ES2229250T3 - Procedimiento para el aprovechamiento del sistema promotor de pa-adh en una levadura para la produccion por via biiotecnologica de proteinas heterologas en altos rendimientos. - Google Patents
Procedimiento para el aprovechamiento del sistema promotor de pa-adh en una levadura para la produccion por via biiotecnologica de proteinas heterologas en altos rendimientos.Info
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Abstract
LA INVENCION TRATA DE UN NUEVO PROCEDIMIENTO PARA LA UTILIZACION DEL SISTEMA PROMOTOR ADH-II DE LA LEVADURA PARA LA PRODUCCION DE PROTEINAS HETEROLOGAS CON ELEVADO RENDIMIENTO, P. E. PARA LA OBTENCION DE HIRUDINAS, MINIPROINSULINAS, LEPTINAS O SUS DERIVADOS.
Description
Procedimiento para el aprovechamiento del sistema
promotor de p\alpha-ADH II en una levadura para
la producción por vía biotecnológica de proteínas heterólogas en
altos rendimientos.
El invento se refiere a un nuevo procedimiento
para el aprovechamiento del sistema promotor de
p\alpha-ADH II en levadura para la producción por
vía biotecnológica de hirudina, de derivados de hirudina o de
proteínas de fusión, que contienen hirudina o un derivado de
hirudina.
En el caso del polipéptido hirudina, aislado
originalmente a partir de la sanguijuela Hirudo medicinalis,
se trata de un agente inhibidor de trombina muy específico,. con un
amplio potencial terapéutico (F. Markwardt, Biomed. Biochim. Acta
44 (1985) 1007-1013). Las cantidades necesarias se
pueden preparar, sin embargo, solamente por la vía de tecnología
genética a través de microorganismos transformados. En tal caso, se
ha mostrado que la levadura Saccharomyces cerevisiae es
apropiada como organismo anfitrión (hospedante), para producir una
hirudina correctamente plegada y plenamente activa (documentos de
solicitudes de patentes europeas EP A1 168.342 y EP A1
200.655).
Por el nombre de hirudina han de entenderse
agentes inhibidores de trombina a modo de péptidos con una
actividad específica de por lo menos 10.000 U-AT/mg
(unidades de anti-trombina / mg), que se derivan de
las conocidas isohirudinas de la especie Hirudo medicinalis,
y presentan unas características estructurales esenciales de éstas,
en particular la unión característica de los tres puentes de
disulfuro (J. Dodt y colaboradores, Biol. Chem.
Hoppe-Seyler 366 (1985) 379-385),
(compárense p.ej. los documentos EP A1 158.564, EP A1 168.342, el
de patente alemana DE 34.45.517, y los EP A2 193.175, EP A1 200.655,
EP A1 158.986, EP A1 209.061, DE 33.42.199 y EP A1 171.024).
En particular, se entiende por este nombre una
hirudina, tal como se describe en los documentos EP A1 171.024, EP
A1 158.986 y EP A1 209.061.
El gen para la isoenzima II deshidrogenasa de
alcohol (ADH II) es regulado estrictamente en células de una
levadura. El producto génico de ADH II no se descubre 1 cuando al
medio de fermentación se le han añadido fuentes de carbono
fermentables, tales como p.ej. glucosa.
Las condiciones de inducción para el promotor de
ADH II se pueden conseguir también en procesos discontinuos (batch
= por cargas) aerobios sencillos en matraces sometidos a
sacudimiento o en fermentadores, que se ponen en marcha p.ej. con
una concentración de glucosa de 4%. En primer lugar, en el caso de
un crecimiento sobre glucosa, debido al denominado efecto de
Crabtree, con ayuda de la enzima ADH I, se forma etanol, que a su
vez después de un consumo total de la glucosa sirve como fuente de
C adicional. Después de una descomposición de la glucosa, se
induce la enzima ADH II que descompone al etanol, y comienza la
expresión de hirudina.
Tales fermentaciones discontinuas no aportan por
regla general el alto rendimiento de espacio / tiempo que se
pretende para aplicaciones industriales. Se desea la separación de
la fermentación en una fase de crecimiento y una fase de producción,
tal como se consigue p.ej. en fermentaciones clásicas de
antibióticos mediante un modo de funcionamiento de alimentación
discontinua (fed-batch = alimentación por cargas)
limitada en el que, después de haberse establecido una determinada
densidad celular, se alimenta posteriormente, limitando el
crecimiento, una fuente de C, con el fin de formar con alto
rendimiento el producto (p.ej. el metabolito secundario penicilina)
en condiciones fisiológicas óptimas (Hersbach y colaboradores: The
Penicillins: Properties, Biosynthesis and Fermentation, in:
Biotechnology of Industrial Antibiotics [Las penicilinas:
propiedades, biosíntesis y fermentación en: Biotecnología de
Antibióticos Industriales], páginas 45-140,
coordinador de edición E.J. Vandamme, Marcel Dekker, Nueva York,
1984).
A causa de la regulación del sistema promotor de
ADH II, éste se aprovecha para la preparación por vía
biotecnológica de proteínas recombinantes en la levadura de
panadero Saccharomyces cerevisiae (Price y colaboradores:
Methods in Enzimology [Métodos en enzimología], volumen 185,
308-318, 1990). La fermentación se basa en este
caso, debido al crecimiento de las células en levadura, en la
eliminación natural de glucosa como fuente de C. En el caso de una
ausencia de glucosa, se conecta e inicia la formación de producto y
se prosigue hasta el final de la fermentación. No obstante, el
rendimiento de producto parece quedar por detrás de lo
esperado.
T\phittrup y colaboradores (Biotechnol.
Bioeng., 35, 339-348, 1990) describen una
realización modificada de la fermentación para la producción
intracelular de una proteína de fusión con insulina humana, que
implica una alimentación de glucosa con una subsiguiente
alimentación de etanol para realizar la óptima inducción del
sistema. Se consiguió por ellos, en comparación con un proceso
discontinuo, casi una duplicación del rendimiento del producto
referido al volumen, mediante una alimentación continua de glucosa
con caudal constante durante todo el período de tiempo de
fermentación. Finalmente, una duplicación adicional se consiguió
mediante el recurso de que a partir de un determinado momento, la
alimentación de glucosa se reemplazó por una alimentación de igual
tipo de etanol. A partir de este resultado, se sacó la conclusión
de que, incluso en el caso de un defecto de glucosa en el caldo de
cultivo, o bien de muy bajas concentraciones de glucosa. de < 20
mg/l, el promotor híbrido todavía es reprimido parcialmente por
glucosa o por un metabolito de la glicolisis. Tan sólo mediante una
adición de etanol se consigue entonces una inducción completa.
Si el sistema de expresión, descrito en el
artículo de Price y colaboradores, se aprovecha para la preparación
del producto génico hirudina, mencionado en el documento de
patente europea 0.324.712 B1 (véase el Ejemplo 1), los autores del
invento hemos comprobado con sorpresa que el rendimiento específico
de producto, referido a la biomasa, disminuye de un modo continuo o
discontinuo, mediante la adición de etanol, puesto que se puede
observar un crecimiento celular aumentado con un título de producto
de igual magnitud.
La adición directa de etanol ha sido investigada
a la escala de laboratorio. El aumento adicional de concentración
de una tanda discontinua con etanol, durante el crecimiento sobre
etanol, ha aumentado ciertamente la cantidad de biomasa pero, en
comparación con la tanda sin aumento de concentración, no ha
conducido a una concentración aumentada de producto.
Las tandas de laboratorio, que se habían llevado
a cabo exclusivamente con etanol como fuente de C, no aportaron,
dentro del marco de la exactitud de medición, tampoco ningún
rendimiento específico más alto (referido a la densidad óptica o
bien a la biomasa) que una tanda comparativa con glucosa (véase
también el Ejemplo 2). A partir de esto se puede sacar la
conclusión de que el etanol a solas no es ningún inductor de la ADH
II.
Asimismo, el intento de producir un crecimiento
desreprimido mediante una alimentación de glucosa regulada, apoyada
en un modelo, (regulación posterior, es decir aumento, del régimen
de alimentación de un modo correspondiente a la densidad celular
creciente) y evitar una formación de etanol como consecuencia del
efecto de Crabtree, para a continuación, en la 2ª etapa, mediante
una adición pulsante de glucosa con subsiguiente formación de
etanol como consecuencia del efecto de Crabtree, inducir más
intensamente la expresión, no aportó ningún rendimiento aumentado
de producto.
Sorprendentemente, se encontró por fin un modo de
fermentación sencillo, autorregulable, y sobre todo realizable a
gran escala técnica, para el aprovechamiento del sistema promotor
de ADH II en una levadura con el fin de efectuar la producción por
vía biotecnológica de proteínas heterólogas en altos rendimientos.
Este procedimiento comprende la adición dosificada continua de
glucosa como fuente de carbono a una tanda de fermentación (cultivo
principal), en la que inicialmente no estaba presente nada de
glucosa. En el transcurso de la cultivación, se recorrieron
diferentes fases, de tal manera que se llegase a una óptima
inducción o bien formación de producto. Una inducción de este tipo
de la expresión génica heteróloga en una levadura, mediando
utilización del sistema promotor de ADH II, es muy sorprendente a
la luz del estado de la técnica, p.ej. de la cita bibliográfica de
Price y colaboradores ya mencionada, puesto que, de acuerdo con
Price y colaboradores, tan sólo después de un fuerte agotamiento de
la glucosa se desreprime el promotor de ADH II.
Nosotros pudimos conseguir en nuestro sistema
óptimos rendimientos de producto con una alta productividad
específica, cuando directamente después de la inoculación del
cultivo principal se alimenta de manera continua con caudal
constante una pequeña cantidad de glucosa. El aumento de volumen
del cultivo, condicionado por la alimentación, puede conducir en
este caso a una disminución de hasta 25% del caudal real de
alimentación de glucosa al final del período de tiempo de
cultivación. En primer término, la glucosa está presente en exceso
para la baja población celular, es decir que en el caso de un
crecimiento reprimido se forma etanol como consecuencia del efecto
de Crabtree. A partir de un determinado momento, la densidad
celular es tan alta que ya no resulta suficiente la glucosa como
única fuente de carbono, y aparece un crecimiento mixto sobre
glucosa y etanol. Tan sólo cuando entonces se ha consumido asimismo
el etanol formado de manera primaria, y mediante la glucosa se
limita un crecimiento adicional (desreprimido), se conecta el
promotor de ADH II y comienza la formación del producto. En
comparación con el proceso discontinuo, de esta manera se puede por
ejemplo triplicar el rendimiento de producto.
Es objeto del invento, por consiguiente, un
procedimiento para la fermentación por vía biotecnológica de
proteínas heterólogas en una levadura, en el que un cultivo
principal se inocula con un cultivo preliminar de una cepa de
levadura, que puede expresar la proteína heteróloga, inmediatamente
después de la inoculación se aporta en régimen continuo con caudal
constante una pequeña cantidad de glucosa, p.ej. de
0,7-1,4, de modo preferido de
0,9-1,3, y de modo muy especialmente preferido 1,1 g
de glucosa / l de volumen de cultivo / h, mientras que la
fermentación total asegura unas condiciones aerobias de cultivo, no
dejándose disminuir la presión parcial de oxígeno por debajo de un
20% de la saturación, terminándose la fermentación después de 2
días, y finalmente aislándose la proteína heteróloga a partir de la
tanda de fermentación.
Un objeto adicional del invento es un
procedimiento de acuerdo con el descrito en el párrafo precedente,
en el que los medios de los cultivos preliminar y principal son
equivalentes, excepto por una adición de 1% de glucosa en el medio
de cultivo preliminar, que preferiblemente se ha consumido
prácticamente de modo total al inocular el cultivo principal, y
contienen uno o varios constituyentes complejos, tales como p.ej.
un líquido de maceración de maíz (cornsteep), harina de soja o un
extracto de levadura. La expresión "consumido de modo
prácticamente total" significa en este caso una concentración de
glucosa < 100 mg/l.
Las cepas de levaduras, utilizadas en los
procedimientos mencionados, pueden ser Saccharomyces
cerevisiae, preferiblemente Y79 (véase el documento EP
0.324.712), o también cepas de Kluyveromyces lactis.
La proteína heteróloga, que se puede preparar de
acuerdo con el procedimiento, puede ser una hirudina, un derivado
de hirudina, o bien una hirudina o un derivado de hirudina que
contiene una proteína de fusión. El término "derivados"
significa en este caso, entre otros, fragmentos funcionales, es
decir biológicamente activos, de las proteínas de partida, o
mutantes con nuevas propiedades biológicas, particularmente
ventajosas.
El vector p\alpha ADH II (véase la Figura 2A
del artículo de Price y colaboradores) contiene, de modo vecino al
sitio de corte con la enzima de restricción Spe 1 en dirección al
extremo 3' del ADNc (ADN cromosomal), un sitio de reconocimiento
para la enzima Nco 1, que es singular para el plásmido.
Si, entonces, el ADN del vector descrito se hace
reaccionar con Kpn 1 y Nco 1, entonces se obtienen dos fragmentos
de ADN, que son separados uno de otro por electroforesis en gel.
El mayor de los dos fragmentos se aísla y se hace reaccionar, en
una reacción con la ligasa de T4, con un fragmento de hirudina de
Kpn 1 / Nco 1, que se obtiene a partir del plásmido p\alphaf
Hirl7 (documento EP 0.324.712 B1) por digestión parcial con la
enzima Kpn 1 y digestión total con la enzima Nco 1.
Células de E. coli K12 competentes,
obtenibles comercialmente, de la cepa HB101 se transforman con la
mezcla de ligación, y la tanda de transformación se siembra sobre
placas de Na-agar, que contienen 25 mg/1 de
ampicilina. Las placas se incuban a 37ºC durante una noche y a la
mañana siguiente se entresacan colonias individuales desde las
placas y se utilizan para la cultivación de sistemas de cultivo
durante una noche. A partir de las células de los cultivos se aísla
en cada caso un ADN de plásmido, y se comprueba mediante un
análisis por restricción. Un ADN de plásmido correcto, que contiene
el gen de hirudina incorporado tal como se desea, es utilizado
para la transformación de la cepa Y79 de Saccharomyces
cerevisiae, tal como se ha descrito en el documento EP
0.324.712 B1.
De esta manera, se obtiene el sistema de
expresión, que se ha usado para el descrito desarrollo del
procedimiento.
En un fermentador de laboratorio, en unas
condiciones por lo demás iguales, se investigan diferentes fuentes
de carbono (fuentes de C). El medio de las etapas preliminar y
principal se compone de la siguiente manera:
1% de un extracto de levadura
2% de peptona
- fuente de C (en cada caso la misma cantidad referida al contenido de C)
80 mg/l de adenina
80 mg/l de uracilo
pH = 5,0
El cultivo principal se inocula con 2% de un
inóculo y se incuba durante 48 horas.
En lo que se refiere al etanol y a la glucosa
como fuentes de C, se consiguieron los siguientes resultados:
| Fuente de C | Concentración de hirudina [%] | Densidad óptica A_{578nm} [%] |
| Glucosa al 2% | 100 | 100 |
| Etanol al 1,54% | 83 | 71 |
En un fermentador con un volumen total de 3.600 l
se esterilizan, durante 20 minutos a 121ºC, 1.600 l de un medio de
cultivo, que consta de uno o varios constituyentes complejos, tales
como p.ej. un líquido de maceración de maíz, harina de soja, un
extracto de levadura, etc., sin adición de glucosa o de otras
fuentes de C, tales como sacarosa.
Después de haber enfriado, el medio se inocula
con aproximadamente 200 l de un cultivo preliminar que ha crecido
durante aproximadamente 12 horas (densidad óptica A_{540nm} = 3,5
\pm 0,5) que contiene todavía solamente muy pequeñas 5 cantidades
restantes de glucosa. El medio del cultivo preliminar es
equivalente al del cultivo principal, con la excepción de que se
añade 1% de glucosa.
Directamente después de una inoculación de la
etapa principal, se añaden dosificadamente 2 kg de glucosa por hora
en forma de una solución acuosa al 20% con caudal constante hasta
el final de la fermentación, a través de un dispositivo destinado a
la esterilización continua.
Durante la fermentación deben de estar aseguradas
unas condiciones aerobias; ha de respetarse una presión parcial de
oxígeno de pO_{2} \geq 20%.
La fermentación está terminada después de 48
\pm 2 horas y se termina mediante la adición de 0,225 \pm
0,025% de cloruro de benzalconio, p.ej. de 0,45 \pm 0,05% de
®Dodigen 226 (una solución al 50% de una mezcla de cloruros de
alquil-) dimetil-bencil-amonio en
agua).
A continuación, comienza el tratamiento para el
aislamiento de hirudina a partir del caldo de cultivo.
El volumen final (medio + material condensado +
cultivo preliminar + solución de glucosa añadida dosificadamente -
pérdida de agua como consecuencia de la gasificación) es de 2.300
\pm 50 l.
El proceso discontinuo es equivalente al proceso
de alimentación discontinua que se ha descrito en el apartado a),
con las siguientes excepciones:
- -
- El medio contiene antes de la inoculación, junto a los constituyentes complejos, también 4% de glucosa.
- -
- No se efectúa ninguna adición dosificada adicional de glucosa.
- -
- El volumen final es solamente de 1.800 \pm 50 l.
| Procedimiento | Concentración de hirudina [%] | Cantidad de hirudina [%] |
| Proceso discontinuo | 100 | 100 |
| Proceso de alimentación discontinua | 228 | 291 |
Claims (8)
1. Procedimiento para la fermentación por vía
biotecnológica de hirudina, de derivados de hirudina o de proteínas
de fusión que contienen hirudina o un derivado de hirudina, en una
levadura, mediando aprovechamiento de un sistema promotor de
p\alpha-ADH II, caracterizado porque
- a)
- un cultivo principal se inocula con un cultivo preliminar de una cepa de levadura, que puede expresar la hirudina, el derivado de hirudina o una proteína de fusión que contiene hirudina o un derivado de hirudina;
- b)
- inmediatamente después de la inoculación, se aportan de modo continuo con un caudal constante 0,7-1,4 g de glucosa / l de volumen de cultivo / h;
- c)
- se aseguran unas condiciones aerobias de cultivo;
- d)
- se termina la fermentación después de aproximadamente 2 días, y finalmente
- e)
- se aísla desde la tanda de fermentación la hirudina, el derivado de hirudina o una proteína de fusión que contiene hirudina o un derivado de hirudina.
2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, en el que la glucosa se aporta en régimen continuo
inmediatamente después de la inoculación con un caudal constante de
0,9-1,3, o con 1,1 g de glucosa / l de volumen de
cultivo / h.
3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación
1, caracterizado porque los medios de los cultivos
preliminar y principal son equivalentes, excepto por una adición de
1% de glucosa en el estadio del cultivo preliminar.
4. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 ó 3, caracterizado porque la adición de
1% de glucosa en el medio del cultivo preliminar se ha consumido
prácticamente de modo total en el momento de la inoculación.
5. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque las condiciones
aerobias de cultivo se aseguran mediante una presión parcial de
oxígeno de por lo menos 20% de la saturación.
6. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los medios
mencionados contienen uno o varios constituyentes complejos, tales
como p.ej. un líquido de maceración de maíz, harina de soja o un
extracto de levadura.
7. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la mencionada
cepa de levadura es una cepa de Saccharomyces cerivisiae,
preferiblemente la Y79.
8. Procedimiento de acuerdo con una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la mencionada
cepa de levadura es una cepa de Kluyveromyces lactis.
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