KR100429935B1 - 이종단백질을생물공학적으로고수율로생산하기위한효모알콜데하이드로게나제이소엔자임ii(adhii)프로모터시스템의사용방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 예를들어, 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체와 같은 이종(heterologous) 단백질을 생물공학적으로 고수율로 생산하기 위한, 효모 ADH II 프로모터 시스템을 사용하는 신규 방법에 관한 것이다.

Description

이종 단백질을 생물공학적으로 고수율로 생산하기 위한 효모 알콜 데하이드로게나제 이소엔자임 II(ADH II) 프로모터 시스템의 사용방법
본 발명은 이종 단백질을 생물공학적으로 고수율로 생산하기 위한, 효모 알콜 데하이드로게나제 이소엔자임 II(ADH II) 프로모터 시스템을 사용하는 신규 방법에 관한 것이다.
본래에 거머리인 히루도 메디시날리스(Hirudo medicinalis)로부터 추출된 폴리펩타이드 히루딘은 광범위한 치료학적 잠재력을 지닌 매우 특이적인 트롬빈 억제제이다[참조: F.Markwardt, Biomed. Biochim. Acta 44(1985)1007-1013]. 하지만, 형질전환된 미생물을 사용하는 재조합 방법에 의해서만이 수요량을 충족시킬 수 있다. 상기 문헌에서, 정확하게 폴딩(folding)되어 완전한 활성을 나타내는 히루딘을 제조하기 위해서는 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)가 가장 적합한 숙주 유기체인 것으로 밝혀졌다[참조: EP A1 168 342, EP A1 200 655].
히루딘은 10,000ATU/mg(항-트롬빈 단위/mg)이상의 비활성을 가지며 히루도 메디시날리스 종의 공지된 이소히루딘(isohirudin)에서 유도되며 특징적으로 3개의디설피드 브릿지로 결합된 이들 이소히루딘의 필수 구조적 특징을 가지는, 펩타이드형 트롬빈 억제제를 의미하는 것으로 사료된다[참조: J. Dodt et al., Biol. Chem. Hoppe-Seyler 366(1985) 379-385, EP A1 158 564, EP A1 168 342, DE 34 45 517, EP A2 193 175, EP A1 200 655, EP A1 158 986, EP A1 209 061, DE 33 42 199, EP A1 171 024].
특히, 이중에서 히루딘은 EP A1 171 024, EP A1 158 986 및 EP A1 209 061에 기술된 히루딘인 것으로 사료된다.
알콜 데하이드로게나제 이소엔자임 II(ADH II)에 대한 유전자는 효모 세포에서 엄격하게 조절된다. ADH II 유전자의 산물은 글루코스와 같은 발효성 탄소원이 발효 배지에 첨가될 때 발견되지 않는다.
ADH II 프로모터를 유도하기 위한 조건은 4%의 글루코스 농도를 사용하여, 교반 플라스크 또는 발효기내에서 단순한 호기성 배치 방법으로 성취될 수 있다. 글루코스를 사용하여 배양시킬 때, 소위 크랩트리(Crabtree) 효과로 인해 ADH I 효소가 처음에 작용하여 에탄올이 형성되고, 이어서 글루코스가 고갈된 후 즉시, 형성된 에탄올이 추가의 탄소원으로서 사용된다. 글루코스가 고갈된 후 에탄올 분해 효소인 ADH II가 유도되고 히루딘의 발현이 시작된다.
일반적으로, 상기 배치 발효는 산업적 응용에 필요한 대형 공간/시간 수율을 제공하지 못한다. 어느정도의 세포 농도에 도달한 후에 생리학적으로 최적 조건하에서, 고수율로 산물(예: 2차 대사물 페니실린)을 형성시키기위해 성장-제한 방식으로 탄소원이 공급되는 제한된 유가식 방법을 사용하는 통상적인 항생제 발효에서성취되는 바와 같이 발효 과정이 증식 단계 및 생산 단계로 분리될 필요가 있다(참조: Hersbach et al.: The Penicillins: Properties, Biosynthesis and Fermentation, in: Biotechnology of Industrial Antibiotics, pp. 45-140, Ed. E.J. Vandamme, Marcel Dekker, New York, 1984)
조절되는 방법 때문에, 재조합 단백질의 생물공학적 제조를 위해 베이커(baker) 효모인 사카로마이세스 세레비지애내에서 ADH II 프로모터 시스템을 사용한다(참조: Price et al.: Methods of Enzymology, Vol. 185, 308-318, 1990). 상기 문헌에서, 발효는 효모 세포의 증식과는 무관하게 탄소원인 글루코스가 자연적으로 소모됨을 근거로 한 것이다. 글루코스의 부재하에서, 산물 형성이 시작되고 발효 말기까지 계속된다. 하지만 산물 수율은 기대이하인 것으로 나타났다.
퇴트루프(Tøttrup) 등은 문헌(참조: Biotechnol. Bioeng., 35, 339-348, 1990)에서 사람 인슐린 융합 단백질의 세포내 생산을 위한 변형된 발효 방법을 기술하고 있으며 상기 방법은 글루코스를 공급한 다음 시스템의 유도를 최적화하기 위해 에탄올을 공급한다. 이들 연구가는 전체 발효기간동안 일정한 비율로 계속적으로 글루코스를 주입하는 방법을 사용하는 배치 방법과 비교하여 부피에 비례하는 산물 수율을 거의 2배로 증가시키는데 성공하였다. 추가로, 특정 시기에 글루코스 공급을 에탄올 공급으로 대체함으로서 2배로 증가시킬 수 있다. 배양액내에 글루코스가 존재하지 않거나 20mg/l미만의 매우 낮은 농도로 글루코스가 존재하는 경우에도 하이브리드 프로모터가 글루코스 또는 해당과정의 대사산물에 의해 여전히 부분적으로 억제된다는 것을 상기 결과로부터 결론지을 수 있다. 완전한 유도는 에탄올을 첨가함으로써만이 성취된다.
프라이스 등의 문헌에 기술된 발현 시스템이 문헌[참조: 유럽 특허 제0 324 712 B1호]에 언급된 히루딘 유전자 산물을 제조하는데 사용될 경우(실시예 1 참조), 세포 증식의 증가가 동일한 정도로 산물 적정농도와 연관되어 관찰될 수 있기 때문에, 놀랍게도 계속적으로 또는 간헐적으로 에탄올을 첨가함으로써 생물량(biomass)을 기초로하는 특정의 산물 수율이 감소될 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 밝혀졌다
에탄올의 직접적인 첨가가 실험 규모상에서 조사되어왔다. 에탄올상에서 성장하는 동안에 보충없이 배양한 것과 비교하여 배치 배양물에 추가의 에탄올을 보충함으로써 바이오매스가 증가된 반면에 산물 농도가 증가하지는 않은 것으로 나타났다.
유사하게, 에탄올을 유일한 탄소원으로서 사용하여 수행되는 실험실 배양은 측정 정확도의 오차범위내에서 글루코스를 사용하는 배양과 비교하여 보다 높은 특정 수율(광학밀도 또는 생물량을 기초로함)을 제공하지는 않는다(실시예 2 참조). 이로부터, 에탄올이 독자적으로는 ADH II의 유도인자가 아닌 것으로 결론지을 수 있다.
유사하게, 탈억제 성장을 유도하고 모델-원조된 글루코스 공급(세포 밀도가 증가함에 따라 공급 속도를 증가시킴)을 조절하여, 크랩트리 효과로 인한 에탄올 형성을 막으며, 이어서, 2차 단계에서 글루코스를 펄스로 첨가하고 이에 따른 고농도의 에탄올이 형성됨으로써 보다 강력한 발현을 유도하기 위한 시도는 크랩트리효과로 인한 고농도의 에탄올 형성과 함께 산물 수율을 증가시키지 못하였다.
놀랍게도, 본 발명에 의해서 단순하고 자가-조절되며 무엇보다 산업적 규모에서 수행될 수 있는 발효 방법이 고수율의 이종 단백질의 생물공학적 생산용 효모 ADH II 프로모터 시스템을 사용하기 위해 개발되어 왔다. 상기 방법은 배양 초기에 글루코스가 존재하지 않는 발효 배지내로 탄소원으로서 글루코스를 계량하여 계속적으로 첨가하는 것을 포함한다. 배양동안에, 최적 유도 및 산물 형성이 성취될 수 있도록 여러 단계를 거친다. 예를들어, 이미 인용된 프라이스의 문헌의 기술분야에 따라 ADH II 프로모터 시스템을 사용하는 효모내의 이종 유전자 발현의 유도는, 글루코스가 상당히 고갈된 후에만이 ADH II 프로모터가 탈억제된다는 프라이스의 지적으로 인하여 매우 주목할만 하다.
본 발명의 시스템에서, 본 배양물에 접종한 후 소량의 글루코스를 직접 일정한 비율로 계속적으로 주입하는 경우에, 높은 비생산성과 관련된 최적의 산물 수율을 성취할 수 있다. 상기 경우에서, 배양액 주입으로 인한 배양물 부피의 증가는 배양이 종료되는 시간까지 실질적인 글루코스 주입률의 25%이하로 저하시킬 수 있다. 처음에, 글루코스는 낮은 세포 증식(즉, 증식이 억제됨)에 비해 과량으로 존재하고 에탄올이 크랩트리 효과의 결과로서 형성된다. 특정 시간에, 세포농도가 증가되어 글루코스가 더 이상 유일한 탄소원으로서 충족될 수 없으며 글루코스 및 에탄올상에서의 혼합 증식을 하게된다. 또한 주로 형성된 에탄올이 소비되고 추가의(억제된) 증식(탈억제)이 글루코스에 의해 제한되는 경우에 만이 ADH II 프로모터가작동하여 산물 형성이 시작된다. 상기 방법으로, 산물 수율은 대략적으로 배치 방법과 비교하여 3배로 증가된다.
결과적으로 본 발명은 이종 단백질을 발현시킬 수 있는 효모 균주의 전배양물을 사용하여 본배양물에 접종하고 접종한 후 즉시, 소량의 글루코스, 예를들어, 시간당 배양부피 ℓ당 0.7 내지 1.4, 바람직하게, 0.9 내지 1.3, 및 매우 특히 바람직하게 1.1g의 글루코스를 일정한 속도로 계속적으로 공급하며, 산소의 분압이 포화농도의 20%이하로 저하되지 않도록 전체 발효기간동안 호기성 배양 조건이 유지되도록 하고 2일후에 발효를 종료하고 최종적으로 이종 단백질을 발효된 배양물에서 분리함을 포함하는, 효모내의 이종 단백질의 생물 공학적 발효 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 이전에 기술한 방법에 관한 것으로서, 전배양과 본배양의 배지가, 1%의 글루코스가 전배양 배지에 첨가되어 있는 것을 제외하고는 동일하고 바람직하게 첨가물은 본배양물에 접종시 거의 완전히 소비되어 첨가물이 존재하지 않으며 배지는 하나 이상의 복합 성분(예: 옥수수 시럽, 대두 밀 또는 효모 추출물)을 포함한다. 상기 문헌에서, 거의 완전히 소비된다는 것은 글루코스 농도가 100mg/l미만임을 의미한다.
상기 방법에서 사용되는 효모 균주는 사카로마이세스 세레비지애, 바람직하게 Y79(EP 0 324 712 참조)일 수 있거나 이외에 크루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 균주일 수 있다.
예를들어, 상기 방법에 따라 제조될 수 있는 이종 단백질은 히루딘, 미니프로인슐린(참조: EP 0 347 781), 렙틴[문헌(참조: Zhang et al., Nature 372:425-32, 1994)에 기술된 비만 유전자 산물] 또는 이전에 언급한 단백질의 유도체 또는 이전에 언급한 단백질 및/또는 유도체를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 상기 문헌에서, 유도체란 용어는 특히, 기능적인 즉, 생물학적으로 활성인, 특히, 유리한 생물학적 성질을 가진 출발 단백질 또는 돌연변이 처리 신규물질의 단편을 의미한다.
실시예 1: 효모내에서 히루딘의 재조합 생산용 발현 벡터의 제조
벡터 pαADH 2(프라이스의 문헌에서의 도2A 참조)는 cDNA의 3'말단의 Spe I 제한 효소 절단 부위에 인접한 부위와 플라스미드의 유일한 효소 Nco I의 인식 부위를 포함한다.
상기 기술한 벡터의 DNA를 Kpn I과 Nco I와 반응시키는 경우에 2개의 DNA 단편이 수득되고 이것은 젤 전기영동에 의해 서로 분리된다. 2개의 단편중 보다 큰 단편을 분리하고 T4 리가제 반응물 속에서 효소 Kpn I를 사용한 부분적인 분해 및 효소 Nco I를 사용한 완전한 분해에 의해 플라스미드 Pαf Hir17(EP 0 324 712 B1)으로부터 분리되는 Kpn I/Nco I 히루딘 단편과 반응시킨다.
시판되는 컴피턴트(competent) 이.콜라이 K12세포의 균주 HB101를 연결 혼합물로 형질전환시키고 형질전환 배양물을 25mg/ℓ의 앰피실린을 포함하는 Na 한천 플레이트상에 도말한다. 플레이트를 하루밤동안 37℃에서 배양시키고 다음날 아침에, 각각의 콜로니를 평판 배지에서 분리하고 하루밤동안 배양하는데 사용한다. 각각의 경우에, 플라스미드 DNA를 배양물의 세포에서 분리하고 제한 분석법을 사용하여 조사한다. 바람직한 방식으로 삽입된 히루딘 유전자를 포함하는 정확한 플라스미드 DNA를 사용하여 문헌[참조: EP 0 324 712 B1]에 기술된 바와 같이 사카로마이세스 세레비지애 균주 Y79를 형질전환시킨다.
이것은 기술된 방법을 개발시키는데 사용되어온 발현 시스템을 제공한다.
실시예 2: 상이한 탄소원을 사용한 효모 내에서의 히루딘 재조합 제조를 위한 실험실 배양의 비교
서로 상이한 탄소원은 별도의 동일한 조건하에서 실험실 발효기내에서 조사된다. 전배양 및 본배양 단계를 위한 배지의 조성은 다음과 같다:
1% 효모 추출물
2% 펩톤
탄소원(각각의 경우에, 탄소함유량을 기준으로 동일량)
80mg/ℓ 아데닌
80mg/ℓ 우라실
pH = 5.0
본배양물을 2%의 접종물로 접종하고 48시간동안 배양한다.
하기의 결과는 에탄올 및 글루코스를 탄소원으로서 사용하는 경우 수득된다.
실시예 3: 글루코스 주입 또는 주입없이 발효시킴에 의한 효모내에서의 히루딘의 재조합 제조의 비교
a) 글루코스를 주입하는 발효(유가식 방법)
글루코스 또는 다른 탄소원(예: 슈크로스)을 첨가하지 않고, 하나이상의 복합 성분(예: 옥수수, 콩밀, 효모 추출물)을 포함하는 1600ℓ의 배양배지를 총 3600ℓ의 부피를 가지는 발효기내에서 20분동안 121℃에서 살균시킨다.
이를 냉각한 후에, 약 12시간(흡광도 A540nm=3.5 ±0.5)동안 배양시키고 매우 저농도의 글루코스 잔량을 포함하는 전배양물의 200ℓ를 배지에 접종한다. 전배양물의 배지는 1% 글루코스가 첨가된다는 것을 제외하고는 본배양물의 성분과 동일하다.
본배양 단계에서 접종한 후 즉시, 20% 수용액 형태로 발효를 종료할 때까지 일정한 비율로 연속살균용 장치를 통하여 시간당 2kg의 글루코스를 계량하여 첨가한다.
발효동안에 통기 조건을 보장해야만한다: 산소의 분압이 20%이상으로 유지되어야만 한다.
48±2시간후에 0.225 ±0.025%의 벤잘코늄 클로라이드[예: 0.45 ±0.05%?Dodigen 226(물중의 알킬디메틸벤질암모늄 클로라이드의 혼합물의 50% 용액)]을 첨가함으로써 발효를 완결 및 종료한다.
배양액에서 히루딘을 분리하여 후처리를 시작한다.
최종 부피[배지 + 농축물 + 전배양물 + 계량된 글루코스 용액 - 기화로 인해 손실된 물]는 2300 ±50ℓ이다.
b) 배치 방법
배치 방법은 하기에 기술된 것을 제외하고는 a)에서 기술한 유가식 방법과 동일하다:
- 접종하기 전에 배지는 복합 성분 뿐만아니라 4%의 글루코스를 포함한다.
-추가로 글루코스를 계량하여 첨가하지 않는다.
-최종 부피는 약 1800 ±50ℓ이다.
c) 결과의 비교
효모내에서 ADH II 프로모터 시스템을 사용함으로써 유전자 재조합 기술에 의해 발현되는 이종 단백질(예: 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체)의 생산 수율을 증가시킬 수 있다.

Claims (26)

  1. (a) 이종 단백질을 발현할 수 있는 효모 균주의 전배양물을 본배양물에 접종하는 단계;
    (b) 접종 후 즉시, 시간당 배양물 용적 ℓ당 글루코스 0.7 내지 1.4g을 일정한 속도로 지속적으로 공급하는 단계;
    (c) 호기성 배양조건을 확실히 유지하는 단계;
    (d) 대략 2일 후에, 발효를 종결시키는 단계; 및
    (e) 이종 단백질을 발효 배양물로부터 분리하는 단계를 포함하는, 알콜 데하이드로게나제 이소엔자임 II(ADH Ⅱ) 프로모터 시스템을 사용하여 효모에서 이종 단백질을 생물공학적으로 발효생산하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 전배양 배지에 1% 글루코스가 첨가되어 있는 것을 제외하고는 전배양 배지와 본배양 배지가 동일한 배지인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 전배양 배지에 첨가시킨 1% 글루코스가 접종시 거의 완전히 소모되는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 호기성 배양 조건이 포화도 20% 이상의 산소 분압으로 유지되는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 배지가, 옥수수 시럽, 대두 밀 또는 효모 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 복합 성분을 함유하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 효모 균주가 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)균주인 방법.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 효모 균주가 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis) 균주인 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이종 단백질이 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 이종 단백질이 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체의 아미노산 서열을 함유하는 융합 단백질인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 단계(b)에서 시간당 배양물 용적 ℓ당 글루코스 0.9 내지 1.3g이 일정한 속도로 지속적으로 공급되는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계(b)에서 시간당 배양물 용적 ℓ당 글루코스 1.1g이 일정한 속도로 지속적으로 공급되는 방법.
  12. 제3항에 있어서, 호기성 배양 조건이 포화도 20% 이상의 산소 분압으로 유지되는 방법.
  13. 제3항에 있어서, 배지가, 옥수수 시럽, 대두 밀 또는 효모 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 복합 성분을 함유하는 방법.
  14. 제4항에 있어서, 배지가, 옥수수 시럽, 대두 밀 또는 효로 추출물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 복합 성분을 함유하는 방법.
  15. 제3항에 있어서, 효모 균주가 사카로마이세스 세레비지애 균주인 방법.
  16. 제4항에 있어서, 효모 균주가 사카로마이세스 세레비지애 균주인 방법.
  17. 제5항에 있어서, 효모 균주가 사카로마이세스 세레비지애 균주인 방법.
  18. 제3항에 있어서, 효모 균주가 클루이베로마이세스 락티스 균주인 방법.
  19. 제4항에 있어서, 효모 균주가 클루이베로마이세스 락티스 균주인 방법.
  20. 제5항에 있어서, 효모 균주가 클루이베로마이세스 락티스 균주인 방법.
  21. 제3항에 있어서, 이종 단백질인 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체인 방법.
  22. 제4항에 있어서, 이종 단백질인 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체인 방법.
  23. 제5항에 있어서, 이종 단백질인 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체인 방법.
  24. 제6항에 있어서, 이종 단백질인 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체인 방법.
  25. 제7항에 있어서, 이종 단백질인 히루딘, 미니프로인슐린, 렙틴 또는 이의 유도체인 방법.
  26. 제6항에 있어서, 효모 균주가 사카로마이세스 세레비지애 Y79 균주인 방법.
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