JPS6120269B2

JPS6120269B2 -

Info

Publication number: JPS6120269B2
Application number: JP55172118A
Authority: JP
Inventors: Shigemichi Okamura; Masazumi Watanabe
Original assignee: Kikkoman Corp
Current assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 1980-12-08
Filing date: 1980-12-08
Publication date: 1986-05-21
Also published as: US4370416A; JPS5799193A; US4426448A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規ヒドロキシ・シナミツク酸エステ
ル加水分解酵素並びにアスペルギルス属又はボト
リチス属に属する糸状菌を用いる新規ヒドロキ
シ・シナミツク酸エステル加水分解酵素の製造法
に関する。本発明方法により得られる新規ヒドロキシ・シ
ナミツク酸エステル加水分解酵素（以下、HCEH
と略称する）は、一般式（式中Ｒは水素原子、水酸基、メトキシル基、Ｘ
は酒石酸残基又はキナ酸残基を意味する）で表わ
されるヒドロキシ・シナミツク酸エステル物質、
例えばＰ−クマロイル酒石酸、カフエオイル酒石
酸、フエルロイル酒石酸又は３−カフエオイルキ
ナ酸等のエステル結合を加水分解する新規な酵素
である。本発明者らは果実酒中のポリフエノール物質に
ついて種々検討した結果、果実酒中にはタンニン
酸と共に多量のヒドロキシ・シナミツク酸エステ
ル物質が存在し、かつこれらの物質が苦味をもた
らし、特にヒドロキシ・シナミツク酸エステル物
質は酵素褐変の基質として大きく影響しているこ
とを発見した。しかし、従来果実酒中のフエノール酸エステル
物質を除去する方法としては、例えばフエノール
酸エステル物質のエステル結合を加水分解するタ
ンナーゼを用いることが良く知られているが、タ
ンナーゼの基質はタンニン酸やメチルガレートな
どの没食子酸のデプシド結合物質若しくはアルキ
ルエステル物質であり、ヒドロキシ・シナミツク
酸のエステル物質に対してはタンナーゼはほとん
ど加水分解作用を示さないか、全く示さなかつ
た。そこで本発明者らは果実酒等に含まれるヒドロ
キシ・シナミツク酸エステルの除去法を鋭意検討
した結果、アスペルギルス属又はボトリチス属に
属する菌株を通常の固体培地若しくは液体培地で
培養することによりヒドロキシ・シナミツク酸エ
ステル物質のエステル結合を加水分解する新規
HCEHが得られ、この新規HCEHを例えば果実酒
等のヒドロキシ・シナミツク酸エステル物質含有
物に用いた場合、苦味の緩和された酒質の良いか
つ色沢の安定した果実酒等が得られることを知り
本発明を完成した。即ち本発明は新規HCEH並びにアスペルギルス
属又はボトリチス属に属し、一般式（式中Ｒは水素原子、水酸基、メトキシル基、Ｘ
は酒石酸残基又はキナ酸残基を意味する）で表わ
されるヒドロキシ・シナミツク酸エステル物質の
エステル結合を加水分解する新規HCEHを生産す
る能力を有する菌株を培地に培養し、培養物より
該新規HCEHを採取することを特徴とする新規
HCEHの製造法である。先ず、本発明方法により製造される新規HCEH
の理化学的性質について述べる。 (1) 作用及び基質特異性本酵素は一般式（式中Ｒ、Ｘは前記の意味を有する）で表わさ
れるヒドロキシ・シナミツク酸エステル物質、
例えばＰ−クマロイル酒石酸、カフエオイル酒
石酸、フエルロイル酒石酸又は３−カフエオイ
ルキナ酸等のエステル結合に作用して、エステ
ル結合を加水分解する。そしてヒドロキシ・シ
ナミツク酸エステル物質のエステル結合に特異
的であり、他のフエノール酸エステル（没食子
酸エステル、安息香酸エステル等）結合には作
用せず実質的にタンニン酸分解活性を有しな
い。 (2) 至適PH及び安定PH範囲至適PHは6.5、安定PH範囲は３〜7.5である。 (3) 力価の測定法新規HCEHの活性の測定は0.1Mリン酸緩衝
液（PH6.5）に市販３−カフエオイルキナ酸
（東京化成工業K.K.）を300mg/濃度で溶解し
た溶液５mlに、同緩衝液に溶解した酵素液0.3
mlを添加し、30℃で反応させる。一定時間毎に
反応液0.5mlをとり、これに80％メタノール水
10mlを加えて反応を止め、340nｍにおける吸
光度を測定する。活性は１分間に基質1nmolを
加水分解することのできる酵素の量を１単位
（Ｕ）と定め、酵素液１mlあたりで表示する。
酵素活性は以下の式から得られる。Ｕ（単位）＝6.01×10⁴×Ｅｔ_１−Ｅｔ_２／ｔ_２−
ｔ_１ t₂−t₁：反応時間（分） Et₁：t₁時におけるOD値 Et₂：t₂時におけるOD値ただしEt₁−Et₂の値は0.35以下とする。 (4) 作用適温の範囲作用適温は20〜60℃の範囲内にあり、特に45
〜60℃付近が最適である。 (5) PH、温度等による失活条件 70℃、10分間の熱処理で完全に失活するが60
℃、10分で80％残存する。 PHは２以下、９以上で失活する。 (6) 阻害、活性化及び安定化 Hg⁺⁺、Fe⁺⁺、８−ヒドロキシキノリン、ｐ
−CMB（ｐ−クロロマ−キユリ安息香酸）、ヨ
ード、DFP（ジイソプロピルフルオロリン
酸）で阻害され、活性化剤、安定化剤は特にな
い。 (7) 分子量本酵素の分子量はアンドリウスの方法（P.
Andrews：Biochem.J.、91巻、222頁、1960）
に基づきセフアデツクスＧ−200（Sephadex
Ｇ−200）（スウエーデン国、フアーマシア社
製）を用いて測定した結果、４℃、PH5.0の
0.1Mクエン酸緩衝液中で150000である。 (8) 等電点が4.8の酸性蛋白質である。 (9) アミノ酸分析値（モル％）アスパラギン酸12.4、スレオニン6.2、セリ
ン5.6、グルタミン酸8.7、プロリン8.2、グリシ
ン9.3、アラニン9.7、シスチン0.5、バリン
7.6、メチオニン1.0、イソロイシン4.2、ロイシ
ン6.7、チロシン6.8、フエニルアラニン5.1、リ
ジン2.4、ヒスチジン1.6、アルギニン4.0、アン
モニア（13.6）以下、本発明による新規HCEHの製法について
具体的に述べる。先ず本発明において使用される微生物としては
アスペルギルス属又はボトリチス属に属し、新規
HCEH生産能を有する菌株が挙げられる。アスペ
ルギルス属に属する菌株の具体例としてはアスペ
ルギルス・ソーヤIAM2678、アスペルギルス・
ニガーIAM3002、アスペルギルス・ヤポニカス
ATCC20236が、ボトリチス属に属する菌株の具
体例としてはボトリチス・シネレアFERM−Ｐ
No.1612が挙げられる。しかしながら本発明方法の使用菌株としては上
記のものに限定されることなく新規HCEH生産能
を有する糸状菌はすべて使用できる。上記ヒドロキシ・シナミツク酸エステル物質の
エステル結合を加水分解する酵素生産能を有する
菌株の培養は、糸状菌の培養に用いられる培地を
用い常法に従つて固体培養又は液体培養すること
により行われる。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用され得る。即ち炭素源としては、資化可能な炭素化合物又
はその含有物であればよく、例えば小麦、〓、グ
ルコース、シユークロース、スターチ、マルトー
ス、デキストリン、グリセリン、ケイ皮酸エチ
ル、ケイ皮酸ベンジル、クロロゲン酸等が用いら
れる。窒素源としては利用可能な窒素化合物又は
これを含有するものであればよく、例えば大豆
粉、脱脂大豆粉、グルテン、ペプトン、肉エキ
ス、カゼイン、大豆ミール、コーンステイープリ
カー、硫安、塩安等が使用される。またリン酸、
カリウム、マグネシウム、カルシウムなどの適当
な無機塩類を適宜使用することができ、更に必要
に応じて菌の生育に必要な各種の有機物、無機物
等を培地に添加使用することができる。先ず固体培養の場合には、適当な固体培地原
料、例えば〓に散水し、120℃、30分間殺菌した
後、３〜５日間培養を行う。このようにして得た
〓培養物（麹）に適量の水又は衝緩液を加え、室
温で適当時間抽出を行い抽出液を得る。このもの
はさらに硅藻土濾過又は遠心分離等の処理を行つ
て透明抽出液を得ることができる。そして液体培養を行う場合には、上記の炭素
源、窒素液及び無機塩を適宜組合せた栄養培地、
例えばケイ皮酸ベンジル、グルコース、ペプト
ン、硫安、酵母エキス、KH₂PO₄等からなる培地
をPH５〜７に調整し、常法による加熱殺菌処理し
た培地に種菌を接種し、培養する。この場合、静
置培養、振盪培養、撹拌培養、通気培養など適宜
の培養法を用いて実施することができるが、大量
に培養する場合は、通気撹拌培養を行うのが好適
である。培養温度は、該酵素生産菌が生育し、酵素を生
産する範囲内で変更することができるが、特に好
ましいのは25〜30℃である。培養期間は使用菌及び培養形態によつても異な
るが、通常１〜５日程度であつて、酵素の生産蓄
積量が最高に達する時期を見計らつて培養を終了
すればよい。このようにして酵素が生産蓄積された培養物
は、遠心分離又は硅藻土濾過等を行つて、培養濾
液を得る。これら抽出液又は培養濾液より硫安等
を用いる塩析法で沈殿物を得、これを透析後、凍
結乾燥により粗酵素粉末を得るか、又はアルコー
ル類、アセトン類を用いる有機溶媒沈殿法による
沈殿物を凍結乾燥して粗酵素粉末を得る。なお抽出液より硫安飽和で該酵素沈殿物を得る
場合、アスペルギルス・ヤポニカス
No.1744ATCC20236では60〜90％硫安飽和で、他
の菌株の場合でも50〜90％硫安飽和で得ることが
できる。また有機溶媒沈殿法で該酵素の沈殿物を
得る場合には、アセトン、アルコール等の50〜80
％濃度で得ることができる。上記粗酵素粉末は更にDEAE−セフアデツクス
Ａ−50、QAE−セフアデツクスＡ−50又はCM−
セフアデツクス等のイオン交換セフアデツクス
や、セフアデツクスＧ−200等のセフアデツクス
を用いるゲル濾過法、アンホライン（スウエーデ
ン国、エルケービー製）を用いる等電点分画法、
アセテート膜澱粉、アクリルアマイドゲルを用い
る電気泳動法、その他等電点沈殿法等の個々の手
段又はこれらの適当な組み合せを適宜利用するこ
とによつて精製酵素とすることができる。従来のタンニン酸加水分解酵素であるタンナー
ゼと、本発明において得られる新規HCEHとの区
別は次の方法によつて容易に行なわれる。即ち３
−カフエオイルキナ酸加水分解作用をもつ精製し
た新規HCEH水溶液（500U）のタンナーゼ活性
を飯渕らの方法（Agr.Biol.Chem.、Vol.31、
No.5、513〜518、1967）により測定する。即ち
0.05Mクエン酸バツフアー（PH5.5）に0.350W/V
％精製タンニン酸を溶解し、この基質溶液４mlに
１mlの精製HCEH水溶液を加え、30℃に保つた。
一定時間後、反応溶液0.1mlをとり、これに10ml
の90％エタノール溶液を加えて反応を止め、
310nｍにおける吸光度を測定した。タンナーゼ
活性は１分間にタンニン酸１μmolを加水分解す
ることのできる酵素量とし、以下の式により算出
した。タンナーゼ活性（Ｕ）＝114×Ｅｔ_１−Ｅｔ_２／ｔ_２−ｔ_１ただし、Et₁、Et₂はそれぞれt₁、t₂分後におけ
る310nｍでのエタノール溶液の吸光度（OD）を
示す。上記方法で新規精製HCEHのタンナーゼ活性を
測定したところ、反応時間にかかわらずEt₁＝Et₂
となりタンナーゼ活性は全く認められなかつた。また新規HCEHとタンナーゼは以下の方法によ
り容易に分画される。即ち新規HCEH、タンナー
ゼの両酵素活性の認められる粗酵素を0.01Mクエ
ン酸緩衝液（PH6.0）溶液とした後透析するかあ
るいはセフアデツクスＧ−25カラムクロマト、限
外濾過等により脱塩する。得られた粗酵素蛋白溶
液は蛋白濃度２%(W/V)以下となるように0.01M
クエン酸緩衝液（PH6.0）で調整した後、あらか
じめ0.01Mクエン酸緩衝液（PH6.0）でバツフア
ーライズしたDEAE−セフアデツクスＡ−25カラ
ムクロマトグラフイーに供する。ただし樹脂量は
蛋白１ｇあたり100ml以上とする。移動相として
0.01Mクエン酸緩衝液（PH6.0）を用いて、樹脂
に吸着されない蛋白成分を集め（Ａ区分）、蛋白
が溶出されなくなつた時点で0.2Mクエン酸緩衝
液（PH6.0）をカラムに流し始める。この緩衝液
により樹脂に吸着された蛋白成分を溶出する（Ｂ
区分）。Ａ区分及びＢ区分のHCEH活性、タンナーゼ活
性をそれぞれ前記の方法により測定した結果、Ａ
区分にはHCEH活性のみが、Ｂ区分にはタンナー
ゼ活性のみが認められる。これらの結果から、本発明により得られた
HCEH酵素が、従来のフエノール酸エステル分解
酵素のタンナーゼとは異なる酵素蛋白物質である
ことがわかる。次に新規HCEHを用いてワイン中のヒドロキ
シ・シナミツク酸エステル物質であるカフエオイ
ル酒石酸が加水分解される実験例及びカフエオイ
ル酒石酸含量における褐変度について実験例を示
す。実施例甲州種ワインよりシングレトン（V.L.
Singleton）らの方法（J.Sci.Food Agric.、29、
403、1978）で単離したカフエオイル酒石酸を500
mg/となるように0.1Mクエン酸バツフアー（PH
4.5）に溶解する。この溶液各10mlに本発明で得
られた新規HCEH180単位を添加して30℃で反応
させ30分、１時間、１時間30分及び２時間後に70
℃、10分間熱処理して酵素反応を止め、カフエオ
イル酒石酸濃度380mg/、260mg/、140mg/及
び30mg/の各溶液を得た。なお、カフエオイル酒石酸の定量はO.D.S.を
分離用の樹脂とした液体クロマト法により行つ
た。次に得られた溶液にあらかじめ甲州種ブドウ果
汁よりN.S.Dizikらの方法（J.FdSci.、35、282、
1970）で調製したポリフエノールオキシダーゼ粗
酵素溶液を５％添加し、30℃で１時間放置後、
430nｍで溶液の褐変度を測定した。その結果を
第１表に示す。

【表】第１表よりカフエオイル酒石酸の濃度が低下す
るるに従つて褐変度が少なくなり、色沢が安定す
ることが確認される。また、カフエオイル酒石酸500mg/、タンニン
酸500mg/となるように0.1Mクエン酸バツフア
ー（PH4.5）に溶解し、上記同様に新規HCEHを
作用させた後酵素反応を止め第２表記載の各溶液
を得た。これらの溶液に上記同様にポリフエノー
ルオキシダーゼ粗酵素を作用させた場合の結果を
第２表に示す。

【表】ここで0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）を用いて、
各ヒドロキシ・シナミツク酸エステル物質及びタ
ンニン酸に対するHCEH活性を液体クロマトグラ
フイによる測定により各物質の加水分解量（モ
ル）の比率で表わし、その結果を第３表に示す。

【表】本発明方法によつて得られる新規HCEHは、例
えば果汁、果実酒、コーヒー飲料等のヒドロキ
シ・シナミツク酸エステル物質含有物に用いるこ
とができ、特にタンニン酸及びヒドロキシ・シナ
ミツク酸エステル物質が共存する果実酒等に用い
る場合にはヒドロキシ・シナミツク酸エステル物
質が特異的に加水分解され、得られる果実酒等は
苦味が緩和され、色沢が安定し、かつタンニン酸
の存在により、タンニン酸の緩衝作用が果実酒等
の香味をマイルドに感じさせ、更に微生物に対す
る抗菌殺用が期待されることが確認された。次に実施例を挙げて本発明方法を具体的に説明
する。実施例１ 200ｇの〓に200mlの水を散水し、オートクレー
ブにより１気圧、30分蒸煮後、これにアスペルギ
ルス・ヤポニカスATCC20236を接種し、30℃で
４日間培養した。このようにして得られた麹に
1000mlの水を加え、室温にて２時間撹拌後、木綿
布にて濾過し、更にセライトを添加して濾過し
た。このようにして得られた抽出液850mlに硫安
520ｇを添加し、酵素を沈殿させ、この沈殿物を
遠心分離して集め、0.01Mクエン酸緩衝液（PH
6.0）に溶解し、同じ緩衝液に対し十分透析後、
DEAE−セフアデツクスＡ−25のカラムクロマト
グラフイーを行つた。即ち0.01Mクエン酸緩衝液
（PH6.0）で平衡化したDEAE−セフアデツクスＡ
−25に0.01Mクエン酸緩衝液で十分透析させた酵
素液を通し、不純蛋白を吸着させた。この操作で
吸着されなかつた酵素蛋白溶液を0.01Mクエン酸
緩衝液（PH4.0）で透析した後、CM−セフアデツ
クスＣ−50のカラムクロマトグラフイーを行つ
た。即ち0.01Mクエン酸緩衝液（PH4.0）で平衡
化したCM−セフアデツクスＣ−50に酵素液を吸
着させ、十分洗浄後、同緩衝液のモル濃度を連続
的に上昇せしめる溶出法によつてクロマトグラフ
イーを行い、緩衝液濃度0.13〜0.18Mまで溶出さ
れる区分でフラクシヨンナンバー95〜108まで112
ml（本酵素のCM−セフアデツクスＣ−50による
カラムクロマトグラムを示す第１図参照）を集
め、ついでこの区分を純水に対して透析後、凍結
乾燥した。この乾燥物を少量の0.1Mクエン酸緩
衝液（PH5.0）に溶解し、セフアデツクスＧ−200
のカラムによるゲル濾過を行つた。更に新規
HCEH活性の認められる区分を集め凍結乾燥した
後再度上記セフアデツクスＧ−200のカラムクロ
マトグラフイーを行つて新規HCEH以外の酵素を
全く含まず超遠心電気泳動的に均一な精製酵素
10.8mgを得た。上記のようにして得られた精製酵素の調製用デ
イスク電気泳動図を第３図に示す。実施例２ 0.2％NH₄Cl、0.3％KH₂PO₄、0.01％MgSO₄・
7H₂O、2.0％ケイ皮酸ベンジル（PH6.0）からな
る培地を100mlずつ500ml容坂口フラスコに入れ、
１気圧、15分蒸煮後アスペルギルス・ニガー
IAM3002を接種して、25℃で12日間振幅10cm、
140r.p.mで振盪培養を行い、得られた培養液２
にセライトを添加して濾過を行つた。この濾液を限外濾過（分画分子量：10000）に
より100mlに濃縮し、0.01Mクエン酸緩衝液（PH
3.5）で十分に透析した後、不溶物を遠心分離に
より除去した。上澄液を0.01Mクエン酸緩衝液
（PH3.5）で前もつて平衡化したSP−セフアデツ
クスＣ−50カラム（1.9×30cm）に吸着させ、カ
ラムを十分洗浄後、同緩衝液の濃度を連続的に上
昇せしめる溶出方法によつてクロマトグラフイー
を行つた。溶出液の新規HCEH活性区分を0.01M
リン酸緩衝液（PH7.5）に対して透析を行い、次
のこの緩衝液で平衡化したDEAE−セフアデツク
スＡ−50カラム（１×25cm）に上述の透析溶液を
吸着させ、緩衝液濃度を連続的に上昇せしめる方
法によつてクロマトグラフイーを行つた。この溶
出液の新規HCEH活性区分を集めた後、水に対し
て透析し、凍結乾燥した。この粉末を少量の
0.1Mリン酸緩衝液（PH6.5）に溶解し、同緩衝液
で平衡化したセフアデツクスＧ−200に吸着さ
せ、同緩衝液でクロマトグラフイーを行つた。得られた新規HCEHは蛋白的に均一であつた。上記各精製工程における全蛋白質量（mg）、全
活性（units）、比活性（units／mg）等を第４表
に示す。なお全蛋白質量（mg）はJ.Biol.
Chem.193265−275（1951）に従つて測定した。

【表】

【表】実施例３ 100ｇの〓に５ｇのケイ皮酸エチルを懸濁させ
た水80mlを散水しオートクレーブにより１気圧、
30分間殺菌後、これにボトリチス・シネレア
FERM−Ｐ No.1612を接種し、28℃10日間培養
した。得られた麹に水道水600mlを加え、室温にて２
時間撹拌後、濾過し抽出液を得た。この抽出液に
３倍量のエタノールを冷却しつつ加え、４℃で１
晩放置した。生じた沈殿物を遠心分離して集め、
真空乾燥して粗酵素38ｇを得た。この粗酵素を水
400mlに溶解し、不溶物を遠心により除去した
後、上澄液に0.8飽和になるまで硫安を加えた。
生じた沈殿物を遠心分離して集め、60mlの水に溶
解し、セフアデツクスＧ−25（1.9×120cm）カラ
ムクロマトグラフイーを行い、溶液の脱塩を行つ
た。この溶液を0.01Mクエン酸緩衝液（PH4.2）
で透析し、この緩衝液で平衡化したCM−セフア
デツクスＣ−50カラムクロマトグラフイーを行つ
た。即ち酵素溶液をCM−セフアデツクスＣ−50
に吸着させ、同緩衝液でカラムを洗浄後、緩衝液
の濃度を連続的に上昇せしめる溶出方法によつて
クロマトグラフイーを行つた。得られた新規
HCEH活性区分は更に上記同様に0.01Mクエン酸
緩衝液の濃度を連続的に上昇せしめる方法でリク
ロマトグラフイーを行つた。新規HCEH活性区分
は0.05Mクエン酸緩衝液（PH6.0）で透析した
後、同緩衝液で平衡化したDEAE−セルロースカ
ラムクロマトグラフイーを行い、夾雑物をDEAE
−セルロースに吸着させ、溶出したHCEH活性区
分を0.1Mクエン酸緩衝液（PH6.0）で透析した。
この溶液を限外濾過（分画分子量：50000）によ
り濃縮し、0.1Mクエン酸緩衝液（PH6.0）で平衡
化したセフアデツクスＧ−200カラムクロマトグ
ラフイーを行つて新規HCEHを得た。上記各精製工程における全蛋白質量、全活性、
比活性、収率等を第５表に示す。

【表】【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１における本酵素のCM−セフ
アデツクスＣ−50によるカラムクロマトであり、
第２図は実施例１における本酵素のセフアデツク
スＧ−200によるカラムクロマトであり、また第
３図は実施例１で得られた本酵素の調製用デイス
ク電気泳動図である。

Claims

【特許請求の範囲】１以下の理化学的性質を有する新規ヒドロキ
シ・シナミツク酸エステル加水分解酵素。 (a) 作用及び基質特異性一般式（式中Ｒは水素原子、水酸基、メトキシル基、
Ｘは酒石酸残基又はキナ酸残基を意味する）で
表わされるヒドロキシ・シナミツク酸エステル
物質のエステル結合を特異的に加水分解し、実
質的にタンニン酸分解活性を有しない。 (b) 至適PH及び安定PH範囲至適PHは6.5、及び安
定PH範囲は３〜7.5である。 (c) 作用適温の範囲：20〜60℃ (d) 温度及びPHによる失活条件 70℃、10分間の熱処理で完全に失活する。PH
は２以下、９以上で失活する。 (e) 阻害 Hg⁺⁺、Fe⁺⁺、８−ヒドロキシキノリン、Ｐ
−クロロマーキユリ安息香酸、ヨード、ジイソ
プロピルフルオロリン酸で阻害される。 (f) 分子量：150000 ２ヒドロキシ・シナミツク酸エステル物質がＰ
−クマロイル酒石酸、カフエオイル酒石酸、フエ
ルロイル酒石酸、３−カフエオイルキナ酸より選
ばれる少なくとも一種である特許請求の範囲第１
項記載の新規ヒドロキシ・シナミツク酸エステル
加水分解酵素。３アスペルギルス属又はボトリチス属に属し、
新規ヒドロキシ・シナミツク酸エステル加水分解
酵素を生産する能力を有する菌株を培地に培養
し、培養物より該ヒドロキシ・シナミツク酸エス
テル加水分解酵素を採取することを特徴とする新
規ヒドロキシ・シナミツク酸エステル加水分解酵
素の製造法。