JP3469265B2 - 酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法 - Google Patents
酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法Info
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、低いpＨで澱粉物質を
加水分解するのに有用な新規な酸性アミラーゼ、該アミ
ラーゼの製造法およびそれを用いた特異的な組成を有す
る澱粉分解物の製造法に関する。
加水分解するのに有用な新規な酸性アミラーゼ、該アミ
ラーゼの製造法およびそれを用いた特異的な組成を有す
る澱粉分解物の製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】アミ
ラーゼは澱粉を加水分解し、澱粉を液化させる酵素とし
て古くから知られ、従来から、澱粉工業、アルコール製
造工業、繊維工業、食品加工業など、産業上広範に用い
られている重要な酵素である。特に、食品分野におい
て、澱粉分解物、特にマルトオリゴ糖(グルコースのα
−１,４結合したもので重合度２〜１０のもの)は、低甘
味(砂糖を１００とした場合、１０〜３０)で、かつ低粘
度という性質を有しているため、食品改良剤として用い
られている。その上、溶解性も高く、マルトトリオース
(Ｇ３)を含んでいるものはその性質上、保湿性にも優れ
ている。
ラーゼは澱粉を加水分解し、澱粉を液化させる酵素とし
て古くから知られ、従来から、澱粉工業、アルコール製
造工業、繊維工業、食品加工業など、産業上広範に用い
られている重要な酵素である。特に、食品分野におい
て、澱粉分解物、特にマルトオリゴ糖(グルコースのα
−１,４結合したもので重合度２〜１０のもの)は、低甘
味(砂糖を１００とした場合、１０〜３０)で、かつ低粘
度という性質を有しているため、食品改良剤として用い
られている。その上、溶解性も高く、マルトトリオース
(Ｇ３)を含んでいるものはその性質上、保湿性にも優れ
ている。
【０００３】ところが、今まで一段の酵素反応でマルト
オリゴ糖を生成する型のアミラーゼは、澱粉に作用させ
ると、その分解物にグルコース(Ｇ１)やマルトース(Ｇ
２)が組成比で約２０〜３０重量％(以下、特に断らない
限り％は重量％である)程度含まれるのが普通である。
この場合、これらの糖が食品中に含まれてしまうことに
より、甘味度の上昇やアミノ酸、タンパク質との反応に
よる褐変現象(メイラード反応)、異性化など食品の風
味、外観において悪影響を及ぼすことになる。
オリゴ糖を生成する型のアミラーゼは、澱粉に作用させ
ると、その分解物にグルコース(Ｇ１)やマルトース(Ｇ
２)が組成比で約２０〜３０重量％(以下、特に断らない
限り％は重量％である)程度含まれるのが普通である。
この場合、これらの糖が食品中に含まれてしまうことに
より、甘味度の上昇やアミノ酸、タンパク質との反応に
よる褐変現象(メイラード反応)、異性化など食品の風
味、外観において悪影響を及ぼすことになる。
【０００４】現在までにマルトオリゴ糖生成型アミラー
ゼの中で、比較的Ｇ１やＧ２の生成が少なく、Ｇ３以上
のオリゴ糖を生成するものが幾つか存在している[特開
昭６３−２３７７８６号公報、Ｙoshiyuki Ｔakahashi,
Ａgric. Ｂiol. Ｃhem., ４７, ２１９３−２１９９
(１９８３)など]。しかし、得られる分解物におけるＧ
１とＧ２の組成比が１０％を下回るものは知られていな
い。
ゼの中で、比較的Ｇ１やＧ２の生成が少なく、Ｇ３以上
のオリゴ糖を生成するものが幾つか存在している[特開
昭６３−２３７７８６号公報、Ｙoshiyuki Ｔakahashi,
Ａgric. Ｂiol. Ｃhem., ４７, ２１９３−２１９９
(１９８３)など]。しかし、得られる分解物におけるＧ
１とＧ２の組成比が１０％を下回るものは知られていな
い。
【０００５】また、酸性領域に至適pＨが存在している
アミラーゼが幾つか知られている[特開昭６０−２１８
２号公報、特開昭６１−１１５４８４号公報、特開昭６
２−９１１８１号公報、特開昭６３−１９６２８８号公
報、Ａgric. Ｂiol. Ｃhem.,４６, ７−１３(１９８
２); Ｊ. Ｂacteriol., １２８, ５１５−５２１(１９
７６); Ｓtarch Ｉstaerke, ３１, １６６−１７１(１
９７９)]。しかし、それを用いた分解物はいずれも一般
のアミラーゼと大差がない。また、特開平４−６６０８
４号公報にも新規な酸性アミラーゼが開示されている
が、それによる澱粉分解物には依然としてＧ１やＧ２が
含まれる。
アミラーゼが幾つか知られている[特開昭６０−２１８
２号公報、特開昭６１−１１５４８４号公報、特開昭６
２−９１１８１号公報、特開昭６３−１９６２８８号公
報、Ａgric. Ｂiol. Ｃhem.,４６, ７−１３(１９８
２); Ｊ. Ｂacteriol., １２８, ５１５−５２１(１９
７６); Ｓtarch Ｉstaerke, ３１, １６６−１７１(１
９７９)]。しかし、それを用いた分解物はいずれも一般
のアミラーゼと大差がない。また、特開平４−６６０８
４号公報にも新規な酸性アミラーゼが開示されている
が、それによる澱粉分解物には依然としてＧ１やＧ２が
含まれる。
【０００６】最近、ある種のラクトバチルス属の微生物
が特異的な澱粉分解能を有することが報告されたが
(Ｊ．Ｆerment．Ｂioeng., ７３, ３, １９３−１９７
(１９９２))。しかしながら、その酵素は未だ単離され
るに至っていない。本発明者らは、かかるラクトバチル
ス属の微生物の酵素ついて研究を重ねる間に、当該微生
物が、酸性側で安定な、比較的高分子量の新規なアミラ
ーゼを産生することを見出し、その単離に成功した。ま
た、当該アミラーゼがＧ１やＧ２を殆ど含まない澱粉分
解物を生成することを見出した。
が特異的な澱粉分解能を有することが報告されたが
(Ｊ．Ｆerment．Ｂioeng., ７３, ３, １９３−１９７
(１９９２))。しかしながら、その酵素は未だ単離され
るに至っていない。本発明者らは、かかるラクトバチル
ス属の微生物の酵素ついて研究を重ねる間に、当該微生
物が、酸性側で安定な、比較的高分子量の新規なアミラ
ーゼを産生することを見出し、その単離に成功した。ま
た、当該アミラーゼがＧ１やＧ２を殆ど含まない澱粉分
解物を生成することを見出した。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記本発明者
らの知見に基づいて完成されたものであって、次の性質
を有するラクトバチルスＬ−１３７株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３４２５）が生産する新規な酸性アミラーゼ： （１）至適ｐＨ３．５〜４．５、 （２）ｐＨ３．５〜５．０の範囲で最大活性の５０％を
保持、 （３）作用温度３０℃〜４５℃で、至適作用温度３５℃
付近、 （４）ｐＨ６以上の活性は最大活性の数％以下、 （５）５０℃以上の活性は最大活性の数％以下、 （６）５５℃３０分間の処理で失活、および （７）カラムクロマトグラフィーにより測定した分子量
約１８０，０００〜２２０，０００、を提供するもので
ある。
らの知見に基づいて完成されたものであって、次の性質
を有するラクトバチルスＬ−１３７株（ＦＥＲＭ Ｐ−
１３４２５）が生産する新規な酸性アミラーゼ： （１）至適ｐＨ３．５〜４．５、 （２）ｐＨ３．５〜５．０の範囲で最大活性の５０％を
保持、 （３）作用温度３０℃〜４５℃で、至適作用温度３５℃
付近、 （４）ｐＨ６以上の活性は最大活性の数％以下、 （５）５０℃以上の活性は最大活性の数％以下、 （６）５５℃３０分間の処理で失活、および （７）カラムクロマトグラフィーにより測定した分子量
約１８０，０００〜２２０，０００、を提供するもので
ある。
【０００８】また、本発明はラクトバチルス属に属する
該新規酸性アミラーゼ産生能を有する微生物を培養して
アミラーゼを産生させ、その培養物から該アミラーゼを
回収する該新規アミラーゼの製造法および該アミラーゼ
を澱粉に作用させることにより、マルトトリオース(Ｇ
３)、マルトテトラオース(Ｇ４)およびマルトペンタオ
ース(Ｇ５)を主成分とし、実質的にグルコース(Ｇ１)お
よびマルトース(Ｇ２)を含まない澱粉分解物を得る澱粉
分解物の製造法も提供するものである。以下、本発明を
詳細に説明する。
該新規酸性アミラーゼ産生能を有する微生物を培養して
アミラーゼを産生させ、その培養物から該アミラーゼを
回収する該新規アミラーゼの製造法および該アミラーゼ
を澱粉に作用させることにより、マルトトリオース(Ｇ
３)、マルトテトラオース(Ｇ４)およびマルトペンタオ
ース(Ｇ５)を主成分とし、実質的にグルコース(Ｇ１)お
よびマルトース(Ｇ２)を含まない澱粉分解物を得る澱粉
分解物の製造法も提供するものである。以下、本発明を
詳細に説明する。
【０００９】本発明の新規酸性アミラーゼは、当該アミ
ラーゼ産生能を有するラクトバチルス属に属する微生
物、代表的には上記Ｊ. Ｆerment. Ｂiolog., ７３,
３, １９３−１９７(１９９２)に記載されるラクトバチ
ルスＬ−１３７株により産生される。該菌株は発酵食品
より分離されたラクトバチルスに属する微生物であり、
１９９３年２月１２日に工業技術院生命工学工業技術研
究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２５の寄託番号の下に寄
託されている。この菌株の菌学的性質を表１に示す。
ラーゼ産生能を有するラクトバチルス属に属する微生
物、代表的には上記Ｊ. Ｆerment. Ｂiolog., ７３,
３, １９３−１９７(１９９２)に記載されるラクトバチ
ルスＬ−１３７株により産生される。該菌株は発酵食品
より分離されたラクトバチルスに属する微生物であり、
１９９３年２月１２日に工業技術院生命工学工業技術研
究所に、ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２５の寄託番号の下に寄
託されている。この菌株の菌学的性質を表１に示す。
【００１０】
【表１】
【００１１】また、糖からの酸およびガスの産生は表２
に示すとおりである。
に示すとおりである。
【００１２】
【表２】
【００１３】これらの結果より、「バージエーズ・マニ
ュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジ
ー」第８版に基づいて本菌株はラクトバチルス属の微生
物と同定された。この微生物は、ＤＮＡのグアニンとシ
トシン(Ｇ＋Ｃ)の含量が４５.１％と類似しているラク
トバチルス・プランタラム(Ｌactobacillus plantaru
m)と比較すると、セロビオース、ラクトース、マンニト
ール、メリビオース、キシロース、可溶性澱粉について
の酸の産生が異なる。すなわち、Ｌ−１３７株ではメリ
ビオースおよび可溶性澱粉から酸を産生するのに対し、
ラクトバチルス・プランタラムでは産生しない。また、
セロビオース、ラクトース、マンニトールについては、
Ｌ−１３７株では酸を産生しないのに対し、ラクトバチ
ルス・プランタラムはこれらの糖から酸を産生する。
ュアル・オブ・デターミネイティブ・バクテリオロジ
ー」第８版に基づいて本菌株はラクトバチルス属の微生
物と同定された。この微生物は、ＤＮＡのグアニンとシ
トシン(Ｇ＋Ｃ)の含量が４５.１％と類似しているラク
トバチルス・プランタラム(Ｌactobacillus plantaru
m)と比較すると、セロビオース、ラクトース、マンニト
ール、メリビオース、キシロース、可溶性澱粉について
の酸の産生が異なる。すなわち、Ｌ−１３７株ではメリ
ビオースおよび可溶性澱粉から酸を産生するのに対し、
ラクトバチルス・プランタラムでは産生しない。また、
セロビオース、ラクトース、マンニトールについては、
Ｌ−１３７株では酸を産生しないのに対し、ラクトバチ
ルス・プランタラムはこれらの糖から酸を産生する。
【００１４】以上のことから、ラクトバチルスＬ−１３
７株はラクトバチルス属の新規な微生物とされており、
本菌株の産生する本発明の酸性アミラーゼも、その至適
pＨ、分子量および特異的な澱粉分解物を生成するとこ
ろから、従来の酸性アミラーゼとは異なる新規なもので
ある。
７株はラクトバチルス属の新規な微生物とされており、
本菌株の産生する本発明の酸性アミラーゼも、その至適
pＨ、分子量および特異的な澱粉分解物を生成するとこ
ろから、従来の酸性アミラーゼとは異なる新規なもので
ある。
【００１５】本発明の酸性アミラーゼの詳細な酵素学的
性質は以下のとおりである。 作用および基質特異性 可溶性澱粉および糊化澱粉に作用するが、未糊化澱粉に
は作用しない。また、プルラン、グリコーゲンにも作用
する。
性質は以下のとおりである。 作用および基質特異性 可溶性澱粉および糊化澱粉に作用するが、未糊化澱粉に
は作用しない。また、プルラン、グリコーゲンにも作用
する。
【００１６】作用ｐＨ
本酵素を０.３％可溶性澱粉存在下、グリシン・塩酸緩
衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液中で４０℃で３０分反
応させると、pＨ３.５において最大活性の７０％を示
し、pＨ４.０〜５.０において８０％の活性を有する
が、pＨ３以下および５.５以上で急激な活性の低下がみ
られ、pＨ２.０および６.０では活性を示さない。
衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液中で４０℃で３０分反
応させると、pＨ３.５において最大活性の７０％を示
し、pＨ４.０〜５.０において８０％の活性を有する
が、pＨ３以下および５.５以上で急激な活性の低下がみ
られ、pＨ２.０および６.０では活性を示さない。
【００１７】pＨ安定性
本酵素をグリシン・塩酸緩衝液、酢酸緩衝液、リン酸緩
衝液を用いて、氷中１６時間放置すると、その残存活性
は、pＨ３.５〜５.０において最大活性の５０％以上で
ある。
衝液を用いて、氷中１６時間放置すると、その残存活性
は、pＨ３.５〜５.０において最大活性の５０％以上で
ある。
【００１８】作用温度
本酵素のpＨ４.５における至適温度は３５℃付近であ
り、７０％以上の活性を有する温度は４５℃までであ
る。活性は５０℃以上で急激に低下し、５５℃での活性
は殆どみられない。
り、７０％以上の活性を有する温度は４５℃までであ
る。活性は５０℃以上で急激に低下し、５５℃での活性
は殆どみられない。
【００１９】温度安定性
本酵素をpＨ４.０および５mＭカルシウムイオン存在下
で２０℃〜６０℃で３０分間放置後の活性は、４０℃ま
でほぼ最大活性に近く、４５℃以上で急激に低下し、５
０℃以上では完全に失活する。
で２０℃〜６０℃で３０分間放置後の活性は、４０℃ま
でほぼ最大活性に近く、４５℃以上で急激に低下し、５
０℃以上では完全に失活する。
【００２０】分子量
本酵素の分子量は、ゲル濾過カラムクロマトグラフィー
(セファロースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア社製)における
移動度より、約１５０,０００〜３００,０００、好まし
くは１８０,０００〜２２０,０００、さらに好ましくは
２００,０００前後である。
(セファロースＣＬ−４Ｂ、ファルマシア社製)における
移動度より、約１５０,０００〜３００,０００、好まし
くは１８０,０００〜２２０,０００、さらに好ましくは
２００,０００前後である。
【００２１】本酵素による澱粉分解物
本酵素を１％可溶性澱粉存在下、pＨ４.５、５０mＭ酢
酸緩衝液で４０℃、６０分間反応させた場合の分解物
は、Ｇ３、Ｇ４およびＧ５が主成分(組成比が約９０％)
であり、Ｇ１およびＧ２は５％以下である。
酸緩衝液で４０℃、６０分間反応させた場合の分解物
は、Ｇ３、Ｇ４およびＧ５が主成分(組成比が約９０％)
であり、Ｇ１およびＧ２は５％以下である。
【００２２】かくして、本発明の酸性アミラーゼを製造
するには、該アミラーゼ産生能を有するラクトバチルス
属に属する微生物、代表的にはラクトバチルスＬ−１３
７株であり、または該アミラーゼ産生能を有する、例え
ば、化学的変異手段、遺伝子操作技法等の公知手段によ
るその変異株を培地で培養する。用いる培地の組成は特
に限定するものではなく、ラクトバチルス属の微生物培
養に通常用いられるものが使用できる。例えば、窒素源
としては、コーン・スティープ・リカー、ポリペプト
ン、肉汁エキス、酵母エキス、カザミノ酸が使用でき、
炭素源としては、グルコース、マルトース、乳糖、各種
澱粉、可溶性澱粉、澱粉液化液、デキストリン等が使用
できる。これらの窒素源、炭素源の他に各種塩(マグネ
シウム塩、マンガン塩、鉄塩、ナトリウム塩など)や各
種ビタミンを必要により添加してもよい。
するには、該アミラーゼ産生能を有するラクトバチルス
属に属する微生物、代表的にはラクトバチルスＬ−１３
７株であり、または該アミラーゼ産生能を有する、例え
ば、化学的変異手段、遺伝子操作技法等の公知手段によ
るその変異株を培地で培養する。用いる培地の組成は特
に限定するものではなく、ラクトバチルス属の微生物培
養に通常用いられるものが使用できる。例えば、窒素源
としては、コーン・スティープ・リカー、ポリペプト
ン、肉汁エキス、酵母エキス、カザミノ酸が使用でき、
炭素源としては、グルコース、マルトース、乳糖、各種
澱粉、可溶性澱粉、澱粉液化液、デキストリン等が使用
できる。これらの窒素源、炭素源の他に各種塩(マグネ
シウム塩、マンガン塩、鉄塩、ナトリウム塩など)や各
種ビタミンを必要により添加してもよい。
【００２３】本発明に使用する微生物の生育初発pＨお
よび生育pＨは弱酸性であるので、適当なpＨ調整剤
(例、炭酸カルシウム等)を用いて培地のpＨを６.０〜
７.０、好ましくは６.２〜６.６に調整する必要があ
り、酢酸ナトリウムのような各種緩衝液を用いることも
できる。
よび生育pＨは弱酸性であるので、適当なpＨ調整剤
(例、炭酸カルシウム等)を用いて培地のpＨを６.０〜
７.０、好ましくは６.２〜６.６に調整する必要があ
り、酢酸ナトリウムのような各種緩衝液を用いることも
できる。
【００２４】培養は静置培養、緩やかな振とう培養のよ
うな通常の培養法が採用でき、温度約２０℃〜４０℃、
好ましくは３０℃で２０時間〜７２時間程度の培養によ
り培地中に酸性アミラーゼが分泌され、蓄積される。培
養後、遠心分離等の常套の分離手段により菌体を除去す
る。得られた粗酵素液は、そのまま本発明の酸性アミラ
ーゼとしての活性を有するが、所望により、硫酸アンモ
ウニム等の塩析、エタノール、アセトンなどの溶媒沈澱
法、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等の一般的な酵素精製法により
精製することもできる。
うな通常の培養法が採用でき、温度約２０℃〜４０℃、
好ましくは３０℃で２０時間〜７２時間程度の培養によ
り培地中に酸性アミラーゼが分泌され、蓄積される。培
養後、遠心分離等の常套の分離手段により菌体を除去す
る。得られた粗酵素液は、そのまま本発明の酸性アミラ
ーゼとしての活性を有するが、所望により、硫酸アンモ
ウニム等の塩析、エタノール、アセトンなどの溶媒沈澱
法、限外濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル
濾過クロマトグラフィー等の一般的な酵素精製法により
精製することもできる。
【００２５】また、得られた酵素を公知の酵素剤調製法
により、要すれば、適当な担体、希釈剤、賦形剤と共に
液体や固体の製剤としてもよく、また、固定化酵素とし
てもよく、そのような酵素も本発明の範囲内のものであ
る。
により、要すれば、適当な担体、希釈剤、賦形剤と共に
液体や固体の製剤としてもよく、また、固定化酵素とし
てもよく、そのような酵素も本発明の範囲内のものであ
る。
【００２６】本発明における澱粉分解物の製造は、該酵
素の活性条件下、例えば、pＨ３〜５、温度２０〜４５
℃で、該酵素を、例えば、バッチ式または連続式で澱粉
に作用させることにより製造できる。用いる澱粉は、特
に、限定するものではなく、例えば、可溶性澱粉、デキ
ストリン等が挙げられ、通常、固形分濃度０.５〜３０
％程度で０.５〜２時間酵素を作用させるとＧ３〜Ｇ５
を主成分(例、含量８０％以上)とし、実質的にＧ１およ
びＧ２を含まない(例、５％以下)所望の澱粉分解物が得
られる。
素の活性条件下、例えば、pＨ３〜５、温度２０〜４５
℃で、該酵素を、例えば、バッチ式または連続式で澱粉
に作用させることにより製造できる。用いる澱粉は、特
に、限定するものではなく、例えば、可溶性澱粉、デキ
ストリン等が挙げられ、通常、固形分濃度０.５〜３０
％程度で０.５〜２時間酵素を作用させるとＧ３〜Ｇ５
を主成分(例、含量８０％以上)とし、実質的にＧ１およ
びＧ２を含まない(例、５％以下)所望の澱粉分解物が得
られる。
【００２７】得られた分解物はその主成分がマルトトリ
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオースであ
り、グルコース、マルトースを殆ど含んでいないので、
低甘味度、吸湿性の向上等のすぐれた特性を有し、食品
改良剤等として使用でき、医薬等の分野における使用も
期待できる。
オース、マルトテトラオース、マルトペンタオースであ
り、グルコース、マルトースを殆ど含んでいないので、
低甘味度、吸湿性の向上等のすぐれた特性を有し、食品
改良剤等として使用でき、医薬等の分野における使用も
期待できる。
【００２８】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく
説明するが、これに限定されるものではない。なお、本
明細書において、アミラーゼ活性の測定は次のようにし
て行った。１％の可溶性澱粉(ナカライテスク(株)製ア
ミラーゼ定量用)５０μlと、０.１Ｍ酢酸ナトリウム−
酢酸緩衝液(所定のpＨに調整したもの)７５μlとを混合
し、４０℃５分間保温した。ついで、酵素液２５μlを
添加し、所定の温度で所定の時間反応させ、直ちに１.
０Ｎ水酸化ナトリウム５０μlと混合し反応を停止さ
せ、ソモジー・ネルソン(Ｓomogyi−Ｎelson)法で反応
液の還元糖を測定した。酵素１単位(unit)は１分間に１
μmolのグルコースを生成する酵素量とした。
説明するが、これに限定されるものではない。なお、本
明細書において、アミラーゼ活性の測定は次のようにし
て行った。１％の可溶性澱粉(ナカライテスク(株)製ア
ミラーゼ定量用)５０μlと、０.１Ｍ酢酸ナトリウム−
酢酸緩衝液(所定のpＨに調整したもの)７５μlとを混合
し、４０℃５分間保温した。ついで、酵素液２５μlを
添加し、所定の温度で所定の時間反応させ、直ちに１.
０Ｎ水酸化ナトリウム５０μlと混合し反応を停止さ
せ、ソモジー・ネルソン(Ｓomogyi−Ｎelson)法で反応
液の還元糖を測定した。酵素１単位(unit)は１分間に１
μmolのグルコースを生成する酵素量とした。
【００２９】実施例１
可溶性澱粉１０g、ポリペプトン５g、酵母エキス５g、
および金属溶液(硫酸マグネシウム１１５g、硫酸マンガ
ン２４g、塩化ナトリウム２４g、硫酸第一鉄２gを１リ
ットルの水に溶かしたもの)５mlを１リットルの水に溶
かした液体培地(pＨ６.５)に、pＨ調整剤として炭酸カ
ルシウム２０gを添加した。ラクトバチルスＬ−１３７
株を植菌後、３０℃で２日間、静置培養を行った。培養
後、培養液を７０００rpmで遠心分離し、菌体における
未使用の炭酸カルシウムを除去した。ついで、培養上清
に最終濃度が５０mＭ酢酸緩衝液(pＨ４.５)および１mＭ
フッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)となるよう
にこれらを添加し、排除分子量:５万の限外濾過膜(東洋
濾紙(株)製)で限外濃縮を行なった。これを陰イオン交
換クロマトグラフィー(ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ
−６Ｂ ファルマシア製)に付し、０〜０．５Ｍ塩化ナ
トリウムの直線濃度勾配を用いて分画した。活性画分を
回収後、上記の限外濾過膜で脱塩濃縮し、ゲル濾過クロ
マトグラフィー(セファロース ＣＬ−４Ｂ ファルマ
シア製)を行った。ゲル濾過によるアミラーゼ活性を有
するピークの比活性は、１８.５unit／mgであり、培養
上清から比較すると約６００倍と比活性が向上した。
および金属溶液(硫酸マグネシウム１１５g、硫酸マンガ
ン２４g、塩化ナトリウム２４g、硫酸第一鉄２gを１リ
ットルの水に溶かしたもの)５mlを１リットルの水に溶
かした液体培地(pＨ６.５)に、pＨ調整剤として炭酸カ
ルシウム２０gを添加した。ラクトバチルスＬ−１３７
株を植菌後、３０℃で２日間、静置培養を行った。培養
後、培養液を７０００rpmで遠心分離し、菌体における
未使用の炭酸カルシウムを除去した。ついで、培養上清
に最終濃度が５０mＭ酢酸緩衝液(pＨ４.５)および１mＭ
フッ化フェニルメチルスルホニル(ＰＭＳＦ)となるよう
にこれらを添加し、排除分子量:５万の限外濾過膜(東洋
濾紙(株)製)で限外濃縮を行なった。これを陰イオン交
換クロマトグラフィー(ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ
−６Ｂ ファルマシア製)に付し、０〜０．５Ｍ塩化ナ
トリウムの直線濃度勾配を用いて分画した。活性画分を
回収後、上記の限外濾過膜で脱塩濃縮し、ゲル濾過クロ
マトグラフィー(セファロース ＣＬ−４Ｂ ファルマ
シア製)を行った。ゲル濾過によるアミラーゼ活性を有
するピークの比活性は、１８.５unit／mgであり、培養
上清から比較すると約６００倍と比活性が向上した。
【００３０】実施例２
各種pＨ緩衝液(０.１Ｍ)７５μl、１％可溶性澱粉５０
μl、酵素液(ゲル濾過精製品)２５μlで、４０℃にて、
３０分間反応させ、還元糖の増加をソモジー・ネルソン
法で測定することによって、各種pＨにおける酵素活性
を比較した。なお、pＨ３.５における活性を１００％と
して比較した。結果を表３に示す。
μl、酵素液(ゲル濾過精製品)２５μlで、４０℃にて、
３０分間反応させ、還元糖の増加をソモジー・ネルソン
法で測定することによって、各種pＨにおける酵素活性
を比較した。なお、pＨ３.５における活性を１００％と
して比較した。結果を表３に示す。
【００３１】
【表３】
【００３２】実施例３
０.１Ｍ酢酸緩衝液７５μl、１％可溶性澱粉５０μl、
酵素液(１unit／ml)２５μlを各温度、３０分反応さ
せ、還元糖の増加をソモジー・ネルソン法で測定するこ
とによって、各温度における酵素活性を比較した。な
お、３５℃における酵素活性を１００％とした。結果を
表４に示す。
酵素液(１unit／ml)２５μlを各温度、３０分反応さ
せ、還元糖の増加をソモジー・ネルソン法で測定するこ
とによって、各温度における酵素活性を比較した。な
お、３５℃における酵素活性を１００％とした。結果を
表４に示す。
【００３３】
【表４】
【００３４】実施例４
０.１Ｍ酢酸緩衝液(pＨ４.５)１.５ml、１％可溶性澱粉
１ml、酵素液(１unit／ml)０.５mlを４０℃、６０分間
反応させ、反応生成物を高速液体クロマトグラフィーで
確認した。カラムはＡsahipak ＮＨ2Ｐ−５０(旭化成
製)で行ない、アセトニリトル／水(６０:４０)で溶出
し、示差屈折計により検出し、データ処理装置で組成比
を求めた。結果を表５に示す。
１ml、酵素液(１unit／ml)０.５mlを４０℃、６０分間
反応させ、反応生成物を高速液体クロマトグラフィーで
確認した。カラムはＡsahipak ＮＨ2Ｐ−５０(旭化成
製)で行ない、アセトニリトル／水(６０:４０)で溶出
し、示差屈折計により検出し、データ処理装置で組成比
を求めた。結果を表５に示す。
【００３５】
【表５】
【００３６】Ｇ１:グルコース Ｇ２:マルトース Ｇ
３:マルトトリオース Ｇ４:マルトテトラオース Ｇ５:マルトペンタオース Ｇ６:マルトヘキサオース
３:マルトトリオース Ｇ４:マルトテトラオース Ｇ５:マルトペンタオース Ｇ６:マルトヘキサオース
【００３７】実施例５
０.１Ｍ酢酸緩衝液(pＨ４.５)７５μl、１％各種基質溶
液５０μlおよび酵素液(１unit／ml)２５μlを４０℃、
３０分間反応させたときに生じる還元糖量をソモジー・
ネルソン法で測定することにより、分解性を比較した。
なお、可溶性澱粉の場合を１００％とした。結果を表６
に示す。
液５０μlおよび酵素液(１unit／ml)２５μlを４０℃、
３０分間反応させたときに生じる還元糖量をソモジー・
ネルソン法で測定することにより、分解性を比較した。
なお、可溶性澱粉の場合を１００％とした。結果を表６
に示す。
【００３８】
【表６】
【００３９】
【発明の効果】本発明によれば、新規な酸性アミラーゼ
が提供でき、これにより食品改良剤等として有用な、主
成分がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオースであり、グルコース、マルトースを殆ど含
まない澱粉分解物が得られる。
が提供でき、これにより食品改良剤等として有用な、主
成分がマルトトリオース、マルトテトラオース、マルト
ペンタオースであり、グルコース、マルトースを殆ど含
まない澱粉分解物が得られる。
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 平３−251173（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−226295（ＪＰ，Ａ)
特開 昭63−237786（ＪＰ，Ａ)
特開 平３−219879（ＪＰ，Ａ)
高野光男，デンプン分解型乳酸菌およ
びその酵素の利用，食品科学振興財団年
報，1989年、第1987巻，第173−175頁
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ， 1981， Ｖｏ
ｌ．32， ｐ．47−62
Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎ
ｇ．， 1992， Ｖｏｌ．73， Ｎｏ.
３， ｐ．193−197
Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏ
ｌ．， 1983， Ｖｏｌ．55， Ｎｏ.
３， ｐ．487−493
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/00 - 9/99
C12P 19/14
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (3)
- 【請求項１】 次の性質を有するラクトバチルスＬ−１
３７株（ＦＥＲＭＰ−１３４２５）が生産する酸性アミ
ラーゼ： （１）至適ｐＨ３．５〜４．５、 （２）ｐＨ３．５〜５．０の範囲で最大活性の５０％を
保持、 （３）作用温度３０℃〜４５℃で、至適作用温度３５℃
付近、 （４）ｐＨ６以上の活性は最大活性の数％以下、 （５）５０℃以上の活性は最大活性の数％以下、 （６）５５℃３０分間の処理で失活、および （７）カラムクロマトグラフィーにより測定した分子量
約１８０，０００〜２２０，０００。 - 【請求項２】 ラクトバチルスＬ−１３７株（ＦＥＲＭ
Ｐ−１３４２５）を培養して酸性アミラーゼを産生さ
せ、その培養物から該アミラーゼを回収することを特徴
とする請求項１記載の酸性アミラーゼの製造法。 - 【請求項３】 請求項１記載のラクトバチルスＬ−１３
７株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３４２５）が生産する酸性アミ
ラーゼを澱粉に作用させることにより、マルトトリオー
ス、マルトテトラオースおよびマルトペンタオースを主
成分とし、実質的にグルコースおよびマルトースを含ま
ない澱粉分解物を得ることを特徴とする澱粉分解物の製
造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP06797493A JP3469265B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-03-26 | 酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3168893 | 1993-02-22 | ||
| JP5-31688 | 1993-02-22 | ||
| JP06797493A JP3469265B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-03-26 | 酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06296486A JPH06296486A (ja) | 1994-10-25 |
| JP3469265B2 true JP3469265B2 (ja) | 2003-11-25 |
Family
ID=30002089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP06797493A Expired - Fee Related JP3469265B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-03-26 | 酸性アミラーゼ、その製造法およびそれを用いた澱粉分解物の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3469265B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2785294B1 (fr) * | 1998-10-30 | 2003-04-18 | Orstom | Procede de production de farines lactiques et produits obtenus |
| JP2010119350A (ja) * | 2008-11-20 | 2010-06-03 | Hiroshima Prefecture | マルトオリゴ糖高含有乳酸発酵物、その製造方法及びそれを含有する飲食品、飼料、又はこれらの原材料 |
| WO2023190332A1 (ja) * | 2022-03-29 | 2023-10-05 | 株式会社ヤクルト本社 | 発酵食品及びその製造方法 |
-
1993
- 1993-03-26 JP JP06797493A patent/JP3469265B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．， １９８３， Ｖｏｌ．５５， Ｎｏ．３， ｐ．４８７−４９３ |
| Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．， １９９２， Ｖｏｌ．７３， Ｎｏ．３， ｐ．１９３−１９７ |
| Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ， １９８１， Ｖｏｌ．３２， ｐ．４７−６２ |
| 高野光男，デンプン分解型乳酸菌およびその酵素の利用，食品科学振興財団年報，１９８９年、第１９８７巻，第１７３−１７５頁 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06296486A (ja) | 1994-10-25 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |