KR100279844B1 - 치주염 원인세균인 포필로모나스 진지발리스 세포를 용균시키는 용균효소 와이유205와 그를 생산하는 미생물 - Google Patents

치주염 원인세균인 포필로모나스 진지발리스 세포를 용균시키는 용균효소 와이유205와 그를 생산하는 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치주염 원인세균인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 용균시키는 용균효소와 그를 생산하는 미생물에 관한 것이다.
본 발명자들은 식품 등의 첨가물과 치약 또는 의약품으로 사용할 목적으로 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 용균시키는 용균효소 생산균주를 탐색하여 지금까지 알려진 용균효소와는 물리·화학적인 면에서 다른 새로운 용균효소를 생산하는 미생물을 토양으로부터 분리하여 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로 동정하고 균주의 성질 및 효소의 특성을 검토한 결과 기존의 생산균주와 다른 특성을 갖고 있음을 발견하고 이러한 발견을 기초로 본 발명을 환성하였다. 생산배지로는 서당, 과당, 포도당, 전분 등의 탄소원자와 NH4 +염, 요소, 단백질, 대두분과 같은 질소원, 아미노산, 옥수수 침지액, 펩톤, 육즙과 같은 천연배지, Mg2+염, 인산염 등을 배지로 사용할 수 있었다. 또한 아세톤침전, 양이온, 음이온 교환수지등의 정제과정을 통해 수율 22%, 정제도 522배의 정제효소를 얻었고, 본 효소는 분자량 29,000달톤(Da)의 크기를 가진 것으로 판명되었으며, 최적 PH는 7.0 최적온도는 60℃였으며, pH 6.0∼11.0, 0∼40℃의 범위에서 안정함을 보였다.

Description

치주염 원인세균인 포필로모나스 진지발리스 세포를 용균시키는 용균효소 와이유205와 그를 생산하는 미생물
제1도는 본 균주를 기질균주인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)가 현탁된 한천평판배지에 접종하여 용균여부를 나타낸 사진이다.
제2도는 본 균주의 동정을 위한 여러 가지 형태학적, 생화학적 특성들을 나타낸 표이다.
제3도는 본 균주를 유안침전법, 유기용매 침전법등을 이용하여 용균효소의 침전 정도를 나타낸 그림이다.
제4도는 본 균주의 배양상등액을 아세톤 침전한 침전액을 디이에이-세파로즈 컬럼 크로마토그래피한 크로마토그램이다.
제5도는 씨엠-세파로즈 컬럼 크로마토그래피한 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
제6도는 정제 단계별 용균효소 YU205의 생산수율을 나타낸 표이다.
제7도는 정제된 용균효소 단백질의 에스디에스 폴리아크릴아마이드 겔 전기영도(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 사진이다.
제8도는 정제된 용균효소의 최적 pH와 안정한 pH 범위를 나타낸 그림이다.
제9도는 정제된 용균효소의 최적 온도와 안정한 온도 범위를 나타낸 그램이다.
[발명의 목적]
[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래의 기술]
본 발명은 치주염의 원인세균인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 용균시키는 용균효소와 그를 생산하는 미생물에 관한 것이다.
치주염(Periodontitis)은 치근막염, 치주위염이라고도 하며, 치아 주위조직(치근막)의 염증으로 보통은 치은(gingiva)의 염증으로부터 치근막으로 파급되어 일어난다. 치주염은 치근막의 염증을 수반하는 세균감염을 통틀어서 말하며, 치아의손실로까지 진행될 수 있다. 이러한 감염에 대한 치료를 하지 않을 경우 치근막의 근성분과 치조골의 파괴에 까지 이를수 있다. 미국에서는 4천 900만 이상의 사람들이, 또한 한국인의 90%이상이 치주염을 갖고 있다고 보고되고 있다. 그러나, 다른 만성질환과 마찬가지로 치주질환은 통증을 느끼거나 치아가 들리는 등 심각하게 진행된 단계가 되기 전에는 이상을 느끼지 못하기 때문에‘침묵의 질환’으로 불리기도 한다.
치주질환은 복잡한 세균감염성 질환이다. 구강내에는 수십억개에 달하는 세균이 살고 있다. 이러한 세균은 평소에는 해로운 균이 아니다. 그러한 구강위생이 철저하지 못하거나 칫솔질을 게을리 할 때는 그 숫자가 급격히 증가하여 치아면에 무색의 엷은 막을 형성하며 이것을 프라그(치태)라고 한다. 프라그 내의 세균들이 증식하여 독성물질을 내게 되어 잇몸에 염증을 일으킨다. 프라그는 빨리 제거되지 않으면 서서히 누렇거나 갈색의 딱딱한 석회물질인 치석으로 변하여 잇몸에 나쁜 영향을 미친다. 염증이 잇몸에만 국한된 잇몸병을 치은염이라 하는데 사춘기 전후에 잘 발생한다. 치은염의 초기 증상은 출혈인데 칫솔질할 때나 사과를 먹을 때 피가 나오며 점점 진행되면서 잇몸이 약간 붓고 색깔이 푸르게 변한다. 이 때 치료를 받으면 100% 완치되는데 치석제거와 치근활택술등의 아주 간단한 치료가 행해진다. 치은염이 오래 방치되면 염증이 치아를 둘러싸서 보호해 주는 치조골로 확산되며 치조골의 흡수가 일어난다. 이런 병명을 치주염이라 하며 40대 이후에 급격히 증가한다고 해서 옛날부터 풍치라고 불렸다. 치주염환자는 입에서 냄새가 나고 잇몸이 자주 붓고 고름이 나오며 찬 것을 먹으면 이가 시리고 이가 들뜬 기분이 든다. 치료방법은 치조골의 흡수정도에 따라 달라지는데 치석제거와 치근활택술로부터 치조골 이식, 치은 이식, 치주조직 재생 유도술등 다양하며 치료비도 엄청난 차이가 난다. 그러나, 치조골이 원래 높이의 2분의 1이상이 파괴된 경우에는 치료가 불가능하며 치아를 빼야만 하는 경우가 된다.
치주염의 병인은 성별, 인종 연령에 따라 관련된 병원균이 다르다. 이러한 치주 질환은 수년간 악화되고 소강상태가 되는 것을 반복하며 감염상태가 지속되며, 당뇨, 에이즈, 호중구감소증, 다운증후군등의 전신성질환을 가진 환자들에게서 높은 발병율을 나타내고 있다. 건강한 치근막에 질병이 생기는 과정은 치은구(gingival crevice)내의 우세한 그람 양성 세균총이 그람음성 혐기성균으로 대치되는 것과 관련이 있다. 몇몇 그람 음성속 세균들은 특정형태의 치주 질환과 관련되어 있다. 그증 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)는 만성, 악성 성인 치주염을 일으키는 것으로 알려져 있다.
이러한 치주염을 억제하기 위하여 여러 가지 방법이 사용되어왔다. 이중 현재까지 제시된 방법으로는 크게 1) 에리스로마이신(erythromycin)등의 항생물질을 이용한 방법, 2) 유기 또는 무기 불소에 의한 치주염 세균의 억제, 3) 글루칸(glucan) 분해 효소, 덱스트란(dextran) 분해 효소 등의 효소를 이용한 플라그(plaque)의 제거 4) 스케일링이나 치근 활택술을 통한 물리적인 치석 제거, 5) 치주염균의 섬모(fimbriae) 항원에 대한 면역 치료법등으로 분류될 수 있다.
그러나, 이중 첫 번째방법은 치주염 치료에 효과적인 방법이 될 수 있으나, 항생 물질의 사용에 의한 내성균주의 발생과, 설사, 구토등의 부작용을 유발할 수 있다는 점과 비특이적으로 구강내의 모든 세균의 증식을 억제하여 구강 정상 세균총의 균형이 깨져 기회 감염증 또는 외부로부터 들어온 병원성 세균에 의한 다른 질병의 가능성을 갖고 있다는 제약을 갖고 있다. 두 번째 불소를 사용하는 방법도 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법으로 불소가 탈회를 억제하고 재광화를 촉진하는 물질로 알려져 있을 뿐 아니라 실제 향균 효과도 있는 것으로 평가되고 있으나, 치아에 흰색 반점을 나타나게 하는 단점이 있어 치아 우식증 예방의 목적에 있어서는 어려움이 따른다고 하겠다. 세 번째로 글루칸(glucan) 분해효소, 덱스트란(dextran) 분해효소등의 효소를 사용하는 방법이 실제적으로 치석을 제거하는데 가능성과 잠재력이 높은 방법이라고 할 수 있으나, 이는 치석의 제거를 목적으로 하는 방법으로서 직접적이 아닌 2차적인 방법이라 할 수 있다. 네 번째 방법은 물리적인 치료방법으로 치주염의 전 단계인 치은염의 치료인 간접적인 치료이며, 계속적인 치료가 필요하므로 보다 근원적인 치료 방법이라고 할수 없다. 마지막으로 다섯 번째 방법은 현재 널리 연구중인 방법이고 효과적이라고 추정되지만, 치료목적의 단일항체를 약품으로 개발하는데는 단일 항체를 대량으로 생산하는데 많은 비용이 들고, 항체를 투여시 신체의 정상적인 단백질에도 결합하여 부작용을 일으킬 소지가 크다. 또한 지금까지 연구된 항체에 대한 항원은 섬모로서 이는 미생물의 생육에 필수적이지 않고, 물리적 또는 화학적인 처리에 의해서 섬모가 절단이 되었을 경우 재생이 가능한 기관이기 때문에 치료용 항체에 대한 항원으로서는 부적합하다고 할 수 있다.
따라서 치주염을 예방하기 위하여 치주염 원인세균에 대한 선택성이 강하고, 특이적으로 작용하는 새로운 물질이 요구되고 있다. 이러한 관점에서 비특이적으로 항균 작용을 나타내는 천연물의 사용에 대하여는 재검토가 필요하다고 하겠으며, 치주염균에 대한 선택적이고 특이적으로 작용하는 치주염균 용균효소의 탐색이 절실하다고 할 수 있다.
현재 용균효소를 이용한 치주염균의 근원적 제거에 대한 연구는 아직 미약한 상태로서, 효소가 같은 인체에 대한 상대적인 안정성에도 불구하고 이러한 연구는 미미한 실정이다. 따라서 이들에 대한 용균효소를 탐색, 개발함으로서 보다 더 안전하고 효용성이 높은 구강 위생제제 개발이 가능할 것이다.
[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]
이에, 본 발명자들은 토양미생물로부터 치주염 원인균인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 용균시키는 신규한 용균효소를 찾아내고자 노력한 결과, 토양세균 YU-1432(KFCC-11056)에서 신규한 용균효소를 분리해내어 본 발명을 완성하였다.
결국, 본 발명의 목적은 신규한 용균효소를 이용하여 치주질환을 예방, 치료에 적용하고자 하는 것이다.
[발명의 구성 및 작용]
이하 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
본 발명자들은 치주염 원인균에 대한 용균활성을 갖는 신규의 용균효소를 분리, 정제하고자 먼저 용균효소를 생산하는 토양세균 YU-1432(KFCC-11056)를 배양하였다. 균주 배양에는 전분, 설탕, 포도당, 밀기울등의 탄소원과 요소 암모니아 염, 펩톤, 효모 엑기스, 콘스트립리커 등의 질소원, 무기염, 생육인자를 혼합한 것 등을 고체, 액체 배지로 사용하여 용균효소를 생산 할 수 있었다. 이후 토양세균 YU-1432(KFCC-11056)의 배양액을 원심분리하여 상등액만을 모은후, 배양액의 4배에 해당하는 양의 아세톤을 가하여 4℃에서 단백질 부분을 침전시킨 뒤, 그의 침전액을 음이온 교환수지인 디이에이이-세파로즈 패스트 플로우(DEAE-Sepharose fast flow) 컬럼에 적용하여 이온교환이 되지 않은 활성분획부분만을 모아 다시 양이온 교환수지인 씨엠-세파로즈 패스트 플로우(CM-Sepharose fast flow) 크로마토그래피를 실시하여 활성분획을 모아 정제를 수행하였다. 이어 활성분획에 대한 순도검정을 위하여 에스디에스-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)을 실시하여 29,000달톤 정도의 크기를 가지며, 최적반응 pH 7.0이고, 최적 반응온도는 60℃인 효소로서 치주염 원인균인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 용균시키는 용균효소를 얻었다.
따라서, 본 발명의 용균효소를 껌, 캔디, 초콜릿, 아이스크림, 발효제품, 두유, 두부등의 식품이나 호상, 또는 액상 치약등의 첨가물로 치주질환의 예방에 이용하거나, 동물실험, 임상실험을 통하여 본격적으로 약재로 개발되어 치주질환의 치료제로 이용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1]
[치주염 원인균의 배양(기질균체의 배양)]
효소활성을 측정하기 위하여 먼저 기질균주를 배양하였다. 기질균주인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)을 비에이취아이(BHI : Brain Heart infusion, Difco 제품) 1.85%, 효모 추출물(Difco 제품) 0.5%, 헤민(Hemin) 용액(sigma 제품) 1.0%, 메나디온(menadione)용액 (sigma 제품) 0.02%의 조성의 배지(한천평판배지 경우, 양피(sheep blood) 5% 첨가)에서 37℃에서 3일간 정치배양한후 원심 분리하여 균체를 모은다음 생리식염수로 2회 세척하고 -20℃에서 보관하여 기질 균체로 사용하였다.
[실시예 2]
[용균활성을 갖는 균주의 분리]
치주염 원인세균에 용균활성이 있는 균주를 탐색하기 위하여, 국내·외 각지에서 채집한 토양시료에서 분리해낸 미생물을 기질균주인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis) 균체가 첨가된 한천평판배지에 접종하여, 자라난 균락(colony) 부위에 투명환(clear zone)이 생성되는 균주들을 1차로 분리한 뒤 이중 재현성이 있으며, 가장 높은 용균활성을 가진 균주를 치주염 원인균 용균활성을 갖는 균주로 선정하였다.(참조 제1도)
[실시예 3]
[균주의 동정]
본 발명의 균주는 형태상 세균의 일종으로 그람 양성이며, 간균으로서 미생물의 특성과 본 균주의 형태적 특성(참조 제2도)을 비교해 본 바, 본 발명의 균주는 기존의 용해효소 생산균주와는 다른 형태적 특성을 갖고 있는 미생물로서 본 발명자들은 이 균주를 신규의 균주로 단정하고 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) YU-1432이라고 명명하였다. 이 균주는 한국종균협회에 1998년 10월 14일 자로 KFCC-11056의 수탁번호로 기탁되어 있다.
[실시예 4]
[최적배양조건의 검토]
상기의 균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFCC-11056에서 치주염 원인균을 용균시키는 용균효소를 생산하기 위하여 본 발명의 균주를 옥수수 전분, 당류와 같은 탄소원, 대두분, 효소추출물과 같은 유기질소원으로 구성된 배지에서 4∼70℃의 배양온도, 초기 pH 3∼11 정도의 배양조건으로 배양하였을 때, 포도당 1.0%, 폴리 펩톤 0.5%, 효모 추출물 0.5%, pH 7.0의 배지조건에서 배양온도를 37℃가 적당하였다. 위의 조성의 배지를 넣은 5리터 배양기(jar fermenter)에서 37℃의 호기적 조건하에 16시간 배양하였을 때 배양액으로부터 최대활성의 포필로모나스 진지발리스 균체의 세포벽을 용해시키는 용균효소 YU205를 제조하였다.
[실시예 5]
[용균활성의 측정]
100℃에서 5분간 끓여 자가분해(autolysis)활성을 제거한 기질균체를 pH 7.0의 50mM 트리스/염산 완충액에 660nm에서 흡광도가 1.0이 되도록 현탁킨 후 이 균체 현탁액 2ml에 효소액 0.2ml를 가하여 37℃에서 10분간 반응시킨 다음 660nm에서의 흡광도 감소를 측정하였다. 이 때, 효소활성은 주어진 조건에서 1분동안 660nm에서 흡광도를 0.001만큼 감소시키는 효소의 양을 효소의 1 단위(1 unit)로 정하였다.
[실시예 6]
[용균효소 YU205의 제조법과 정제 및 순도 검정]
용균효소를 정제하기 위하여 1998년 10월 14일 국제균주기탁기관인 사단법인 한국종균협회 부설 한국미생물보존센터(KFCC)에 기탁번호 KFCC-11056으로 기탁된 YU-1432으로 명명된 토양 세균을 이용하였다. 본 균주를 유안침전법, 유기용매 침전법등을 이용하여 용균효소의 침전 정도를 알아보았다.(참조 제3도)
최적 효소생산 배지로 37℃에서 16시간동안 배양한 균주배양액을 7,500rpm에서 15분간 원심분리를 하여 상등액만을 취한 뒤 상등액의 4배의 양에 해당하는 아세톤을 상등액에 가한 뒤 4℃에서 방치하였다. 아세톤에 의하여 침전된 단백질 부분만을 모아 15,000rpm에서 15분간 원심분리한 뒤 침전물만을 모아 증류수은 가하여 현탁시킨 뒤 다시 15,000rpm에서 15분간 원심분리를 하여 침전된 침전부분을 버리고 단백질이 녹아 있는 상등액 부분만을 취하여 다음 정제 단계를 진행하였다. 약한 음이온 교환수지인 디이에이이-세파로즈 패스트 플로우(DEAE-Sepharose fast flow) 수지 250ml를 5.0×30.0cm의 컬럼에 충전시킨 후 2L의 10mM 트리스/염산 완충액(pH 8.6)으로 컬럼의 pH를 평형화 시켰다. 그 후 아세톤 침전액 400ml를 컬럼에 적용하여 10mM 트리스/염산 완충액(pH 8.6)으로 이온교환이 일어나지 않은 단백질 부분만을 세척하여 모았다.(참조 제4도)
이 단백질 분획을 모두 모아 3 노르말 염산(3N HC1)로 pH를 6.0으로 조절한 후, 2L의 5.0×30.0cm의 컬럼에 충진시킨 후 10mM 인산나트륨/초산 완충액(pH 6.0)으로 pH가 평형화된 약한 양이온 교환 수지인 씨엠 세파로즈 패스트 플로우(CM-Sepharose fast flow) 수지 150ml가 충진된 5.0×30.0cm 컬럼에 위의 부분 정제액을 적용하였다. 10mM 인산나트륨/초산 완충액(pH 6.0)으로 흡착되지 않은 단백질을 세척한 후 1L의 0.1몰(M) 염화나트륨액으로 용출시켜 단일 peak의 활성 분획을 모아 최종 정제 실험을 수행하였다.(참조 제5도)
용균효소 YU205의 정제 단계별 생산 수율은 제6도에 나타냈다.
[실시예 7]
[정제된 효소의 물리 화학적 성질]
정제된 효소의 크기는 에스 디 에스-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(SDS-polyarcylamide gel electrophoresis)을 실시하여 분자량 29,000달톤 정도의 크기를 가진 효소임을 확인하였다.(참조 제7도)
효소반응에 있어서 최적 pH는 7.0이었고, pH는 6.0에서부터 pH 11까지 안정하였다(참조 제8도). 또한 최적 반응 온도는 60℃였으며, 0∼40℃까지는 2시간 동안 방치해도 활성이 안정적으로 유지되었다.(참조 제9도)

Claims (3)

  1. 치주염 원인균인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 용균시키는 용균효소를 생산하는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFCC-11056의 미생물.
  2. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KFCC-11056을 사용한 치주염 원인균인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 용균시키는 용균효소 YU205의 제조방법.
  3. 치주염 원인균인 포필로모나스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)를 용균시키는 신규한 용균효소 YU205.
KR1019980044922A 1998-10-27 1998-10-27 치주염 원인세균인 포필로모나스 진지발리스 세포를 용균시키는 용균효소 와이유205와 그를 생산하는 미생물 KR100279844B1 (ko)

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