JPH10136976A - 細胞壁加水分解酵素を産生する微生物 - Google Patents

細胞壁加水分解酵素を産生する微生物

Info

Publication number
JPH10136976A
JPH10136976A JP9143499A JP14349997A JPH10136976A JP H10136976 A JPH10136976 A JP H10136976A JP 9143499 A JP9143499 A JP 9143499A JP 14349997 A JP14349997 A JP 14349997A JP H10136976 A JPH10136976 A JP H10136976A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
hydrolase
cell wall
bacillus
streptococcus mutans
molecular weight
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP9143499A
Other languages
English (en)
Inventor
Shoko Gyoku
承昊 玉
Soei Kin
素影 金
東薫 ▲べ▼
Tokun Be
Tokan Go
斗煥 呉
Shoyu Nan
承佑 南
Yokugen Ro
翼鉉 呂
Shugen Ryu
洲鉉 柳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PLUMWON KK
Original Assignee
PLUMWON KK
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by PLUMWON KK filed Critical PLUMWON KK
Publication of JPH10136976A publication Critical patent/JPH10136976A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205Bacterial isolates
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/78Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/80Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in linear amides (3.5.1)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12RINDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07Bacillus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【課題】 むし歯を発生させる細菌であるストレプトコ
ッカス ミュータンスの細胞壁を分解する加水分解酵素
を産成する微生物を提供する。 【解決手段】 本発明の発明者は、ストレプトコッカス
ミュータンスの細胞壁を分解する加水分解酵素を産成
する微生物を分離し、そしてその微生物を、形態学、生
化学及び生理学の観点から公知の株とは完全に異なる、
バチルス エスピー(Bacilluis sp.)と特定した。更
に、発明者らは、その微生物が従来の細胞壁加水分解酵
素とは全く異なる物理化学的特徴を有する新規な加水分
解酵素を産生することを発見した。バチルス エスピー
YU-1005(KCCM-10090)によって産生された細胞壁加水
分解酵素は、27,000ダルトンの分子量を有している単量
体(YU 103)と、45,000ダルトンの分子量を有している
単量体(YU 104)の二種類としてそれぞれ単離され、そ
れらの至適pHと温度は8.0及び60℃であった。本
発明のバチルス エスピーにより産生された加水分解酵
素は、液体、ペースト又は固体として、食品、歯磨き及
び薬品の活性成分として適用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、むし歯(齲蝕)を
発生させる細菌であるストレプトコッカス ミュータン
スの細胞壁を分解する加水分解酵素を産成する微生物に
関するものである。
【0002】
【従来の技術】歯は、リン酸カルシウムからなる石灰化
物質であると共に、種々の微生物の生息地でもある。口
腔内で増殖している細菌は、ストレプトコッカス ミュ
ータンス(Streptococcus mutans)や乳酸桿菌(Lactob
acilli)のような空気に対する耐性を有する嫌気性細菌
や、数種の好気性細菌を含む。しばしば、唾液からの酸
性の糖たんぱく質が歯に付着し、そこでストレプトコッ
カス ミュータンスが増殖して、そして嫌気性の細菌の
層を成形するための不溶性のグルカンを生成する。細菌
の層の嫌気性環境が、種々の嫌気性微生物に生息地を供
給し、そしてそれら微生物によって生成された酸性の物
質が、歯のエナメル質層を脱灰し、むし歯を発生させ
る。それゆえに、ストレプトコッカス ミュータンス
は、むし歯の発性の主要な原因となっている。
【0003】微生物学では古くから、歯石を形成する細
菌についての研究が継続して実行されてきた。その結
果、歯石の形成を阻止する次のような方法が提案され
た:第一は、スピラマイシン、塩酸バンコマイシンやク
ロロヘキシジン等のような抗生物質を使用する方法;第
二は、無機又は有機のフッ化物により、むし歯を発生さ
せる細菌の増殖を抑制する方法;第三は、グルカナーゼ
やデキストラナーゼ等のような酵素を使用して、プラー
クを除去する方法。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】上記のうち、最初の方
法は、むし歯を防止するためには効果的であるが、抗生
物質の使用による薬物耐性株の出現や、下痢や嘔吐等の
ような潜在的な副作用や、通常の生理的寄生菌を含む、
口腔で生活するすべての細菌の非特異的な規制によりも
たらされる、偶然の感染や他の疾病という、いくつかの
欠点を示した。
【0005】フッ化物を使用する二番目の方法は、再石
灰化を抑制し、そして歯に輝きをもたせるために、広く
使用されてきたが、これには歯に白いスポットができる
という不利がある。
【0006】グルカナーゼやデキストラナーゼ等のよう
な酵素を使用する第三の方法は、高い可能性のあること
で知られているが、歯石を除去するためには幾分間接的
な方法であることが分かっている。
【0007】上記のような状況下、最終的にはむし歯を
予防するために、歯石を形成する細菌に対し選択的且つ
特異的態様で作用する、新規な物質の探索と開発のため
の強い理由がある。上記見地から、口腔衛生のための安
全で、そして効果的な薬剤が、むし歯を発生させる細菌
を分解する酵素の適用によって開発できることが提案さ
れた。
【0008】
【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは、ス
トレプトコッカス ミュータンスの細胞壁を分解する加
水分解酵素を産成する微生物を分離し、そしてその微生
物を、形態学、生化学及び生理学の観点から公知の株と
は完全に異なる、バチルス エスピー(Bacilluis s
p.)と特定した。更に、発明者らは、その微生物が従来
の細胞壁加水分解酵素とは全く異なる物理化学的特徴を
有する、新規な加水分解酵素を産生することを発見し
た。
【0009】それゆえに本発明の第一の目的は、ストレ
プトコッカス ミュータンスの細胞壁を分解する加水分
解酵素を産成する微生物を提供することである。
【0010】本発明の他の目的は、上記微生物により産
成された新規な加水分解酵素を提供することである。
【0011】
【発明の実施の態様】本発明の上記と他の目的及び特徴
は、添付図面と以下の記載から明らかになる。
【0012】細胞壁を分解する加水分解酵素活性を有す
る微生物を表土環境から選択するために、寒天培地平板
に接種されたストレプトコッカス ミュータンスの集落
の上に明白な帯域を与える微生物株が探索された(図1
を参照)。その結果、次のような特徴を有する桿状のグ
ラム陽性の細菌が、最終的に選択された(表1を参
照)。
【0013】
【表1】
【0014】株の形態学、生化学及び生理学上の特徴に
ついての研究の結果、例えば、分子量が11,000ダルトン
及び20,000ダルトンでミュタノライシン(mutanolyci
n)を産生するストレプトミセス属(Streptomyces)
や、分子量が11,000ダルトンで酵素を産生するバチルス
属(Bacillus)のような、ストレプトコッカス ミュー
タンスを分解する加水分解酵素を産生する公知の細菌に
照らし、選択された株が、細胞壁加水分解酵素を産生す
る従来の株とは完全に異なる新規の微生物であることが
示された。それゆえに発明者は、上記株が新規なもので
あると結論を下し、そして微生物をバチルス エスピー
YU-1005と指定した。バチルス エスピーYU-1005は、19
96年4月8日付けで、国際寄託機関である韓国微生物培
養センター(the Korean Culture Center of Microorga
nism [KCCM])に、寄託番号KCCM-10090として寄託され
た。
【0015】好ましくは、バチルス エスピーYU-1005
(KCCM-10090)は、最大の酵素生産性を与えるために、
1%のグルコース、0.5%のポリペプトン及び0.5%の酵母菌
抽出物を含んでいるpH7に調整された発育媒体中で、
嫌気性条件下、37℃の温度で培養される。
【0016】バチルス エスピーYU-1005(KCCM-1009
0)によって産生された細胞壁加水分解酵素は、27,000
ダルトンの分子量を有している単量体(YU 103)と、4
5,000ダルトンの分子量を有している単量体(YU 104)
の二種類としてそれぞれ単離され、それらの至適pHと
温度は8.0及び60℃であった。
【0017】
【実施例】本発明は、以下の実施例で更に詳しく説明さ
れるが、実施例は本発明の範囲を制限するものではな
い。
【0018】実施例1 バチルス エスピーYU-1005(KCCM-10090)は、最大の
酵素生産性を与えるために、1%のグルコース、0.5%のポ
リペプトン及び0.5%の酵母菌抽出物を含んでいる媒体中
で、37℃の温度で18時間培養され、以下、これを酵
素液として使用した。酵素活性の測定のために、基質株
であるストレプトコッカス ミュータンスKCTC 3283
が、BHI(Brain Heart Infusion [Difco])媒体
中、37℃で3日間培養された。その後、微生物は遠心
法によって収穫され、生理的食塩水で二度洗浄され、そ
して−20℃で貯蔵された。基質株は、OD660nmが1.
0となるように、緩衝液(pH8.0)で再度懸濁され
た。そして、0.2mlの酵素液が2mlの細胞懸濁液に加
えられ、37℃で30分間培養され、660nmにおける吸
収度変化が測定された。この点に関して、上記の状態の
下で1分間に660nmにおける吸収度を0.001だけ減少させ
た酵素の量を、1単位の酵素活性と規定した。
【0019】実施例2 実施例1と同様にして、バチルス エスピーYU-1005(K
CCM-10090)が培養された。図4は、株の発育、酵素の
産生及びpHの変化を示すグラフである。図4に示され
ているように、株は接種後13時間発育して定常期に入
った。媒体のpHは当初7であったが、13時間後に6
に減少し、そして再度8に増加した。約5時間の培養後
に酵素の産生は増加し始め、18時間の培養により最大
の酵素活性である25単位/mlが得られた。
【0020】実施例3 上記のようにして調製されたバチルス エスピーYU-100
5(KCCM-10090)の培養物の1リットルから、メタノー
ル沈殿法、CM−セルロース(Sigma, USA)を使用したカ
チオン交換クロマトグラフィー、セファデックスG−7
5(Sigma, USA)を使用したゲル濾過及びハイドロキシア
パタイト(Bio-Rad)クロマトグラフィーにより、加水分
解酵素が精製された。最終的に、加水分解酵素はハイド
ロキシアパタイトクロマトグラフィーにより、SDS−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により次のように特徴
付けられる2種類に単離された;一方は、27,000ダルト
ンの分子量を有している単量体(YU II)と、他方は、4
5,000ダルトンの分子量を有している単量体(YU III)
(図5を参照)。
【0021】実施例4 2種類の加水分解酵素は以下のように特徴付けられた:
2種類の加水分解酵素の至適pHは8.0であり、中性
からアルカリ条件となるpH6.0から11において、
50%或いはそれ以上の活性と、約100%という高い
安定性が維持されていた(図6及び7を参照)。
【0022】実施例5 加水分解酵素の作用部位を調査するため、基質株である
ストレプトコッカスミュータンスKCTC 3283が酵素液
と、最適条件下で1時間反応され、その後、シリカゲル
を使用した薄層クロマトグラフィーが実行された。その
結果、加水分解酵素はペプチド−グリカン細胞壁のアミ
ノ酸配列を分解するエンドペプチダーゼであることが判
明した。
【0023】実施例6 細胞壁加水分解酵素の特異性を調査するため、以下の表
2に示す口腔内及び腸内細菌、グラム陽性及び陰性細菌
が試験細菌株として使用された。それぞれの株は、24
時間培養され、同じ緩衝液(pH8.0)にOD660nmが
0.5となるように懸濁された。そして、20単位の酵
素が2mlの反応液に加えられ、37℃の温度で30分間
培養された。660nmにおける吸収度変化が測定され、結
果はストレプトコッカス ミュータンスKCTC 3283の分
解に対する相対比として、表2に要約された。
【0024】表2に明らかなように、本発明の加水分解
酵素は、種々のストレプトコッカスミュータンス、そし
てラクトバシラス属に対して高い活性があることが分か
る。しかしながら、酵素は他の真核生物的な微生物には
活性を示さず、これは、酵素が虫歯の原因となる細菌に
特異的に作用することを意味する。
【0025】
【表2】
【0026】以上から明らかなように、本発明は、むし
歯を発生させる細菌であるストレプトコッカス ミュー
タンスの細胞壁を分解する加水分解酵素を産生する新規
なバチルス エスピーを提供する。本発明のバチルス
エスピーにより産生された加水分解酵素は、液体、ペー
スト又は固体として、食品、歯磨き及び薬品の活性成分
として適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【図1】本寒天培地板上のストレプトコッカス ミュー
タンスの分解パターンを示している写真である。
【図2】ストレプトコッカス ミュータンスの細胞壁を
分解する加水分解酵素を産生する微生物を示している光
学顕微鏡写真である。
【図3】ストレプトコッカス ミュータンスの細胞壁を
分解する加水分解酵素を産生する微生物を示している電
子顕微鏡写真である。
【図4】本発明のバチルス エスピーからの酵素生産量
の経時的変化を示しているグラフである。
【図5】精製した加水分解酵素のSDS−ポリアクリル
アミドゲルの電気泳動パターンを示している写真であ
る。
【図6】精製した加水分解酵素の反応に対するpHの影
響を示しているグラフである。
【図7】精製した加水分解酵素の安定性に対するpHの
影響を示しているグラフである。
【図8】精製した加水分解酵素の反応に対する温度の影
響を示しているグラフである。
【図9】精製した加水分解酵素の安定性に対する温度の
影響を示しているグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 FI (C12N 9/14 C12R 1:07) (72)発明者 金 素影 大韓民国京畿道果川市中央洞 住公アパー ト1005棟503号 (72)発明者 ▲べ▼ 東薫 大韓民国忠清南道天安市星井洞 住公6団 地アパート305棟106号 (72)発明者 呉 斗煥 大韓民国ソウル市西大門区新村洞134番地 延世大学校内 (72)発明者 南 承佑 大韓民国ソウル市瑞草区瑞草洞1450−7 株式会社プルムウォンソウル事務所内 (72)発明者 呂 翼鉉 大韓民国ソウル市西大門区延禧洞15−1 株式会社プルムウォン技術研究所内 (72)発明者 柳 洲鉉 大韓民国ソウル市西大門区新村洞134番地 延世大学校内

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ストレプトコッカス ミュータンスの細
    胞壁を分解する加水分解酵素を産生するバチルス エス
    ピーYU-1005(KCCM-10090)。
  2. 【請求項2】 27,000ダルトンの分子量を有している単
    量体である請求項1に記載のバチルス エスピーYU-100
    5(KCCM-10090)により産生された加水分解酵素。
  3. 【請求項3】 45,000ダルトンの分子量を有している単
    量体である請求項1に記載のバチルス エスピーYU-100
    5(KCCM-10090)により産生された加水分解酵素。
JP9143499A 1996-05-15 1997-05-15 細胞壁加水分解酵素を産生する微生物 Pending JPH10136976A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1996P16051 1996-05-15
KR1019960016051A KR0175495B1 (ko) 1996-05-15 1996-05-15 치아우식증 원인세균인 스트렙토코커스 뮤탄스의 세포벽을 용해하는 용해효소와 그의 생산 미생물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH10136976A true JPH10136976A (ja) 1998-05-26

Family

ID=19458677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP9143499A Pending JPH10136976A (ja) 1996-05-15 1997-05-15 細胞壁加水分解酵素を産生する微生物

Country Status (2)

Country Link
JP (1) JPH10136976A (ja)
KR (1) KR0175495B1 (ja)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007290988A (ja) * 2006-04-24 2007-11-08 Kao Corp 歯垢形成抑制剤
US7776325B2 (en) 2003-12-17 2010-08-17 Two Cells Co., Ltd. Bactericide against Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7776325B2 (en) 2003-12-17 2010-08-17 Two Cells Co., Ltd. Bactericide against Streptococcus mutans and Streptococcus sobrinus
JP2007290988A (ja) * 2006-04-24 2007-11-08 Kao Corp 歯垢形成抑制剤

Also Published As

Publication number Publication date
KR970074929A (ko) 1997-12-10
KR0175495B1 (ko) 1999-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA1152014A (en) Lactate dehydrogenase mutants of streptococcus mutans
JP3440694B2 (ja) 口腔用組成物
US4438093A (en) Oral composition containing dextranase and α-1,3 glucanase and a method for preventing and suppressing oral diseases using the same
Mikx et al. Keratinolytic activity of cutaneous and oral bacteria
EP0468411B1 (en) A mutant of bacterium Clostridium histolyticum, a process for the obtaining thereof, and its use in the production of clostripain-free collagenase
US4364926A (en) Novel alkaline protease M3 method for the preparation thereof and dental caries-prophylactic composition containing the same
US5468479A (en) Compositions containing lactic acid bacterium Streptococcus salivarius
US3985869A (en) Dental caries-inducing microorganism cells lytic enzyme
US4454109A (en) Method of treating periodontosis
US3929579A (en) Dental caries-inducing microorganism cells lytic enzyme
US4328313A (en) Method of producing a plaque dispersing enzyme
NO139590B (no) Tannpleiemiddel for aa hindre dannelse av tannbelegg
JPH10136976A (ja) 細胞壁加水分解酵素を産生する微生物
JP3954711B2 (ja) 液体発酵によるビスパン菌の生産方法
US4436725A (en) Physiologically active novel substance mutastein and process for its production
US4324860A (en) Lactate dehydrogenase mutants of Streptococcus mutans
US4209508A (en) Antimicrobial substance C-3603 and process for preparing the same
JP3516104B2 (ja) ムタナーゼ産生微生物及びムタナーゼ
KR100279844B1 (ko) 치주염 원인세균인 포필로모나스 진지발리스 세포를 용균시키는 용균효소 와이유205와 그를 생산하는 미생물
US4159317A (en) Method for preventing alveolar pyorrhea
JP3516105B2 (ja) ムタナーゼ産生微生物及びムタナーゼ
JPS6210520B2 (ja)
KR100202528B1 (ko) 스트랩토코커스 뮤탄스의 세포벽을 용해하는 용해효소와 그의 생산미생물
JPS63301788A (ja) α−1,3−グルカナーゼの製造方法
KR0130541B1 (ko) 글루카네이즈를 생산하는 스트렙토마이세스 속 미생물