JPS63185381A - デキストラナ−ゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、う蝕原性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｓｍｕｔａｎｓ）が産生ずる歯垢の不溶性グルカンな
どに含まれる１、６−α−Ｄ−グルカンのα−１，６−
グルコシド結合を特異的に切断分解する酵素であるデキ
ストラナーゼを製造する方法に関する。

特に、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）
属の細菌、またはその突然変異株を培養し、該培養物よ
りデキストラナーゼを製造する方法に関する。

（従来の技術） 虫歯の原因となろう蝕原性連鎖球菌 （Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）は、該
菌が産生ずる不溶性グルカン（ムタンとも言う）によっ
て、該菌と不溶性グルカンの複合体であるデンクルプラ
ーク（ｄｅｎｔａｌ　ｐｌａｑｕｅ）すなわち歯垢を形
成して、歯の表面に付着し、該菌が口腔内に存在する蔗
糖を分解して生じる有ｌ！！酸の作用により、歯牙エナ
メル質を溶解することによって虫歯が発生することが判
明している。

従って、虫歯を予防するためには、歯垢の主成分である
不溶性グルカンを分解して、前記菌の歯の表面への付着
を阻止することが提案されている。

さらに、この不溶性グルカンは、α−Ｌ６−グルコシド
結合及びα−１，３−グルコシド結合よりなっており、
これらを分解するにはそれぞれ、α−１，６−グルコシ
ド結合を特異的に切断分解する酵素であるデキストラナ
ーゼ〔正式名は１，６−α−Ｄ−グルカン６−グルカノ
ハイドロラーゼ（ＰＣ３，２，１）１）　）と、α−１
，３−グルコシド結合を特異的に切断分解する酵素であ
るα−１，３−グルカナーゼの単独或いは両酵素の共同
作用が有効であることが判明している。

（発明が解決しようとする問題点） 従来からデキストラナーゼに関しては、その産生株、例
えば、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属〔例
えば、ペニシリウム　フェニキュローサムＩＡＭ−７０
１３（微工研菌寄第１２９０号）〕、アスペＪレギルス
（八３ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　）属、ケトミウム（Ｃｈａ
ｅｔｏｍｉｕｍ）属に属する糸状菌、コリネバクテリウ
ム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属〔例えば、
コリネバクテリウムＡＫ−Ｏｆ　（微工研菌寄第２５０
５号）〕、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ）属、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌ
ｌｕｓ　）属に属する細菌、及びストレプトマイセス （Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｍｙｃｅｓ　）属に属する放線菌
、ニヨッテ産生されることが解明されている。

しかしながら、これらの従来のデキストラナーゼ産生菌
を利用して得られたデキストラナーゼは、歯垢の分解活
性が高くなく、従って当該技術分野においては、高い歯
垢の分解活性を有するデキストラナーゼを産生ずる菌株
の選定、及び該菌株を利用した工業的生産に供し得るデ
キストラナーゼの分離・精製方法が期待されるところで
あった。

本発明者は、上記した理由で新たなデキストラナーゼ産
生菌株を検索した結果、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒ
ｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌又はその突然変異株が高い歯
垢の分解活性を有するデキストラナーゼを産生ずること
を見出した。

従って、本発明の目的とするところは、上記したアルス
ロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属の細菌又は
その突然変異株を用いて、工業的な使用に供し得る培養
条件、分離精製方法等を具備した優れたデキストラナー
ゼの製造方法を提供しようとするものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明のデキストラナーゼの製造方法の要旨とするとこ
ろは、デキストラナーゼを産生ずるアルスロバクタ−（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌又はその突
然変異株を、培養培地に接種して所定の培養条件下で培
養した後、該培養物を遠心分離して、該培養物から蘭体
を分離除去し、デキストラナーゼを採取するようにした
ことである。

まず、本発明者は、不溶性グルカンＣ（Ｌ３゜１．６）
−α−Ｄ−グルカン）又はデキストラン（１゜６−α−
Ｄ−グルカン）を炭素源として利用できる微生物を検索
した結果、アルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ）属に属する細菌、とりわけアルスロバクタ−３ｐ、
　ＣＢ−８菌〔八ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｐ、　ＣＢ
−３（微工研菌条寄第９９５号）　　（ＦＥＲＭ　ＢＰ
−９９５号）〕（以下、ＣＢ−８菌と言う）が、強力に
デキストラナーゼを産生ずることが判明したので、以下
このＣＢ−８菌を利用して、デキストラナーゼを製造す
る方法について、より詳細に説明する。

本発明の方法に利用できる前記ＣＢ−１３菌は、下記の
通りの菌学的性状を有することが判明している。

（ＣＢ−８菌の蘭学・性］′） （］）　　細胞 グラム陽性桿菌。大きさと形は培養条件、培養時期で変
化するが、０．５　Ｘｏ、６〜２．０μｍ。無芽胞。偏
性好気性に増殖。

（２）　コロニーの性状 ペプトン・イーストエキス寒天上で、円形で平滑な濃黄
色のコロニーを形成する。

（３）生理的性質 ・カタラーゼ：（＋） ・溶血性（羊）　　：　　（−） ・炭水化物醗酵性ニブドウＩＪ！　（−）　、乳ｖ４（
−）、麦芽糖（−）、マ ンニット　（−）、サリシ ン（−）、デンプン（− ）、蔗糖（−）、）レバ ロース（−）、キシロ− ス（−）。

・ｖＰ（ボーゲス−プロスカラエル）　　：　　（−）
・エスタリン加水分解：（−） ・硝酸塩還元＝（−） ・ゼラチン液化：（＋） ・ウレアーゼ：（＋） ・アルギニン加水分解：（−） ・細胞壁のペプチドグリカンの構成ジアミノ酸としてリ
ジンを含む。

・キノンはイソプレンユニット数９．１飽和型のメナキ
ノン（Ｍｅｎａｑｕｉｎｏｎｅ）　ＭＫ−９（Ｈｚ）。

上記した諸性質によって、ＣＢ−８菌はアルスロバクタ
−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属することが判明
した。

また、本発明のデキストラナーゼの製造方法に使用した
菌は、アルスロバクタ− （Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属するＣＢ−８菌で
あるが、このＣＢ−８菌とその突然変異株、及びアルス
ロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細
菌とその突然変異株で、デキストラナーゼを産生ずる菌
株は全て使用可能である。

１、デキストラナーゼ　生菌の培゛ （ａ）　　デキストラナーゼ産生菌培養のための培地デ
キストラナーゼを製造するためには、まず上記デキスト
ラナーゼ産生菌を、天然または人工培地に接種して培養
するが、工業的生産には液体培地で通気攪拌培養法によ
って実施するのが、コストの上からも有利である。

培地の栄養源としては、微生物一般に用いられるものを
使用することが可能である。例えば、炭素源及びデキス
トラナーゼの酵素産生誘導物質として、デキストランの
添加が有効で、窒素源としては、リン酸アンモニウム、
硫酸アンモニウム、ペプトン、酵母エキス等が用いられ
る。無機塩としては、リン酸、ナトリウム、カリウム、
マグネシウム、カルシウム等の塩類が用いられる。

ｆｂｌ　　デキストラナーゼ−生　の培養上記ｉａ１項
で調製した培地に、デキストラナーゼ産生菌を接種し、
所定の培養温度、好ましくは３０℃〜３７℃で、培地の
ｐＨを６〜７で、デキストラナーゼが培養液中で最も高
い活性を示すまで所定の培養時間（培養条件によって異
なるが、通常通気攪拌培養では２４〜４８時間）培養す
る。

２、培養物からのデキストラナーゼの採取・精製上記の
ようにして、充分にデキストラナーゼが産生された培養
物から、遠心分離によって菌体を取り除けば、粗酵素液
が得られる。

このようにして得ちれた粗酵素液は、そのままでも製品
として充分に使用可能であるが、さらに該酵素液を公知
の分離精製方法、例えば、限外濾過膜濃縮法、減圧濃縮
法、硫安などにょる塩析法、エタノール等による溶媒分
画法、等電点沈澱法、カラムクロマト分画法などを、単
独或いは適宜組み合わせることによって、デキストラナ
ーゼの精製酵素液を採取することが可能である。

Ｂ、デキストラナーゼの理化学的性質 本発明の製造方法によって得られるデキストラナーゼは
、歯垢の不溶性グルカンなどに含まれるα−１，６−グ
ルコシド結合を特異的に切断する酵素で、下記の通りの
理化学的性質を有する。

ｆ］、１　　活性測定方法 ０．５５５％のデキストラン（分子量ｉｏ、ｏｏ。

−２０，０００）を含むｐｌ＋　６．５の５０　ｍＭ燐
酸緩衝液０．９ｍｊ２に、酵素液０．１ｍ＃を加えて、
３７°Ｃで３０分間反応させる。反応停止後、遊離した
還元糖をソモギー・ネルソン （Ｓｏｍｏｇｙｉ−Ｎｅｌｓｏｎ）法で測定し、上記の
条件において、１分間に１μｍｏｌｅのブドウ糖に相当
する還元力を増加させる酵素活性をＩｊｉｋ位とした。

（２）酵素作用の特異性 デキストランや歯垢の不溶性グルカンなどに存在するα
−１，６−グルコシド結合を特異的にエンドタイプに切
断する加水分解酵素である。

（３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ 第１図は、デキストラナーゼの各ｐｌ＋における活性を
示すグラフであり、デキストラナーゼのデキストランに
対する作用至適ｐＨが、ｐＨ５，５〜７．５で、特にｐ
Ｈ６，５〜７．０で強い活性を示している。

第２図は、デキストラナーゼの各ｐＨにおける安定性を
示すグラフで、デキストラナーゼを各ｐＨにおいて、３
７℃で１時間放置した場合の残存活性を示したものであ
り、デキストラナーゼがｐＨ５，５〜７．０の範囲にお
いて、非常に安定であることを示している。

（４）作用至適温度と温度安定性 ｐ）ｌ　６．５におけるデキストラナーゼのデキストラ
ンに対する作用至適温度は、第３図に示したように、３
７℃〜４５℃であり、４２℃がピークであった。

第４図は、各温度におけるデキストラナーゼの安定性を
示すグラフで、デキストラナーゼをｐ）＋　６．５で各
温度で１時間放置した場合の、残存活性を示したもので
ある。第４図に示したように、デキストラナーゼは３７
℃以下で安定である。

（５）金属イオン、酵素阻害剤の影響 デキストラナーゼは、下記の表１に示したように、Ａｇ
２−１Ｃｕ２′″、Ｈｇ２＋、によって著しく阻害を受
け、またｐＣＭＢ　（パラクロロマーキュリ−ベンゾエ
ート）によっても強く阻害された。

（６）分子量 デキストラナーゼの分子量は、ＳＯ３−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で６２，０００゜ゲル濾過法（ファ
ルマシア５ｕｐｅｒｏｓｅ　１２）で約４０，００（ｌ
と算定された。分子量測定法の相違によって、分子量の
値に差が馳められるのは、おそらくタンパク分子の形状
によるものと思われる。

（７）等電点 ポリアクリルアミドゲル等電点電気泳動法を利用して、
デキストラナーゼの等電点（ｐｌ）を求めたところ、４
．９と決定された。

Ｃ，デキストラナーゼによる不溶性グルカンのつぎに、
上述の製造方法によって製造し、且つ上述のような理化
学的性質を有するＣＢ−８菌のデキストラナーゼが、歯
垢の不溶性グルカンを分解することについて行った下記
の実験例について説明する。

尖腺炭よ 不溶性グルカンのノ解 不溶性グルカン（下記不溶性グルカンの調製注参照）を
０．２２％含む５０　ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）　
　９００μｌに、精製したＣＢ−８菌のデキストラナー
ゼ溶液を１００μｌ加えて、３７℃で２時間反応させた
。また、対照として市販されているペニシリウム属のデ
キストラナーゼ（Ｋｏｃｈ−Ｌｉｇｈｔ社製）を同一条
件で反応させた。反応を停止して、水溶性となる糖をフ
ェノール硫酸法で定量した。その結果、ＣＢ−８菌のデ
キストラナーゼはペニシリウム属のデキストラナーゼに
比べて、約３倍の分解率を示すことが明らかとなった（
第５図参照）。

不溶性グルカンの調製法 トソドヘビソトブロス（Ｔｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔｔ　Ｂｒ
ｏｔｈ、Ｄｉｆｃｏ社製）３％を含む液体培地に、う蝕
原性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａ
ｎｓ）　ＯＭＺ−１７６株を接種し、３７℃にて２４時
間静置培養する。得られた培養液を遠心分離にかけて菌
体を除去した後、５０％飽和の硫安塩析を実施し、生じ
た不溶物を遠心分離して、沈澱物として集める。これを
ｐＨ６，５の５０　ｍＭクエン酸緩衝液に溶解し、同緩
衝液にて透析して、これを不溶性グルカン合成酵素液と
した。

透析終了後、上記酵素液に基質溶液として、１０％の蔗
糖を含有するｐＨ６，５の５０　ｍＭクエン酸緩衝液を
加えて、３７℃で２４〜４８時間反応させて、不溶性グ
ルカンを合成した。これを、遠心分離にかけて不溶性グ
ルカンを集め、蒸留水にて洗浄し、ついでエタノール、
アセトンで洗浄した後、１００℃以下で加熱通風乾燥し
て、不溶性グルカンを調製した。

抜歯したヒトの歯を５ｍｍ角の平板として裁断した歯の
断片を、プラスチック製小試験管（直径１．０ｍ、長さ
５ｃｍ）に接着剤で貼着する。これに蔗糖５．０％とト
ッドヘビットブロス３％を含む液体培地を入れて滅菌し
て、う蝕原性連鎖球菌ＯＭＺ　１７６株を接種し、３７
℃にて２４時間培養したところ、歯面に歯垢が沈着する
のが肉眼的にもよく認められた。その際、培地中に１４
ｃ−蔗＃Ｍ（２μｃ／ｍｌ）或いは３ト２チミジ７　（
２ｐｃ７ｍｌ）を加えて、歯垢中の不溶性グルカン又は
う蝕原性連鎖球菌の存在を標識づけすることができる。

このカウントをそれぞれ１００％とし、培養液中にＣＢ
−８菌のデキストラナーゼを１単位／ｎ＋１存在させた
場合には、歯垢の沈着はほとんど認められなかった（そ
れぞれ５％以下）。

また別に、上述のような培養条件下で、う蝕原性連鎖球
菌によって作られた歯垢に対して、培養後にデキストラ
ナーゼを加えて分解を調べてみたところ、ＣＢ−８菌の
デキストラナーゼの方が、同単位のペニシリウム属のデ
キストラナーゼよりも、より速やかに分解が進むことが
明らかになった。

従って、ＣＢ−８菌のデキストラナーゼが不溶性グルカ
ンを分解して、歯に歯垢が沈着しないように働くことが
如実に示された。

（実施例） 実施例１ デキストラナーゼの産生 バタトトリプトン（Ｄｉｆｃｏ社製）０．５％、酵母エ
キス（Ｄｉｆｃｏ社製）０．２％、燐酸１カリウム０．
１％、食塩０．１％を含有する液体培地（ｐＨ７，０）
にデキストラン（和光純薬社製；分子量６０，０００〜
９０，０００）をそれぞれ、０．５％、１．０％、２．
０％、３．０％添加した培地１００ｍｊ！を用意する。

それぞれを５００ｎｌ容のエルシンマイヤーフラスコに
入れ、綿栓して滅菌した後、別に滅菌しておいた１Ｍ硫
酸マグネシウム溶液、及び０．１１塩化力ルシウム溶液
各１ｍ７！ずつを加えて培地を調製した。これに、予め
０．５％デキストランを含有する培地で２４時間培養し
ておいたＣＢ−８菌の培養液４ｍｌをそれぞれ接種して
、３７℃でロータリ一式振盪培養を実施した。経時的に
５ｍｊ２ずつ分取し、その中に含まれるデキストラナー
ゼ活性の測定を行った。

その結果、下記の表２に示したように、培地中に加えた
デキストランの濃度が０．５％の場合には、２４時間の
培養でその活性は最大となり、デキストランの濃度が１
．０％以上の場合には、４８時間で最大となった。

表−１ □□□盟保 実施例２ ＣＢ−８菌を用いたデキストラナーゼの分離・精製バタ
トトリプトン０．５％、酵母エキス０．２％、ｔａ酸１
　力！Ｊ　ラム０．１　％、食塩０．１　％、デキスト
ラン１．０　Ｖｏを含有する液体培地（ｐＨ７，０）　
　５００　ｍｊ２を３ｐ容のエルシンマイヤーフラスコ
に入れ、綿栓して滅菌した後、別に滅菌しておいた１Ｍ
硫酸マグネシウム溶液及び０．１　Ｍ塩化カルシウム溶
液各５ｍＡずつを添加して培地を調製した。

これに予め同じ培地で２４時間培養しておいたＣＢ−８
菌の培養液を２０ｍ１！加えて接種し、３７℃でロータ
リ一式振盪機で２４〜４８時間培養した。この規模の培
養で計１８Ａを培養し、培養液を集めて遠心分離により
培養上清を得た。

培養上清を限外濾過によって濃縮し、硫安８０％飽和に
て塩析した。塩析後、沈澱物を遠心分離によって集め、
少量の５０１燐酸緩衝液（ｐ＋（６，５）に溶解して、
同じ緩衝液を外液として透析した。これを同緩衝液で平
衡化したＤＥＡＲ−セファ−セル（ファルマシア社製）
カラムに入れ、イオン交換クロマトグラフィーを行った
。０〜０．５Ｍの直線濃度勾配の食塩（５０ｍＭ燐酸緩
衝液、ｐＨ６，５）溶液にて溶出した。ついで、５０　
ｍＭ燐酸緩衝液（ｐＨ６，５）で平衡化したバイオ・ゲ
ルＰ−３０（バイオランド社製）カラムによるゲル濾過
分画を実施した。デキストラナーゼ活性のある両分を集
め、硫安による結晶化を３度行った。この標品について
ＳＯ３−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったとこ
ろ、１本のタンパクバンドのみが認められ、以上の精製
操作によって、デキストラナーゼが電気泳動的に均一に
まで精製されたことが明らかとなった。

以上の精製過程が表３に示されているが、１８１の培養
上清より、３６８単位、４．６　ｍｇの精製デキストラ
ナーゼが得られ、その比活性は８０．０　（単位７ｍｇ
タンパク）であった。

人−ｙ デキストラナーゼの精製過程各段階における酵素活性、
収量、比活性（効果） デキストラナーゼは、虫歯の原因となろう蝕原性連鎖球
菌が産生ずる不溶性グルカンなどに含まれるα−１，６
−グルコシド結合を特異的に切断分解する酵素であり、
本発明のデキストラナーゼの製造方法によれば、このよ
うな作用を有するデキストラナーゼを産生ずるアルスロ
バクタ−属に属する菌株、或いはその突然変異株を培養
して、容易にデキストラナーゼを分離採取、及び精製す
ることができるものである。

本来、本発明の主目的とするところは、歯垢の不溶性グ
ルカン又は歯垢そのものをデキストラナーゼの作用によ
って効率よく分解除去することにあったが、本発明のＣ
Ｂ−８菌のデキストラナーゼは、ペニシリウム属のデキ
ストラナーゼに比べて、同一酵素単位（デキストランの
分解活性単位）でも不溶性グルカンに対して約３倍の分
解率を示しく実験例１）、さらに歯垢そのものの分解に
ついても、ＣＢ−８菌のデキストラナーゼはペニシリウ
ム属のそれよりも優れている（実験例２）ことが判明し
ている。

従って、本発明のデキストラナーゼの製造方法は、従来
技術の他の糸状菌や細菌を利用したデキストラナーゼに
比較して、歯垢をよく分解するデキストラナーゼを生産
するという点において明らかに優れた製造方法であると
いえる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、各ｐＨにおけるデキストラナーゼの活性を示
すグラフ、第２図は、各ｐ）ｌにおけるデキストラナー
ゼの安定性を示すグラフ、第３図は、各温度におけるデ
キストラナーゼの活性を示すグラフ、第４図は、各温度
におけるデキストラナーゼの安定性を示すグラフ、第５
図は、ＣＢ−８菌デキストラナーゼとペニシリウム属の
デキストラナーゼの不溶性グルカン分解率を比較を示す
グラフである。 に襖曹媒 く嬌妥隼 典實軟ヴ 年淑炊阜

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）デキストラナーゼを産生するアルスロバクター（
   Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）属に属する細菌又はその突
   然変異株を、培養培地に接種して所定の培養条件下で培
   養した後、該培養物を遠心分離して、該培養物から菌体
   を分離除去し、デキストラナーゼを採取することを特徴
   とするデキストラナーゼの製造方法。
2. （２）前記アルスロバクター属に属する細菌が、アルス
   ロバクターｓｐ．ＣＢ−８（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ
   ｓｐ．ＣＢ−８）である特許請求の範囲第１項に記載の
   デキストラナーゼの製造方法。