JP3629290B2 - 物質の製造法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、所望の物質の効率的製造法を提供するものであり、詳しくはエッシェリヒア属に属し、酢酸耐性を有する微生物を宿主として用い、そこに所望の物質の生産に関与する遺伝情報を導入し、得られる形質転換株を培養することによる所望の物質の製造法に関する。
【0002】
【従来の技術】
一般に、大腸菌を用いて所望の物質を生産する場合には、生産物収量の向上はもとより、発酵槽の有効な運用や生産物の効率よい回収などの観点から、高密度で細胞を培養することは有効な手段である。しかし、大腸菌の場合、栄養物質の代謝に伴って酢酸を生成し、培養中に酢酸が著量蓄積するにつれて細胞の増殖が阻害されるため、高密度に培養することは困難であった。これを解決する手段としては、培養液を透析または濾過することにより培養系から酢酸を除去する透析培養法〔ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー(J.Gen.Microbiol.)、103巻、345頁、1977年〕や濾過培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioeng.)、36巻、330頁、1990年〕が知られている。また、純酸素を用いて培養液中の溶存酸素を高濃度に維持することで、酢酸の生成を抑制しながら培養する方法〔アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー(Agric.Biol.Chem.)、53巻、2115頁、1989年〕や、培養液中のグルコース濃度を低濃度に保つことにより、酢酸の蓄積を抑制する方法〔ジャーナル・オブ・ファーメンテーション・アンド・バイオエンジニアリング(J.Ferment.Bioeng.)、74巻、196頁、1992年〕などが報告されている。しかしながら、これらの方法は、専用の装置を必要としたり、装置の維持や管理の複雑化の問題を伴い、工業的には有利とはいえない。
【0003】
さらにフルオロ酢酸ナトリウムに対する耐性付与により、酢酸の生合成経路の酵素活性を低下または欠失させて酢酸の生成能を低減させる方法(公表特許公報平2−502065)も報告されているが、ピルビン酸や乳酸の蓄積が生じる〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioeng.)、38巻、1318頁、1991年〕等の問題がある。
【0004】
酢酸耐性を有する微生物としては、アセトバクター属に属する微生物及びグルコノバクター属に属する微生物〔ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J. Bacteriol.) 、172巻、2096頁、1990年〕が知られている。
しかしながら、エッシェリヒア属に属し、酢酸耐性を有する微生物及び該微生物を宿主微生物として用い、所望の物質を製造する方法については知られていない。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有する微生物を宿主微生物として、所望の物質の生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドを用い、形質転換することにより得られる形質転換株を用いて所望の物質の効率的な製造法を提供することにある。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明によれば、所望の物質を生成しえる微生物を培地に培養し、培養物中に所望の物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造法において、微生物として、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有する微生物を所望の物質の生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドで形質転換して得られる形質転換株を用いることを特徴とする方法および宿主微生物として有用なエッシェリヒア・コリに属し、酢酸に対する耐性を有する微生物を提供することができる。
【0007】
本発明で宿主微生物として用いられる微生物としては、エッシェリヒア属に属し、酢酸に対する耐性を有する微生物であればいずれでもよい。
耐性とは親株が生育できない濃度の酢酸の存在下で生育できる能力をいう。
本願明細書に記載の実施例においては親株が生育できない150mM の酢酸存在下で生育できる変異株が例示されているが、親株よりも耐性を有する菌株であればいずれの菌株でも用いることができる。
【0008】
このような微生物は所望の物質の生産に一般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物に対して、通常用いられる変異誘起処理を施した後、親株が生育できない濃度の酢酸を含有する適当な寒天平板培地上に塗布し、生育した変異株を取得し、得られた変異株を、酢酸を含有した適当な培養液で振盪培養し、細胞増殖量を測定し、親株と比較して生育の良好な菌株を、酢酸耐性株として選択することにより得られる。
【0009】
より具体的には、まず所望の物質の生産に一般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物に通常の変異誘起処理、例えば、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジンなどの変異剤での処理、UV照射、γ線照射による変異処理などを行い、得られた細胞を緩衝液で適当に希釈し、親株が生育できない濃度(150mM) の酢酸を含んだ適当な寒天平板培地上で培養し、生じたコロニーを変異株として分離する。
【0010】
親株としては、所望の物質の生産に一般に用いられるエッシェリヒア属に属する微生物であればいずれでもよく、とくに大腸菌が好ましい。例えば、具体的には大腸菌(Escherichia coli) MM294株、MC1000株、MC1061株、LE392株、W3110株、JM105株、JM109株、XL1−Blue株、DH1株、DH5α株[モレキュラー・クローニング第2版(Molecular Cloning 2nd Edition、J.サムブルック、E.F.フリッチ、T.マニアチス著、コールドスプリングハーバー出版社、1989年)、エクスペリメンツ・ウイズ・ジーン・フュージョン(Experiments With Gene Fusion、T.J.シルハリー、M.L.バーマン、L.W.エンクイスト著、コールドスプリングハーバー出版社、1984年)]などがあげられる。
【0011】
得られた変異株を適当な液体培地で培養し、親株より生育が良好でかつ培養後のpHの低下が少ない株を本発明の変異株として選択する。
このようにして得られる変異株の例として、例えば大腸菌(Escherichia coli )HN0020株、大腸菌(Escherichia coli) HN0074株および大腸菌(Escherichia coli) HN0124株があげられる。これらの菌株はいずれもフルオロ酢酸に感受性を示す。該菌株は、平成5年9月28日付で、工業技術院生命工学工業技術研究所に、ブダペスト条約に基づいて、FERM BP−4426、FERM BP−4425およびFERM BP−4427としてそれぞれ寄託されている。
【0012】
このような変異株は親株が酢酸を著量生成する培養条件下においても、酢酸の生成量が親株と比べて低減しており、またこの際、変異株の培養終了時における培養液のpHの低下が少ないことから、培養液中へのピルビン酸や乳酸の蓄積量も少ないものと考えられる。従って、これらの変異株を用いることにより特殊な培養装置の使用や複雑な培養管理技術を必要とせず、容易に細胞を高密度に培養できる。
【0013】
上記のようにして得られる変異株を宿主微生物として用い、所望の物質の生産に関与する遺伝子をベクターに導入して構築される組換え体プラスミドを該宿主微生物に導入し、得られる形質転換株を培地に培養することにより所望の物質を生産することができる。
本発明における所望の物質の製造法は、所望の物質を生産する能力を有する微生物由来の該物質の生産に関与する遺伝子をクローニングし、構築された該遺伝子を保有する組換え体プラスミドを用いることにより、微生物によって生産されるいずれの物質の製造にも広く応用できる。具体的な物質としては、例えば、ウリカーゼ、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼなどの酵素、13Leu−モチリン、ヒト顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF) などの生理活性ペプチド、スレオニンなどのアミノ酸、フラビンアデニンジヌクレオチドなどの核酸関連物質、ビオチンなどのビタミン、カロチノイドなどの色素などがあげられる。
【0014】
所望の物質を生産する能力を有する微生物の染色体からの該物質の生産に関与する遺伝子の単離は、常法、例えばカレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbiology and Imunrology) 、96巻、1982年に記載の方法に従っておこなうことができる。
得られた遺伝子を適当なベクターに組み込んで組換え体プラスミドを構築する。ベクターとしてはエッシェリヒア属に属する微生物を宿主とすることが可能なベクターであればよい。
【0015】
遺伝子のベクターへの組み込みは、常法に従って、たとえば染色体及びベクターを適当な制限酵素で切断し、遺伝子DNA断片及びベクターDNA断片を調製したのち、両者の混合物をDNAリガーゼで処理することによりおこなう。
具体的な組換え体プラスミドの例としては、ウリカーゼの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドpUT118(EP−A−545688)、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドptrcNMAPH(特開平4−71489)、13Leu−モチリンの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドpMTOI4(特開昭63−71195 )、G−CSFの生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドpCfBD28(特開昭63−267292)、スレオニンの生合成遺伝子を保有する組換え体プラスミドpEthr1(特開昭60−30693)などがあげられる。
【0016】
得られた組換え体プラスミドの宿主微生物への導入は、常法、例えば、モレキュラー・クローニング第2版に記載の方法によって行う。
得られる形質転換株としては、大腸菌( Escherichia coli)HN0021株、大腸菌HN0027株、大腸菌HN0028株、大腸菌HN0075株、大腸菌HN0125株があげられる。
【0017】
上記のようにして得られた形質転換株の培養は、以下のように行う。すなわち、該微生物を炭素源、窒素源、無機物等を含有する培地において、好気的条件下にて温度、pHなどを調整しつつ培養を行えばよい。
培地に用いる炭素源としては、例えば、グルコース、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの炭水化物、エタノール、グリセリン、ソルビトールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳酸、酢酸などの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸など該微生物が資化可能なものであればいずれでも使用できる。
【0018】
窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、NZアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたはその消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミン酸などのアミノ酸などが使用できる。
【0019】
無機物としては、リン酸1カリウム、リン酸2カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。
用いる微生物が、アミノ酸、核酸、ビタミンなどの特定の栄養物質を生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添加する。
【0020】
培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気的条件下、25〜42℃で1〜48時間行う。培地のpHはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中性付近に保つことが望ましい。
上記の方法により培養することにより生成した目的物質の定量は、下記のごとく行う。すなわち、培養終了後、培養液から大腸菌細胞を遠心分離などの方法で集め、適当な緩衝液に懸濁する。この懸濁液、またはこれより調製した無細胞抽出液をレムリら(U.K.Laemmli、Nature、227巻、680頁、1970年)の方法に従い、SDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した後に、クマシーブリリアントブルーR250溶液で染色し、目的物質の生産量を、クロマトスキャナーで測定することにより定量する。無細胞抽出液の調製は、超音波処理、ガラスビーズを用いる磨砕処理、フレンチプレス処理などにより破砕することにより行う。また、目的物質がそれぞれの活性を有している場合には、無細胞抽出液中の物質の活性を測定することにより、その生産量を定量してもよい。
【0021】
以下に本発明の実施例を示す。
【0022】
【実施例】
実施例1.大腸菌MM294株からの酢酸耐性株の造成
大腸菌MM294株を、30mlのLB培地(バクトトリプトン 10g/l、バクトイーストエキストラクト 5g/l、NaCl 5g/l)を含む300ml三角フラスコに植菌し、37℃で3時間振盪培養して得られた対数増殖期の細胞を、トミー製冷却遠心機RD−20IV(ローターNo.4)を用いて4℃で10,000rpm、10分間遠心分離して回収した。これを、N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン 0.5mg/mlを含有するTM緩衝液〔トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(以下トリスと略) 6.057g/l、マレイン酸 5.804g/l、MgSO4・7H2O 0.1g/l、(NH4)2SO4 1g/l、クエン酸ソーダ 0.5g/l、pH6.0〕に懸濁し、35℃で60分間振盪して変異処理を行った。この細胞を集めて洗浄した後、無菌水で細胞数がおよそ105個/mlとなるように懸濁した。この懸濁液を、1.5%の寒天を含有するMCGA培地〔グルコース 5g/l、酢酸アンモニウム 11.562g/l(150mM 酢酸) 、Na2HPO4・12H2O 15.14g/l、KH2PO4 3g/l、NaCl 5g/l、NH4Cl 1g/l 、MgSO4・7H2O 0.24g/l、カザミノ酸 5g/l、ビタミンB1 4μg/ml〕からなる平板培地上に0.1mlずつ塗布し、35℃で2日間培養し、出現したコロニーを変異株として単離した。取得した変異株を、10mlのMCGA培地を含有した試験管(直径24mm)に植菌し、30℃で24時間振盪培養して、培養終了後、分光光度計により各培養液について550nmの波長で濁度(OD550)を測定した。その結果、親株であるMM294株と比較して、生育が良好な変異株を選択した。
【0023】
次に、この変異株を10mlのMCG培地(グルコース 10g/l、Na2HPO4・12H2O 15.14g/l、KH2PO4 3g/l、NaCl 5g/l、NH4Cl 1g/l、MgSO4・7H2O 0.24g/l、カザミノ酸 5g/l、ビタミンB1 4μg/ml) を含有する試験管(直径24mm) に植え、30℃で24時間振盪培養した。培養終了後、生育が良好で、培養液のpHの低下が少なかった菌株を選択し、大腸菌HN0020株と命名した。
【0024】
第1表に、親株であるMM294株とHN0020株のMCGA液体培地における生育能を比較した結果を示すが、HN0020株は親株よりも良好な生育を示した。
【0025】
【表1】
【0026】
HN0020株を、種々の濃度の酢酸を含むMCGA寒天培地に塗布し、33℃で2日間培養し生育を調べた。結果を第2表に示す。HN0020株は、150mMの酢酸を含むMCGA寒天培地でも生育を示し、親株より高い酢酸耐性度を示した。
【0027】
【表2】
【0028】
また、10mlのMCG培地を含有する試験管(直径24mm)にMM294株とHN0020株を植菌し、30℃で24時間振盪培養した。その後HPLCを用い、蓄積した有機酸を調べたところ、酢酸以外には見いだせず、酢酸の蓄積量も親株に比較して低下していた。
酢酸の生成量を比較した結果を第3表に示すが、HN0020株は、親株であるMM294株と比較して良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減していた。
【0029】
【表3】
【0030】
実施例2.酢酸耐性株HN0020株を用いたウリカーゼ生産
実施例1で取得した、HN0020株にウリカーゼ発現用の組換えプラスミドpUT118(EP−A−545688)を用いて形質転換した。HN0020株のコンピテントセルは、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. of Molecular Biology)、166巻、557頁、1983年に記載の方法に従って調製した。形質転換は、pUT118を含む溶液1μlと210μlのコンピテントセルを混合し、氷上に30分間静置後、42℃で90秒間熱処理をし、その後、氷中に2分間保った。これに800μlのSOC培地(2% バクトトリプトン、0.5% バクトイーストエキストラクト、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4、20mM グルコース)を加えて、37℃で1時間振盪培養した後に、これを50μg/mlのアンピシリンを含むLB寒天平板培地上に100μlずつ塗布した。これを37℃で1晩培養することにより生じたコロニーを、形質転換体として取得した。これらの形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、pUT118であることを確認して、この組換え型大腸菌をHN0021株と命名した。
(1)HN0021株のフラスコ培養
HN0021株を、30mlのMCG培地を含む300ml三角フラスコに植菌し、33℃で24時間振盪培養を行い、10,000rpm、10分の遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞を、3mlのPBS緩衝液(NaCl8g/l、KCl 0.2g/l、Na2HPO4・12H2O 1.25g/l、KH2PO4 0.2g/l)に懸濁し、超音波破砕機(ブランソン社、CELL DISRUPTOR200)にて細胞を破砕した。破砕液を14,000rpmで15分間遠心分離し、回収した上清を、無細胞抽出液とした。
【0031】
なお、本発明において、ウリカーゼの生産量は無細胞抽出液中のウリカーゼ活性として示した。
ウリカーゼ活性は、基質となる尿酸の紫外部吸収(293nm)の吸光度の減少量を測定し、これに基づいて算出した。具体的には、3mlの反応液〔50mM ほう酸緩衝液(pH8.5)、125μM 尿酸〕中に、ウリカーゼを含む0.15μg/mlの蛋白質濃度の無細胞抽出液を添加し、25℃で3分間反応させた。本反応中の293nmの吸光度の変化(ΔOD)を測定し、次式によりウリカーゼの単位(U)を算出した。上記条件下で、1分間に1μmoleの尿酸を分解する酵素量を1Uとする。
【0032】
【数1】
【0033】
その結果、第4表に示すように、MM294株を宿主とした場合よりも、HN0020株を宿主とした場合の方が、ウリカーゼの生産量が増大した。
【0034】
【表4】
【0035】
(2)HN0021株のジャーファーメンターを用いた培養
得られたHN0021株をジャーファーメンターを用いて培養する場合には、高密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリング(Biotechnol.Bioeng.)、17巻、227頁、1975年〕が好適であり、以下のように行った。なお、下記のいずれの培地においても、プラスミドを安定に組換え型大腸菌中に保持させるために、アンピシリンを50μg/mlの濃度で添加した。前培養として、HN0021株を1%のグルコースを含有する100mlの培地Aを含む1リットルの三角フラスコに植菌し、30℃で16時間振盪培養した。
【0036】
次に、5リットル容量の発酵槽に、1.8リットルの培地Aを封入し、120℃で20分間蒸煮滅菌した。その後、滅菌した10% グルコース、2.4% MgSO4・7H2O、0.4% ビタミンB1を含む溶液100mlを発酵槽に添加した後、HN0021株を培養した前記培養物を植菌した。
【0037】
【表5】
【0038】
培養は14%アンモニア水を用いてpH6.8に調整しつつ、攪拌(500rpm)、通気(2リットル/min)し、33℃で24時間行った。また、70%グルコース溶液を連続的に発酵槽に添加することにより、培養液中のグルコース濃度がそれぞれ0.5%、1%、2%になるように保った。さらに、生育にともない、OD550が50になった時に、培地Bを、1リットルの培地Aに対して100mlの割合で添加した。
【0039】
【表6】
【0040】
なお、本発明において、培地中の酢酸の生成量は、細胞を遠心分離により除いた後、培養上清をガスクロマトグラフィー法(日立236−50型、カラム;PEG−6000(SUPPORT:Chromosorb WAW)、カラム長;1m、カラム温度;170℃、キャリアガス;ヘリウム、流量;60ml/分、検出器;FID)により定量した。
【0041】
第7表にそれぞれのグルコース濃度における、培養開始24時間後の菌株の生育量、酢酸蓄積量およびウリカーゼ生産量の結果を示すが、親株であるMM294株を宿主として用いた場合には、高濃度の酢酸の蓄積が認められるが、HN0020株を宿主として用いたHN0021株の場合には、いずれの糖濃度での培養においても、親株と比較して酢酸の蓄積量が低減し、細胞をより高密度に培養することが可能であった。さらに、ウリカーゼの生産量は、HN0020株を宿主とした場合は、MM294株を用いた場合よりも増大した。従って、酢酸耐性株を宿主として利用することにより、培養中に煩雑な糖濃度の制御を必要としなくとも、細胞を高密度に培養できるだけでなく、培養液当たりのウリカーゼ生産量も高く、効率良くウリカーゼを生産させることが可能である。
【0042】
【表7】
【0043】
実施例3 HN0020株を用いたアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産
実施例1で取得した、HN0020株にアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ発現用の組換えプラスミドptrcNMAPH(特開平4−71489)を実施例2に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、ptrcNMAPHであることを確認して、この組換え型大腸菌をHN0027株と命名した。
【0044】
HN0027株を、30mlのMCG培地を含む300mlの三角フラスコに植菌し、28℃で24時間振盪培養を行い、10,000rpm、10分の遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞から無細胞抽出液を取得し、プロテインアッセイキット(バイオラッド)を用いて、蛋白質濃度が0.2mg/mlになるように調製した。サンプル処理液〔SDS 0.92g、β−メルカプトエタノール 2ml、グリセロール 4.0g、トリス 0.3gおよび0.1%(W/V)ブロモフェノールブルー溶液 2mlを水に溶解して、塩酸でpH6.8に調製し、全量を20mlにする〕と等量混合し、100℃で2分間処理した後、14%ポリアクリルアミドゲル(14cm×11cm)に10μlをのせて、40mAで2時間泳動した。泳動後、ゲルを染色液(クマシーブリリアントブルー R250 0.25g、メタノール 125ml、酢酸 25ml、水100ml)に浸し、3時間染色した後、脱色液(メタノール 100ml、酢酸 100ml、水 800ml)に浸し、12時間脱色した。染色後のポリアクリルアミドゲルをクロマトスキャナー(島津製作所、クロマトスキャナーCS−930)を用い、560nmの波長を測定することにより、無細胞抽出液中の総蛋白質量に対するアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの含量を測定した。
【0045】
その結果、第8表に示すように、MM294株を宿主とした場合よりも、HN0020株を宿主とした場合の方が、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの生産量が増大した。
【0046】
【表8】
【0047】
実施例4 HN0020株を用いた13Leu−モチリンの生産
実施例1で取得した、HN0020株に13Leu−モチリン発現用の組換えプラスミドpMTOI4(特開昭63−71195)を実施例2に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、pMTOI4であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をHN0028株と命名した。
【0048】
HN0028株を、30mlのMCG培地を含む300mlの三角フラスコに植菌し、35℃で24時間振盪培養を行い、10,000rpm、10分の遠心分離により細胞を回収した。
得られた細胞を、濁度(OD550)が8.5になるようにPBS緩衝液に懸濁し、超音波処理により菌体を破砕した。この菌体破砕物から調整した試料を、14%ポリアクリルアミドゲルで泳動し、泳動後のゲルを染色して、クロマトスキャナーを用いて、全菌体蛋白質量に対する13Leu−モチリンの含量を測定した。
【0049】
その結果、第9表に示すように、MM294株を宿主とした場合よりも、HN0020株を宿主とした場合の方が、13Leu−モチリンの生産量が増大した。
【0050】
【表9】
【0051】
実施例5 大腸菌MC1000株からの酢酸耐性株の造成
大腸菌MC1000株から、実施例1に記載した方法と同様の方法で、目的変異株を取得し、HN0074株と命名した。
HN0074株を、種々の濃度の酢酸を含むMCGA寒天培地に塗布し、33℃で2日間培養し生育を調べた。
【0052】
その結果、第10表に示すように、HN0074株は、150mMの酢酸を含むMCGA寒天培地でも生育を示し、親株より高い酢酸耐性度を示した。
【0053】
【表10】
【0054】
また、10mlのMCG培地を含有する試験管(直径24mm)にMC1000株とHN0074株を植菌し、30℃で24時間振盪培養し、酢酸の生成量を比較した。
その結果、第11表に示すように、酢酸耐性株HN0074株は、親株であるMC1000株と比較して、良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減した。
【0055】
【表11】
【0056】
実施例6 HN0074株を用いたウリカーゼの生産
実施例5で取得した、HN0074株にウリカーゼ発現用の組換えプラスミドpUT118を実施例2に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、pUT118であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をHN0075株と命名した。
【0057】
HN0075株を、30mlのMCG培地を含む300mlの三角フラスコに植菌し、33℃で24時間振盪培養を行い、10,000rpm、10分の遠心分離により細胞を回収した。得られた細胞から、無細胞抽出液を取得し、培養液当たりのウリカーゼ生産量を測定した。
その結果、第12表に示すように、HN0075株は、MC1000株を宿主とした組換え型大腸菌よりも生育が良好であった。さらに、MC1000株を宿主とした場合よりも、HN0074株を宿主とした場合の方が、ウリカーゼの生産量が増大した。
【0058】
【表12】
【0059】
実施例7 大腸菌NY49株からの酢酸耐性株の造成
大腸菌NY49株から、実施例1に記載した方法と同様の方法で、目的変異株を取得し、HN0124株と命名した。
HN0124株を、種々の濃度の酢酸を含むMCGA寒天培地に塗布し、33℃で2日間培養し生育を調べた。
【0060】
その結果、第13表に示すように、HN0124株は、150mMの酢酸を含むMCGA寒天培地でも生育を示し親株より高い酢酸耐性度を示した。
【0061】
【表13】
【0062】
また、10mlのMCG培地を含有する試験管(直径24mm)にNY49株とHN0124株を植菌し、30℃で24時間振盪培養し、酢酸の生成量を比較した。
その結果、第14表に示すように、酢酸耐性株HN0124株は、親株であるNY49株と比較して良好な生育を示すと同時に、酢酸の生成量が低減した。
【0063】
【表14】
【0064】
実施例8 HN0124株を用いたヒト顆粒球コロニー刺激因子の生産
実施例7で取得した、HN0124株に顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)発現用の組換えプラスミドpCfBD28(特開昭63−267292)を実施例2に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、pCfBD28であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をHN0125株と命名した。
【0065】
組換え型大腸菌HN0125株を、30mlのMCG培地を含む300mlの三角フラスコに植菌し、33℃で24時間振盪培養を行い、10,000rpm、10分の遠心分離により細胞を回収した。
得られた細胞から、無細胞抽出液を取得し、培養液当たりの顆粒球コロニー刺激因子の生産量を測定した。
【0066】
その結果、第15表に示すように、HN0125株は、NY49株を宿主とした組換え型大腸菌よりも生育が良好であった。さらに、NY49株を宿主とした場合よりも、酢酸耐性株HN0125株を宿主とした場合の方が、顆粒球コロニー刺激因子の生産量が増大した。
【0067】
【表15】
【0068】
実施例9 HN0020株を用いたL−スレオニンの生産
実施例1で取得した、HN0020株に大腸菌のL−スレオニン生合成遺伝子を保有する組換え体プラスミドpEthr1(特開昭60−30693)を実施例2に記載の方法に従って導入し、形質転換体から常法によりプラスミドを分離精製し、その構造解析を行い、pEthr1であることを確認して、得られた組換え型大腸菌をHN0310株と命名した。
【0069】
HN0310株を、MCG培地組成中グルコース濃度を20g/lに増強したMCGG培地30mlを含む300mlの三角フラスコに植菌し、35℃で48時間振盪培養を行い、10,000rpm、10分の遠心分離により培養液上清を得た。
得られた培養液上清をアミノ酸分析計(日本分光製、高速液体クロマトグラフィーアミノ酸分析システム)で分析し、生成したL−スレオニンの量を定量した。
【0070】
その結果、第16表に示すように、HN0310株は、MM294株を宿主とした組換え型大腸菌よりも生育が良好であった。さらに、MM294株を宿主とした場合よりも、酢酸耐性株HN0020株を宿主とした場合の方が、スレオニンの生産量が増大した。
【0071】
【表16】
【0072】
【発明の効果】
本発明によれば、組換え型大腸菌による所望の物質の生産において、容易に高密度に細胞を培養することができると同時に効率よく所望の物質を製造することができる。
Claims (4)
- 所望の物質を生成しえる微生物を培地に培養し、培養物中に所望の物質を生成蓄積させ、該培養物から該物質を採取することを特徴とする物質の製造法において、微生物として、エッシェリヒア・コリFERM BP−4425、エッシェリヒア・コリFERM BP−4426およびエッシェリヒア・コリFERM BP−4427から選ばれる微生物を所望の物質の生産に関与する遺伝子を保有する組換え体プラスミドで形質転換して得られる形質転換株を用いることを特徴とする方法。
- 所望の物質が、酵素、生理活性ペプチド、アミノ酸、核酸関連物質、ビタミンまたは色素である請求項1記載の方法。
- 所望の物質が、ウリカーゼ、アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ、13Leu-モチリン、ヒト顆粒球コロニー刺激因子、スレオニン、フラビンアデニンジヌクレオチド、ビオチンまたは色素である請求項1記載の方法。
- エッシェリヒア・コリFERM BP−4425、エッシェリヒア・コリFERM BP−4426およびエッシェリヒア・コリFERM BP−4427から選ばれる微生物。
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