SU1056909A3 - Способ получени глицерин-дегидрогеназы - Google Patents
Способ получени глицерин-дегидрогеназы Download PDFInfo
- Publication number
- SU1056909A3 SU1056909A3 SU803271751A SU3271751A SU1056909A3 SU 1056909 A3 SU1056909 A3 SU 1056909A3 SU 803271751 A SU803271751 A SU 803271751A SU 3271751 A SU3271751 A SU 3271751A SU 1056909 A3 SU1056909 A3 SU 1056909A3
- Authority
- SU
- USSR - Soviet Union
- Prior art keywords
- enzyme
- cultivation
- glycerol
- dehydrogenase
- aerobacter aerogenes
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/828—Aerobacter
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИЦЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ из микроорганизмов Aerobacter aerogenes посредством их аэробного культивировани в содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экстракции клеток, фракционировани сульфатом аммони и терйоинактивации примесных белков, отличагощийс тем, что, с целью увеличени образовани целевого продукта в расчете на литр культуры, снижени продол жительности ферментации и получени фермента со сниженной К дл субстрата , в качестве микроорганизмов из вида Aerobacter aerogenes используют штаммы Aerobacter aerogenes DSM 1643 или Aerobacter aerogenes NCIB 418, a после .завершени фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивировани осуществл ют анаэроб ное культивирование.§ 2.Способ по п. 1, отлича- i- ю щ и и с тем, что в процессе ана-, эробного культивировани ввод т допол| в нительные количества глицерина до- достижени 1% его содержани в ереде . .5 3.способ поп. l,oтличaю щ и и с тем, что в питательную среду ввод т биотин в концентрации 50 мкг/л.
Description
;о Изобретение относитс к биохимической промьишенности в частности к получению ферментных препаратов,и может быть использовано дл энзиматического определени глицерина и его производных (после расщеплени последних до глицерина). Известен способ получени глицерин-дегидрогенаэы из микроорганизмов Aerobacter aerogenes штамма 1033 путем их аэробного культивировани на содержащей глицерин (0,2%) среде с последующей очисткой фермента из экстрактов клеток. Культивирование провод т в течение 18 ч, а выход фермента составл ет 57,5 ед/л . культуры. Среда культивировани не содержит биотин или дрожжевой экстракт . Величина К дл в&делени фер мента не определена точно, но, исхо д из значений активности при двух концентраци х субстрата. Км быть меньше, чем 1-10 М ij . Недостатками способа вл ютс не обходимость длительного (не менее 18 ч) культивировани клеток, выход фермента в расчете на литр кул туры, а также низка величина Кд дл глицерина. Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаем му эффекту вл етс способ получени глицерин-дегидрогеназы из микроорга низмов Aerobacter aerogenes посредством их аэробного культивировани содержащей глицерин среде с последу ющей очисткой фермента путем экстракции клеток, фракционировани сульфатом аммони и термоинактиваци примесных белков. Культивирование микроорганизмов провод т при аэрации в течение 18-24 ч на среде с l, глицерина. Выход фермента после кул тивировани в течение 24 ч составл ет 8.3 ед/л среди Н . Недостатками известного способа . вл ютс низкий выход фермента в расче на литр среды, необходимость длитель ного культивировани , а также получение фермента с высокой К () свидетельствунхиий о невысоком срод- стве фермента к субстрату. Последнее обсто тельство не позвол ет эффективно использовать полученную глицерин-дегидрогеназу дл энзиматического определени глицерина при низких концентраци х последнего. Целью изобретени вл етс увеличение образовани целевого продукта в Р4счете на литр культуры, снижение продолжительности ферментации и получение фермента со сниженной К/ дл субстрата. Поставленна цель достигаетс тем что согласно способу получени глицерин-дегидрогеназы из микроорганизмов Aerobacter aerogenes посредством их аэробного культивировани в содержащей глицерин среде с последующей очисткой фермента путем экстракции клеток, функционировани суль фатом аммони и термоинактивации примесных белков, в качестве микроорганизмов из вида Aerobacter aerogenes используют штаммы Aerobacter aerogenes DSM 1643 или Aerobacter aerogenes NCIB 418,a после завермени фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивировани осуществл ют анаэробное культивирование . В процессе анаэробного культивировани ввод т дополнительные количества глицерина до достижени 1 % его содержани в среде. Кроме того, в питательную среду ввод т биотин в концентрации 50 мкг/л. Использование микроорганизмов Aerobacter aerogenes штаммов DSM 1643 или NCI В 418 позвол ет значительно увеличть выход глицерин-дегидрогеназы по активности (не менее , чем в 10 раз) даже при использовании известных способов культивировани и внщелени фермента. Предложенна в изобретении последовательность культивировани - сначала аэробные услови с подводом кислорода или кислородсодержащих смесей в течение фазы логарифмического роста, а затем анаэробные услови ,позвол ют получить фермент с большим выходом, чем при чисто анаэробных услови х. Увеличение образовани глицериндегидрогеназы происходит также при введении на стадии анаэробного кулъ тивировани дополнительных количеств глицерина, т.е. количеств , чем потребл етс микроорганизмами. Предпочтительно также вводить в среду культивирование биотин в концентрации 50 мкг/мл вместо дрожжевого экстракта. При культивировании в указанных услови х за 6-8 ч ферментации достигаетс максимальное содержание глицерин-дегидрогеназы , причем окончание культивировани может быть определено по начинающемус снижению Рн среды. Выход фермента составл ет при этом 3000-9000 ед/л среды. Величина К/ у выделенного фермента составЛ . ет 6,6-10 М. Вьзделение фермента из биомассы микроорганизмов провод т после разрушени клеток ультразвуком и последующего отделени растворимого фермента с помощью центрифугировани . Экстракт клеток фракционируют сульфатом аммони . Примесные белки выпадают в осадок при насыщении 35%, а глицерин-дегидрогеназы - при доведении насыщени сульфатом аммони до 45%. Содержащий глицерин-дегидрогеназу осадок раствор ют в буфере и нагревают при в течение 4 мин
дл денатурации примесных белков, которые отдел ют центрифугированием. Удельна активность очигаенного фермента - 20 ед/мг белка.
Пример 1. Микроорганизмы Aerobacter aerogenes штамма DCM 1643 культивируют в среде, содержащей,%: пептон из казеина 0,8; м сной пептон 0,8; К2НРО4 О,3;(NH)НРОд О,2; NaCj 0,6; глицерин 1; биотин 50 мкг/ рН 7,0. Культивирование провод т при 37С, продувании воздуха и перемешивании в 10-литровом ферменте. В ферментер подают 300 л воздуха в час до окончани фазы логарифмического роста. Интенсивность перемешивани 300 об/мин.
При завершении фазы логарифмического роста прекращают доступ воздуха и начинают добавление глицерина При этом концентраци глицерина возрастает от 0,3 до 1,0% при окончании ферментации, протекающей за 6 ч.Количество полученной биомассы состав лет 10 г/л, а активность глицериндегидрогеназы - 9000 ед/л.
Полученную суспензию культуры обрабатывают в аппарате, генерирую1;ем ультразвук, в течение 3 мин. Разрушенные клетки центрифугируют дл отделени нерастворимых компонентов и определ ют активность глицериндегидрогеназы в надосадочной жидкости .
Дл дальнейшей очистки экстракт фракционируют сульфатом аммони , довод т насыщение раствора сульфа- том аммони до 35% и отдел ют баластные белки центрифугированием, затем довод т насыцение до 45% и отдел ют осадок, содержащий глицерин-дегидрогеназу . Осадок фермента раствор ют в 0,1 М фосфатном буфе1ре с рН 7,0, содержащем 0,85% Ne(C.
Раствор нагревают при в течение 4 мин дл инактивации примесных белков,. которые отдел ют центрифугированием . Прозрачный раствор содержит глицерин-дегидрогеназу с удельной активностью 20 ед/мг и Куу дл глицерина 6,.
Активность глицерин-дегидрогеназы определ ют спектрофотометрически при 366 нм по образованию НАДН в
0 ходе ферментативной реакции. Реакционна смесь общим объемом 3,05 мл содержит 2,65 мл буфера с рН 10 (0,12 М ЫаНСОз и 0,04 М (), 0,1 мл ЮМ раствора НАД, 0,2 мл 1,5 М раствора глицерина и 0,1 мл .
5 экстракта или раствора фермента, разведенного в соответствии с его активностью. Реакцию начинают добавлением глицерина.
Пример 2. Культивирование
0 и вьщеление фермента провод т,как описано в примере 1, но в качестве микроорганизмов используют штамм Aerobacter aerogenes NCIB 4l8 (обозначаемый также как Enterobac-r
5 ter aerogenes). Длительность культивировани составл ет 8 ч. Активность глицерин-дегидрогеназы 4000 ед/л культуры.
Применение предлагаемого способа
0 позвол ет в 50-100 раз увеличить выход глицерин-дегидрогеназы в расчете на литр культуры, снизить врем культивировани в 3-4 раза, а также получить фермент с величиной
5 6,, котора в 60 раз ниже , чем величина Км при других способах получени глицерин-дегидрогеназы . Получение глицерин-дегидрогеназы с более низкой величиной К позвол ет более эффективно исполь0 зовать этот фермент, особенно, в аналитических цел х.
Claims (3)
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИЦЕРИНДЕГИДРОГЕНАЗЫ из микроорганизмов Aerobacter aerogenes посредством их аэробного культивирования в содержащей глицерин среде с последуивдей очисткой фермента путем экстракции клеток, Фракционирования сульфатом аммония и термоинактивации примесных белков, отличагощийс я тем, что, с целью увеличения образования целевого продукта в расче те на литр культуры, снижения продолжительности ферментации и получения фермента со сниженной ~КМ для субстрата, в качестве микроорганизмов из вида Aerobacter aerogenes используют штаммы Aerobacter aerogenes DSM 1643 или Aerobacter aerogenes NC1B 418, а после завершения фазы логарифмического роста в процессе аэробного культивирования осуществляют анаэроб ное культивирование.
2. Способ поп. 1, отличающийся тем, что в процессе ана эробного культивирования вводят допо нительные количества глицерина додостижения 1% его содержания в среде.
3.
ю щ и среду
50 мкг/л
Способ й с я вводят поп. 1, отличатем, что в питательную биотин в концентрации
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19792952410 DE2952410A1 (de) | 1979-12-27 | 1979-12-27 | Verfahren zur gewinnung von glycerindehydrogenase |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SU1056909A3 true SU1056909A3 (ru) | 1983-11-23 |
Family
ID=6089712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU803271751A SU1056909A3 (ru) | 1979-12-27 | 1980-12-16 | Способ получени глицерин-дегидрогеназы |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4395489A (ru) |
| EP (1) | EP0031553B1 (ru) |
| JP (1) | JPS58871B2 (ru) |
| AT (1) | ATE5601T1 (ru) |
| CA (1) | CA1163217A (ru) |
| DE (2) | DE2952410A1 (ru) |
| SU (1) | SU1056909A3 (ru) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5002886A (en) * | 1985-03-19 | 1991-03-26 | British Gas Plc | Oxidoreductase and the preparation thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5021553B2 (ru) * | 1972-09-25 | 1975-07-23 | ||
| JPS5261287A (en) * | 1975-11-08 | 1977-05-20 | Eisai Co Ltd | Preparation of pancreatic elastase |
| JPS5840467B2 (ja) * | 1977-04-09 | 1983-09-06 | 協和醗酵工業株式会社 | グリセロ−ル脱水素酵素の製造法 |
| GB2021594B (en) * | 1978-05-22 | 1982-10-20 | Atkinson A | Glycerol dehydrogenase |
-
1979
- 1979-12-27 DE DE19792952410 patent/DE2952410A1/de not_active Withdrawn
-
1980
- 1980-11-28 CA CA000365791A patent/CA1163217A/en not_active Expired
- 1980-12-16 SU SU803271751A patent/SU1056909A3/ru active
- 1980-12-18 DE DE8080108022T patent/DE3065924D1/de not_active Expired
- 1980-12-18 AT AT80108022T patent/ATE5601T1/de not_active IP Right Cessation
- 1980-12-18 EP EP80108022A patent/EP0031553B1/de not_active Expired
- 1980-12-19 US US06/218,138 patent/US4395489A/en not_active Expired - Fee Related
- 1980-12-26 JP JP55184183A patent/JPS58871B2/ja not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. Lin E.G. , Magasanik В. Activation of glycetol de ydrogenase from Aerobacter aerogenes by monovalent cations.-Jornal Biolog. Chem., 1960, v. 235,№ 6, p.18201823. 2. Burton R.M. Glycerol dehydro. genase from Aerobacter aerogenes N8724.- Methods in Enzymology Editors S.P.Colowick,N.O.Kaplan, New Jork, 1955, V. 1, p.397-400. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE5601T1 (de) | 1983-12-15 |
| CA1163217A (en) | 1984-03-06 |
| JPS58871B2 (ja) | 1983-01-08 |
| DE2952410A1 (de) | 1981-07-02 |
| US4395489A (en) | 1983-07-26 |
| EP0031553A2 (de) | 1981-07-08 |
| EP0031553B1 (de) | 1983-12-14 |
| JPS5699791A (en) | 1981-08-11 |
| DE3065924D1 (en) | 1984-01-19 |
| EP0031553A3 (en) | 1981-11-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR850004268A (ko) | 폴리-d-(-)-3-하이드록시부티르산의 제조방법 | |
| JPH0671425B2 (ja) | ウリカ−ゼおよびその製造法 | |
| EP0798377B1 (en) | Process for producing aspartase and l-aspartic acid | |
| US5416019A (en) | Rhodococcus microorganisms that produce phenylalanine dehydroganase | |
| KR880001944B1 (ko) | 2,5-디케토-d-글루콘산 리덕타제의 제조방법 | |
| US3391059A (en) | Process for producing l-aspartic acid | |
| US3440142A (en) | Production of asparaginase | |
| SU1056909A3 (ru) | Способ получени глицерин-дегидрогеназы | |
| JPS6322188A (ja) | 新規なｌ−アミノアシラ−ゼ | |
| US4530903A (en) | L-2-hydroxy-4-methylpentanoic acid-dehydrogenase, process for obtaining it and its use | |
| JPH01277495A (ja) | Ｌ―チロシン及びｌ―フエニルアラニンの２，５―ジヒドロキシフエニル酢酸への生物学的変換法 | |
| US4357425A (en) | Process for producing L-amino acid oxidase | |
| EP0071485B1 (en) | Novel microorganisms derived from microorganisms of the genus escherichia by mutation and their use in the preparation of glutathione | |
| Dohner et al. | Anaerobic fermentation of lysine | |
| Sakai et al. | Formation of β-cyanoalanine by cyanide-resistant strain Enterobacter sp. 10-1 | |
| JPH0420597B2 (ru) | ||
| US3770585A (en) | Process for preparing l-lysine | |
| US3997397A (en) | Production of proteic materials from yeast cells | |
| US3579427A (en) | Process for producing methionine decarboxylase | |
| RU2032735C1 (ru) | Способ получения микросомальной фракции алканокисляющих дрожжей candida maltosa | |
| US4425436A (en) | Process for the production of amine oxidase | |
| SU871525A1 (ru) | Способ получени НАД-зависимой формиатдегидрогеназы | |
| RU2032743C1 (ru) | Способ получения дрожжевой алкогольоксидазы | |
| SU763463A1 (ru) | Способ получени дегидрогеназ | |
| SU835170A1 (ru) | Способ выделени биомассы микроорганизмов |