KR0175495B1 - 치아우식증 원인세균인 스트렙토코커스 뮤탄스의 세포벽을 용해하는 용해효소와 그의 생산 미생물 - Google Patents

치아우식증 원인세균인 스트렙토코커스 뮤탄스의 세포벽을 용해하는 용해효소와 그의 생산 미생물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 치아우식증의 원인 세균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 세포벽에 선택적으로 작용하여 세균을 용해시키는 세포벽 용해효소와 그를 생산하는 미생물에 관한 것이다.
본 발명자들은 식품 등의 첨가물과 치약 또는의약품으로 사용할 목적으로 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 세포벽을 용해하는 용균효소를 탐색하여 지금까지 알려진 세포벽 용해효소와는 물리·화학적인 면에서 다른 새로운 세포벽 용해효소를 생산하는 미생물을 토양으로부터 분리하여 바실러스 (Bacillus sp)로 동정하고 균주의 성질 및 효소의 특성을 검토한 결과 기존의 생산균주와 다른 특성을 갖고 있음을발견하였다. 본 균주는 두종류의 용균효소를 생산하는데 각각은 분자량 27,000달톤(Da)과 45,000달톤(Da)의 단일 서브유니트(subunit)를 가진 단백질이다. 각각의 반응 최적 pH는 pH 6 과 8 범위에 있고, 최적온도는 30℃와 60℃범위에 있으며, pH5-11범위에서 안정하고, 60℃까지는 안정한 성질을 가지고 있다. 생산배지로는 서당, 과당, 포도당, 전분 등의 탄소원과 NH4+염, 요소, 단백질, 대두분과 같은 질소원, 아미노산, 옥수수 침지액, 펩톤, 육즙과 같은 천연배지, Mg+염, 인산염 등을 배지로 사용할 수 있었다. 각 효소는 공통적으로 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 세포벽 성분중 펩티도 글리칸(pepeidoglycan)의 아미노산 결합을 분해하는 엔도펩티데이즈(endopeptodase)이며, 기존의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) ATCC 6051 이 생산하는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 세포벽 용해요소인 분자량 50,000달톤(Da)의 엘 알라닌 아미데이즈(L-alanine amidase), 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 168이 생산하는 분자량 30,000 달통의 엔 아세틸 뮤라모일 엘 알라닌 아미데이즈 (N-acetyl muramoyl-L-alanine amidase)와 다른 신규효소로 추정되어진다.

Description

치아우식증 원인세균이 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 세포벽을 용해하는 용해효소와 그의 생산 미생물
제1도는 본 균주를 기질균주인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 현탁된 플레이트에 스트리킹(streaking)하여 용균여부를 나타낸 사진이다.
제2도는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 세포벽 용해효소를 생산하는 미생물의 광학 현미경 사진이다.
제3도는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 세포벽 용해효소를 생산하는 미생물의 전자 현미경사진이다.
제4도는 본 균주의 배양시간에 따른 효소생산을 나타낸 도면이다.
제5도는 정제된 효소단백질의 에스 디 에스 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동
(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)사진이다.
제6도는 정제된 효소단백질의 반응에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.
제7도는 정제된 효소단백질의 안정성에 미치는 pH의 영향을 나타내는 도면이다.
제8도는 정제된 효소단백질의 반응에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.
제9도는 정제된 효소단백질의 안정성에 미치는 온도의 영향을 나타내는 도면이다.
본 발명은 치아 우식증의 원인 세균인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 의 세포벽에 선택적으로 작용하여 세균을 용해시키는 세포벽 용해효소와 그를 생산하는 미생물에 관한 것이다
치아는 calcium phosphate로 이루어진 mineral matrix 이며 다양한 미생물의 서식이 가능하다. 구강에 서식하는 세균은 주로 통성 혐기성균(aerotolerant anaerobes)인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)와 락토바실리(Lactobacilli)이며 약간의 호기성균(aerobes)이 있다. 깨끗한 치아 위에 타액으로부터 산성의 당단백질이 점착되고 이 점착된 곳에 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)가 증식하면서 불용성 글루칸을 생산하여 혐기적 세균층을 형성한다. 이 세균층의 혐기적 성질을 이용하여 다양한 혐기미생물이 증식된다. 이들 미생물이 생산하는 산성 물질은 치아의 enamel성분을 녹여서 치아 우식(dental caries)를 일으킨다.
즉 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 치아 우식의 가장 초기 원인을 제공하는 세균이다.
미생물학 초기부터 치석 형성세균에 대한 많은 연구가 진행되어 왔으며, 이들에 대한 많은 연구가 진행되어지고 있다. 이중 현재까지 제시된 방법으로는 크게 1)Spiramycin, Vancomycin HCl, Chlorohexidine등의 항생 물질을 이용한 방법, 2)Inorganic 또는 organic fluorides에 의한 우식 세균의 억제, 3) glucanase, dextranase등의 효소를 이용한 palque의 제거 등으로 분류될 수 있다.
그러나 이중 첫번째의 벙법은 우식을 예방하는 데 있어서는 효과적인 방법이나 항생물질의 사용에 의한 내성 균주의 발생과, 설사, 구토 등의 부작용을 유발할 수 있다는 점과 비특이적으로 구강내의 모든 세균의 증식을 억제하여 구강 정상 세균층의 균형이 깨져 기화 감염증 또는 외부로부터 들어온 병원성 세균에 의한 다른 질병의 가능성을 갖고 있다는 제약을 갖고 있다.
두번째의 불소를 사용하는 방법도 현재 가장 널리 사용되고 있는 방법으로 불소가 탈퇴를 억제하고 재광화를 촉진하는 물질로 알려져 있을 뿐 아니라 실제 항균 효과도 있는 것으로 평가되고 있으나, 치아에 흰색 반점을 나타나게 하는 단점이 있어 치아 우식증 예방의 목적에 있어서는 어려움이 따른다고 하겠다. 마지막으로 glucanase, dextranase 등의 효소를 사용하는 방법이 실제적으로 가장 가능성이 높고 잠재력 있는 방법으로 평가되고 있으나, 이는 치석의 제거를 목적으로 하는 방법으로서 2차적인 방법이라 할 수 있겠다.
따라서 치아 우식을 예방하기 위하여는 치아 우식 세균에 대한 선택성이 강하고, 특이적으로 작용하는 새로운 물질이 요구되고 있다. 이러한 관점에서 따라서 이들에 대한 용균효소를 탐색, 개발함으로서 보다 더 안전하고 효용성이 높은 구강 위생제제 개발이 가능할 것이라 추측된다. 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 용해시키는 용균효소에 관해서는 현재 스트렙토마이세스(Streptomyces)가 생산하는 분자량 11,000 Dalton, 20,000Dalton 의 뮤타노라이신(mutanolycin)과, 바실러스(Bacillus)가 생산하는 분자량 37,000Dalton의 효소가 알려져 있다.
본 발명자들은 지금까지 알려진 세포벽 용해효소와는 물리 화학적인 면에서 다른 새로운 세포벽 용해효소를 생산하는 미생물을 토양으로부터 분리하여 바실러스 YU-1005(Bacillus KFCC 10894)로 동정하고 균주의 성질 및 효소의 특성을 검토한 결과 기존의 생산균주와 다른 특성을 갖고 있음을 발견하고 이러한 발견을 기초로 본 발명을 완성하게 되었다. 발견 효소는 식품과 치약, 의약품에 혼용하여 사용할 수 있다. 그리고 포도당, 효모엑기스, 대두분 등을 포함한 배지로 배양하여 생산할 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 작용하여 세포벽을 용해시키는 세균세포벽 용해효소 및 이 효소를 생산하는 미생물을 제공하는 것이다.
[효소활성을 갖는 균주의 분리]
본 발명의 미생물 균주는 토양으로부터 세포벽 용해활성이 있는 균주를 선택하기 위해서 기질균주인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) KCTC3283 균체가 첨가된 한천평판배지에 분리한 미생물을 접종하여 자라난 균락(conoly) 부위에 투명환(clear zone)이 생기는 균주를 세포벽 용해활성을 갖는 균주로 선정하였다.(제1도 참조)
[균주의 동정]
본 발명의 균주는 형태상 세균의 일종으로 그람 양성이며, 포자를 형성하는 간균으로서, 아래의 특성을 나타내었다.
본 균주의 형태적 특성을 조사해 본 바, 본 발명의 균주는 다른 세포벽 용해효소 생산균주와는 다른 형태적 특성을 갖고 있는 미생물로서 본 발명자들은 이 균주를 신규의 다른 균주로 단정하고 바실러스 YU-1005(Bacillus sp.)KFCC 10894라고 명명하였다.
이 균주는 한국종균협회에 1996년 4월 3일 자료 KFCC 10894의 수탁번호로 기탁되어있다.
상기의 바실러스 YU-1005(Bacillus sp.)KFCC 10894을 배양히기 위한 배지의 조성은 포도당 1%, 폴리펩톤 0.5%, 효모 추출물 0.5%이면, 배지의 pH는 7로 하였다. 배양온도는 37℃가 적당하다.
본 발명의 균주를 포도당 1%, 폴리 펩톤 0.5%, 효모추출물 0.5%를 증류수에 용해시킨 pH7의 배지에서 37℃의 호기적 조건하에 배양할 때 최대의 효소생산을 얻을 수 있었다. 본 발명의 바실러스 YU-1005(Bacillus sp.)KFCC 10894가 생산하는 세포벽 용해효소는 두 가지로 분리되었다. 각각은 실시예3 및 4에서 나타낸 바와 같이 분자량이 27,000(YU 103)과 45,000달톤(YU 104)정도의 단일 서브유니트를 갖는 효소로서 각각의 최적반응 pH와 온도는 pH8.0, 60℃인 효소이다.
본 발명의 균주 및 이 균주에 의해 생산된 효소세포벽 용해효소에 대해 하기의 실시예를 참고로 더욱 상세히 설명한다.
[실시예 1]
본 발명의 균주를 상기의 배지에서 배양하였을 때 37℃의 배양온도, 18시간 배양시 최대의 효소를 얻을 수 있었다.
효소활성을 측정하기 위하여 기질균주를 배양하였다. 기질균주인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) KCTC3283을 BHI(Brain Heart Infusion, Difco 제품) 배지에서 37℃에서 3일간 정치배양한 후 원심분리하여 균체를 모은 다음 생리식염수로 2회 세척하고 -20℃에 보관하여 기질균체로서 사용하였다. 기질균체를 pH8.0의 완충액에 OD의 값이 1.0이 되도록 현탁시킨 후 이 균체현탁액 2ml에 효소액 0.2ml를 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 660nm에서의 흡광도 감소를 측정하였다. 이 때, 효소활성은 1단위(Unit)는 주어진 조건에서 1분동안 660nm에서의 흡광도를 0.001 감소시키는 효소의 양으로 정하였다.
[실시예 2]
상기의 최적 효소생산 배양조건으로 본 발명의 바실러스 YU-1005(Bacillus sp.)KFCC 10894를 배양하였다. 균주의 생육과 효소생산 및 pH변화를 경시적으로 관찰한 결과를 제4도에 나타내었다. 제4도에서 볼 수 있는 바와 같이 균의 생육은 접종 후 13시간까지 증강하다가 정지기에 들어갔으며 배지의 pH는 최초 7으로부터 점차 감소하여 13시간에서 pH 6까지 떨어진 후 시간이 지나면서 다시 증가하여 pH 8 까지 증가하였다. 효소의 생산은 약 5시간 배양이후부터 증가하기 시작하여 18 시간 배양할 때 최대활성(25 U/ml를 보였으나 이후 활성이 감소되는 현상을 보였다.
[실시예 3]
최적 효소생산 배지 1L의 배양액으로부터 본 효소를 메탄올 침전법, 양이온 교환수지(CM-cellulose, Sigma 제품), 젤 칼럼크로마토그래피(Sephadex G-75, Sigma 제품), 하디으록시아파타이트 크로마토그래피(Hydroxyapatite HTP, Biorad 제품)로 분리하였다. 정제 결과 본 효소는 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 상에서 두가지 효소로 분리되었다. 두 효소의 특성을 확인한 결과 본 효소는 분자량 27,000(YU Ⅱ)달톤 정도의 단일 서브유니트(subnit)를 가진 효소와, 45,000달톤(YU Ⅲ) 정도의 단일 서브유니트를 가진 효소임을 에스 디 에스-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 확인하였다. 이 실험결과는 제5도에 나타내었다.
[실시예 4]
활성을 나타내었다. 이 결과는 제8도 및 제9도에 나타내었다.
[실시예 5]
본 효소의 세포벽에 대한 용해부위를 검토하기 위하여 기질균주인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 세포벽을 최적반응조건하에서 1시간 반응시킨 후 실리카 젤 씬 레이어 크로마토그래피(Silica gel thin layer chromatography)를 행한 결과 본 세포벽 용해효소는 세포벽 펩티도 글라이칸 (Peptido-glycan)의 아미조산 결합을 분해하는 엔도펩티다아제(endopeptidase)로 추정된다.
[실시예 6]
본 균주가 생산하는 세포벽 용해효소의 작용범위를 알아보기 위해 여러종류의 구강세균 및 장내세균과 다른 그림양성세균 또는 그람음성세균등을 검정균주로 사용하였다. 각 균주를 24시간 배양한 후 pH8.0 완충액에 OD가 0.5가 되도록 현탁한 후 20 U 의 효소를 반응액 2ml에 첨가하여 37℃에서 30분 반응시켰다.
660nm에서의 흡광도 감소를 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 용해도에 대한 상대적 비로 로 측정한 결과는 표2에 나타내었다.
결과에서 보여지듯이 본 용균 효소는 다양한 스트렙토코커스 뮤탄스에 대하여 높은 용균 활성을 나탄내었으며 치아 우식의 다른 원인균인 락토바실러스에 대하여도 높은 활성을 보였다. 하지만 다른 진핵 미생물에 대하여는 전혀 활성을 보이지 않아 치아 우식균에 특이적으로 작용하는 것으로 보인다.

Claims (3)

  1. 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 세포벽 용해효소를 생산하는 그림 제2도와 제3도와 같은 형태를 지닌 바실러스속 YU-1005(Bacillus sp. YU-1005) KFCC10894의 미생물
  2. 바실러스 YU-1005(Bacillus sp.)KFCC 10894가 생산하는 분자량 27,000달톤, 최적 활성 pH8 부근, pH6-10 안정, 30℃-60℃의 반응온도, 50℃의 최적반응온도, 30℃이하에서 안정등의 특성을 지니는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 세포벽 용해효소 YU103
  3. 바실러스 YU-1005(Bacillus sp.)KFCC 10894가 생산하는 분자량 45,000달톤, 최적 활성 pH8 부근, pH5-10 안정, 30℃-60℃의 반응온도, 40℃의 최적반응온도, 40℃이하에서 안정등의 특성을 지니는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)의 세포벽 용해효소 YU104
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