JP2959777B2 - 新規エンドデキストラナーゼ、その製造方法及び本酵素を用いたイソマルトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は新規エンドデキストラナーゼ、その製造方法
及び本酵素を用いたイソマルトオリゴ糖の製造方法に関
する。

［従来の技術］ 近年、各種オリゴ糖が食品工業界等で機能性食品素材
として注目されている。これらのオリゴ糖の一種である
イソマルトトリオースは、難う蝕性甘味剤、腸内のビフ
ィズス菌増殖因子、あるいは研究用試験、また、保湿性
が極めて高いので有効な保湿剤などとしての用途が期待
出来、その効率的な製造法の開発が望まれている。

イソマルトトリオースを製造する方法としては、従来
よりデキストランを鉱酸で部分加水分解する方法が知ら
れているが、この方法ではイソマルトトリオースが選択
的に取得できず、その収率も極めて低い。また、精製工
程も煩雑であり、工業的方法としては適していなかっ
た。

他の方法として、デキストランを加水分解し、主とし
てイソマルトトリオースを生成するデキストラナーゼを
利用した、酵素法によるイソマルトトリオースの製造も
検討されている。

デキストランを加水分解し、主としてイソマルトトリ
オースを生成するデキストラナーゼとしては、ブレビバ
クテリウム・フスクム（Brevibacterium fuscum var.d
extranlyticum）が生産する細菌性エキソ型酵素［Bioch
im．Biophys．Acta，350、61〜70（1974）］が知られて
いる。しかしながら、ブレビバクテリウム起源のデキス
トラナーゼは、精製工程の煩雑さに加えて、酵素の回収
率ならびに精製酵素の示す比活性も低く、工業的生産に
は適していなかった。

［発明が解決しようとする課題］ 本発明は、上記従来技術の問題点に鑑みてなされたも
のであり、その目的は、ブレビバクテリウム起源でない
新たなエンドデキストラナーゼ生産菌を利用することに
より高力価の新規なエンドデキストラナーゼを提供する
こと、上記エンドデキストラナーゼ生産菌を用いてエン
ドデキストラナーゼを高収率で工業的に製造する方法を
提供すること、更に、上記エンドデキストラナーゼを用
いてイソマルトトリオースを主体としたイソマルトオリ
ゴ糖を効率的に製造する方法を提供することにある。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、デキストランに作用し、主としてイソ
マルトトリオースを生成する酵素を生産する微生物の検
索を行った結果、糸状菌フザリウム（Fusarium）属に属
する１菌株が、デキストランに作用して主としてイソマ
ルトトリオースを生成する酵素を、効率よる菌体外に大
量生産することを認め、本発明を完成するに至った。

本菌株の菌学的性質を以下に述べる。

（１）各種培養培地における生育状態 麦芽寒天培地 本菌の麦芽寒天培地上での生育速度は、25℃、３日間
ではコロニーの直径が0.5〜1.5cmに達し、７日間では2.
0〜3.0cmに達する。性状は白色・ビロード状であり、分
生子の形成は良好である。

ポテト・スクロース寒天培地 本菌のポテト・スクロース寒天培地上での生育速度
は、25℃、３日間ではコロニーの直径が1.0〜2.0cmに達
し、７日間では3.0〜5.0cmに達する。性状は白色・ビロ
ード状であり、分生子の形成は良好である。

オートミール寒天培地 本菌のオートミール寒天培地上での生育速度は、25
℃、３日間ではコロニーの直径が0.5〜1cmに達し、７日
間では1.5〜2.0cmに達する。性状は白色・ビロード状で
あり、分生子の形成は少ない。

（２）生理的性質 生育pH pH4.5〜8.0のpH領域で生育できるが、生育に至適なpH
は5.0〜6.5である。

15〜45℃の温度域で生育できるが、生育に至適な温
度は20〜30℃である。

その他の顕著な特徴 デキストラン含有培地での培養により、エンドデキス
トラナーゼを菌体外に誘導生産する。

（３）形態的特徴 分生子柄 分生子は側生である。

フィアライド モノフィアライドである。

分生子 大型分生子と小型分生子を有する。大型分生子は25〜
32×４〜５μｍで、腕曲しており、ショルダーを有す
る。小型分生子は５〜７×２〜３μｍである。大型分生
子と小型分生子は０〜３個の隔壁を有する。

以上の所見をもとに、「菌類図鑑上・下」、宇田川俊
一、椿啓介ほか著、講談社、1877年刊行などにより分類
し、本菌株をFusarium sp.と同定した。

なお、上記菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所
に、微工研菌寄第10976号（FERMP−10976）として寄託
されている。

本発明におけるエンドデキストラナーゼの製造方法の
骨子とするところは、上記のような糸状菌フザリウム
（Fusarium）属に属するエンドデキストラナーゼ生産菌
またはその突然変異体を培養培地に接種し、所定の培養
条件下で培養した後、当該培養物から菌体を除去し、簡
便な分離・精製法により高力価のデキストラナーゼを高
収率で採取するようにしたことにある。

以下に、本発明で得られた新規エンドデキストラナー
ゼの諸性質について記載する。

（１）作用 本酵素はデキストランに作用し、主としてα−イソマ
ルトトリオースを生成する。

（２）基質特異性 本酵素は主として細菌性多糖デキストランを加水分解
する。一方、可溶性デンプン、アミロペクチン、プルラ
ン、カードラン、ラミナリン、キシランなどには作用を
示さない。

（３）至適pH及び安定pH範囲 本酵素はpH4.0〜11.5の広範囲で作用し、至適pHは6.4
付近にある（0.25％ファルマシア社製デキストランT200
0に30℃,7分間作用させた）。5mM KCl−NaOH緩衝液中
で、本酵素はpH11.0においても約40％の相対活性発現を
示した。したがって、本酵素が高アルカリ領域において
も高活性を発現することが確認された。また、本酵素は
pH4.5〜10.0の広範囲で安定である（各種pHの25mM McIl
vaine緩衝液中で４℃,24時間放置後、それぞれの残存活
性を測定した）。

（４）作用温度範囲及び至適作用温度 本酵素はほぼ20〜55℃の範囲で作用し、至適作用温度
は35℃付近である（0.25％デキストランT2000、pH6.4、
５分間反応）。

（５）温度安定性 本酵素をpH6.4で、10分間各種温度で加熱処理後、そ
れぞれの残存活性を測定した。その結果、45℃までは10
0％、50℃で約25％の残存活性を示し、55℃でほぼ完全
に失活した。

（６）酵素力価の測定法 エンドデキストラナーゼ活性測定における反応組成は
１％デキストランT2000溶液0.5ml、25mM McIlvaine緩衝
液（pH6.4）1.0mlおよび酵素溶液0.5mlからなり、30℃
で一定時間反応させる。反応混液1.0mlにつき、酵素反
応により生成された還元糖をSomogyi−Nelson法を用い
て定量する。この条件下で１分間に１μmolのグルコー
スに相当する還元力を生成せしめる酵素量を１単位と定
義する。

（７）エンドデキストラナーゼの精製方法 Fusarium sp.を液体培地にて25℃,5日間ジャーファメ
ンターを用いて培養し、その培養液３を高速冷却遠心
（8,000×ｇ）にかけ、除菌する。４℃で、上清液に冷
エタノールを加え、30〜60％濃度で沈澱する画分を高速
冷却遠心（8,000×ｇ）にかけて集めた。次いで、この
エタノール沈澱物を直ちに、25mM McIlvaine緩衝液（pH
6.4）に溶解し、同上緩衝液で充分に平衝化したDEAE−
トヨパール650Sを充填したカラム（4.4×55cm）にのせ
た。100mM McIlvaine緩衝液（pH6.1）にて溶出される活
性画分を集めた。この画分を濃縮・透析後、25mM McIlv
aine緩衝液（pH6.4）で充分に平衝化したバイオゲルＰ
−100を充填したカラム（1.8×120cm）にかけ、ゲル濾
過を行った。得られた単一の活性画分を集め、濃縮し、
高度に精製されたエンドデキストラナーゼを得た。

（８）分子量 SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）
法により推定されたエンドデキストラナーゼの分子量は
約88,000である。

（９）等電点（ｐＩ） LKB社製等電点電気泳動装置（110ml用カラム）により
測定された精製エンドデキストラナーゼの等電点は4.50
である。

（10）阻害及び活性化 5mMの水銀、銀、鉄、銅などの重金属イオンにより、
またこれと同一濃度のＮ−プロモスクシンイミドなどに
より該酵素の活性が阻害される。

一方、5mMのカルシウムイオンにより該酵素の活性が
賦活される。

（11）アミノ酸組成（モル比％） アルギニン4.24、リジン4.31、ヒスチジン2.15、フェ
ニルアラニン4.04、チロシン3.73、ロイシン6.82、イソ
ロイシン5.87、メチオニン0.47、バリン7.56、アラニン
9.16、グリシン8.69、プロリン6.34、グルタミン酸8.0
8、セリン6.51、スレオニン7.31、アスパラギン酸12.2
6、トリプトファン1.94、シスチン0.52 次に、当該エンドデキストラナーゼを生産せしめる為
の培養方法について述べる。

デキストラナーゼを製造するためには、前記した糸状
菌Fusarium sp.などの糸状菌フザリウム（Fusarium）属
に属するエンドデキストラナーゼ生産菌またはその突然
変異株を、培養培地に接種して培養する。本菌の培養方
法については、液体培養および固形培養のいずれにおい
ても可能であるが、工業的生産には好気的に液体培養す
るのが好ましい。

当該菌の培地の栄養源は、一般に微生物培養に用いら
れものを使用することが可能である。また、細菌性多糖
デキストランを唯一の炭素源に用いると、当該エンドデ
キストラナーゼを誘導生成せしめることができる。

窒素源としては、有機窒素含有物として各種アミノ
酸、肉エキス、ペプトン、マルトエキス、尿素などが、
また、無機窒素化合物としては塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム
などが単独または組合わせて用いることができる。その
他、無機塩類、ビタミン類などを適時添加するとよい。

培養温度は20〜30℃が適しており、より好ましくは24
〜27℃がよい。培養開始時のpHは4.5〜8.0が適している
が、より好ましくはpH5.0〜6.5がよい。培養日数は５〜
７日間が好ましい。

上記のような培養条件下で、充分にデキストラナーゼ
を生産せしめた培養物から、遠心分離により細体を除去
すれば、粗酵素液が得られる。

このようにして得られた粗酵素液は、そのままでも製
品として充分に使用可能であるが、さらに粗酵素液を公
知の分離・精製方法、例えば限外濾過膜濃縮法、エタノ
ールなどによる有機溶媒沈澱法、硫酸アンモニウムなど
による塩析法、カラムクロマト分画法、アフィニティー
クロマト分画法、等電点電気泳動法などを、単独あるい
は適宜組合わせることによって、当該エンドデキストラ
ナーゼの精製酵素液を採取することが可能である。次に
その一例を示す。

まず、培養液中の菌体等を遠心分離で除去し、無細胞
上清液を得る。この上清液を粗酵素として利用すること
も可能である。この上清液に冷エタノールを加え、30〜
60％濃度で沈澱する画分を25mM McIlvaine緩衝液（pH6.
4）に溶解し、DEAE−トヨパール650Sカラムにのせる。1
0mM McIlvaine緩衝液（pH6.1）で溶出される活性画分を
バイオゲルＰ−100カラムでゲル濾過を行い、精製エン
ドデキストラナーゼを得る。

本発明のイソマルトオリゴ糖の製造方法は、こうして
得られたエンドデキストラナーゼを、デキストランに作
用させて、イソマルトトリオースを主体とするイソマル
トトオリゴ糖を生成させることを特徴としている。この
場合、エンドデキストラナーゼは、前記のようにして培
養された培養物として、または培養物から調製された粗
酵素液として、さらには精製された酵素として、デキス
トランに作用させることができる。

このようにして生成されたエンドデキストラナーゼを
用い、イソマルトトリオースを製造するための酵素反応
は、好ましくは30〜50℃、pH5.0〜8.0、反応時間は４〜
18時間、デキストラン濃度は２〜８％で行うとよい。反
応液中の生成糖組成はイソマルトテトラオース以上のも
の約30％、イソマルトトリオース約60％、イソマルトー
ス約７％、グルコース約３％であった。

また、予めデキストランT2000を希塩酸などで部分加
水分解したものに、本精製エンドデキストラナーゼを作
用させると、短時間内にイソマルトトリオースを主体と
したイソマルトオリゴ糖を効率よく生成・取得できるこ
とが判明した。

［実施例］ 次に、以下の実施例により、本発明を具体的に説明す
る。

実施例１ 粗酵素液の調製１ 1.0％ デキストラン（名糖70）、0.2％NH₄NO₃、0.1
％KH₂PO₄、0.05％MgSO₄・7H₂O、0.04％CaCl₂・2H₂O、0.
3％ ポリペプトン、0.3％ イーストエクストラクトか
らなる培養培地（pH5.5）３を、５のジャーファー
メンターに仕込み、糸状菌Fusarium sp.を1.1vvm、110r
pmにて25℃、５日間培養した。培養後、培養液を高速冷
却連続遠心分離にかけて菌体を除去し、無細胞上清液を
得た。この上清液は5.2単位/mlのデキストラナーゼを含
有していた。本活性は前述したブレビバクテリウム属の
生産するデキストラナーゼ（4.2単位/ml）と比較して明
らかに高い。

実施例２ 粗酵素液の調製２ 実施例１で得られた除菌液を30〜60％濃度の冷エタノ
ールで処理し、生じた沈澱を25mM McIlvaine緩衝液（pH
6.4）に溶解せしめ、粗酵素液50mlを得た。この酵素液
は58.1単位/mlのエンドデキストラナーゼ活性を含有し
ていた。

実施例３ 酵素の精製 実施例２で得られた粗酵素液のうち、48.4mlを25mM M
cIlvaine緩衝液（pH6.4）で充分に平衝化したDEAE−ト
ヨパール650Sを充填したカラム（4.4×55cm）にのせ、
本酵素を吸着せしめた後、100mM McIlvaine緩衝液（pH
6.1）にて溶出される活性画分を集めた。この活性画分
を濃縮・透析後、25mM McIlvaine緩衝液（pH6.4）で充
分に平衡化したバイオゲルＰ−100を充填したカラム
（1.8×120cm）にのせ、ゲル濾過を行った。得られた単
一の活性画分を集め、コロジオンバッグで濃縮し、精製
エンドデキストラナーゼを得た。本精製酵素について、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）およびSDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−PAGE）を行っ
たところ、それぞれ単一のタンパク質染色バンドのみが
認められた。これらの精製操作によって、本エンドキデ
キストラナーゼが電気泳動的に均一な標品にまで精製さ
れたことが明らかとなった。

以上の酵素精製過程に伴う総タンパク質量、酵素の総
活性量、活性回収率、比活性等の変化を第１表に示す。
この表に示されるように、３の培養上清液より、本酵
素の精製標品16.5mgを活性回収率86.7％で得た。本精製
酵素標品の力価（比活性）は152単位/mgタンパク質であ
った。また、本精製酵素は前記の性質を有していた。

実施例４ 10gのデキストランT2000（ファルマシア社製）を12.5
mM McIlvaine緩衝液（pH6.4）250mlに溶解し、Fusarium
sp.起源のエンドデキストラナーゼを基質1mg当り0.085
単位添加し、35℃で30分間、１、３、６、18、27時間そ
れぞれ反応を行った。反応液中の生成糖組成の経時的な
変化を高速液体クロマトグラフィーにより分析した結果
を第１図に示す。反応時間30分における生成糖組成は、
イソマルトテトラオース以上のもの約47.8％、イソマル
トトリオース約51％、イソマルトース約１％、グルコー
ス約0.2％であった。さらに、反応時間６時間における
生成糖組成は、イソマルトテトラオース以上のもの約33
％、イソマルトトリオース約61％、イソマルトース約４
％、グルコース約２％の分布を示した。これ以後、反応
時間が経過するにつれてイソマルトトリオースの収率は
若干低下する傾向がみられた。なお、高速液体クロマト
グラフィーの条件は以下の如くである。

カラム:Aminex HPX−42A（7.8mmφ×300mm） 移動相：脱イオン水 流速:0.6ml/min カラム圧:30kg/cm² カラム温度:70℃ 検出器：示差屈折計、（株）島津製作所製、商品名
「RID−6A」 分析オリゴ糖はデキストランの酸による部分加水分解
物を標準物質として、ペーパークロマトグラフィーおよ
び高速液体クロマトグラフィーにより構造確認を行った
ところ、すべてα−1,6−グルコシド結合からなるイソ
マトルオリゴ糖であった。

実施例５ デキストランT2000（ファルマシア社製）5.0gを0.2Ｎ
塩酸80mlに溶解し、95℃で４時間加水分解した後に２Ｎ
水酸化ナトリウムを添加して、pH6.1に調整した。次い
で、脱イオン水を加えて、全量を125mlとした。上記し
たデキストランの部分加水分解物1mg当り精製エンドデ
キストラナーゼ0.085単位を添加し、35℃で30分間、
１、３、６、18時間それぞれ反応を行った。反応液中の
生成糖組成の経時的な変化を高速液体クロマトグラフィ
ーにより分析した。反応時間30分における生成糖組成
は、イソマルトテトラオース以上のもの約19％、イソマ
ルトトリオース約51％、イソマルトース約15％、グルコ
ース約15％であった。さらに、反応時間３時間における
生成糖組成は，イソマルトテトラオース以上のもの約８
％、イソマルトトリオース約60％、イソマルトース約15
％、グルコース約17％の分布を示した。

なお、高速液体クロマトグラフィーの実施条件は実施
例４の場合と同一である。

実施例６ 10％ショ糖、0.05％ MgSO₄・7H₂O、0.2％ K₂HPO₄、１
％ポリペプトンからなる溶液培地（pH7.0、1l）に、う
蝕原性連鎖球菌（Streptococcus mutans）を接種し、3
7℃にて５日間静置培養する。培養液中に生成された不
溶性物質を濾別し、脱イオン水にて充分洗浄した。残渣
の懸濁液（約80ml）をロータリーエバポレーターを用い
て減圧濃縮し（60℃）、凍結乾燥を施した。これら一連
の操作を経て、１の培養液より不溶性グルカンの凍結
乾燥標品約1.2gを得た。

上記不溶性グルカンを0.2％含有する25mM McIlvaine
緩衝液（pH6.4）2.4mlに、Fusarium sp.起源の精製エン
ドデキストラナーゼ溶液（2.5単位）を100μｌ加え、37
℃で反応させた。この反応条件下で経時的に生成される
還元糖をSomogyi−Nelson法を用いて定量した。また、
不溶性グルカン中の全糖をフェノール硫酸法で定量し、
不溶性グルカンの分解率を算出した。

得られた結果を総合すると、Fusarium sp.起源のエン
ドデキストラナーゼは、Streptococcus matansの産生
する不溶性グルカンを約25％分解することが確認され
た。

［発明の効果］ 以上説明したように、本発明の一つによれば、糸状菌
Fusarium sp.の産生する高力価の新規エンドデキストラ
ナーゼを提供することができる。

また、本発明のもう一つによれば、糸状菌フザリウム
（Fusarum）属に属する上記エンドデキストラナーゼ生
産菌またはその突然変異株を培養して、培養物中からエ
ンドデキストラナーゼを高収率で工業的に得ることがで
きる。

更に、本発明のもう一つによれば、上記エンドデキス
トラナーゼをデキストランに作用させて、イソマルトト
リオースを主体とするイソマルトオリゴ糖を効率的に生
成させることができる。

そのイソマルトオリゴ糖は、難う蝕性甘味料、保湿
剤、または腸内のビフィズス菌を活性化する因子などと
して、食品工業、化粧品工業等で有効に利用し得るもの
である。

更に、本発明のエンドデキストラナーゼは、Streptoc
occus mutansの産生する不溶性グルカン分解能力をも
有するので、歯磨き剤、義歯洗浄剤、口臭除去剤などの
口腔衛生関連商品への利用も可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図は２％デキストランT2000溶液を基質として、精
製エンドデキストラナーゼを作用させた場合の生成糖組
成の経時変化を示す図である。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C12P 19/16 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の理化学的特性を有することを特徴と
   する新規エンドデキストラナーゼ。 （１）作用 本酵素はデキストランをエンド様式で加水分解し、主と
   してα−イソマルトトリオースを生成する。 （２）基質特異性 本酵素は主として細菌性多糖デキストランを加水分解す
   る。 （３）至適pH及び安定pH範囲 本酵素はpH4.0〜11.5の広範囲で作用し、至適pHは6.4付
   近にある。また、pH4.5〜10.0の範囲で安定である。 （４）作用温度範囲及び至適作用温度 本酵素は温度20〜55℃の範囲で作用し、至適作用温度は
   35℃付近である。 （５）温度安定性 本酵素をpH6.4で、10分間各種温度で加熱処理すると、4
   5℃までは100％、50℃で約25％の残在活性を示し、55℃
   でほぼ完全に失活する。 （６）分子量 本酵素の分子量は約88,000である。 （７）等電点（pI） 本酵素の等電点は4.50である。 （８）アミノ酸組成（モル比％） アルギニン4.24、リジン4.31、ヒスチジン2.15、フェニ
   ルアラニン4.04、チロシン3.73、ロイシン6.82、イソロ
   イシン5.87、メチオニン0.47、バリン7.56、アラニン9.
   16、グリシン8.69、プロリン6.34、グルタミン酸8.08、
   セリン6.51、スレオニン7.31、アスパラギン酸12.26、
   トリプトファン1.94、シスチン0.52
2. 【請求項２】糸状菌フザリウム（Fusarium）属に属する
   請求項１記載のエンドデキストラナーゼ生産菌またはそ
   の突然変異株を培養培地に接種して、所定の培養条件下
   で培養し、該培養物からエンドデキストラナーゼを採取
   することを特徴とするエンドデキストラナーゼの製造方
   法。
3. 【請求項３】請求項１記載のエンドデキストラナーゼ
   を、デキストランに作用させて、イソマルトトリオース
   を主体とするイソマルトオリゴ等を生成させることを特
   徴とするイソマルトオリゴ糖の製造方法。
4. 【請求項４】前記エンドデキストラナーゼを、この酵素
   を含む培養物、この培養物から調製された粗酵素液、ま
   たは精製酵素として作用させる請求項３記載のイソマル
   トオリゴ糖の製造方法。