JPH0937773A

JPH0937773A - ムタナーゼ産生微生物及びムタナーゼ

Info

Publication number: JPH0937773A
Application number: JP21537095A
Authority: JP
Inventors: Motoyasu Odera; 基靖大寺; Hiromitsu Kikawa; 博光木川; Isao Shimotsuura; 勇雄下津浦; Yoshiko Yokobori; 佳子横堀; Yoshio Asai; 芳男浅井
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1995-08-01
Filing date: 1995-08-01
Publication date: 1997-02-10

Abstract

(57)【要約】【解決手段】バチルス・エスピーＲＭ４株（生命研菌
寄第１４８３７号）を培養し、その培養物からムタンの
α−１，３−グルコシド結合をよく分解し、ｐＨ４．
５、６５℃で作用が至適で、ｐＨ４〜１１、６０℃以下
で活性が安定であり、水銀、銀、ｐ−クロロマーキュリ
ー安息香酸により作用が阻害され、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動による分子量が約１４万であるム
タナーゼを採取する。【効果】本発明のムタナーゼ産生微生物は、優れた歯
垢形成抑制効果を有し、口腔用組成物の製品として充分
に安定的に配合可能な新規ムタナーゼを得ることがで
き、本発明のムタナーゼはデキストラナーゼとの併用に
より相乗的な歯垢除去効果を示す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規なムタナーゼ
産生微生物及び新規ムタナーゼに関し、詳しくは、土壌
より分離して得られるバチルス属に属し、その菌株を培
養することによりムタナーゼを産生する新規なムタナー
ゼ産生微生物及び該微生物の菌株を培養することにより
得られ、歯磨等の口腔用組成物に安定的に配合できる新
規なムタナーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】口腔中
に存在する細菌であるストレプトコッカス・ミュータン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）やス
トレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ）等とこれらの菌から産生さ
れる不溶性グルカンからなる歯垢とが、う触形成の要因
の一つと推定されている。う触は、歯垢部位において細
菌に由来する酸が産生し、さらにはそれが歯牙を脱灰す
ることにより生じる。

【０００３】その歯垢を除去する手法の一つとして、歯
垢を形成する多糖である不溶性グルカンを酵素を用いて
分解することが有効である。不溶性グルカンは、グルコ
ースが主にα−１，６−グルコシド結合とα−１，３−
グルコシド結合を有するグルカンが複雑にからみあって
形成されているが、従来より、α−１，６−グルコシド
結合を切断するデキストラナーゼ、及び、α−１，３結
合を切断するムタナーゼが、それぞれ歯垢形成抑制効果
を持つことが知られており、これらを単独で配合した口
腔用組成物が提案されている（特許第７８２１５４号明
細書、同第１０５５３６５号明細書等）。

【０００４】また、歯垢に対する作用点の異なるデキス
トラナーゼとムタナーゼとを併用することによって、各
々を単独で用いるよりも高い歯垢形成抑制効果が得られ
ることも知られている（特開昭５７−１６５３１２号公
報）。

【０００５】しかしながら、実際には、これまで上市さ
れているムタナーゼは、ごく一部に限定されており、ま
たムタナーゼを配合した歯磨等の口腔用組成物の製品と
して上市されているムタナーゼ配合組成物もない。何故
ならば、現在上市されているムタナーゼは、歯磨、ある
いは洗口剤などの口腔用組成物中に配合するのに必要な
安定性、例えば耐熱性や組成中での安定性が不十分であ
り、未だかかる製品の安定供給には至っていないからで
ある。

【０００６】本発明は、上記事情に鑑みなされたもの
で、歯垢形成の予防や歯垢の除去に有効で、且つ歯磨等
の口腔用組成物に安定的に配合できる新規なムタナーゼ
及び土壌より分離して得られるバチルス属に属し、その
菌株を培養することにより上記ムタナーゼを産生する新
規なムタナーゼ産生微生物を提供することを目的とする
ものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明者らは上記目的を達成するため鋭意検討を行い、歯
磨・洗口剤等の口腔用組成物の配合成分の共存下にあっ
て優れた安定性を有し、且つ歯垢分解に有効性の高いム
タナーゼを産生する微生物を自然界より広く探索した結
果、公知のムタナーゼよりも歯垢除去能力が高く、且つ
熱安定性にも優れた新規ムタナーゼを培地中に産生する
下記微生物を見い出し、本発明をなすに至った。

【０００８】即ち、本発明は、［Ａ］バチルス属に属す
ると共に、グラム染色性が陰性で、生育ｐＨが５〜７．
５であり、且つプロテアーゼ産生が陰性であることを特
徴とするムタナーゼ産生微生物、［Ｂ］バチルス・エス
ピーＲＭ４株（生命研菌寄第１４８３７号）及び［Ｃ］
下記の理化学的性質を有することを特徴とするムタナー
ゼを提供する。（１）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分
解する性質を有する。（２）基質特異性：ムタンをよく分解する。（３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が至適で
あり、ｐＨ４〜７の範囲で高い活性を示す。（４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
ｐＨ４〜１１の範囲で安定である。（５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度６５℃において作用が至適である。（６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理する場合、
６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活する。（７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀又は銀により作用が阻害される。（８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。（９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１４万である。

【０００９】以下、本発明につき更に詳述すると、本発
明のムタナーゼ産生微生物は自然界より分離採取したも
のであり、バチルス属に属すると共に、グラム染色性が
陰性で、生育ｐＨが５〜７．５であり、且つプロテアー
ゼ産生が陰性であることを特徴とするムタナーゼ産生微
生物、特に上記（１）〜（９）の特性を有するムタナー
ゼを産生するという特性により、他のムタナーゼ産生微
生物と差別化される。その菌株の菌学的性質は以下の通
りである。

【００１０】なお、菌学的性質および分類方法はヴァー
ジズマニュアルオブシステマチックバクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（１９
８４）、ザジーナスバチルス（ＴｈｅＧｅｎｕｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（１９７３）に準じて行った。

【００１１】Ａ．形態的性質肉汁寒天培地上で４０℃にて２日間培養したとき、以下
の形態的特徴が観察される。（１）細胞の形及び大きさ：桿菌であり、大きさは０．
６〜１μｍ×３〜４μｍである。（２）多形性：なし。（３）運動性：周鞭毛、運動性あり。（４）胞子：胞子を形成し、胞子の形は楕円形で、その
部位は中立〜亜端立で胞子嚢の膨潤が認められる。胞子
の大きさは１μｍ×１．２〜１．７μｍである。（５）グラム染色性：陰性である。（６）抗酸性：陰性である。

【００１２】Ｂ．培養的性質（１）肉汁寒天平板培養：円形、扁平状、全縁のコロニ
ーを形成する。該コロニーは、中心部が乳白色、周辺部
外側が半透明の乳白色で、光択があり、粘質である。（２）肉汁寒天斜面培養：拡帯状に生育し、白〜クリー
ム色のコロニーを形成する。（３）肉汁液体培養：生育するが、菌膜は形成しない。（４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育しているが、液化し
ない。（５）リトマス・ミルク：変色しない。液化しない。

【００１３】Ｃ．生理学的性質（１）硝酸塩の還元：陰性（２）脱窒反応：陰性（３）ＭＲテスト：陰性（４）ＶＰテスト：陰性（５）ＶＰブロスのｐＨ：６．９８（６）インドールの生成：検出せず。（７）硫化水素の生成：検出せず。（８）デンプンの加水分解：陽性（９）クエン酸の利用：シモンズ（Ｓｉｍｍｏｎｓ）培
地では利用しない。クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎ）培地では利用しない。（１０）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用する。アンモ
ニウム塩は利用する。（１１）色素の生成：陰性（１２）ウレアーゼ：陰性（１３）オキシダーゼ：微弱（１４）カタラーゼ：陽性（１５）生育の範囲：ｐＨ５〜７．５、２５〜５３℃で
生育する。（１６）酸素に対する態度：好気性（１７）Ｏ−Ｆテスト：好気的に分解（１８）糖類から酸及びガスの生成：下記表１に示す通
りである。なお、表１において、「＋」は酸又はガスを
生成することを示し、「−」は酸又はガスを生成しない
ことを示す。

【００１４】

【表１】

【００１５】Ｄ．その他の性質（１）塩化ナトリウムの耐性：寒天培地において、２％
塩化ナトリウム存在下で生育し、５％塩化ナトリウム存
在下では生育しない。（２）嫌気下での生育：陰性（３）カゼイン分解：陰性（４）プロピオン酸塩の利用：陰性（５）ｐＨ６．８での生育：陽性（６）ｐＨ５．７での生育：陽性（７）クリスタル形成：陰性（８）プロテアーゼ産生：陰性

【００１６】次に、本発明のムタナーゼ産生微生物の菌
株と公知の菌株との相違を述べる。公知のムタナーゼ産
生微生物として、細菌のシュードモナス属、フラボバク
テリウム属、バチルス属、放線菌のストレプトミセス
属、かびのトリコデルマ属、アスペルギルス属などが知
られている。

【００１７】まず、本発明のムタナーゼ産生微生物と同
じバチルス属の菌株バチルス・サーキュランス（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＢＣ−８（以下、Ｂ
Ｃ−８菌という）（特開昭６３−３０１７８８号公報）
について述べると、本発明のムタナーゼ産生微生物はグ
ラム染色性が陰性であるのに対し、ＢＣ−８菌は陽性で
ある。また、本発明のムタナーゼ産生微生物は胞子の部
位が中立〜亜端立であるのに対し、ＢＣ−８菌では亜端
立である。更に、本発明のムタナーゼ産生微生物は５％
ＮａＣｌの生育性が陰性であるのに対し、ＢＣ−８菌は
陽性である。本発明のムタナーゼ産生微生物はＬ−アラ
ビノースからの酸産生が陽性であるのに対し、ＢＣ−８
菌は陰性であり、本発明のムタナーゼ産生微生物はＤ−
キシロースからの酸産生が陽性であるのに対し、ＢＣ−
８菌は陰性である。本発明のムタナーゼ産生微生物は４
５℃の生育性が陽性であるのに対し、ＢＣ−８菌は陰性
である。

【００１８】一方、本発明のムタナーゼ産生微生物と同
じバチルス属に属するバチルス・サーキュランス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）ＦＥＲＭ−Ｐ４７
６５株（以下、ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株という）（特開
昭５５−８８６９３号公報）は、菌株の菌学的性質が不
明であるが、本発明のムタナーゼ産生微生物の菌株が産
生するムタナーゼは、分子量が約１４万であり、至適温
度が６５℃、至適ｐＨが４．５であるのに対し、ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ４７６５株が産生するムタナーゼは、分子量７万
以上で至適温度が３０〜４０℃、至適ｐＨが６．２〜
６．７であることから、本発明のムタナーゼ産生微生物
はＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株とは差別化される。

【００１９】更に、特開昭５２−３４９８０号公報に記
載されたムタナーゼ産生微生物はストレプトミセス属に
属し、特開昭５０−１４５５８３号公報に記載されたム
タナーゼ産生微生物はフラボバクテリウム属に属するも
のであり、特開昭４７−９７４３号公報に記載されたム
タナーゼ産生微生物はトリコデルマ・ハルジアヌム、ペ
ニシリウム・リラシム、ペニシリウム・フニクロサム、
ペニシリウム・メリニイ及びペニシリウム・ヤンシネル
ムであることから、本発明のムタナーゼ産生微生物はこ
れらの公知のムタナーゼ産生微生物と差別化される。

【００２０】以上の点から、本発明のムタナーゼ産生微
生物の菌株は公知の菌株とは相違するものである。

【００２１】本発明者らは新規なムタナーゼ産生微生物
であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｐ．）ＲＭ４株（以下、ＲＭ４株という）を工業技術院
生命工学工業技術研究所へ生命研菌寄第１４８３７号
（ＦＥＲＭＰ−１４８３７）として寄託した。このＲ
Ｍ４株は上記菌学的性質を有するものである。なお、こ
の菌株を分離した土壌の採取場所は群馬県草津温泉であ
り、土壌の採取は１９９４年に行った。

【００２２】そして、上記ＲＭ４株は、次に述べるスク
リーニング法により自然界より分離採取されるものであ
る。

【００２３】スパテル１杯の土壌を５ｍｌの滅菌した生
理食塩水に懸濁し、その懸濁液１００μｌをムタンを加
えた寒天培地に塗布する。４５℃で３〜５日培養し、コ
ロニー周辺に透明な分解帯を生じたものをムタナーゼ産
生微生物として分離し、培養して得られる酵素の特性を
検討することによって優れた歯垢除去能と安定性とを有
するＲＭ４株を選抜した。

【００２４】このＲＭ４株を天然又は合成培地に接種し
て、通常の培養条件により培養することによりムタナー
ゼが産生されるが、培地としては、通常、炭素源、窒素
源、無機塩等の微生物の生育に必要な成分を含んだもの
が好適であり、培地の栄養源としては微生物一般に用い
られるものを使用することができる。このような栄養源
は、例えば炭素源としてグルコース，イノシトール，フ
ルクトース，ムタン，デンプン等を、窒素源としてペプ
トン，大豆粉，酵母エキス等を、無機塩としてリン酸，
ナトリウム，カリウム，マグネシウム等の塩類を挙げる
ことができ、これらを一種単独で又は二種以上を適宜組
み合わせて使用するが、これらの中でも、特にイノシト
ール、ムタン、ペプトン、リン酸塩等が好適に使用され
る。培養液のｐＨは５〜７．５が好ましく、特にｐＨ７
とすると好適である。また、培養温度は３５〜４８℃が
好ましく、特に４０℃が好適である。培養時間は、培養
条件によって異なるが、通常１〜３日が好ましい。

【００２５】次いで、充分にムタナーゼが産生された上
記ＲＭ４株の培養液から遠心分離等により菌体等を取り
除いた上清を本発明のムタナーゼの粗酵素液として得
る。この粗酵素液は、このままでも使用することはでき
るが、更に、公知の分離精製方法、例えば限外濾過膜濃
縮法、減圧濃縮法、硫安等による塩析法、エタノール等
による分画法、等電点沈殿法、カラムクロマト分画法な
どを、単独で又は適宜組み合わせることによって精製酵
素液とすると好適である。なお、この精製処理は、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって単一バン
ドにまで精製されていることが確認できるまで行うこと
が望ましい。

【００２６】なお、本発明のムタナーゼの産生には、上
記ＲＭ４株以外にも、ＲＭ４変異株や該ムタナーゼ遺伝
子を持つ組換え微生物を用いることができる。

【００２７】次に、本発明の新規ムタナーゼは上記
（１）〜（９）の特性を有するものであるが、以下これ
らについて詳述する。

【００２８】まず、ムタナーゼとは、口腔連鎖球菌、特
にう蝕菌であるストレプトコッカス・ミュータンスやス
トレプトコッカス・ソブリナス等によってシュークロー
スから生成する不溶性グルカン（α−１，３−１，６−
グルカン）のα−１，６結合の側鎖を除去した不溶性の
α−１，３−グルカンであるムタンを基質とする酵素で
あるが、本発明の新規ムタナーゼは以下の理化学的性質
を有するものである。なお、下記性質において基質とし
て用いられているムタンは、公知の方法により得られる
ものであり、例えばストレプトコッカス・ミュータンス
又はストレプトコッカス・ソブリナスの培養により産生
された不溶性グルカンのα−１，６−グルコシド結合を
デキストラナーゼで切断して得られるものである。

【００２９】（１）酵素作用ムタナーゼ（α−１，３−グルカナーゼ）にはそのグル
コシド結合の切断パターンから、末端より切断するエキ
ソ型とランダムに切断するエンド型が存在するが、本発
明のムタナーゼは、ムタンのα−１，３−グルコシド結
合をエンド型に分解する性質を有するものと推定され
る。

【００３０】即ち、１００μｌの３％ムタンに５０μｌ
の本発明のムタナーゼ又はムタンのα−１，３−グルコ
シド結合をエキソ型に分解するノボザイム２３４（商品
名：ノボ社製、トリコデルマ・ハルジアヌム菌由来）を
加えて、３７℃において２０時間保温して反応させ、そ
の後、反応生成物を遠心分離して得られる上清を薄層板
にスポットして展開（１−ブタノール：イソプロパノー
ル：水＝４：７：１）し、その薄層板に濃硫酸を噴霧
し、１００℃で５分間加熱することにより、上記反応に
より産生する糖類をＴＬＣによって分析する。この場
合、本発明のムタナーゼのムタン分解物は、ランダムに
分解され、グルコースより低い移動度の位置に帯状の長
いスポットが検出されるのに対し、ノボザイム２３４の
ムタン分解物は、グルコースのスポットを示すことか
ら、本発明のムタナーゼは基質をランダムに分解するエ
ンド型の酵素と推定される。

【００３１】（２）基質特異性本発明のムタナーゼはムタンをよく分解する。即ち、本
発明のムタナーゼ溶液（５００単位／ｍｌ）１００μｌ
に対し、表２に示す各基質溶液１００μｌ（１％溶液）
を３０分間反応させ、還元糖量を以下に示す酵素活性の
測定法に準じて検出すると表２に併記する結果を示す。
なお、表２における相対水解度は、ムタナーゼのムタン
分解に対する遊離の還元量を１００とした場合の各基質
の還元糖量の相対値を意味する。

【００３２】酵素活性の測定法１００μｌのムタナーゼ溶液を１００μｌの３％ムタン
（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５）に加えて、３５℃で１
０分間反応させる。この間、１００回／分で振とうす
る。０．４ｍｌのＤＮＳ溶液（４，６−ジニトロサリチ
ル酸）で反応を停止し、遠心分離を行い、上清を０．５
ｍｌ試験管に移して、ガラス玉を載せて１００℃で１０
分間加熱する。流水中で５分間冷却し、４ｍｌの蒸留水
で希釈してＯＤ₅₃₀の吸光度を測定する。０〜９０μｇ
のグルコース標準液の検量線から力価を求める。１分間
に１μｇの還元糖を生じさせる酵素量を１単位と定義す
る。なお、以下の理化学的諸性質における酵素活性はこ
の方法により測定するものである。

【００３３】

【表２】

【００３４】（３）至適作用ｐＨ本発明のムタナーゼは、下記の各緩衝液で各ｐＨに調整
した３％ムタンに本発明のムタナーゼを５０単位／ｍｌ
となるように加え、３５℃で１０分間反応させ、活性を
測定し、至適ｐＨでの活性を１００％とするときの各ｐ
Ｈでの相対活性を求める場合、図１に示すように、ｐＨ
４．５において作用が至適であり、特にｐＨ４〜７の範
囲で高い活性を示す。緩衝液ｐＨ３〜７：クエン酸−Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液ｐＨ６〜８：ＮａＨ₂ＰＯ₄−Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液ｐＨ９〜１０：グリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ１０〜１１：Ｎａ₂ＨＰＯ₄−ＮａＯＨ緩衝液

【００３５】（４）安定ｐＨ範囲本発明のムタナーゼは、２０ｍＭの上記各緩衝液中に本
発明のムタナーゼを３００単位／ｍｌとなるように加
え、２５℃で２４時間インキュベートした後、活性を測
定し、インキュベート前の活性を１００％として各ｐＨ
での相対活性を求めると、図２に示すように、ｐＨ３〜
１１の範囲でほぼ１００％の残存活性率を示す。

【００３６】（５）至適温度本発明のムタナーゼは、基質となるムタンを溶液全体に
対して３％含有するｐＨ５の０．１Ｍ酢酸緩衝液に本発
明のムタナーゼ酵素を５０単位／ｍｌとなるように加
え、１０分間各温度で反応させ、３７℃での活性を１０
０％として各温度での相対活性を求める場合、図３に示
すように、温度６５℃において作用が至適である。

【００３７】（６）温度安定性本発明のムタナーゼは、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）
に透析した３００単位／ｍｌの本発明のムタナーゼを加
え、各温度で１０分間熱処理し、氷冷した後、熱処理前
の酵素活性を１００％として残存活性率を求める場合、
図４に示すように、６５℃で残存活性率は約８５％とな
り、７５℃で失活するが、３０〜６０℃の残存活性率は
１００％である。

【００３８】（７）金属イオンの影響本発明のムタナーゼは、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）
を使用して本発明のムタナーゼが５０単位／ｍｌとなる
ように調製し、これに各種金属塩を最終濃度が１ｍＭ濃
度になるように添加し、３５℃で３０分間保温処理し、
処理後の各溶液の活性を測定し、金属塩無添加の活性を
１００％として各種金属塩を添加した溶液における相対
活性を求めると、表３に示すように、水銀又は銀を添加
することにより、本発明のムタナーゼの酵素活性が阻害
されることが認められる。

【００３９】

【表３】

【００４０】（８）阻害剤の影響本発明のムタナーゼは、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）
を使用して本発明のムタナーゼが５０単位／ｍｌとなる
ように調製し、これに各種阻害剤を最終濃度が１ｍＭ濃
度になるように添加し、３５℃で３０分間保温処理した
後に、各溶液の残存活性を測定し、阻害剤無添加の活性
を１００％として各溶液の相対活性を求めると、表４に
示すように、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭ
Ｂ）の添加により、酵素活性が特に強く阻害されること
が認められる。

【００４１】

【表４】

【００４２】（９）分子量本発明のムタナーゼは、５〜２０％ポリアクリルアミド
グラジエントゲル（バイオラッド（株）製のレディーメ
イドゲル）を用いて４０ｍＡで１時間泳動し、標準タン
パクとしてシグマ・マーカー・ハイレンジ（シグマ社
製）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により精製した酵素タンパクの分子量を求める場合、分
子量は約１４万であると算定される。

【００４３】なお、本発明のムタナーゼは、上記理化学
的性質を有する限りその産生方法は制限されず、上述し
たようにＲＭ４株等から産生されたものに限られること
なく、例えばＲＭ４株から産生されたムタナーゼに化学
的修飾又は遺伝子組換え等により、より安定且つ有効な
酵素に改質したものも含まれる。

【００４４】本発明のムタナーゼは、上記のような理化
学的性質を備えるものであり、公知のムタナーゼと比較
すると、本発明のムタナーゼと上記ノボザイム２３４と
はムタンのα−１，３−グルコシド結合の切断パターン
が相違する。そして、本発明のムタナーゼは至適温度が
６５℃であるのに対し、上記ＢＣ−８菌由来のムタナー
ゼは４５〜５０℃である。また、上述したように、本発
明のムタナーゼは分子量が約１４万であり、至適温度が
６５℃、至適ｐＨが４．５であるのに対し、上記ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ４７６５株由来のムタナーゼは分子量７万以上で
至適温度が３０〜４０℃、至適ｐＨが６．２〜６．７で
ある。更に、特開昭５２−３４９８０号、同５０−１４
５５８３号又は同４７−９７４３号公報に記載されたム
タナーゼは、それぞれストレプトミセス属又はフラボバ
クテリウム属に属する微生物又はトリコデルマ・ハルジ
アヌム、ペニシリウム・リラシム、ペニシリウム・フニ
クロサム、ペニシリウム・メリニイ及びペニシリウム・
ヤンシネルムにより産生されたものであり、例えば本発
明のムタナーゼは至適ｐＨが４．５、安定ｐＨ領域が４
〜１１であるのに対し、特開昭５２−３４９８０号公報
のムタナーゼは至適ｐＨが５．５、安定ｐＨ領域が５〜
７、特開昭５０−１４５５８３号公報のムタナーゼは至
適ｐＨが６．０、安定ｐＨ領域が５．０〜７．０であ
り、その理化学的性質は多くの点で相違する。なお、特
開昭４７−９７４３号公報に記載されたムタナーゼの理
化学的性質は不明である。

【００４５】本発明のムタナーゼは、歯磨（練り歯磨、
粉歯磨、液状歯磨）、洗口剤、義歯洗浄剤、うがい用錠
剤、歯肉マッサージクリーム、トローチ、口腔用パスタ
等の口腔用組成物に配合が可能であり、組成物１ｇに対
して１〜５０，０００単位となるように、単独で又はデ
キストラナーゼと併用して配合することにより、優れた
歯垢形成抑制作用及び歯垢除去能を示す。

【００４６】

【実施例】以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具
体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限される
ものではない。（１）ムタンの調製まず、本実施例において使用するムタンの調製を以下に
ように行った。ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５
株を２００ｍｌのＢＨＩ培地（ブレインハートインヒュ
ージョン（ＢｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏ
ｎ）オキソイド社製）に植菌し、３７℃で１日間の培養
を行った。得られた培養物を仕込み量４リットルの５％
シュークロースを含むＢＨＩ培地に接種し、３７℃で５
日間の培養を行った。このオートクレーブ処理後の沈殿
物を収穫し、５００ｍｌの１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液
に溶解し、室温で１時間放置した。この遠心分離上清を
塩酸で中和し、析出した沈殿をろ過処理により回収し
た。更に、この回収物にデキストラナーゼを作用させ、
α−１，６−グルコシド結合を切断した。

【００４７】（２）ムタナーゼの調製次に、本実施例のムタナーゼを以下のようにして調製し
た。まず、培地を以下の培養組成で調製した。培養組成イノシトール１０ｇ／リットルムタン１ｇ／リットルペプトン５ｇ／リットル酵母エキス３ｇ／リットルＫＨ₂ＰＯ₄ ２ｇ／リットルＮＨ₄ＮＯ₃ ２ｇ／リットルＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．３ｇ／リットル（ｐＨ７．
０）

【００４８】上述したスクリーニング法により得られた
ＲＭ４株を上記培地に接種し、４０℃で２日間培養した
後、培養液を８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上
清を得、これを限外濾過で濃縮した。次に、この上清に
硫酸アンモニウムを９０％飽和になるように加え、これ
をよく撹拌した後、１時間以上氷中に静置し、その後、
遠心分離して沈殿を回収することにより塩析を行った。
次いで、１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁
し、同緩衝液で透析した。透析後のサンプルを８０００
ｒｐｍ、１０分間の遠心分離にかけ、得られた上清を本
実施例のムタナーゼ（以下、ＲＭ４酵素という）とし、
その精製を以下のようにして行った。まず、陰イオン交
換クロマトグラフィーＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ
６５０Ｍ（商品名：東ソー社製）に対し、ｐＨ７で素通
り画分を得た後、ｐＨ８．５でも素通り画分を取る２回
のカラム操作を行った。更に、ゲル濾過クロマトグラフ
ィーＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ−３００ＨＲ（商品名：フ
ァルマシア社製）でムタナーゼ活性画分を集め、精製酵
素を得た。

【００４９】このようにして精製されたＲＭ４酵素を用
いて上記の理化学的性質を確認したところ、本発明のム
タナーゼは上記理化学的性質を有することが確認され
た。この精製されたＲＭ４酵素を以下の酵素特性評価に
使用した。

【００５０】（３）市販酵素との比較ＲＭ４酵素及び現在市販されているムタナーゼを含む混
合酵素である上記ノボザイム２３４（比較例）の至適ｐ
Ｈ、ｐＨ安定性、至適温度及び温度安定性を上記と同様
にして測定した。結果を図５〜８に示す。図５〜８によ
れば、ＲＭ４酵素はノボザイム２３４に比較して明らか
に安定であることが認められる。

【００５１】（４）酵素作用特性ムタンを含む寒天プレートに直径３ｍｍ、深さ１ｍｍの
穴をあけ、初期値１００単位のＲＭ４酵素又はノボザイ
ム２３４を２倍づつ希釈することを繰り返した酵素サン
プル、即ち、１、２、４、８倍に希釈した各酵素サンプ
ルを５μｌ注入し、３０℃で２４時間保温した後の各酵
素サンプルによる透明な分解帯を調べた。結果を表５に
示す。

【００５２】

【表５】

【００５３】表５によれば、ＲＭ４酵素は同じ酵素単位
のノボザイム２３４よりも高いムタン分解能力を示し、
ムタンをエンド型に分解するムタナーゼのほうがエキソ
型のものより分解効率がよいことを示唆するものと認め
られる。

【００５４】（５）歯垢除去能の有効性評価ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ）１０４４９株をＢＨＩ（Ｂ
ｒａｉｎＨｅａｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ）培地にて３
７℃で一晩静置し、前培養液を調製した。この前培養液
１００μｌを１％シュークロースを含むＢＨＩ培地３ｍ
ｌ（Ｍ２試験管）に添加し、試験管を傾け、３７℃で一
晩静置培養して、試験管壁に歯垢を形成させた。その
後、培地を捨て、試験管内を蒸留水で２回洗浄し、３ｍ
ｌの人工唾液（０．８５ｍＭＣａＣｌ₂／６．２２ｍ
ＭＫＨ₂ＰＯ₄／５０ｍＭＮａＣｌ／０．１５ｍＭ
ＭｇＣｌ₂（ｐＨ５．９４））を添加した後、表６に示
す酵素を各１ｍｌ加え、３７℃で３分間保温した。その
後、酵素液を捨て、試験官内を蒸留水で２回洗浄した
後、更に４ｍｌの蒸留水を添加し、超音波処理を行った
後の各溶液の濁度測定を行い、酵素無添加のものを対照
とし、各酵素溶液の歯垢除去能を計算した。なお、デキ
ストラナーゼとの併用系の検討では、人工唾液を添加し
た後、デキストラナーゼ２０００単位に対してＲＭ４酵
素又はノボザイム２３４が１０単位になるように調製し
た酵素溶液を用いた。結果を表６に示す。

【００５５】

【表６】

【００５６】表６の結果によれば、ムタナーゼはデキス
トラナーゼと併用することで相乗的な歯垢除去能を示
し、その効果はＲＭ４酵素のほうがノボザイム２３４よ
りも優れていることが認められ、エンド型のムタナーゼ
が歯垢除去酵素として好適であると考えられる。

【００５７】（６）製剤中での安定性市販の練り歯磨１０ｇにＲＭ４酵素又はノボザイム２３
４をそれぞれ２００単位添加し、各練り歯磨の練り混み
を１０分間行い、３７℃で約１カ月間にわたり経日的に
各練り歯磨をそれぞれ０．８ｇづつサンプリングしてｐ
Ｈ８のリン酸緩衝液２．４ｍｌに投入し、これを遠心分
離した後、その上清をサンプルとし、各サンプルの酵素
活性測定を上記測定方法と同様にして行い、残存活性を
求めた。結果を表７に示す。

【００５８】

【表７】

【００５９】なお、ＲＭ４酵素は、一般的な組成の粉歯
磨、液状歯磨、洗口剤、義歯洗浄剤、うがい用錠剤、歯
肉マッサージクリーム、トローチ、口腔用パスタに各組
成物１０ｇに対して２００単位となるように単独で又は
デキストラナーゼと併用して配合した製剤中においても
優れた安定性を示した。

【００６０】

【発明の効果】本発明のムタナーゼ産生微生物によれ
ば、優れた歯垢形成抑制効果を有するのみならず、歯磨
等の口腔用組成物の製品として充分に安定的に配合する
ことができる新規のムタナーゼを得ることができる。本
発明のムタナーゼはデキストラナーゼとの併用により、
相乗的な歯垢除去効果を示すものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のムタナーゼの至適ｐＨを示すグラフで
ある。

【図２】本発明のムタナーゼのｐＨ安定性を示すグラフ
である。

【図３】本発明のムタナーゼの至適温度を示すグラフで
ある。

【図４】本発明のムタナーゼの温度安定性を示すグラフ
である。

【図５】本実施例のムタナーゼと比較例のムタナーゼと
の至適ｐＨを比較するグラフである。

【図６】本実施例のムタナーゼと比較例のムタナーゼと
のｐＨ安定性を比較するグラフである。

【図７】本実施例のムタナーゼと比較例のムタナーゼと
の至適温度を比較するグラフである。

【図８】本実施例のムタナーゼと比較例のムタナーゼと
の温度安定性を比較するグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者横堀佳子東京都墨田区本所１丁目３番７号ライオン株式会社内 (72)発明者浅井芳男東京都墨田区本所１丁目３番７号ライオン株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス属に属すると共に、グラム染色
性が陰性で、生育ｐＨが５〜７．５であり、且つプロテ
アーゼ産生が陰性であることを特徴とするムタナーゼ産
生微生物。
【請求項２】バチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）ＲＭ４株（生命研菌寄第１４８３７号）であ
る請求項１記載のムタナーゼ産生微生物。
【請求項３】下記の理化学的性質を有することを特徴
とするムタナーゼ。（１）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分
解する性質を有する。（２）基質特異性：ムタンをよく分解する。（３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が至適で
あり、ｐＨ４〜７の範囲で高い活性を示す。（４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
ｐＨ４〜１１の範囲で安定である。（５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度６５℃において作用が至適である。（６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活する。（７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀又は銀により作用が阻害される。（８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸によって阻害される。（９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１４万である。
【請求項４】請求項１又は２記載のムタナーゼ産生微
生物の菌株を培養した培養物から採取されてなる請求項
３記載のムタナーゼ。
【請求項５】請求項３記載のムタナーゼを産生する請
求項１記載のムタナーゼ産生微生物。