及1个结痂，1只2个包，另有2只均出现3个包；

Y87H/A145R组小鼠有1只1个包，另有1只2个包；

而R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、D143N、A145R组小鼠免疫注射部位没有发现包，无溃烂，无结痂。

在第28天三次免疫前，再次观察和触摸免疫注射部位形态，发现野生型hTNF-α组小鼠有1只出现1个包，有1只1个包及1处脱毛，另有1只2个包及1处脱毛；

K11F组小鼠有2只均出现1个包，二免前其中1只的脱毛和溃烂现象消失；

K11Y组小鼠有1只1个包，有2只均出现2个包，另有1只3个包；

R31T组小鼠有2只均出现2个包，另有2只均出现1个包；

S86F组小鼠有1只1个包，另有1只2个包；

Y87H组小鼠有3只均出现1个包，另有1只3个包；

S95F组小鼠有2只均出现1个包；

Y115F组小鼠有2只均出现1个包；

Y119N组小鼠有2只均出现1个包，且其中1只1处脱毛；

Y119G组小鼠有3只均出现1个包；

Y119W组小鼠有2只均出现2个包且均出现3处脱毛，有1只出现3个包及3处脱毛，另有1只出现4个包；

D143N组小鼠有1只1个包；

A145R组小鼠有1只1个包，另有1只3个包；

Y87H/A145R组小鼠有1只1个包；

而R32Y、Y119C组小鼠免疫注射部位没有发现包，无溃烂，无结痂。

第35天，从各小鼠眼眶取血，室温静置2h，4000r/min离心10min后，弃沉淀并取上部血清-20℃备用。

用包被缓冲液(50mmol/L碳酸氢盐缓冲液，pH 9.6)将野生型hTNF-α蛋白稀释至浓度为100ng/100μL，然后转移到聚苯乙烯96孔板上(每孔加100μL)4℃孵育过夜。用PBST(0.01mol/L Na₂HPO₄，0.002mol/L KH₂PO₄，0.137mol/L NaCl，0.0027mol/L KCl，0.15％(v∶v)Tween-20，pH 7.4)每孔300μL洗板6次，每次5分钟。再加入300μL含5％(m/v)脱脂奶粉的封闭液(溶于PBST)，37℃孵育2小时进行封闭。用PBST(0.01mol/L Na₂HPO₄，0.002mol/L KH₂PO₄，0.137mol/L NaCl，0.0027mol/L KCl，0.15％(v∶v)Tween-20，pH 7.4)每孔300μL洗板6次，每次5分钟，然后用含5％(m/v)脱脂奶粉的封闭液(溶于PBST)将K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、119W、D143N、A145R、Y87H/A145R突变蛋白对应的抗血清稀释100倍后每孔加100μL，37℃孵育1小时，用PBST(0.01mol/L Na₂HPO₄，0.002mol/L KH₂PO₄，0.137mol/L NaCl，0.0027mol/L KCl，0.15％(v∶v)Tween-20，pH 7.4)每孔300μL洗板6次，每次5分钟。将二抗(羊抗鼠-IgG-辣根过氧化物酶交联物)用含5％(m/v)脱脂奶粉的封闭液(溶于PBST)稀释8000倍，向每孔加入100μL稀释后的二抗，37℃孵育1小时。用PBST(0.01mol/LNa₂HPO₄，0.002mol/L KH₂PO₄，0.137mol/L NaCl，0.0027mol/L KCl，0.15％(v∶v)Tween-20，pH 7.4)每孔300μL洗板6次，每次5分钟。每孔加100μL底物溶液TMB(购自碧云天公司生物技术)，37℃中放置15min，然后加入25μL 2mol/L的H₂SO₄终止反应。用酶标仪测定hTNF-α及各突变蛋白OD_450nm值分别是：

hTNF-α为2.96、2.95、2.95、2.95，K11F为2.83、2.83、2.40、2.00，

K11Y为2.80、2.94、2.80、2.43，R31T为2.80、2.64、2.57、1.48，

R32Y为2.85、2.82、2.65、2.40，S86F为2.75、2.74、2.56、2.47，

Y87H为2.74、2.82、2.86、1.60，S95F为2.78、2.96、2.78、2.30，

Y115F为2.58、2.42、2.63、2.25，Y119C为2.81、2.71、2.75、2.55，

Y119N为2.87、2.67、2.76、1.58，Y119G为2.88、2.86、2.87、1.87，

Y119W为2.92、2.75、2.71、2.74，D143N为2.81、2.86、2.83、1.80，

A145R为2.77、2.83、2.83、1.84，Y87H/A145R为2.83、2.85、2.42、0.93。

依据上述OD_450nm结果，使用GraphPad Prism 5.0软件作图2。从结果可知，以野生型hTNF-α蛋白作为包被抗原，将各突变蛋白免疫组的小鼠抗血清作为一抗孵育时，突变蛋白K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、Y119W、D143N、A145R、Y87H/A145R的抗血清均能产生特异性抗体，且此抗体能针对野生型hTNF-α蛋白产生免疫反应。

本发明所用的各引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(如下表)：

Claims

1.一种TNF-α突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白降低TNF-α生物活性导致的副反应，同时产生针对TNF-α的免疫反应及中和抗体。

2.如权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白包括在TNF-α蛋白的第11、31、32、86、87、95、115、119、143或145位氨基酸位点上的突变中的一个或多个。

3.如权利要求1所述的突变蛋白，其特征在于，所述的TNF-α来自人TNF-α，小鼠TNF-α，大鼠TNF-α，或其它哺乳动物的TNF-α蛋白。

4.如权力要求2所述的突变蛋白，其特征在于，所述突变蛋白的突变包括K11Y、K11F、R31T、R32Y、S86F、Y87H、S95F、Y115F、Y119C、Y119N、Y119G、Y119W、D143N、A145R或其组合。

5.一种多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码权利要求1所述的突变蛋白。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的多核苷酸。

7.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求6所述的表达载体，或者在基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的突变蛋白，权利要求5所述的多核苷酸或者权利要求6所述的表达载体或者权利要求7所述的宿主细胞，以及药学上可以接受的载体和/或辅料。

9.一种疫苗组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1所述的突变蛋白，权利要求5所述的多核苷酸或者权利要求7所述的表达载体或者权利要求7所述的宿主细胞，以及免疫学上可接受的载体和/或辅料。

10.如权利要求1所述的TNF-α突变蛋白在制备针对TNF-α及其突变蛋白的抗体和/或制备治疗与TNF-α相关的疾病的药物中的用途。