JPS5840467B2 - グリセロ−ル脱水素酵素の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物によるグリセロール脱水素酵素ＣＥＣ１
，１，１，６，）の製造法に関する。

更に詳しくは本発明はアクロモバクタ属、アルスロバク
タ属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属に属し
、グリセロール脱水素酵素生産能を有する微生物を栄養
培地に培養し、グリセロール脱水素酵素を培養物中に蓄
積せしめ、該培養物中から蓄積したグリセロール脱水素
酵素を採取することを特徴とするグリセロール脱水素酵
素の製造法に関する。

その目的とするところは、優れたグリセロール脱水素酵
素を工業的に安価に製造する方法を提供するにある。

従来、グリセロール脱水素酵素（以下ＧＤＨと略記スる
）は、アエロバクタ・アエロバクタ、エシェリヒア・コ
リー、バチルス・ズブチリス等の菌体に所在することが
古くから知られている。

またその他の微生物起源のものとしては、プロテウス属
、エルピニア属、セラチア属に属する微生物によるもの
が知られている。

（特公昭５０２１５５３号公報） ＧＤＨはリポプロティン・リパーゼと組み合せることに
より、血清中のトリグリセライドの定量に、またアルカ
リフォスファターゼの基質としてβ−グリセロリン酸を
用い、遊離してくるグリセロールにＧＤＨを作用させて
、アルカリ・フォスファターゼ活性の測定に利用できる
ことが知られている。

この場合ＧＤＨは共役酵素となるので酵素化学的性質と
しては側鎖の低い優れたＧＤＨを安価に工業的に製造す
る方法を提供することが望まれている。

本発明者らは工業的に安価にＧＤＨを製造する方法につ
いて研究を重ねた結果、アクロモバクタ属、アルスロバ
クタ属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属に属
する微生物を培養したときに菌体中に脂値の低い優れた
性質を有するＧＤＨが著量に生産されることを見い出し
本発明を完成するに到った。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明によれば、アクロモバクタ属、アルスロバクタ属
、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属に属する微
生物を培養することにより、菌体中に著量のＧＤＨが生
産されるので、これを採取する。

本発明に用いる微生物としてはアクロモバクタ属、アル
スロバクタ属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス
属に属しＧＤＨを生産することができるものであればい
かなる菌株をも用いることができる。

具体的に好適な菌株の一例としては、たとえば次のごと
きものが挙げられる。

（１）アクロモバクタ・リフダム ＫＹ３０４７ 微
工研菌寄第３９６１号（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｌ
ｉｑｕｉｄｕｍ ） （２） アクロモバクタ・リクエファシエンス ＫＹ
３０４４ （Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ １ｉｑｕｅ
ｆａｃｉｅｎｓ ）（３） アルスロバクタ・ビスコ
サス ＫＹ ３１６０ＮＲＲＬ−Ｂｌ ９７３ （ＡＴ
ＣＣＩ ９５８４ ）（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｖ
ｉｓｃｏｓｕｓ ）（４） アルスロバクタ・ウレア
ファシェンス ＫＹ３１５２ ＡＴＣＣ７５６２（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ ） （５） ブレビバクテリウム・リクエファシエンスＫ
Ｙ ３４３５ ＡＴＣＣ１４９２９ （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ １ｉｑｕｅｆａｃｉ
ｅｎｓ ）（６）ブレビバクテリウム・アルバム ＫＹ
４３１９ＡＴＣＣＩ ５１１１ （Ｂｒｅｖｉｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ ａｌｂｕｍ ）（７） シュードモナス
・オーレオファシェンスＫＹ ３９９８ ＮＲＲＬ
Ｂ−１５７６（ＡＴＣＣ１３９８５） （Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ ）（８）
シュードモナス・シュイルキリエンシスＫＹ ３９７３
ＮＲＲＬ Ｂ−６ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ５ｃｈｕｙｌｋｉｌｌｉｅ
ｎｓｉｓ ）これら微生物の菌学的性質は次の文献に記
載がある。

アクロモバクタ・リフダムＢｅｒｇｅｙ６ Ｍａｎｕａ
ｌｏｆ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ （以下バージ−と略称する）第６版 ４
２５頁 アクロモバクタ・リクエファシエンス バージ−第７版
３０１頁 アルスロバクタ・ビスコサス バージ−第８版６２５頁 アルスロバクタ・ウレアファシェンス バージ−第８版
６２２頁 ブレビバクテリウム・リクエファシエンス バージ−第
８版 ６２７頁 ブレビバクテリウム・アルバム Ｕ、 Ｓ、 Ｐａｔ。

３２２２２５８ シュードモナス・オーレオファシェンス バージ−第８
版 ２２４頁 シュードモナス・シュイルキリエンシス バージ−第８
版 ２２３頁 本発明で使用する培地としては炭素源、窒素源、無機物
その他の栄養素を程よく含有する培地ならば合成培地ま
たは天然培地のいずれも使用可能である。

炭素源としてはグルコース、ガラクトース、マンノース
、フラクトース、シュクロース、トレハロース、ラクト
ース、セロビオース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉、澱
粉加水分解物などの糖類、グリセリン、ソルビトール、
マンニトールなどの糖アルコール類、酢酸、グルコン酸
、コハク酸、ギ酸、クエン酸、フマール酸、乳酸、ピル
ビン酸などの有機酸類、メタノール、エタノールなどの
アルコール類などが使用できる。

窒素源としてはアンモニア水、塩化アンモニウム、硫酸
アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、
燐酸アンモニウムなどの各種有機および無機のアンモニ
ウム化合物尿素などの窒素化合物、ペプトン、酵母エキ
ス、カゼイン加水分解物、脱脂大豆、あるいはその消化
物などの窒素性有機物質などが使用できる。

無機物としてはナトリウム、カリウム、マンガン、マグ
ネシウム、カルシウム、コバルト、ニッケル、亜鉛、銅
などの金属の塩類、クロム、硫酸、燐酸、硝酸、塩酸な
どの塩類が使用できる。

本発明においては酵素の誘導物質としてグリセロールお
よびグリセロールを含有する物質ならびにその他の誘導
物質を培地に添加すればより大量のＧＤＨな生成せしめ
ることができる。

これらの添加物の添加は培養当初からでも培養途中に行
ってもよい。

添加量としてはグリセロールとして２〜４Ｆ／ｄｉの割
合で添加すれば良い結果が得られる。

培養温度は通常２０〜４０℃の範囲で、好適には２８〜
３３℃の範囲で行われる。

培養時のｐＨは通常６．０〜９０の範囲で、好適には６
．５〜８．５の範囲で行われる。

かくして、１５〜３０時間培養すれば菌体中にＧＤＨが
著量に生成する。

かくして、菌体中に生成したＧＤＨはたとえば次のごと
き方法で採取される。

培養液から遠心分離法によって菌体を得る。

菌体は超音波処理、磨砕、機械的圧縮、自己消化などの
公知の方法で破砕して菌体抽出物とする。

上記菌体抽出物からのＧＤＨの抽出は次のごとく行う。

まず硫酸アンモニウム、芒硝などの塩、あるいはアセト
ン、メタノール、エタノールなどの溶剤によって沈殿物
を得る。

硫酸アンモニウムを使用する場合は５０％飽和で沈殿す
る部分を採取する。

アセトンを使用する場合は６０℃濃度で沈殿する部分を
採取する。

得られた沈殿物を透析あるいはゲル１過の処理を行うこ
とによって沈殿物に含まれる塩類や溶剤を除去する。

透析操作において用いる透析膜はセロファン膜、膀胱膜
、コロジオン膜などがあげられる。

透析液としては０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）を
用いるのがよい。

ゲル１過の操作においてはセファデックスＧ２５、ある
いはセファデックスＧ−５０，０，０５Ｍ燐酸緩衝液（
ｐＨ７，０）を用いるとよい。

塩類を除去した処理液の温度を５５°Ｃに上げ、１５分
間放置し、生ずる沈殿を遠心分離で除去し、上清液を得
る。

この上清液を０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平
衡化しておいたＤＥＡＥ −ｃｅｌｌｕｌｏｓｅのカラ
ムに通塔する。

さらに０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）を通塔する
。

この段階で不純な蛋白は流出してくる。

次に０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）から、０、７
Ｍ Ｎａｃ １を含む０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７
，０）まで濃度勾配液で溶出を行う。

得られる溶出液を一定量づつの画分に分画し、谷両分中
に含まれるＧＤＨの活性を後で述べる方法で測定してＧ
ＤＨ活性のある両分を取出す。

活性画分を集めて硫酸アンモニウムを６０％飽和濃度に
なるように加え、生ずる沈殿を遠心分離法によって集め
、沈殿を０．０５Ｍ燐酸アンモニウム（ｐＨ７，０）で
透析して透析内液を凍結乾燥する。

かくしてＧＤＨの精製酵素粉末を得ることができる。

ＧＤＨの酵素活性はグリセロールとＮＡＤを基質として
反応した場合、生成するＮＡＤＨを３４０ｎｍにおける
吸光度の増加を分光光度計で測定することによって算出
する。

すなわち、１Ｍグリ七〇 −／１／ ０．５ ｍｌ、０
．１ＭＮＡＤ ０．２ｍｌ、 ０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐ
Ｈ１０，０）０２ｒｎｌ、水２．０ｍｌおよび酵素溶液
ｏ、１ｒｎｌを混合し、２５℃で反応させ、反応開始１
分間での３４０ｎｒｒＬの波長における紫外部吸収の増
加を測定する。

対照として上記組成でグリセロールの代りに水を用いて
同様の操作を行ない、対照液の３４０ｎｍで紫外部吸収
の増加を試験液のそれから差し引く。

ＮＡＤＨの３４０ｎｒｒＬにおける分子吸光係数として
（ε＝６．２２Ｘ１０３ ）を用い、差し引いた吸収値
から生成するＮＡＤＨＯ量を求め、これをもとにして試
料中の酵素力価を算出する。

酵素活性の表示はｐＨ１０，０，２５℃、１分間の処理
で１μｍｏｌｅのＮＡＤＨを生成せしめる酵素量を１単
位として行う。

本発明によって得られるＧＤＨの理化学的性質をアクロ
モバクタ・リクダムＫＹ３０４７起源のもの（後記の実
施例１で得られた比活性５．０単位／■の精製酵素）を
代表例として示す。

（１）作用 本酵素は補酵素ＮＡＤの存在下にグリセリンを脱水素し
、ジヒドロキシ−アセトンとＮＡＤＨを生成する反応を
触媒する。

（２）基質特異性 本酵素は、グリセロール以外にも１・２−プロパン・ジ
オール、２・３−ブタン・ジオール等にも作用しうるが
、エチル・アルコール、ｎプロピル・アルコール等は脱
水素できなかった。

また補酵素として、ＮＡＤＰを用いた場合は、ＮＡＤの
約３５％の活性が得られた。

（３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲 本酵素の至適ｐＨは２５℃、１分間の反応でｐＨ９，０
〜１．０．０付近にある。

本酵素の安定ｐＨ領域は５５℃、１５分間の処理でｐＨ
６，０〜９．０の間にある。

（４）作用適温の範囲 本酵素の最適温度はｐＨ７，０，１分間の反応において
４０〜４５°Ｃ付近にある。

（５）ｐＨ，温度などによる失活条件 本酵素はｐＨ７，０，１５分間の処理で５５℃まで安定
、６０℃で２０℃程度失活する。

（６）阻害、活性化および安定化 （ａ） 金属イオン、金属キレート剤の影響酵素反応
液に下表に示した濃度の金属イオンまたは金属キレート
剤を加える以外は上記酵素活性の測定法と同様に行って
下表に示すごとき相対活性を得た。

本酵素活性はＣｕ２＋イオン、Ｚｎ２＋イオンによって
顕著に阻害された。

またＥＤＴＡのような金属キレート剤によっては活性の
阻害は認められなかった。

（ｂ）ＳＨ酸試薬影響 酵素反応液に下表に示した濃度のＳＨ保護剤またはＳＨ
阻害剤を加える以外は上記酵素活性の測定法と同様に行
って下表に示すごとき相対活性を得た。

本酵素はＰＣＭＢのようなＳＨ阻害剤によって活性が顕
著に阻害され、またグルタチオン（還元型）、ジチオス
レイトールのようなＳＨ保護剤によって活性化されるこ
とより、本酵素の活性発現にはＳＨ基が関与しているも
のと推定される。

（７）分子量 セファデックスＧ−１００ゲルフイルトレージヨン法に
より、本酵素の分子量は約 １５００００と算出された。

（８）結晶構造 本酵素は結晶化が困難なため、結晶構造の決定はできな
い。

（９）元素分析値 Ｃ＝４３．２％、Ｎ＝１１．６％、Ｈ＝７．５％次に実
施例について説明する。

実施例 １ アクロモバクタ・リフダムＫＹ ３０４７微工研菌寄第
３９６１号をグリセロール４ｆ！／ｄｌ、ペプトン１
’ ？ ／ｄｌ、肉エキス１ｆ／ｄｌ、酵母エキス０、
５ ？ ／ｄｌ、 Ｎａ Ｃｌ Ｏ，５？ ／ｄｉの組
成を有する培地（ｐＨ７，５）３００ｍｌを含有する２
１容三角フラスコに一白金耳植菌し、３０℃で１８時間
ロータリー・シェーカーにて培養する。

この培養液６００ｖＬｌを上記と同様の組成を有する培
地１５Ｊを含有する３０Ｊジヤー・ファーメンタ−に植
菌し、３０℃で２４時間通気（０，５Ｖ／Ｖ／Ｍ）攪拌
（３００ｒ、ｐ、ｍ）培養する。

培養液１５１を連続遠心分離機にて処理し、菌体約１０
０？ （ｗｅｔ ）を集める。

この菌体を０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０） ５１
で洗浄した後、同緩衝液２１に懸濁する。

この懸濁液をＤＹＮＯ−ＭＩ ＬＬ （Ｗｉ ｌｌｙ
Ａ。

Ｂａｃｈｏｆｅｎ社製、スイス）にかげ菌体を磨砕する
。

磨砕した後、冷凍遠心機にて遠心分離 （１２０００Ｘ？、２０分）し、上清液をうる。

得られた上清液の硫酸アンモニウム０−５０％飽和沈殿
区分は約２５２であり、この沈殿のＧＤＨの活性収率は
９０％で、比活性は３倍に上昇している。

得られた沈殿を５００ｒ／ｌｌの０．０５Ｍ燐酸緩衝液
（ｐＨ７，０）に溶解し、透析膜としてセロファンチュ
ーブを用い、８時間おきに透析外液をとりかえながら、
２０７の同緩衝液で２４時間透析する。

ついで、不純蛋白質を除去するために、透析液５５０ｍ
１の温度を５５°Ｃに上げ、１５分間放置し、生ずる沈
殿を遠心分離（１２０００ｘｆ！、２０分）で除去し、
上清液を得る。

上清液のＧＤＨの活性収率は９０％で、比活性は２倍上
昇する。

次に得られた上清液を０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，
０）で平衡化しておいた１ ｋｇのＤＥＡＥ−ｃｅｌ
１ｕｌｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製、スウェーデン
）を含むカラムに通す。

この操作でＧＤＨはＤＥＡＥｃｅｌｌｕｌｏｓｅに吸着
される。

さらに同緩衝液で不純蛋白質を洗い流す。

次に０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）から０．７Ｍ
ＮａＣ１を含む０．０５ Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）
までの濃度勾配液で溶出を行う。

ＧＤＨの活性画分は単一のピークとして溶出してくる。

得られた活性画分を集め、これに硫酸アンモニウムを６
０％飽和濃度になるように加えて沈殿させる。

沈殿を遠心分離（１２０００Ｘグ、２０分）で集め、イ
オン交換水１００ｍ１に溶かし、透析膜としてセロファ
ンチューブを用い、透析外液として０．０５Ｍ燐酸緩衝
液（ｐＨ７，０）を用いて透析した後、透析液を凍結乾
燥する。

かくして比活性５０単位／ｍ９の精製ＧＤＨ約１２が得
られる。

全体の活性回収率は４０％であり、比活性は５０倍に達
した。

実施例 ２ 使用菌株にアルスロバクタ・ビスコサスＫＹ３１６０を
用い、培地をグリセロール２９７ｄｉ、グルコース２９
７ｄｌ、ペプトン１？／ｄｌ、肉エキス１９７ｄｉの組
成を有する培地（ｐＨ７，０）に替えるほかは実施例１
と同様に行って約１００Ｐの菌体を得た。

これを実施例１と同様にして抽出、精製を行い、比活性
４．０単位／■の精製ＧＤＨ約１１を得た。

活性収率は３５％であった。

実施例 ３ 使用菌株にブレビバクテリウム・アルバムＫＹ４３１９
を用い、培地をグリセロール２ ？／ｄｌ。

グルコース２？／ｄｌ、ソイ・ビーン・ミール２？／ｄ
ｌ、肉エキス１？／ｄｌの組成を有する培地（ｐＨ７，
０）に替えるほかは実施例１と同様に行って、約１５０
１の菌体を得た。

これを実施例１と同様にして抽出、精製を行い、比活性
４０単位／ｍ９の精製ＧＤＨ約１２を得た。

実施例 ４ 使用菌株にシュウトモナス・オーレオファシェンスＫＹ
３９９８を用いろほかは実施例１と同様に行って約１０
０１の菌体を得た。

これを実施例１と同様に抽出、精製を行い、比活性５．
０単位／ｍりの精製ＧＤＨ約０．５２を得た。

活性収率は３５％であった。

実施例 ５ 下表に示すごとき菌株を実施例１に示したと同じ組成を
有する培地５ｏｍｌを含有する５００ｒ／ｌｌ容坂ロフ
ラスコに植菌し、３０℃で１８時間振盪培養する。

培養液を冷凍遠心（２００００Ｘｌ、２０分）にて処理
して菌体約０．５Ｐ（湿重量）を得る。

この菌体を０．０５Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，０）５０ｒ
ｎｌで洗浄し、同緩衝液１０ｒｎｌに懸濁して超音波破
砕機（トミー精工社製）にて２０分間超音波処理し、さ
らに冷凍遠心（２００００ＸＪ、２０分）し、上清液を
得る。

得られた上清液についてＧＤＨの活性を測定して下表の
結果を得た。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アクロモバクタ属、アルスロノくフタ属、ブレビバ
   クテリウム属またはシュードモナス属に属し、グリセロ
   ール脱水素酵素を生産する能力を有する微生物を栄養培
   地に培養し、グリセロール脱水素酵素を培養物中に蓄積
   せしめ、該培養物中から、蓄積したグリセロール脱水素
   酵素を採取することを特徴とするグリセロール脱水素酵
   素の製造法。