CN100487118C

CN100487118C - 一种重组人角质细胞生长因子-2的生产方法

Info

Publication number: CN100487118C
Application number: CNB2005100272064A
Authority: CN
Inventors: 任军; 黄阳滨; 孙九如; 丰涛; 杜碧金
Original assignee: Shanghai Newsummit Biopharma Co Ltd
Current assignee: Zhejiang Thirty Thousand Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2005-06-28
Filing date: 2005-06-28
Publication date: 2009-05-13
Anticipated expiration: 2025-06-28
Also published as: CN1888066A

Abstract

本发明提供了一种优化的人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)编码序列、生产重组人角质细胞生长因子-2的方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。通过采用的优化hKGF-2序列，本发明方法不仅表达量高，而且分离纯化工艺简便。本发明还提供了相应的表达载体和工程菌。

Description

一种重组人角质细胞生长因子-2的生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，更具体地涉及一种优化的人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)编码序列、生产重组人角质细胞生长因子-2的方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。

背景技术

重组人角质细胞生长因子-2(Recombinant Human Keratinocyte GrowthFactor-2，rhKGF-2)是治疗糖尿病性静脉溃疡、溃疡性结肠炎、高剂量化疗引起的粘膜炎、烧烫伤等顽固性、慢性创伤的国家治疗用生物制品1类新药。它可特异性地刺激上皮细胞的增殖，同时促使表皮细胞生长和肉芽组织形成，降解多余胶原，减少疤痕的产生。

rhKGF-2最初通过序列同源性分析被列为FGF家族成员，又称为FGF-10，该家族是参与软组织生长的一个大家族，迄今发现的18个成员均有广阔的促有丝分裂谱，即它们能促进中胚层和神经外胚层起源的各种细胞的增殖和/或促进血管形成。rhKGF-2由208个氨基酸组成，它能特异性地结合于靶细胞表面的成纤维细胞生长因子受体2IIIb(fibroblast growth factor recptor-2IIIb，FGFR2IIIb)和成纤维细胞生长因子受体1IIIb(fibroblast growth factor recptor-1IIIb，FGFR1IIIb)，两个受体触发信号传导，从而发挥生理作用。由于FGFR主要存在于上皮组织中，因此rhKGF-2可特异性地刺激上皮细胞的增殖，同时促使表皮细胞生长和肉芽组织形成，如刺激肝、肾、胰腺、膀胱上皮细胞的增殖和胃肠道细胞数量的增加；同时它通过激活胶原酶，降解疤痕组织中过多的胶原，抑制病理性疤痕的增生，使伤口愈合后不留明显疤痕，是一种对伤口愈合非常有治疗潜力的蛋白因子，因此凡有上皮组织的损伤处均可使用该产品，故在创伤愈合方面起着重要的作用。

Repifermin是美国HUMAN GENOME SCIENCES，Inc(HGS)开发的rhKGF-2产品。1998年2月开始进行rhKGF-2用于创口愈合的两个I期试验研究，其中一个是皮肤表面的局部用药，另一个是通过注射的全身用药。试验的目的在于评价rhKGF-2的安全性、药物动力学以及恰当的剂量。试验结果表明，在选定的剂量下，在人体系统中应用rhKGF-2是安全的，健康志愿者能够良好耐受，几乎无副作用。2001年4月5日HGS公司已开始更大规模的IIb试验，在美国70个临床试验点考察700名患者以进一步评价KGF-2的使静脉溃疡完全愈合的效力。2003年4月2日HGS公司结束了Repifermin针对化疗引起的粘膜炎临床II期研究，结果表明Repifermin安全性好，且疗效显著。

目前国际上的rhKGF-2大肠杆菌表达系统生产工艺，其表达产物无论是否以包涵体形式存在，因密码子未经优化，载体选择不适当，造成表达量低，且必须经过4-5步层析纯化法才能获得纯度为90％的成品的结果。

在中国专利申请CN02110808.0中公开了一种利用大肠杆菌表达系统来生产人角质细胞生长因子-2的方法。虽然该方法对选用的表达载体进行了优化，使得表达量得以提高(约200ug/ml)，并优化了分离纯化工艺，然而由于选用的hKGF-2编码序列仍然是天然的人hKGF-2序列，因此表达量的提高仍受到很大限制。

然而，目前为止用大肠杆菌生产人角质细胞生长因子-2的效率还较低。因此，本领域迫切需要开发新的高效简便的生产人角质细胞生长因子-2的工艺。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和简便的生产rhKGF-2的工艺。

本发明的另一目的是提供用于该方法的表达载体和宿主细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种优化的编码人角质细胞生长因子-2的DNA序列，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，它含有本发明上述优选的hKGF-2编码序列(包括DNA序列或RNA序列)。

在另一优选例中，所述的表达载体是插入了SEQ ID NO：1所示序列的pET30a(+)/rhKGF-2。

在本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的表达载体或所述的优化的编码人角质细胞生长因子-2的DNA序列。更佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌。

在本发明的第四方面，提供了一种生产人角质细胞生长因子-2的方法，它包括步骤：

(a)在适合表达人角质细胞生长因子-2的条件下，用发酵罐培养本发明上述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人角质细胞生长因子-2。

在另一优选例中，所述的表达载体是含IPTG诱导的启动子的表达载体pET30a(+)/rhKGF-2，或者所述的宿主细胞是大肠杆菌。

在另一优选例中，在步骤(a)中进行高密度发酵。

在另一优选例中，所述的步骤(b)包括步骤：

(i)破碎发酵菌体，离心获得破菌上清液；

(ii)通过盐析和/或超滤对破菌液上清液进行初步纯化；

(iii)层析纯化，所述的层析纯化选自：亲和层析、阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、及其组合。

在另一优选例中，所述的培养条件是：培养温度为30-40℃，更佳地34-38℃；pH在6～8之间，更佳地在6.5～7.5之间；葡萄糖或甘油浓度为0.1～5％，更佳地在0.3～3％；诱导剂为1mM IPTG，诱导前OD₆₀₀在0.5～20之间，更佳地在1～10之间；诱导时间0.5～10小时，更佳地1～5小时。

附图说明

图1：显示了人KGF-2天然序列与本发明优化序列的序列比对图。显示两者的相同性较低，约70％。

图2：表达载体pET30a(+)/rhKGF-2的构建线路图。

图3：重组表达载体pET30a(+)/rhKGF-2的酶切鉴定。各泳道如下：1，5：DNAMarker(New England公司)；2：pET30a(+)/KGF-2质粒；3：pET30a(+)/KGF-2经PstI酶切；4：pET30a(+)/KGF-2经NdeI+SalI酶切。

图4：不同培养基的SDS-PAGE电泳图。各泳道如下：1：分子量标准品；2：诱导前；3～6：M9培养基(诱导1，2，3，4hr)；7～9：M9-4培养基(诱导3，2，1hr)。

图5：高密度发酵电泳图。1：分子量标准品；2、5：1号和2号罐的诱导前；3、4：1号罐诱导2、3hr；6、7：2号罐诱导2、3hr。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，通过对hKGF-2编码序列的一系列优化，并经筛选，在多个修饰序列中获得了一个特别适合大肠杆菌表达的优化序列(SEQ ID NO：1)。该优化序列不仅选用了大肠杆菌的优选密码子，还消除了一些不利于表达的二级结构，因此有助于在原核细胞高效、稳定地表达的rhKGF-2。经转化的大肠杆菌，表达量可达约800mg/L。在此基础上完成了本发明。

在另一优选例中，用优选的载体pET30a(+)进行表达，该载体有助于rhKGF-2真核基因在原核中的正确折叠，并以可溶性形式存在，从而简化了分离纯化工艺。

在另一优选例中，用本发明优化的hKGF-2编码序列转化的大肠杆菌(简称为“工程菌”)，经高密度发酵培养，IPTG诱导，rhKGF-2以可溶、活性形式存在于胞间质，同时简便纯化工艺，通过简便的二步纯化方法，即可得到纯度达95％的纯品，获得高表达、高得率、极具产业化价值的一种生产rhKGF-2的方法。

hKGF-2的cDNA序列是已知的，其成熟蛋白由170个氨基酸组成，理论分子量为19.3kD。成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明人先根据大肠杆菌密码子偏爱性，在不改变其氨基酸序列的前提下对hKGF-2的cDNA序列进行了优化，然后还消除了一些不利于表达的二级结构(如不利于转录的发夹结构等)，经过测试，在众多修饰序列中获得了一个特别优化的编码序列。此优化的编码hKGF-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，与hKGF-2天然序列的同源性较低，仅约70％(见图1)。本发明优化的hKGF-2编码序列仍然编码天然的hKGF-2成熟多肽，即全长170个氨基酸的蛋白质(SEQ IDNO：2)。

本发明的发明点主要在于改构的hKGF-2的全新基因设计。至于将改构的hKGF-2基因插入质粒、转化大肠杆菌细胞、工程菌的筛选、工程菌的发酵、以及产物的分离等技术基本上按本领域已知的常规方法进行(例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件)或按照中国专利申请CN02110808.0中所述的方法。

本发明的载体包括表达质粒，例如含IPTG诱导的启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中插入了人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)的编码序列。一种特别优选的表达载体是载体pET30a(+)、pSE280、pSE380和pSE420。

适用于本发明的宿主菌是原核宿主细胞，尤其是大肠杆菌(E.coli)。

通常，在KGF-2优选序列的5’端与3’端分别加起始密码子和终止密码子，并引入特异性酶切位点，然后克隆入含IPTG诱导的启动子的表达质粒中，转化与表达载体相容的大肠杆菌宿主菌，经筛选鉴定后获得工程菌。本发明的工程菌属于IPTG诱导型。

在本发明中，工程菌表达rhKGF-2的发酵条件没有特别限制。可以采用本领域常规的发酵条件。通常，工程菌在以蛋白胨、酵母粉、NH₄Cl或(NH₄)₂SO₄等为氮源，甘油、葡萄糖、乳糖等为碳源，维生素B1作为补充维生素的基础培养基中，摇瓶内或发酵罐中进行培养、表达。

此外，通过控制添加各营养成分，控制培养、诱导阶段溶氧(DO)、pH、温度、时间、菌密度、比生长速率等因素，可以进一步提高表达量。

对于培养基的选择，通常包括氮源、碳源、无机盐、维生素、微量元素等的选择。

(a)氮源含有机氮源和无机氮源，其中有机氮源如蛋白胨、酵母粉，或二者的混合物，总浓度0.1-3％；无机氮源如氨水或NH₄Cl、(NH₄)₂SO₄等铵盐，浓度0-1.5％。

(b)无机盐包括磷酸盐、枸盐酸盐、Mg²⁺盐等。较佳地，磷酸盐缓冲体系浓度20-200mM，pH5-8；Mg²⁺盐0-5mM。

(c)在培养基中添加维生素B1作为补充维生素，浓度1～1000PPM。

(d)根据M₉培养基中的微量元素配方，微量元素可加0.1-2ml/L培液。

(e)碳源包括甘油、葡萄糖、乳糖等。可以是单一碳源，也可以是混合碳源。较佳地，碳源选自下组：甘油浓度为0.1-5％；乳糖浓度为0.1-3％；葡萄糖浓度为0.1-5％。

对于诱导剂而言，可以单独使用IPTG做诱导剂；对于诱导温度而言，诱导温度30-40℃，较佳地34-38℃，更佳地约37℃。

对于溶氧(DO)的控制而言，通常培养阶段在30％以上，诱导阶段在50％以上。

在发酵表达rhKGF-2后，对表达的rhKGF-2进行常规分离。

通常，发酵样品先以离心、过滤等方式去除发酵液上清，获得菌体。缓冲溶液悬浮菌体后，以超声波破碎、高压机械破碎等方式进行完全破菌，获得破菌液。然后对破菌液进行离心以去除菌体碎片，获得破菌液上清液。破菌液上清含目的蛋白质rhKGF-2。破菌液上清可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。

适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

(a)亲和层析：

选择肝素亲和凝胶介质，盐梯度或肝素梯度洗脱。

(b)阴离子层析。

经过2-3步纯化，可得到rhKGF-2纯品，纯化得率40％以上，纯度95％以上。在本发明中，通过hKGF-2编码序列的优化，可将hKGF-2表达量从200mg/升提高到800～1000mg/升。

纯化后rhKGF-2可用常规技术制成各种剂型。

在本发明的一个实例中，选择了有助于真核基因在原核细胞中正确翻译的质粒载体：含IPTG诱导的启动子的表达载体，且在所述表达载体中插入了rhKGF-2的编码序列，构建高效、稳定表达的rhKGF-2工程菌(大肠杆菌)。经高密度发酵培养，IPTG诱导，rhKGF-2以可溶形式存在于胞内及胞间质；表达水平高，占菌体总蛋白50％左右，rhKGF-2表达量达800～1000mg/L发酵液。由于表达水平较高，rhKGF-2又具有天然活性，避免了复杂的复性过程，通过简便、快速的二步纯化方法，即获得高质量的rhKGF-2纯品，每升发酵液可得rhKGF-2纯品300mg，产品纯度95％以上。

纯化后原液加入适当辅料，制成rhKGF-2的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明，该粉针剂稳定。

中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液可获得rhKGF-2纯品约300mg或更多，因此适合产业化生产。

本发明的优点在于：

(1)表达工艺简单。

(2)表达量高。通过控制关键的发酵工艺条件，使表达水平达到800mg/L。

(3)纯化工艺简便，回收率高。由于蛋白是以可溶形式表达，因此简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使大规模生产rhKGF-2成为可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

rhKGF-2表达工程菌的构建

1.目的基因的合成

根据已知的hKGF-2的天然氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变氨基酸序列的条件下，设计hKGF-2的编码序列(如SEQ ID NO：1所示)。委托上海生工生物工程技术有限公司合成所设计的hKGF-2优化序列。

人工合成重组人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)基因的全序列时，在该基因的5’端引入NdeI位点及在3’端引入Sal I位点。

2.表达质粒-pET30a(+)/rhKGF-2的构建与转化宿主菌

表达质粒为购自invitrogen公司的pET30a(+)表达载体(该表达载体含有IPTG诱导的启动子)，宿主菌为常规的大肠杆菌BL21(DE3)。

参见图2。用NdeI和SalI双酶切分别处理基因rhKGF-2和表达载体pET30a(+)，37℃酶切3小时回收相应的片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。连接产物转化进入大肠杆菌，在含有卡那霉素(100μg/mL)的LB平板上挑选阳性克隆并进行质粒酶切鉴定：抽提的质粒DNA用限制性内切酶PstI及NdeI+SalI在37℃反应3小时，得到在pET30a(+)中插入了rhKGF-2基因的重组质粒pET30a(+)/rhKGF-2。

利用PstI进行酶切鉴定。PstI酶切位点存在于KGF-2基因内部，而载体上没有该位点。如果Nde I+SalI双酶切时，能切出大小约500bp的片段，就表明序列已正确插入载体pET30a(+)中。

酶切鉴定结果如图3所示。结果显示：采用Pst I单酶切后(泳道3)，质粒呈线性化状态，大小在接近6000bp的位置；另经过Nde I+SalI双酶切后(泳道4)，能从电泳上看到大小约500bp左右的片段，以上情况说明KGF-2基因已正确插入载体pET30a(+)中。

此外，用常规方法进行正、逆向序列分析，证实克隆序列与设计序列完全一致。

摇瓶试验，该工程菌培养后，经IPTG诱导2小时后，目的蛋白表达量占总蛋白30％左右。

实施例2

合适表达载体的选择

按照实施例1类似的方法，将SEQ ID NO：1分别插入几个不同的表达载体，如pTrc/HisA(购自invitrogen公司)、pBAD/HisA(购自invitrogen公司)、pSE380(购自invitrogen公司)的相同酶切位点(NdeI/SalI)，获得质粒pTrc/HisA/rhKGF-2、pBAD/HisA/rhKGF-2，pSE380/rhKGF-2。

将质粒pTrc/HisA/rhKGF-2、pBAD/HisA/rhKGF-2，pSE380/rhKGF-2分别转化相应的宿主菌，挑选出抗性菌株。与含质粒pET30a(+)/rhKGF-2的工程菌一起进行摇瓶试验，经IPTG(或阿拉伯糖)诱导2小时后，含质粒pET30a(+)/rhKGF-2的工程菌表达的目的蛋白表达量占总蛋白30％左右，而含质粒pTrc/HisA/rhKGF-2、pBAD/HisA/rhKGF-2，pSE380/rhKGF-2的工程菌表达的目的蛋白表达量分别占总蛋白15％，18％和20％。

这表明，pET30a(+)/rhKGF-2表达载体优于其他表达载体。

实施例3

选择最佳培养基

挑实施例1中制备的转入pET30a(+)/rhKGF-2的大肠杆菌BL21(DE3)(以下简称为“工程菌”)单克隆，接种到LB一级种子液中，培养17-20hr；按1:30的比例二级接种于250ml LB的1L三角烧瓶中，培养2～3hr左右，待OD₆₀₀达到0.5～1即上罐发酵(M9培养基、改良M9-2培养基、或改良M9-4培养基)，pH6.8～7.2、温度37℃、DO>50％，待OD₆₀₀达到3～4加入1mM的IPTG开始诱导，待pH上升(碳源耗尽)后以合适转度流加10％的碳源(葡萄糖)及氮源补料维持pH在6.8～7.2，诱导3hr结束。样品进行SDS-PAGE检测(并扫描)、测定蛋白含量。

蛋白含量测定结果如图4所示。结果表明，M9和M9-4培养基都可用于表达hKGF-2，而M9-4培养基优于M9。

另外，用M9-2培养基培养基也可获得较高的蛋白含量。

培养基配方

实施例4

工程菌高密度发酵的研究

挑工程菌单克隆，接种到高密度改良M9培养基种子液中，过夜培养，OD₆₀₀达到1～4即上罐发酵(高密度改良M9培养基)，控制pH7.0、温度37℃、DO>50％，大约3～4hr后开始流加补料，待OD₆₀₀达到10左右加入1mM的IPTG开始诱导，每1hr留样，诱导3hr结束。样品检测SDS-PAGE(并扫描)、测定蛋白含量。

蛋白含量结果见图5。结果表明，运用高密度发酵工艺对KGF-2的产量进行优化，结果证明是非常成功的，在表达水平基本未下降的基础上(30％左右)，由于大大提高了菌密度，使每升培液的湿菌重进一步达到25g以上，目的蛋白表达量提高到800～1000mg/L培液，大大提高了hKGF-2的生产效率。

实施例5

rhKGF-2的纯化

发酵液4℃下5000rpm离心10min，得菌体，菌体高压破菌，8000rpm离心30min，得上清。超滤浓缩及更换缓冲液：使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为10KD，超滤时留取浓缩液(作用是去除小分子杂质和盐类)。发酵液上清超滤至体积剩下500ml左右，加入PBS(PH7.4，20mM)，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水平和PBS(PH7.4，20mM)缓冲液的电导水平接近。

1.层析1(亲和层析)：

层析介质：肝素

缓冲液：溶液A：PBS(PH7.4，20mM)

溶液B：PBS(PH7.4，20mM)+1M NaCl

上样：将超滤浓缩的rhKGF-2溶液上样。

清洗：上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。

收集：收集rhKGF-2样品峰。

2.层析2(阴离子层析)

层析介质：Q Sepharose FF

缓冲液：溶液A：PBS(PH7.4，20mM)

溶液B：PBS(PH7.4，20mM)+1M NaCl

上样：将rhKGF-2溶液上样。

清洗：上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。

收集：收集rhKGF-2样品峰。

样品经过此二步纯化，即亲和层析、阴离子层析以后，纯度提高至95％以上。

用常规的MTT显色法测定hKGF-2对常规的NIH3T3细胞(小鼠成纤维细胞)的促进增生作用。结果表明，纯化后的hKGF-2具有促进NIH3T3细胞的促进增生作用，且活性与市售的hKGF-2相同。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海新生源医药研究有限公司

<120>一种重组人角质细胞生长因子-2的生产方法

<130>054737

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>510

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(510)

<223>优化的人角质细胞生长因子-2(rhKGF-2)编码序列

<400>1

<210>2

<211>170

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Claims

1.一种编码人角质细胞生长因子-2的DNA序列，其特征在于，其DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA序列。

3.如权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体是pET30a(+)/rhKGF-2，所述表达载体是在pET30a(+)中插入了SEQ ID NO：1所示序列而形成的，其中插入位置是NdeI酶切位点和SalI酶切位点之间。

4.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求2所述的表达载体或权利要求1所述的编码人角质细胞生长因子-2的DNA序列。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌。

6.一种生产人角质细胞生长因子-2的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)在适合表达人角质细胞生长因子-2的条件下，用发酵罐培养权利要求4所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出人角质细胞生长因子-2。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞含有表达载体，所述表达载体是pET30a(+)/rhKGF-2，该表达载体是在pET30a(+)中插入了SEQIDNO：1所示序列而形成的，其中插入位置是NdeI酶切位点和SalI酶切位点之间；或者所述的宿主细胞是大肠杆菌。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中进行高密度发酵。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)包括步骤：

(i)破碎发酵菌体，离心获得破菌上清液；

(ii)通过盐析和/或超滤对破菌液上清液进行初步纯化；

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的培养条件是：培养温度为30-40℃；pH在6～8之间；葡萄糖或甘油浓度为0.1～5％；诱导剂为1mM IPTG，诱导前OD₆₀₀在0.5～20之间；诱导时间0.5～10小时。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述的培养条件是：培养温度为34-38℃；pH在6.5～7.5之间；葡萄糖或甘油浓度为0.3～3％；诱导前OD₆₀₀在1～10之间；诱导时间1～5小时。