JP3440694B2 - 口腔用組成物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ムタナーゼを含有
する口腔用組成物に関する。
する口腔用組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】口腔中
に存在する細菌であるストレプトコッカス・ミュータン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）やス
トレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）等とこれらの菌から産生さ
れる不溶性グルカンからなる歯垢とが、う触形成の要因
の一つと推定されている。う触は、歯垢部位において細
菌に由来する酸が産生し、さらにはそれが歯牙を脱灰す
ることにより生じる。
に存在する細菌であるストレプトコッカス・ミュータン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）やス
トレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃ
ｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）等とこれらの菌から産生さ
れる不溶性グルカンからなる歯垢とが、う触形成の要因
の一つと推定されている。う触は、歯垢部位において細
菌に由来する酸が産生し、さらにはそれが歯牙を脱灰す
ることにより生じる。
【０００３】その歯垢を除去する手法の一つとして、歯
垢を形成する多糖である不溶性グルカンを酵素を用いて
分解することが有効である。不溶性グルカンは、グルコ
ースが主にα−１，６−グルコシド結合とα−１，３−
グルコシド結合を有するグルカンが複雑にからみあって
形成されているが、従来より、α−１，６−グルコシド
結合を切断するデキストラナーゼ、及び、α−１，３結
合を切断するムタナーゼが、それぞれ歯垢形成抑制効果
を持つことが知られており、これらを単独で配合した口
腔用組成物が提案されている（特許第７８２１５４号明
細書、同第１０５５３６５号明細書等）。
垢を形成する多糖である不溶性グルカンを酵素を用いて
分解することが有効である。不溶性グルカンは、グルコ
ースが主にα−１，６−グルコシド結合とα−１，３−
グルコシド結合を有するグルカンが複雑にからみあって
形成されているが、従来より、α−１，６−グルコシド
結合を切断するデキストラナーゼ、及び、α−１，３結
合を切断するムタナーゼが、それぞれ歯垢形成抑制効果
を持つことが知られており、これらを単独で配合した口
腔用組成物が提案されている（特許第７８２１５４号明
細書、同第１０５５３６５号明細書等）。
【０００４】また、歯垢に対する作用点の異なるデキス
トラナーゼとムタナーゼとを併用することによって、各
々を単独で用いるよりも高い歯垢形成抑制効果が得られ
ることも知られている（特開昭５７−１６５３１２号公
報）。
トラナーゼとムタナーゼとを併用することによって、各
々を単独で用いるよりも高い歯垢形成抑制効果が得られ
ることも知られている（特開昭５７−１６５３１２号公
報）。
【０００５】しかしながら、実際には、これまで上市さ
れているムタナーゼは、ごく一部に限定されており、ま
たムタナーゼを配合した歯磨等の口腔用組成物の製品と
して上市されているムタナーゼ配合組成物もない。何故
ならば、現在上市されているムタナーゼは、歯磨、ある
いは洗口剤などの口腔用組成物中に配合するのに必要な
安定性、例えば耐熱性や組成中での安定性が不十分であ
り、未だかかる製品の安定供給には至っていないからで
ある。
れているムタナーゼは、ごく一部に限定されており、ま
たムタナーゼを配合した歯磨等の口腔用組成物の製品と
して上市されているムタナーゼ配合組成物もない。何故
ならば、現在上市されているムタナーゼは、歯磨、ある
いは洗口剤などの口腔用組成物中に配合するのに必要な
安定性、例えば耐熱性や組成中での安定性が不十分であ
り、未だかかる製品の安定供給には至っていないからで
ある。
【０００６】本発明は上記事情に鑑みなされたもので、
歯垢形成の予防や歯垢の除去に有効で、しかもムタナー
ゼを安定的に配合した歯磨等の口腔用組成物を提供する
ことを目的とする。
歯垢形成の予防や歯垢の除去に有効で、しかもムタナー
ゼを安定的に配合した歯磨等の口腔用組成物を提供する
ことを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段及び発明の実施の形態】本
発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を行った
結果、本発明に到達したものである。
発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討を行った
結果、本発明に到達したものである。
【０００８】即ち、本発明は、バチルス属に属すると共
に、プロテアーゼ産生が陰性であるムタナーゼ産生微生
物を培養した培養物から採取されるムタナーゼであっ
て、下記の理化学的性質（Ｉ−ａ）〜（Ｖ−ａ）を有す
るムタナーゼ（ムタナーゼＡと記す。）を配合してなる
ことを特徴とする口腔用組成物、下記の理化学的性質
（Ｉ−ｂ）〜（Ｖ−ｂ）を有するムタナーゼ（ムタナー
ゼＢと記す。）を配合してなることを特徴とする口腔用
組成物、下記の理化学的性質（Ｉ−ｃ）〜（Ｖ−ｃ）を
有するムタナーゼＣ（ムタナーゼＣと記す。）を配合し
てなることを特徴とする口腔用組成物を提供する。
に、プロテアーゼ産生が陰性であるムタナーゼ産生微生
物を培養した培養物から採取されるムタナーゼであっ
て、下記の理化学的性質（Ｉ−ａ）〜（Ｖ−ａ）を有す
るムタナーゼ（ムタナーゼＡと記す。）を配合してなる
ことを特徴とする口腔用組成物、下記の理化学的性質
（Ｉ−ｂ）〜（Ｖ−ｂ）を有するムタナーゼ（ムタナー
ゼＢと記す。）を配合してなることを特徴とする口腔用
組成物、下記の理化学的性質（Ｉ−ｃ）〜（Ｖ−ｃ）を
有するムタナーゼＣ（ムタナーゼＣと記す。）を配合し
てなることを特徴とする口腔用組成物を提供する。
【０００９】ムタナーゼＡ：
（Ｉ−ａ）基質特異性：ムタンをよく分解する。
（ＩＩ−ａ）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４において作用が至適
であり、ｐＨ４〜６の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ａ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （ＩＶ−ａ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度６０℃において作用が至適である。 （Ｖ−ａ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１５万である。 さらに、下記理化学的性質も有する。 （ＶＩ−ａ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ａ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活
する。 （ＶＩＩＩ−ａ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀、銀又は３価の鉄により作用が阻害され
る。 （ＩＸ−ａ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。 ムタナーゼＢ： （Ｉ−ｂ）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （ＩＩ−ｂ）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が
至適であり、ｐＨ４〜７の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ｂ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１１の範囲で安定である。 （ＩＶ−ｂ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度６５℃において作用が至適である。 （Ｖ−ｂ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１４万である。 さらに、下記理化学的性質も有する。 （ＶＩ−ｂ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ｂ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活
する。 （ＶＩＩＩ−ｂ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀又は銀により作用が阻害される。 （ＩＸ−ｂ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。 ムタナーゼＣ： （Ｉ−ｃ）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （ＩＩ−ｃ）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が
至適であり、ｐＨ４〜５の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ｃ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （ＩＶ−ｃ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度５０℃において作用が至適である。 （Ｖ−ｃ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１６万である。 さらに、下記理化学的性質も有する。 （ＶＩ−ｃ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ｃ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、５０℃以下で活性は安定である。 （ＶＩＩＩ−ｃ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀又は銀により作用が阻害される。 （ＩＸ−ｃ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４において作用が至適
であり、ｐＨ４〜６の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ａ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （ＩＶ−ａ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度６０℃において作用が至適である。 （Ｖ−ａ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１５万である。 さらに、下記理化学的性質も有する。 （ＶＩ−ａ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ａ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活
する。 （ＶＩＩＩ−ａ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀、銀又は３価の鉄により作用が阻害され
る。 （ＩＸ−ａ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。 ムタナーゼＢ： （Ｉ−ｂ）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （ＩＩ−ｂ）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が
至適であり、ｐＨ４〜７の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ｂ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１１の範囲で安定である。 （ＩＶ−ｂ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度６５℃において作用が至適である。 （Ｖ−ｂ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１４万である。 さらに、下記理化学的性質も有する。 （ＶＩ−ｂ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ｂ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活
する。 （ＶＩＩＩ−ｂ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀又は銀により作用が阻害される。 （ＩＸ−ｂ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。 ムタナーゼＣ： （Ｉ−ｃ）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （ＩＩ−ｃ）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が
至適であり、ｐＨ４〜５の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ｃ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （ＩＶ−ｃ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度５０℃において作用が至適である。 （Ｖ−ｃ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１６万である。 さらに、下記理化学的性質も有する。 （ＶＩ−ｃ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ｃ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、５０℃以下で活性は安定である。 （ＶＩＩＩ−ｃ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀又は銀により作用が阻害される。 （ＩＸ−ｃ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。
【００１０】本発明の口腔用組成物によれば、上記ムタ
ナーゼの優れた歯垢形成阻止作用、歯垢除去作用によ
り、高いう蝕予防効果を発揮する。
ナーゼの優れた歯垢形成阻止作用、歯垢除去作用によ
り、高いう蝕予防効果を発揮する。
【００１１】この場合、上記ムタナーゼにデキストラナ
ーゼを併用することにより、更に優れた歯垢形成阻止効
果を与える。
ーゼを併用することにより、更に優れた歯垢形成阻止効
果を与える。
【００１２】以下、本発明につき更に詳しく説明する
と、本発明の口腔用組成物は、特定のムタナーゼを含有
してなるものである。
と、本発明の口腔用組成物は、特定のムタナーゼを含有
してなるものである。
【００１３】ここで、口腔用組成物としては、練歯磨、
粉歯磨、液状歯磨等の歯磨剤、洗口剤、マウスウォッシ
ュ、歯肉マッサージクリーム、口腔用パスタ、うがい用
錠剤、義歯洗浄剤、チューインガム、トローチ等として
調製され、ペースト状、固体状、液状等のいずれの形態
であってもよい。
粉歯磨、液状歯磨等の歯磨剤、洗口剤、マウスウォッシ
ュ、歯肉マッサージクリーム、口腔用パスタ、うがい用
錠剤、義歯洗浄剤、チューインガム、トローチ等として
調製され、ペースト状、固体状、液状等のいずれの形態
であってもよい。
【００１４】本発明において、ムタナーゼとしては、バ
チルス属に属すると共に、プロテアーゼ産生が陰性であ
るムタナーゼ産生微生物を培養した培養物から採取され
るムタナーゼを使用する。この種のムタナーゼを使用す
ることにより、効果的に歯垢を分解し、う蝕予防効果に
優れた口腔用組成物を得ることができると共に、この種
のムタナーゼは口腔用組成物に安定に配合される。
チルス属に属すると共に、プロテアーゼ産生が陰性であ
るムタナーゼ産生微生物を培養した培養物から採取され
るムタナーゼを使用する。この種のムタナーゼを使用す
ることにより、効果的に歯垢を分解し、う蝕予防効果に
優れた口腔用組成物を得ることができると共に、この種
のムタナーゼは口腔用組成物に安定に配合される。
【００１５】上記ムタナーゼ産生微生物は、グラム染色
性が陰性のもの又は陽性であるが脱色され易いものが好
ましい。
性が陰性のもの又は陽性であるが脱色され易いものが好
ましい。
【００１６】このようなムタナーゼ産生微生物として
は、下記第１〜第３のムタナーゼ産生微生物を挙げるこ
とができるが、これらに限定されるものではなく、上記
性状を有するものであればいずれのものであってもよ
い。
は、下記第１〜第３のムタナーゼ産生微生物を挙げるこ
とができるが、これらに限定されるものではなく、上記
性状を有するものであればいずれのものであってもよ
い。
【００１７】これら第１〜第３のムタナーゼ産生微生物
は、いずれも自然界より分離採取したものであり、バチ
ルス属に属すると共に、プロテアーゼ産生が陰性である
ことで共通している。
は、いずれも自然界より分離採取したものであり、バチ
ルス属に属すると共に、プロテアーゼ産生が陰性である
ことで共通している。
【００１８】この場合、第１及び第２のムタナーゼ産生
微生物は、更にグラム染色性が陰性であることを特徴と
し、第１のムタナーゼ産生微生物は生育ｐＨが５〜８．
５であり、第２のムタナーゼ産生微生物は生育ｐＨが５
〜７．５であり、特に上記（１）〜（９）の特性を有す
るムタナーゼを産生するという特性により、他のムタナ
ーゼ産生微生物と差別化される。その菌株の菌学的性質
は以下の通りである。ここで、下記説明において、第１
のムタナーゼ産生微生物と第２のムタナーゼ産生微生物
とで相違がある点は注記し、注記がない性質は両者で共
通する。
微生物は、更にグラム染色性が陰性であることを特徴と
し、第１のムタナーゼ産生微生物は生育ｐＨが５〜８．
５であり、第２のムタナーゼ産生微生物は生育ｐＨが５
〜７．５であり、特に上記（１）〜（９）の特性を有す
るムタナーゼを産生するという特性により、他のムタナ
ーゼ産生微生物と差別化される。その菌株の菌学的性質
は以下の通りである。ここで、下記説明において、第１
のムタナーゼ産生微生物と第２のムタナーゼ産生微生物
とで相違がある点は注記し、注記がない性質は両者で共
通する。
【００１９】なお、菌学的性質及び分類方法は ヴァー
ジズ マニュアル オブ システマチック バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（１９
８４）、ザ ジーナス バチルス（Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（１９７３）に準じて行った。
ジズ マニュアル オブ システマチック バクテリオ
ロジー（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙ
ｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（１９
８４）、ザ ジーナス バチルス（Ｔｈｅ Ｇｅｎｕｓ
Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（１９７３）に準じて行った。
【００２０】Ａ．形態的性質
肉汁寒天培地上で４０℃にて２日間培養したとき、以下
の形態的特徴が観察される。 （１）細胞の形及び大きさ：桿菌であり、大きさは０．
６〜１μｍ×３〜４μｍである。 （２）多形性：なし。 （３）運動性：周鞭毛、運動性あり。 （４）胞子：胞子を形成し、胞子の形は楕円形で、その
部位は中立〜亜端立で胞子嚢の膨潤が認められる。胞子
の大きさは１μｍ×１．２〜１．７μｍである。 （５）グラム染色性：陰性である。 （６）抗酸性：陰性である。
の形態的特徴が観察される。 （１）細胞の形及び大きさ：桿菌であり、大きさは０．
６〜１μｍ×３〜４μｍである。 （２）多形性：なし。 （３）運動性：周鞭毛、運動性あり。 （４）胞子：胞子を形成し、胞子の形は楕円形で、その
部位は中立〜亜端立で胞子嚢の膨潤が認められる。胞子
の大きさは１μｍ×１．２〜１．７μｍである。 （５）グラム染色性：陰性である。 （６）抗酸性：陰性である。
【００２１】Ｂ．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養：円形、扁平状、全縁のコロニ
ーを形成する。該コロニーは、第１のムタナーゼ産生微
生物は中心部が乳白色〜クリーム色、周辺部が半透明の
乳白色〜クリーム色であり、第２のムタナーゼ産生微生
物は中心部が乳白色、周辺部外側が半透明の乳白色であ
り、両者はいずれも光沢があり、粘質である。 （２）肉汁寒天斜面培養：拡帯状に生育し、白色〜クリ
ーム色のコロニーを形成する。 （３）肉汁液体培養：生育するが、菌膜は形成しない。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育しているが、液化し
ない。 （５）リトマス・ミルク：変色しない。液化しない。
ーを形成する。該コロニーは、第１のムタナーゼ産生微
生物は中心部が乳白色〜クリーム色、周辺部が半透明の
乳白色〜クリーム色であり、第２のムタナーゼ産生微生
物は中心部が乳白色、周辺部外側が半透明の乳白色であ
り、両者はいずれも光沢があり、粘質である。 （２）肉汁寒天斜面培養：拡帯状に生育し、白色〜クリ
ーム色のコロニーを形成する。 （３）肉汁液体培養：生育するが、菌膜は形成しない。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育しているが、液化し
ない。 （５）リトマス・ミルク：変色しない。液化しない。
【００２２】Ｃ．生理学的性質
（１）硝酸塩の還元：陰性
（２）脱窒反応：陰性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陰性
（５）ＶＰブロスのｐＨ：第１のムタナーゼ産生微生物
は６．３７、第２のムタナーゼ産生微生物は６．９８ （６）インドールの生成：検出せず。 （７）硫化水素の生成：検出せず。 （８）デンプンの加水分解：陽性 （９）クエン酸の利用：シモンズ（Ｓｉｍｍｏｎｓ）培
地では利用しない。クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎ）培地では利用しない。 （１０）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用する。アンモ
ニウム塩は利用する。 （１１）色素の生成：陰性 （１２）ウレアーゼ：陰性 （１３）オキシダーゼ：第１のムタナーゼ産生微生物は
陽性、第２のムタナーゼ産生微生物は微弱 （１４）カタラーゼ：陽性 （１５）生育の範囲：第１のムタナーゼ産生微生物はｐ
Ｈ５〜８．５、２５〜６０℃で生育する。第２のムタナ
ーゼ産生微生物はｐＨ５〜７．５、２５〜５３℃で生育
する。 （１６）酸素に対する態度：好気性 （１７）Ｏ−Ｆテスト：好気的に分解 （１８）糖類から酸及びガスの生成：下記表１に示す通
りである。なお、表１において、「＋」は酸又はガスを
生成することを示し、「−」は酸又はガスを生成しない
ことを示す。
は６．３７、第２のムタナーゼ産生微生物は６．９８ （６）インドールの生成：検出せず。 （７）硫化水素の生成：検出せず。 （８）デンプンの加水分解：陽性 （９）クエン酸の利用：シモンズ（Ｓｉｍｍｏｎｓ）培
地では利用しない。クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎ）培地では利用しない。 （１０）無機窒素源の利用：硝酸塩は利用する。アンモ
ニウム塩は利用する。 （１１）色素の生成：陰性 （１２）ウレアーゼ：陰性 （１３）オキシダーゼ：第１のムタナーゼ産生微生物は
陽性、第２のムタナーゼ産生微生物は微弱 （１４）カタラーゼ：陽性 （１５）生育の範囲：第１のムタナーゼ産生微生物はｐ
Ｈ５〜８．５、２５〜６０℃で生育する。第２のムタナ
ーゼ産生微生物はｐＨ５〜７．５、２５〜５３℃で生育
する。 （１６）酸素に対する態度：好気性 （１７）Ｏ−Ｆテスト：好気的に分解 （１８）糖類から酸及びガスの生成：下記表１に示す通
りである。なお、表１において、「＋」は酸又はガスを
生成することを示し、「−」は酸又はガスを生成しない
ことを示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】Ｄ．その他の性質
（１）塩化ナトリウムの耐性：寒天培地において、２％
塩化ナトリウム存在下で生育し、５％塩化ナトリウム存
在下では生育しない。 （２）嫌気下での生育：陰性 （３）カゼイン分解：陰性 （４）プロピオン酸塩の利用：陰性 （５）ｐＨ６．８での生育：陽性 （６）ｐＨ５．７での生育：陽性 （７）クリスタル形成：陰性 （８）プロテアーゼ産生：陰性
塩化ナトリウム存在下で生育し、５％塩化ナトリウム存
在下では生育しない。 （２）嫌気下での生育：陰性 （３）カゼイン分解：陰性 （４）プロピオン酸塩の利用：陰性 （５）ｐＨ６．８での生育：陽性 （６）ｐＨ５．７での生育：陽性 （７）クリスタル形成：陰性 （８）プロテアーゼ産生：陰性
【００２５】一方、第３のムタナーゼ産生微生物は、グ
ラム染色性が陽性であるが、脱色されやすい性質を示す
ことを特徴とし、特に上記（１）〜（９）の特性を有す
るムタナーゼを産生するという特性により他のムタナー
ゼ産生微生物と差別化される。その菌株の菌学的性質は
以下の通りである。
ラム染色性が陽性であるが、脱色されやすい性質を示す
ことを特徴とし、特に上記（１）〜（９）の特性を有す
るムタナーゼを産生するという特性により他のムタナー
ゼ産生微生物と差別化される。その菌株の菌学的性質は
以下の通りである。
【００２６】Ａ．形態的性質
肉汁寒天培地上で３０℃にて２日間培養したとき、以下
の形態的特徴が観察される。 （１）細胞の形及び大きさ：桿菌であり、大きさは１〜
２μｍ×４〜６μｍである。 （２）多形性：なし。 （３）運動性：周鞭毛、運動性あり。 （４）胞子：胞子を形成し、胞子の形は楕円形で、その
部位は中立〜亜端立で胞子嚢の膨潤が認められる。胞子
の大きさは１〜１．５μｍ×２〜３μｍである。 （５）グラム染色性：陽性、但し脱色されやすい。 （６）抗酸性：陰性である。
の形態的特徴が観察される。 （１）細胞の形及び大きさ：桿菌であり、大きさは１〜
２μｍ×４〜６μｍである。 （２）多形性：なし。 （３）運動性：周鞭毛、運動性あり。 （４）胞子：胞子を形成し、胞子の形は楕円形で、その
部位は中立〜亜端立で胞子嚢の膨潤が認められる。胞子
の大きさは１〜１．５μｍ×２〜３μｍである。 （５）グラム染色性：陽性、但し脱色されやすい。 （６）抗酸性：陰性である。
【００２７】Ｂ．培養的性質
（１）肉汁寒天平板培養：円形、扁平状、全縁のコロニ
ーを形成する。該コロニーは、白色で光沢はない。 （２）肉汁寒天斜面培養：拡帯状に生育し、白色〜クリ
ーム色のコロニーを形成する。 （３）肉汁液体培養：生育するが、菌膜は形成しない。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育するが、液化しな
い。 （５）リトマス・ミルク：変色しない。液化も凝固もし
ない。
ーを形成する。該コロニーは、白色で光沢はない。 （２）肉汁寒天斜面培養：拡帯状に生育し、白色〜クリ
ーム色のコロニーを形成する。 （３）肉汁液体培養：生育するが、菌膜は形成しない。 （４）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育するが、液化しな
い。 （５）リトマス・ミルク：変色しない。液化も凝固もし
ない。
【００２８】Ｃ．生理学的性質
（１）硝酸塩の還元：陽性
（２）脱窒反応：陰性
（３）ＭＲテスト：陰性
（４）ＶＰテスト：陰性
（５）ＶＰブロスのｐＨ：５．８
（６）インドールの生成：検出せず。
（７）硫化水素の生成：検出せず。
（８）デンプンの加水分解：微弱
（９）クエン酸の利用：シモンズ（Ｓｉｍｍｏｎｓ）培
地では利用しない。クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎ）培地では利用しない。 （１０）無機窒素源の利用：硝酸塩はわずかに利用す
る。アンモニウム塩は利用する。 （１１）色素の生成：陰性 （１２）ウレアーゼ：陰性 （１３）オキシダーゼ：陽性 （１４）カタラーゼ：陰性 （１５）生育の範囲：ｐＨ６〜８で生育する。２０〜３
３℃で至適に生育する。 （１６）酸素に対する態度：好気性 （１７）Ｏ−Ｆテスト：好気的に分解 （１８）糖類から酸及びガスの生成：下記表２に示す通
りである。なお、表２において、「＋」は酸又はガスを
生成することを示し、「−」は酸又はガスを生成しない
ことを示し、「±」は微弱に生成することを示す。
地では利用しない。クリステンセン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ
ｓｅｎ）培地では利用しない。 （１０）無機窒素源の利用：硝酸塩はわずかに利用す
る。アンモニウム塩は利用する。 （１１）色素の生成：陰性 （１２）ウレアーゼ：陰性 （１３）オキシダーゼ：陽性 （１４）カタラーゼ：陰性 （１５）生育の範囲：ｐＨ６〜８で生育する。２０〜３
３℃で至適に生育する。 （１６）酸素に対する態度：好気性 （１７）Ｏ−Ｆテスト：好気的に分解 （１８）糖類から酸及びガスの生成：下記表２に示す通
りである。なお、表２において、「＋」は酸又はガスを
生成することを示し、「−」は酸又はガスを生成しない
ことを示し、「±」は微弱に生成することを示す。
【００２９】
【表２】
【００３０】Ｄ．その他の性質
（１）塩化ナトリウムの耐性：寒天培地において、２％
塩化ナトリウム存在下では生育しない。 （２）嫌気下での生育：陰性 （３）カゼイン分解：陰性 （４）プロピオン酸塩の利用：陰性 （５）ｐＨ６．８での生育：陽性 （６）ｐＨ５．７での生育：陽性 （７）クリスタル形成：陰性 （８）プロテアーゼ産生：陰性 （９）ＧＣ含量：５６％ 次に、上記ムタナーゼ産生微生物の菌株と公知の菌株と
の相違を述べる。公知のムタナーゼ産生微生物として、
細菌のシュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチ
ルス属、放線菌のストレプトミセス属、かびのトリコデ
ルマ属、アスペルギルス属などが知られている。
塩化ナトリウム存在下では生育しない。 （２）嫌気下での生育：陰性 （３）カゼイン分解：陰性 （４）プロピオン酸塩の利用：陰性 （５）ｐＨ６．８での生育：陽性 （６）ｐＨ５．７での生育：陽性 （７）クリスタル形成：陰性 （８）プロテアーゼ産生：陰性 （９）ＧＣ含量：５６％ 次に、上記ムタナーゼ産生微生物の菌株と公知の菌株と
の相違を述べる。公知のムタナーゼ産生微生物として、
細菌のシュードモナス属、フラボバクテリウム属、バチ
ルス属、放線菌のストレプトミセス属、かびのトリコデ
ルマ属、アスペルギルス属などが知られている。
【００３１】まず、上記ムタナーゼ産生微生物と同じバ
チルス属の菌株バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ） ＢＣ−８（以下、ＢＣ
−８菌という）（特開昭６３−３０１７８８号公報）に
ついて述べると、第１及び第２のムタナーゼ産生微生物
はグラム染色性が陰性であるのに対し、ＢＣ−８菌は陽
性である。また、第１及び第２のムタナーゼ産生微生物
は胞子の部位が中立〜亜端立であるのに対し、ＢＣ−８
菌では亜端立である。更に、第１及び第２のムタナーゼ
産生微生物は５％ＮａＣｌの生育性が陰性であるのに対
し、ＢＣ−８菌は陽性である。第１及び第２のムタナー
ゼ産生微生物はＬ−アラビノースからの酸産生が陽性で
あるのに対し、ＢＣ−８菌は陰性であり、第１及び第２
のムタナーゼ産生微生物はＤ−キシロースからの酸産生
が陽性であるのに対し、ＢＣ−８菌は陰性である。第１
及び第２のムタナーゼ産生微生物は４５℃の生育性が陽
性であるのに対し、ＢＣ−８菌は陰性である。
チルス属の菌株バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ） ＢＣ−８（以下、ＢＣ
−８菌という）（特開昭６３−３０１７８８号公報）に
ついて述べると、第１及び第２のムタナーゼ産生微生物
はグラム染色性が陰性であるのに対し、ＢＣ−８菌は陽
性である。また、第１及び第２のムタナーゼ産生微生物
は胞子の部位が中立〜亜端立であるのに対し、ＢＣ−８
菌では亜端立である。更に、第１及び第２のムタナーゼ
産生微生物は５％ＮａＣｌの生育性が陰性であるのに対
し、ＢＣ−８菌は陽性である。第１及び第２のムタナー
ゼ産生微生物はＬ−アラビノースからの酸産生が陽性で
あるのに対し、ＢＣ−８菌は陰性であり、第１及び第２
のムタナーゼ産生微生物はＤ−キシロースからの酸産生
が陽性であるのに対し、ＢＣ−８菌は陰性である。第１
及び第２のムタナーゼ産生微生物は４５℃の生育性が陽
性であるのに対し、ＢＣ−８菌は陰性である。
【００３２】第３のムタナーゼ産生微生物はグラム染色
性が一応は陽性を示すものの、脱色されやすい性質を示
すのに対し、ＢＣ−８菌は陽性である。そして、第３の
ムタナーゼ産生微生物は運動性があり、胞子の部位が中
立〜亜端立であるのに対し、ＢＣ−８菌は運動性がな
く、胞子の部位が亜端立である。また、第３のムタナー
ゼ産生微生物はカタラーゼが陰性で、硝酸塩還元が陽性
であるのに対し、ＢＣ−８菌はカタラーゼが陽性で、硝
酸塩還元が陰性である。更に、第３のムタナーゼ産生微
生物は５％ＮａＣｌの生育性が陰性であるのに対し、Ｂ
Ｃ−８菌は陽性である。第３のムタナーゼ産生微生物は
Ｄ−キシロースからの酸産生が微弱であるのに対し、Ｂ
Ｃ−８菌は陰性である。第３のムタナーゼ産生微生物は
ＧＣ含量が５６％であるのに対し、ＢＣ−８菌では４
９．５％である。
性が一応は陽性を示すものの、脱色されやすい性質を示
すのに対し、ＢＣ−８菌は陽性である。そして、第３の
ムタナーゼ産生微生物は運動性があり、胞子の部位が中
立〜亜端立であるのに対し、ＢＣ−８菌は運動性がな
く、胞子の部位が亜端立である。また、第３のムタナー
ゼ産生微生物はカタラーゼが陰性で、硝酸塩還元が陽性
であるのに対し、ＢＣ−８菌はカタラーゼが陽性で、硝
酸塩還元が陰性である。更に、第３のムタナーゼ産生微
生物は５％ＮａＣｌの生育性が陰性であるのに対し、Ｂ
Ｃ−８菌は陽性である。第３のムタナーゼ産生微生物は
Ｄ−キシロースからの酸産生が微弱であるのに対し、Ｂ
Ｃ−８菌は陰性である。第３のムタナーゼ産生微生物は
ＧＣ含量が５６％であるのに対し、ＢＣ−８菌では４
９．５％である。
【００３３】一方、第１〜第３のムタナーゼ産生微生物
と同じバチルス属に属するバチルス・サーキュランス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ） ＦＥＲＭ
−Ｐ４７６５株（以下、ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株とい
う）（特開昭５５−８８６９３号公報）は、菌株の菌学
的性質が不明であるが、第１のムタナーゼ産生微生物の
菌株が産生するムタナーゼは、分子量が約１５万であ
り、至適温度が６０℃、至適ｐＨが４であり、第２のム
タナーゼ産生微生物の菌株が産生するムタナーゼは、分
子量が約１４万であり、至適温度が６５℃、至適ｐＨが
４．５であるのに対し、ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株が産生
するムタナーゼは、分子量７万以上で至適温度が３０〜
４０℃、至適ｐＨが６．２〜６．７であることから、第
１及び第２のムタナーゼ産生微生物はＦＥＲＭ−Ｐ４７
６５株とは差別化される。
と同じバチルス属に属するバチルス・サーキュランス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ） ＦＥＲＭ
−Ｐ４７６５株（以下、ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株とい
う）（特開昭５５−８８６９３号公報）は、菌株の菌学
的性質が不明であるが、第１のムタナーゼ産生微生物の
菌株が産生するムタナーゼは、分子量が約１５万であ
り、至適温度が６０℃、至適ｐＨが４であり、第２のム
タナーゼ産生微生物の菌株が産生するムタナーゼは、分
子量が約１４万であり、至適温度が６５℃、至適ｐＨが
４．５であるのに対し、ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株が産生
するムタナーゼは、分子量７万以上で至適温度が３０〜
４０℃、至適ｐＨが６．２〜６．７であることから、第
１及び第２のムタナーゼ産生微生物はＦＥＲＭ−Ｐ４７
６５株とは差別化される。
【００３４】また、第３のムタナーゼ産生微生物の菌株
が産生するムタナーゼは、分子量が約１６万であり、至
適温度が５０℃、至適ｐＨが４．５付近であるのに対
し、ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株が産生するムタナーゼは、
分子量７万以上であり、至適温度が３０〜４０℃、至適
ｐＨが６．２〜６．７であることから、第３のムタナー
ゼ産生微生物はＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株とは差別化され
る。
が産生するムタナーゼは、分子量が約１６万であり、至
適温度が５０℃、至適ｐＨが４．５付近であるのに対
し、ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株が産生するムタナーゼは、
分子量７万以上であり、至適温度が３０〜４０℃、至適
ｐＨが６．２〜６．７であることから、第３のムタナー
ゼ産生微生物はＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株とは差別化され
る。
【００３５】更に、特開昭５２−３４９８０号公報に記
載されたムタナーゼ産生微生物はストレプトミセス属に
属し、特開昭５０−１４５５８３号公報に記載されたム
タナーゼ産生微生物はフラボバクテリウム属に属するも
のであり、特開昭４７−９７４３号公報に記載されたム
タナーゼ産生微生物はトリコデルマ・ハルジアヌム、ペ
ニシリウム・リラシヌム、ペニシリウム・フニクロサ
ム、ペニシリウム・メリニイ及びペニシリウム・ヤンシ
ネルムであることから、第１〜第３のムタナーゼ産生微
生物はこれらの公知のムタナーゼ産生微生物と差別化さ
れる。
載されたムタナーゼ産生微生物はストレプトミセス属に
属し、特開昭５０−１４５５８３号公報に記載されたム
タナーゼ産生微生物はフラボバクテリウム属に属するも
のであり、特開昭４７−９７４３号公報に記載されたム
タナーゼ産生微生物はトリコデルマ・ハルジアヌム、ペ
ニシリウム・リラシヌム、ペニシリウム・フニクロサ
ム、ペニシリウム・メリニイ及びペニシリウム・ヤンシ
ネルムであることから、第１〜第３のムタナーゼ産生微
生物はこれらの公知のムタナーゼ産生微生物と差別化さ
れる。
【００３６】以上の点から、第１〜第３のムタナーゼ産
生微生物の菌株は公知の菌株とは相違するものである。
生微生物の菌株は公知の菌株とは相違するものである。
【００３７】本発明者らは新規な第１のムタナーゼ産生
微生物であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）ＲＭ１株（以下、ＲＭ１株という）を工業技術
院生命工学工業技術研究所へ生命研菌寄第１４８３６号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８３６）として寄託した。このＲ
Ｍ１株は上記菌学的性質を有するものである。なお、こ
の菌株を分離した土壌の採取場所は神奈川県中郡二宮町
であり、土壌の採取は１９９４年に行った。
微生物であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐ．）ＲＭ１株（以下、ＲＭ１株という）を工業技術
院生命工学工業技術研究所へ生命研菌寄第１４８３６号
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８３６）として寄託した。このＲ
Ｍ１株は上記菌学的性質を有するものである。なお、こ
の菌株を分離した土壌の採取場所は神奈川県中郡二宮町
であり、土壌の採取は１９９４年に行った。
【００３８】また、本発明者らは新規な第２のムタナー
ゼ産生微生物であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｐ．）ＲＭ４株（以下、ＲＭ４株という）を工
業技術院生命工学工業技術研究所へ生命研菌寄第１４８
３７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８３７）として寄託した。
このＲＭ４株は上記菌学的性質を有するものである。な
お、この菌株を分離した土壌の採取場所は群馬県草津温
泉であり、土壌の採取は１９９４年に行った。
ゼ産生微生物であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｐ．）ＲＭ４株（以下、ＲＭ４株という）を工
業技術院生命工学工業技術研究所へ生命研菌寄第１４８
３７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８３７）として寄託した。
このＲＭ４株は上記菌学的性質を有するものである。な
お、この菌株を分離した土壌の採取場所は群馬県草津温
泉であり、土壌の採取は１９９４年に行った。
【００３９】更に、本発明者らは新規な第３のムタナー
ゼ産生微生物であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｐ．）Ｍ７株（以下、Ｍ７株という）を工業技
術院生命工学工業技術研究所へ生命研菌寄第１４８３５
号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８３５）として寄託した。この
Ｍ７株は上記菌学的性質を有するものである。なお、こ
の菌株を分離した土壌の採取場所は新潟県見王不動であ
り、土壌の採取は１９９３年に行った。
ゼ産生微生物であるバチルス・エスピー（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ ｓｐ．）Ｍ７株（以下、Ｍ７株という）を工業技
術院生命工学工業技術研究所へ生命研菌寄第１４８３５
号（ＦＥＲＭ Ｐ−１４８３５）として寄託した。この
Ｍ７株は上記菌学的性質を有するものである。なお、こ
の菌株を分離した土壌の採取場所は新潟県見王不動であ
り、土壌の採取は１９９３年に行った。
【００４０】そして、上記ＲＭ１株及びＲＭ４株は、次
に述べるスクリーニング法により自然界より分離採取さ
れるものである。
に述べるスクリーニング法により自然界より分離採取さ
れるものである。
【００４１】スパテル１杯の土壌を５ｍｌの滅菌した生
理食塩水に懸濁し、その懸濁液１００μｌをムタンを加
えた寒天培地に塗布する。４５℃で３〜５日培養し、コ
ロニー周辺に透明な分解帯を生じたものをムタナーゼ産
生微生物として分離し、培養して得られる酵素の特性を
検討することによって優れた歯垢除去能と安定性とを有
するＲＭ１株、ＲＭ４株を選抜した。
理食塩水に懸濁し、その懸濁液１００μｌをムタンを加
えた寒天培地に塗布する。４５℃で３〜５日培養し、コ
ロニー周辺に透明な分解帯を生じたものをムタナーゼ産
生微生物として分離し、培養して得られる酵素の特性を
検討することによって優れた歯垢除去能と安定性とを有
するＲＭ１株、ＲＭ４株を選抜した。
【００４２】このＲＭ１株、ＲＭ４株を天然又は合成培
地に接種して、通常の培養条件により培養することによ
りムタナーゼが産生されるが、培地としては、通常、炭
素源、窒素源、無機塩等の微生物の生育に必要な成分を
含んだものが好適であり、培地の栄養源としては微生物
一般に用いられるものを使用することができ、このよう
な栄養源は、例えば炭素源としてグルコース，イノシト
ール，フルクトース，ムタン，デンプン等が、窒素源と
してペプトン，大豆粉，酵母エキス等が、無機塩として
リン酸，ナトリウム，カリウム，マグネシウム等の塩類
を挙げることができ、これらを一種単独で又は二種以上
を適宜組み合わせて使用するが、これらの中でも、特に
イノシトール、ムタン、ペプトン、リン酸塩等が好適に
使用される。培養液のｐＨは第１のムタナーゼ産生微生
物の場合は５〜８．５が好ましく、第２のムタナーゼ産
生微生物の場合は５〜７．５が好ましく、いずれも特に
ｐＨ７とすると好適である。また、培養温度は３５〜４
８℃が好ましく、特に４０℃が好適である。培養時間
は、培養条件によって異なるが、通常１〜３日が好まし
い。
地に接種して、通常の培養条件により培養することによ
りムタナーゼが産生されるが、培地としては、通常、炭
素源、窒素源、無機塩等の微生物の生育に必要な成分を
含んだものが好適であり、培地の栄養源としては微生物
一般に用いられるものを使用することができ、このよう
な栄養源は、例えば炭素源としてグルコース，イノシト
ール，フルクトース，ムタン，デンプン等が、窒素源と
してペプトン，大豆粉，酵母エキス等が、無機塩として
リン酸，ナトリウム，カリウム，マグネシウム等の塩類
を挙げることができ、これらを一種単独で又は二種以上
を適宜組み合わせて使用するが、これらの中でも、特に
イノシトール、ムタン、ペプトン、リン酸塩等が好適に
使用される。培養液のｐＨは第１のムタナーゼ産生微生
物の場合は５〜８．５が好ましく、第２のムタナーゼ産
生微生物の場合は５〜７．５が好ましく、いずれも特に
ｐＨ７とすると好適である。また、培養温度は３５〜４
８℃が好ましく、特に４０℃が好適である。培養時間
は、培養条件によって異なるが、通常１〜３日が好まし
い。
【００４３】一方、上記Ｍ７株は、次に述べるスクリー
ニング法により自然界より分離採取されるものである。
ニング法により自然界より分離採取されるものである。
【００４４】スパテル１杯の土壌を５ｍｌの滅菌した生
理食塩水に懸濁し、その懸濁液１００μｌをムタンを加
えた寒天培地に塗布する。まず、３０℃で３〜５日培養
し、その後、コロニー周辺に透明な分解帯を生じたもの
をムタナーゼ産生微生物として分離し、培養して得られ
る酵素の特性を検討することによって優れた歯垢除去能
と安定性とを有するＭ７株を選抜した。
理食塩水に懸濁し、その懸濁液１００μｌをムタンを加
えた寒天培地に塗布する。まず、３０℃で３〜５日培養
し、その後、コロニー周辺に透明な分解帯を生じたもの
をムタナーゼ産生微生物として分離し、培養して得られ
る酵素の特性を検討することによって優れた歯垢除去能
と安定性とを有するＭ７株を選抜した。
【００４５】このＭ７株を天然又は合成培地に接種し
て、通常の培養条件により培養することによりムタナー
ゼが産生されるが、培地としては、通常、炭素源、窒素
源、無機塩等の微生物一般に用いられるものを使用する
ことができ、このような栄養源は、例えば炭素源として
イノシトール，ガラクトース，ムタン等が、窒素源とし
てペプトン，ポリペプトン，大豆粉，酵母エキス等が、
無機塩としてリン酸，ナトリウム，カリウム，マグネシ
ウム等の塩類を挙げることができ、これらを一種単独で
又は二種以上を適宜組み合わせて使用するが、これらの
中でも特にイノシトール、ムタン、ポリペプトン、リン
酸塩等が好適に使用される。培養基のｐＨは６〜８が好
ましく、特にｐＨ７とすると好適である。また、培養温
度は２０〜３３℃が好ましく、特に３０℃が好適であ
る。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常１〜
３日が好ましい。
て、通常の培養条件により培養することによりムタナー
ゼが産生されるが、培地としては、通常、炭素源、窒素
源、無機塩等の微生物一般に用いられるものを使用する
ことができ、このような栄養源は、例えば炭素源として
イノシトール，ガラクトース，ムタン等が、窒素源とし
てペプトン，ポリペプトン，大豆粉，酵母エキス等が、
無機塩としてリン酸，ナトリウム，カリウム，マグネシ
ウム等の塩類を挙げることができ、これらを一種単独で
又は二種以上を適宜組み合わせて使用するが、これらの
中でも特にイノシトール、ムタン、ポリペプトン、リン
酸塩等が好適に使用される。培養基のｐＨは６〜８が好
ましく、特にｐＨ７とすると好適である。また、培養温
度は２０〜３３℃が好ましく、特に３０℃が好適であ
る。培養時間は、培養条件によって異なるが、通常１〜
３日が好ましい。
【００４６】次いで、以上のように十分にムタナーゼが
産生された上記各菌株の培養液から遠心分離等により菌
体等を取り除いた上清を本発明のムタナーゼの粗酵素液
として得る。この粗酵素液は、このままでも使用するこ
とはできるが、更に、公知の分離精製方法、例えば限外
濾過膜濃縮法、減圧濃縮法、硫安等による塩析法、エタ
ノール等による分画法、等電点沈殿法、カラムクロマト
分画法などを、単独で又は適宜組み合わせることによっ
て精製酵素液とすると好適である。なお、この精製処理
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
単一バンドにまで精製されていることが確認できるまで
行うことが望ましい。
産生された上記各菌株の培養液から遠心分離等により菌
体等を取り除いた上清を本発明のムタナーゼの粗酵素液
として得る。この粗酵素液は、このままでも使用するこ
とはできるが、更に、公知の分離精製方法、例えば限外
濾過膜濃縮法、減圧濃縮法、硫安等による塩析法、エタ
ノール等による分画法、等電点沈殿法、カラムクロマト
分画法などを、単独で又は適宜組み合わせることによっ
て精製酵素液とすると好適である。なお、この精製処理
は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
単一バンドにまで精製されていることが確認できるまで
行うことが望ましい。
【００４７】なお、本発明のムタナーゼの産生には、上
記菌株以外にも、上記各菌株の変異株や該ムタナーゼ遺
伝子を持つ組換え微生物を用いることができる。
記菌株以外にも、上記各菌株の変異株や該ムタナーゼ遺
伝子を持つ組換え微生物を用いることができる。
【００４８】以上の通り、本発明で配合するムタナーゼ
としては、上記ムタナーゼ産生微生物を培養して得られ
るものであるが、別の観点からいえば、ムタナーゼとし
て具体的には、下記の理化学的性質を有するものを使用
することができる。 （１）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分
解する性質を有する。 （２）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４〜４．５の範囲において至
適作用ｐＨをもつ。 （４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
少なくともｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度５０〜６５℃の範囲において至適温度をも
つ。 （６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
少なくとも５０℃以下で活性は安定である。 （７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀又は銀により作用が阻害される。 （８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。 （９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１４万〜約１６万の範囲である。
としては、上記ムタナーゼ産生微生物を培養して得られ
るものであるが、別の観点からいえば、ムタナーゼとし
て具体的には、下記の理化学的性質を有するものを使用
することができる。 （１）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分
解する性質を有する。 （２）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４〜４．５の範囲において至
適作用ｐＨをもつ。 （４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
少なくともｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度５０〜６５℃の範囲において至適温度をも
つ。 （６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
少なくとも５０℃以下で活性は安定である。 （７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀又は銀により作用が阻害される。 （８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。 （９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１４万〜約１６万の範囲である。
【００４９】なお、上記性質において基質として用いら
れているムタンは、公知の方法により得られるものであ
り、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス又はス
トレプトコッカス・ソブリナスの培養により産生された
不溶性グルカンのα−１，６−グルコシド結合をデキス
トラナーゼで切断して得られるものである。
れているムタンは、公知の方法により得られるものであ
り、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス又はス
トレプトコッカス・ソブリナスの培養により産生された
不溶性グルカンのα−１，６−グルコシド結合をデキス
トラナーゼで切断して得られるものである。
【００５０】好適なムタナーゼとしては、上記第１のム
タナーゼ産生微生物が産生するムタナーゼ（下記の性状
を有するムタナーゼＡ）、第２のムタナーゼ産生微生物
が産生するムタナーゼ（下記の性状を有するムタナーゼ
Ｂ）、第３のムタナーゼ産生微生物が産生するムタナー
ゼ（下記の性状を有するムタナーゼＣ）を挙げることが
できる。
タナーゼ産生微生物が産生するムタナーゼ（下記の性状
を有するムタナーゼＡ）、第２のムタナーゼ産生微生物
が産生するムタナーゼ（下記の性状を有するムタナーゼ
Ｂ）、第３のムタナーゼ産生微生物が産生するムタナー
ゼ（下記の性状を有するムタナーゼＣ）を挙げることが
できる。
【００５１】ムタナーゼＡ
（１）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分
解する性質を有する。 （２）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４において作用が至適であ
り、ｐＨ４〜６の範囲で高い活性を示す。 （４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度６０℃において作用が至適である。 （６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活する。 （７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀、銀又は３価の鉄により作用が阻害される。 （８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。 （９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１５万である。
解する性質を有する。 （２）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４において作用が至適であ
り、ｐＨ４〜６の範囲で高い活性を示す。 （４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度６０℃において作用が至適である。 （６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活する。 （７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀、銀又は３価の鉄により作用が阻害される。 （８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。 （９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１５万である。
【００５２】ムタナーゼＢ
（１）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分
解する性質を有する。 （２）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が至適で
あり、ｐＨ４〜７の範囲で高い活性を示す。 （４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
ｐＨ４〜１１の範囲で安定である。 （５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度６５℃において作用が至適である。 （６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活する。 （７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀又は銀により作用が阻害される。 （８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。 （９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１４万である。
解する性質を有する。 （２）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が至適で
あり、ｐＨ４〜７の範囲で高い活性を示す。 （４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
ｐＨ４〜１１の範囲で安定である。 （５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度６５℃において作用が至適である。 （６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活する。 （７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀又は銀により作用が阻害される。 （８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。 （９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１４万である。
【００５３】ムタナーゼＣ
（１）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結合を分
解する性質を有する。 （２）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が至適で
あり、ｐＨ４〜５の範囲で高い活性を示す。 （４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度５０℃において作用が至適である。 （６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
５０℃以下で活性は安定である。 （７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀又は銀により作用が阻害される。 （８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。 （９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１６万である。
解する性質を有する。 （２）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （３）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃で１０
分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が至適で
あり、ｐＨ４〜５の範囲で高い活性を示す。 （４）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温する場合、
ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （５）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反応させ
る場合、温度５０℃において作用が至適である。 （６）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理した場合、
５０℃以下で活性は安定である。 （７）金属イオンの影響：ムタンを基質とする場合、水
銀又は銀により作用が阻害される。 （８）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、ｐ−ク
ロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって阻害さ
れる。 （９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動による分子量は約１６万である。
【００５４】以下、これらムタナーゼＡ〜Ｃの性状を更
に具体的に説明する。 （１）酵素作用 ムタナーゼ（α−１，３−グルカナーゼ）にはそのグル
コシド結合の切断パターンから、末端より切断するエキ
ソ型とランダムに切断するエンド型が存在するが、本発
明のムタナーゼＡ〜Ｃは、ムタンのα−１，３−グルコ
シド結合をエンド型に分解する性質を有するものと推定
される。
に具体的に説明する。 （１）酵素作用 ムタナーゼ（α−１，３−グルカナーゼ）にはそのグル
コシド結合の切断パターンから、末端より切断するエキ
ソ型とランダムに切断するエンド型が存在するが、本発
明のムタナーゼＡ〜Ｃは、ムタンのα−１，３−グルコ
シド結合をエンド型に分解する性質を有するものと推定
される。
【００５５】即ち、１００μｌの３％ムタンに５０μｌ
の本発明のムタナーゼ又はムタンのα−１，３−グルコ
シド結合をエキソ型に分解するノボザイム２３４（商品
名：ノボ社製、トリコデルマ・ハルジアヌム菌由来）を
加えて、３７℃において２０時間保温して反応させ、そ
の後、反応生成物を遠心分離して得られる上清を薄層板
にスポットして展開（１−ブタノール：イソプロパノー
ル：水＝４：７：１）し、その薄層板に濃硫酸を噴霧
し、１００℃で５分間加熱することにより、上記反応に
より産生する糖類をＴＬＣによって分析する。この場
合、本発明のムタナーゼのムタン分解物は、ランダムに
分解され、グルコースより低い移動度の位置に帯状の長
いスポットが検出されるのに対し、ノボザイム２３４の
ムタン分解物は、グルコースのスポットを示すことか
ら、本発明のムタナーゼＡ〜Ｃは基質をランダムに分解
するエンド型の酵素と推定される。
の本発明のムタナーゼ又はムタンのα−１，３−グルコ
シド結合をエキソ型に分解するノボザイム２３４（商品
名：ノボ社製、トリコデルマ・ハルジアヌム菌由来）を
加えて、３７℃において２０時間保温して反応させ、そ
の後、反応生成物を遠心分離して得られる上清を薄層板
にスポットして展開（１−ブタノール：イソプロパノー
ル：水＝４：７：１）し、その薄層板に濃硫酸を噴霧
し、１００℃で５分間加熱することにより、上記反応に
より産生する糖類をＴＬＣによって分析する。この場
合、本発明のムタナーゼのムタン分解物は、ランダムに
分解され、グルコースより低い移動度の位置に帯状の長
いスポットが検出されるのに対し、ノボザイム２３４の
ムタン分解物は、グルコースのスポットを示すことか
ら、本発明のムタナーゼＡ〜Ｃは基質をランダムに分解
するエンド型の酵素と推定される。
【００５６】（２）基質特異性
本発明のムタナーゼＡ〜Ｃはムタンをよく分解する。即
ち、本発明のムタナーゼＡ〜Ｃの溶液（５００単位／ｍ
ｌ）１００μｌに対し、表３に示す各基質溶液１００μ
ｌ（１％溶液）を３０分間反応させ、還元糖量を以下に
示す酵素活性の測定法に準じて検出すると表３に併記す
る結果を示す。なお、表３における相対水解度は、ムタ
ナーゼのムタン分解に対する遊離の還元量を１００とし
た場合の各基質の還元糖量の相対値を意味する。
ち、本発明のムタナーゼＡ〜Ｃの溶液（５００単位／ｍ
ｌ）１００μｌに対し、表３に示す各基質溶液１００μ
ｌ（１％溶液）を３０分間反応させ、還元糖量を以下に
示す酵素活性の測定法に準じて検出すると表３に併記す
る結果を示す。なお、表３における相対水解度は、ムタ
ナーゼのムタン分解に対する遊離の還元量を１００とし
た場合の各基質の還元糖量の相対値を意味する。
【００５７】酵素活性の測定法
１００μｌのムタナーゼ溶液を１００μｌの３％ムタン
（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５）に加えて、３５℃で１
０分間反応させる。この間、１００回／分で振とうす
る。０．４ｍｌのＤＮＳ溶液（４，６−ジニトロサリチ
ル酸）で反応を停止し、遠心分離を行い、上清を０．５
ｍｌ試験管に移して、ガラス玉を載せて１００℃で１０
分間加熱する。流水中で５分間冷却し、４ｍｌの蒸留水
で希釈してＯＤ530の吸光度を測定する。０〜９０μｇ
のグルコース標準液の検量線から力価を求める。１分間
に１μｇの還元糖を生じさせる酵素量を１単位と定義す
る。なお、以下の理化学的諸性質における酵素活性はこ
の方法により測定するものである。
（０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ５）に加えて、３５℃で１
０分間反応させる。この間、１００回／分で振とうす
る。０．４ｍｌのＤＮＳ溶液（４，６−ジニトロサリチ
ル酸）で反応を停止し、遠心分離を行い、上清を０．５
ｍｌ試験管に移して、ガラス玉を載せて１００℃で１０
分間加熱する。流水中で５分間冷却し、４ｍｌの蒸留水
で希釈してＯＤ530の吸光度を測定する。０〜９０μｇ
のグルコース標準液の検量線から力価を求める。１分間
に１μｇの還元糖を生じさせる酵素量を１単位と定義す
る。なお、以下の理化学的諸性質における酵素活性はこ
の方法により測定するものである。
【００５８】
【表３】
【００５９】（３）至適作用ｐＨ
本発明のムタナーゼは、下記の各緩衝液で各ｐＨに調整
した３％ムタンに本発明のムタナーゼを５０単位／ｍｌ
となるように加え、３５℃で１０分間反応させ、活性を
測定し、至適ｐＨでの活性を１００％とするときの各ｐ
Ｈでの相対活性を求める場合、ムタナーゼＡは、図１に
示すように、ｐＨ４において作用が至適であり、ｐＨ４
〜７、特にｐＨ４〜６の範囲で高い活性を示す。また、
ムタナーゼＢは、図２に示すように、ｐＨ４．５におい
て作用が至適であり、特にｐＨ４〜７の範囲で高い活性
を示す。ムタナーゼＣは、図３に示すように、ｐＨ４．
５において作用が至適であり、ｐＨ４〜６、特にｐＨ４
〜５の範囲で高い活性を示す。緩衝液 ｐＨ３〜７ ：クエン酸−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液 ｐＨ６〜８ ：ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液 ｐＨ９〜１０ ：グリシン−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ１０〜１１：Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＯＨ緩衝液
した３％ムタンに本発明のムタナーゼを５０単位／ｍｌ
となるように加え、３５℃で１０分間反応させ、活性を
測定し、至適ｐＨでの活性を１００％とするときの各ｐ
Ｈでの相対活性を求める場合、ムタナーゼＡは、図１に
示すように、ｐＨ４において作用が至適であり、ｐＨ４
〜７、特にｐＨ４〜６の範囲で高い活性を示す。また、
ムタナーゼＢは、図２に示すように、ｐＨ４．５におい
て作用が至適であり、特にｐＨ４〜７の範囲で高い活性
を示す。ムタナーゼＣは、図３に示すように、ｐＨ４．
５において作用が至適であり、ｐＨ４〜６、特にｐＨ４
〜５の範囲で高い活性を示す。緩衝液 ｐＨ３〜７ ：クエン酸−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液 ｐＨ６〜８ ：ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4緩衝液 ｐＨ９〜１０ ：グリシン−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ１０〜１１：Ｎａ2ＨＰＯ4−ＮａＯＨ緩衝液
【００６０】（４）安定ｐＨ範囲
本発明のムタナーゼは、２０ｍＭの上記各緩衝液中に本
発明のムタナーゼを３００単位／ｍｌとなるように加
え、２５℃で２４時間インキュベートした後、活性を測
定し、インキュベート前の活性を１００％として各ｐＨ
での相対的活性を求めると、ムタナーゼＡは、図４に示
すように、ｐＨ４〜１０の範囲でほぼ１００％の残存活
性率を示し、ｐＨ３、ｐＨ１１の場合であっても９０％
以上の残存活性率を示す。また、ムタナーゼＢは、図５
に示すように、ｐＨ３〜１１の範囲でほぼ１００％の残
存活性率を示す。ムタナーゼＣは、図６に示すように、
ｐＨ４〜１０の範囲でほぼ１００％の残存活性率を示
し、ｐＨ１１の場合は７０％以上、ｐＨ３の場合には４
０％以上の残存活性率を示す。
発明のムタナーゼを３００単位／ｍｌとなるように加
え、２５℃で２４時間インキュベートした後、活性を測
定し、インキュベート前の活性を１００％として各ｐＨ
での相対的活性を求めると、ムタナーゼＡは、図４に示
すように、ｐＨ４〜１０の範囲でほぼ１００％の残存活
性率を示し、ｐＨ３、ｐＨ１１の場合であっても９０％
以上の残存活性率を示す。また、ムタナーゼＢは、図５
に示すように、ｐＨ３〜１１の範囲でほぼ１００％の残
存活性率を示す。ムタナーゼＣは、図６に示すように、
ｐＨ４〜１０の範囲でほぼ１００％の残存活性率を示
し、ｐＨ１１の場合は７０％以上、ｐＨ３の場合には４
０％以上の残存活性率を示す。
【００６１】（５）至適温度
本発明のムタナーゼは、基質となるムタンを溶液全体に
対して３％含有するｐＨ５の２０ｍＭ酢酸緩衝液に本発
明のムタナーゼ酵素を５０単位／ｍｌとなるように加
え、１０分間各温度で反応させ、３５℃での活性を１０
０％として各温度での相対活性を求める場合、ムタナー
ゼＡは、図７に示すように、温度６０℃において作用が
至適であり、ムタナーゼＢは、図８に示すように、温度
６５℃において作用が至適であり、ムタナーゼＣは、図
９に示すように、温度５０℃において作用が至適であ
る。
対して３％含有するｐＨ５の２０ｍＭ酢酸緩衝液に本発
明のムタナーゼ酵素を５０単位／ｍｌとなるように加
え、１０分間各温度で反応させ、３５℃での活性を１０
０％として各温度での相対活性を求める場合、ムタナー
ゼＡは、図７に示すように、温度６０℃において作用が
至適であり、ムタナーゼＢは、図８に示すように、温度
６５℃において作用が至適であり、ムタナーゼＣは、図
９に示すように、温度５０℃において作用が至適であ
る。
【００６２】（６）温度安定性
本発明のムタナーゼは、２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）
に透析した３００単位／ｍｌの本発明のムタナーゼを加
え、各温度で１０分間熱処理し、氷冷した後、熱処理前
の酵素活性を１００％として残存活性率を求める場合、
ムタナーゼＡは、図１０に示すように、６５℃で残存活
性率は３０％となり、７５℃で失活するが、３０〜６０
℃の残存活性率は１００％である。また、ムタナーゼＢ
は、図１１に示すように、６５℃で残存活性率は約８５
％となり、７５℃で失活するが、３０〜６０℃の残存活
性率は１００％である。更に、ムタナーゼＣは、図１２
に示すように、５５℃で残存活性率は２２％となるが、
３０〜５０℃の範囲で１００％の残存活性率を示す。
に透析した３００単位／ｍｌの本発明のムタナーゼを加
え、各温度で１０分間熱処理し、氷冷した後、熱処理前
の酵素活性を１００％として残存活性率を求める場合、
ムタナーゼＡは、図１０に示すように、６５℃で残存活
性率は３０％となり、７５℃で失活するが、３０〜６０
℃の残存活性率は１００％である。また、ムタナーゼＢ
は、図１１に示すように、６５℃で残存活性率は約８５
％となり、７５℃で失活するが、３０〜６０℃の残存活
性率は１００％である。更に、ムタナーゼＣは、図１２
に示すように、５５℃で残存活性率は２２％となるが、
３０〜５０℃の範囲で１００％の残存活性率を示す。
【００６３】（７）金属イオンの影響
本発明のムタナーゼは、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）
を使用して本発明のムタナーゼが５０単位／ｍｌとなる
ように調製し、これに各種金属塩を最終濃度が１ｍＭ濃
度になるように添加し、３５℃で３０分間保温処理し、
処理後の各溶液の活性を測定し、金属塩無添加の活性を
１００％として各種金属塩を添加した溶液における相対
活性を求めると、表４に示すように、ムタナーゼＡは水
銀、銀又は３価の鉄を添加することにより、ムタナーゼ
Ｂ，Ｃは水銀又は銀を添加することにより、ムタナーゼ
の酵素活性が阻害されることが認められる。
を使用して本発明のムタナーゼが５０単位／ｍｌとなる
ように調製し、これに各種金属塩を最終濃度が１ｍＭ濃
度になるように添加し、３５℃で３０分間保温処理し、
処理後の各溶液の活性を測定し、金属塩無添加の活性を
１００％として各種金属塩を添加した溶液における相対
活性を求めると、表４に示すように、ムタナーゼＡは水
銀、銀又は３価の鉄を添加することにより、ムタナーゼ
Ｂ，Ｃは水銀又は銀を添加することにより、ムタナーゼ
の酵素活性が阻害されることが認められる。
【００６４】
【表４】
【００６５】（８）阻害剤の影響
本発明のムタナーゼは、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）
を使用して本発明のムタナーゼが５０単位／ｍｌとなる
ように調製し、これに各種阻害剤を最終濃度が１ｍＭ濃
度になるように添加し、３５℃で３０分間保温処理した
後に、各溶液の残存活性を測定し、阻害剤無添加の活性
を１００％として各溶液の相対活性を求めると、表５に
示すように、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭ
Ｂ）の添加により、酵素活性が特に強く阻害されること
が認められる。
を使用して本発明のムタナーゼが５０単位／ｍｌとなる
ように調製し、これに各種阻害剤を最終濃度が１ｍＭ濃
度になるように添加し、３５℃で３０分間保温処理した
後に、各溶液の残存活性を測定し、阻害剤無添加の活性
を１００％として各溶液の相対活性を求めると、表５に
示すように、ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭ
Ｂ）の添加により、酵素活性が特に強く阻害されること
が認められる。
【００６６】
【表５】
【００６７】（９）分子量
本発明のムタナーゼは、５〜２０％ポリアクリルアミド
グラジエントゲル（バイオラッド（株）製のレディーメ
イドゲル）を用いて４０ｍＡで１時間泳動し、標準タン
パクとしてシグマ・マーカー・ハイレンジ（シグマ社
製）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により精製した酵素タンパクの分子量を求める場合、ム
タナーゼＡの分子量は約１５万、ムタナーゼＢの分子量
は約１４万、ムタナーゼＣの分子量は約１６万であると
算定される。
グラジエントゲル（バイオラッド（株）製のレディーメ
イドゲル）を用いて４０ｍＡで１時間泳動し、標準タン
パクとしてシグマ・マーカー・ハイレンジ（シグマ社
製）を用いるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
により精製した酵素タンパクの分子量を求める場合、ム
タナーゼＡの分子量は約１５万、ムタナーゼＢの分子量
は約１４万、ムタナーゼＣの分子量は約１６万であると
算定される。
【００６８】なお、本発明のムタナーゼは、上記理化学
的性質を有する限りその産生方法は制限されず、上述し
たようにＲＭ１株、ＲＭ４株、Ｍ７株等から産生された
ものに限られることなく、例えばＲＭ１株、ＲＭ４株、
Ｍ７株から産生されたムタナーゼに化学的修飾又は遺伝
子組換え等により、より安定且つ有効な酵素に改質した
ものも含まれる。
的性質を有する限りその産生方法は制限されず、上述し
たようにＲＭ１株、ＲＭ４株、Ｍ７株等から産生された
ものに限られることなく、例えばＲＭ１株、ＲＭ４株、
Ｍ７株から産生されたムタナーゼに化学的修飾又は遺伝
子組換え等により、より安定且つ有効な酵素に改質した
ものも含まれる。
【００６９】本発明のムタナーゼは、上記のような理化
学的性質を備えるものであり、公知のムタナーゼと比較
すると、本発明のムタナーゼＡ〜Ｃと上記ノボザイム２
３４とはムタンのα−１，３−グルコシド結合の切断パ
ターンが相違する。そして、本発明のムタナーゼＡは至
適ｐＨがｐＨ４、至適温度が６０℃、ムタナーゼＢは至
適温度が６５℃、ムタナーゼＣの安定ｐＨ領域はｐＨ４
〜１０（２５℃，２４時間）で、分子量が約１６万であ
るのに対し、上記ＢＣ−８菌由来のムタナーゼは至適ｐ
Ｈ４．５、至適温度が４５〜５０℃、安定ｐＨ領域はｐ
Ｈ７．０〜９．０、分子量が約１８万である。また、上
述したように、本発明のムタナーゼＡは分子量が約１５
万、至適温度が６０℃、至適ｐＨが４であり、ムタナー
ゼＢは分子量が約１４万、至適温度が６５℃、至適ｐＨ
が４．５であり、ムタナーゼＣは分子量が約１６万、至
適温度が５０℃、至適ｐＨが４．５であるのに対し、上
記ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株由来のムタナーゼは分子量７
万以上で至適温度が３０〜４０℃、至適ｐＨが６．２〜
６．７である。更に、特開昭５２−３４９８０号、同５
０−１４５５８３号又は同４７−９７４３号公報に記載
されたムタナーゼは、それぞれストレプトミセス属又は
フラボバクテリウム属に属する微生物又はトリコデルマ
・ハルジアヌム、ペニシリウム・リラシヌム、ペニシリ
ウム・フニクロサム、ペニシリウム・メリニイ及びペニ
シリウム・ヤンシネルムにより産生されたものであり、
例えば特開昭５２−３４９８０号公報のムタナーゼは至
適ｐＨが５．５、安定ｐＨ領域が５〜７、特開昭５０−
１４５５８３号公報のムタナーゼは至適ｐＨが６．０、
安定ｐＨ領域が５．０〜７．０であり、その理化学的性
質は多くの点で相違する。なお、特開昭４７−９７４３
号公報に記載されたムタナーゼの理化学的性質は不明で
ある。
学的性質を備えるものであり、公知のムタナーゼと比較
すると、本発明のムタナーゼＡ〜Ｃと上記ノボザイム２
３４とはムタンのα−１，３−グルコシド結合の切断パ
ターンが相違する。そして、本発明のムタナーゼＡは至
適ｐＨがｐＨ４、至適温度が６０℃、ムタナーゼＢは至
適温度が６５℃、ムタナーゼＣの安定ｐＨ領域はｐＨ４
〜１０（２５℃，２４時間）で、分子量が約１６万であ
るのに対し、上記ＢＣ−８菌由来のムタナーゼは至適ｐ
Ｈ４．５、至適温度が４５〜５０℃、安定ｐＨ領域はｐ
Ｈ７．０〜９．０、分子量が約１８万である。また、上
述したように、本発明のムタナーゼＡは分子量が約１５
万、至適温度が６０℃、至適ｐＨが４であり、ムタナー
ゼＢは分子量が約１４万、至適温度が６５℃、至適ｐＨ
が４．５であり、ムタナーゼＣは分子量が約１６万、至
適温度が５０℃、至適ｐＨが４．５であるのに対し、上
記ＦＥＲＭ−Ｐ４７６５株由来のムタナーゼは分子量７
万以上で至適温度が３０〜４０℃、至適ｐＨが６．２〜
６．７である。更に、特開昭５２−３４９８０号、同５
０−１４５５８３号又は同４７−９７４３号公報に記載
されたムタナーゼは、それぞれストレプトミセス属又は
フラボバクテリウム属に属する微生物又はトリコデルマ
・ハルジアヌム、ペニシリウム・リラシヌム、ペニシリ
ウム・フニクロサム、ペニシリウム・メリニイ及びペニ
シリウム・ヤンシネルムにより産生されたものであり、
例えば特開昭５２−３４９８０号公報のムタナーゼは至
適ｐＨが５．５、安定ｐＨ領域が５〜７、特開昭５０−
１４５５８３号公報のムタナーゼは至適ｐＨが６．０、
安定ｐＨ領域が５．０〜７．０であり、その理化学的性
質は多くの点で相違する。なお、特開昭４７−９７４３
号公報に記載されたムタナーゼの理化学的性質は不明で
ある。
【００７０】本発明の口腔用組成物における上記ムタナ
ーゼの配合量は、通常、口腔用組成物１ｇ当たり１〜５
００００単位であり、より好ましくは１０〜１００００
単位である。１単位より少ないと、ムタナーゼのう蝕予
防効果が十分発揮されない場合があり、５００００単位
を超えると口腔用組成物の使用感に悪影響を与える場合
がある。
ーゼの配合量は、通常、口腔用組成物１ｇ当たり１〜５
００００単位であり、より好ましくは１０〜１００００
単位である。１単位より少ないと、ムタナーゼのう蝕予
防効果が十分発揮されない場合があり、５００００単位
を超えると口腔用組成物の使用感に悪影響を与える場合
がある。
【００７１】ここで、ムタナーゼ１単位とは、ムタンを
基質として反応を行った場合に、１分間当たりにグルコ
ース１μｇに相当する遊離還元糖を生じる酵素量をい
う。また、ここでいうムタンとは、ストレプトコッカス
・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔ
ａｎｓ）６７１５株が産生する不溶性グルカン（α−
１，３及びα−１，６結合）にデキストラナーゼを作用
させて得られる水不溶性の白色粉末である（Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８巻，１９７４
年）。
基質として反応を行った場合に、１分間当たりにグルコ
ース１μｇに相当する遊離還元糖を生じる酵素量をい
う。また、ここでいうムタンとは、ストレプトコッカス
・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｍｕｔ
ａｎｓ）６７１５株が産生する不溶性グルカン（α−
１，３及びα−１，６結合）にデキストラナーゼを作用
させて得られる水不溶性の白色粉末である（Ｃａｒｂｏ
ｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３８巻，１９７４
年）。
【００７２】本発明において、上記ムタナーゼは、それ
単独でも、また必要に応じ他の酵素類、例えばデキスト
ラナーゼ、アミラーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ、溶
菌酵素などと併用して用いてもよいが、特にデキストラ
ナーゼと併用した場合、本発明のムタナーゼとデキスト
ラナーゼとの作用で優れた歯垢形成抑制作用を発揮す
る。
単独でも、また必要に応じ他の酵素類、例えばデキスト
ラナーゼ、アミラーゼ、リゾチーム、プロテアーゼ、溶
菌酵素などと併用して用いてもよいが、特にデキストラ
ナーゼと併用した場合、本発明のムタナーゼとデキスト
ラナーゼとの作用で優れた歯垢形成抑制作用を発揮す
る。
【００７３】この場合、デキストラナーゼとしては公知
のものを使用することができ、例えばケトミウム属（Ｃ
ｈａｅｔｏｍｉｕｎ ｓｐ．）由来のものなどを使用す
ることができる。デキストラナーゼを配合する場合、そ
の配合量は、通常、口腔用組成物１ｇ当たり１０〜５０
０００単位であり、より好ましくは２００〜２００００
単位であることが望ましい。１００単位より少ないと、
デキストラナーゼの歯垢形成抑制効果が十分得られない
場合があり、５００００単位を超えると口腔用組成物の
使用感に悪影響を与える場合がある。
のものを使用することができ、例えばケトミウム属（Ｃ
ｈａｅｔｏｍｉｕｎ ｓｐ．）由来のものなどを使用す
ることができる。デキストラナーゼを配合する場合、そ
の配合量は、通常、口腔用組成物１ｇ当たり１０〜５０
０００単位であり、より好ましくは２００〜２００００
単位であることが望ましい。１００単位より少ないと、
デキストラナーゼの歯垢形成抑制効果が十分得られない
場合があり、５００００単位を超えると口腔用組成物の
使用感に悪影響を与える場合がある。
【００７４】ここで、デキストラナーゼ１単位とは、デ
キストランを基質として反応を行った場合に、１分間当
たりグルコース１μｇに相当する遊離還元糖を生じる酵
素量をいう。
キストランを基質として反応を行った場合に、１分間当
たりグルコース１μｇに相当する遊離還元糖を生じる酵
素量をいう。
【００７５】本発明の口腔用組成物には、その組成物の
適用態様、剤型などに応じた公知の成分を配合すること
ができる。
適用態様、剤型などに応じた公知の成分を配合すること
ができる。
【００７６】例えば歯磨剤の場合は、以下のような研磨
剤、粘結剤、粘稠剤、界面活性剤、甘味剤、香料、防腐
剤、着色剤等を配合することができる。
剤、粘結剤、粘稠剤、界面活性剤、甘味剤、香料、防腐
剤、着色剤等を配合することができる。
【００７７】研磨剤としては、酸化アルミニウム、水酸
化アルミニウム、第２リン酸カルシウム・２水和物及び
無水物、シリカ系研磨剤、炭酸カルシウム、ピロリン酸
カルシウム、ケイ酸アルミニウム、不溶性メタリン酸ナ
トリウム、第３リン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、
合成樹脂等の１種又は２種以上を、通常、組成物全体の
１０〜９０％（重量％、以下同じ）、特に練歯磨の場合
は１０〜６０％の配合量で配合し得る。なお、本発明で
は、シリカ系研磨剤を上記研磨剤として使用することが
好ましく、これによりムタナーゼの有効性を更に確実に
向上させることができる。シリカ系研磨剤としては、例
えば沈降性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート、
ジルコノシリケート等を挙げることができ、また、これ
らの粒径は１〜３０μｍであることが、歯磨剤の使用感
の点から好ましい。
化アルミニウム、第２リン酸カルシウム・２水和物及び
無水物、シリカ系研磨剤、炭酸カルシウム、ピロリン酸
カルシウム、ケイ酸アルミニウム、不溶性メタリン酸ナ
トリウム、第３リン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、
合成樹脂等の１種又は２種以上を、通常、組成物全体の
１０〜９０％（重量％、以下同じ）、特に練歯磨の場合
は１０〜６０％の配合量で配合し得る。なお、本発明で
は、シリカ系研磨剤を上記研磨剤として使用することが
好ましく、これによりムタナーゼの有効性を更に確実に
向上させることができる。シリカ系研磨剤としては、例
えば沈降性シリカ、シリカゲル、アルミノシリケート、
ジルコノシリケート等を挙げることができ、また、これ
らの粒径は１〜３０μｍであることが、歯磨剤の使用感
の点から好ましい。
【００７８】粘結剤としては、カラゲナン、カルボキシ
メチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム等
のアルギン酸アルカリ金属塩、ガム類、ポリビニルアル
コール、ビーガムなどを配合し得る（配合量、通常０．
３〜５％）。粘稠剤としては、ソルビット、グリセリ
ン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、キシリット、マルチッ
ト、ラクチット等を配合し得る（配合量、通常１０〜７
０％）。
メチルセルロースナトリウム、アルギン酸ナトリウム等
のアルギン酸アルカリ金属塩、ガム類、ポリビニルアル
コール、ビーガムなどを配合し得る（配合量、通常０．
３〜５％）。粘稠剤としては、ソルビット、グリセリ
ン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコー
ル、ポリエチレングリコール、キシリット、マルチッ
ト、ラクチット等を配合し得る（配合量、通常１０〜７
０％）。
【００７９】また、界面活性剤としては、ソジウムラウ
リルサルフェート、ラウロイルザルコシネート、α−オ
レフィンスルフォネート、タウレート、ラウリルモノグ
リセライドサルフェート、ラウリルモノグリセライドス
ルフォネート、石鹸等のアニオン界面活性剤、ラウリン
酸ジエタノールアミド、ステアリルモノグリセライド、
ショ糖脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル、ラ
クチトール脂肪酸エステル、マルチトール脂肪酸エステ
ル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等
のノニオン界面活性剤、ベタイン型、アミノ酸型等の両
性界面活性剤などを配合し得る（配合量、通常０．５〜
７％）。
リルサルフェート、ラウロイルザルコシネート、α−オ
レフィンスルフォネート、タウレート、ラウリルモノグ
リセライドサルフェート、ラウリルモノグリセライドス
ルフォネート、石鹸等のアニオン界面活性剤、ラウリン
酸ジエタノールアミド、ステアリルモノグリセライド、
ショ糖脂肪酸エステル、ラクトース脂肪酸エステル、ラ
クチトール脂肪酸エステル、マルチトール脂肪酸エステ
ル、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート等
のノニオン界面活性剤、ベタイン型、アミノ酸型等の両
性界面活性剤などを配合し得る（配合量、通常０．５〜
７％）。
【００８０】更に、甘味剤としては、サッカリンナトリ
ウム、ステビオサイド、ネオヘスペリジルジヒドロカル
コン、タウマチン、グリチルリチン、ペリラルチン等を
配合し得る。香料としては、アネトール、カルボン、シ
ネオール、メチルサリシレート、オイゲノール、エチル
ブチレート、シンナミックアルデヒドなどやこれらの香
料成分を含む精油、例えばスペアミント油、ペパーミン
ト油、ウインターグリーン油などを配合し得る。防腐剤
としては、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナト
リウム等を配合し得る。
ウム、ステビオサイド、ネオヘスペリジルジヒドロカル
コン、タウマチン、グリチルリチン、ペリラルチン等を
配合し得る。香料としては、アネトール、カルボン、シ
ネオール、メチルサリシレート、オイゲノール、エチル
ブチレート、シンナミックアルデヒドなどやこれらの香
料成分を含む精油、例えばスペアミント油、ペパーミン
ト油、ウインターグリーン油などを配合し得る。防腐剤
としては、パラオキシ安息香酸エステル、安息香酸ナト
リウム等を配合し得る。
【００８１】上記成分を配合した本発明に係る歯磨剤と
して、例えば練歯磨を製造する場合は、上記成分を適量
の水と練合することにより製造し得る。このようにして
得られた練歯磨は、アルミニウムチューブ、アルミニウ
ム箔の両面をプラスチック等でラミネートしたラミネー
トチューブ、プラスチックチューブ等のチューブ状容
器、ボトル状容器、エアゾール容器などの所定の容器に
収容して使用することができる。
して、例えば練歯磨を製造する場合は、上記成分を適量
の水と練合することにより製造し得る。このようにして
得られた練歯磨は、アルミニウムチューブ、アルミニウ
ム箔の両面をプラスチック等でラミネートしたラミネー
トチューブ、プラスチックチューブ等のチューブ状容
器、ボトル状容器、エアゾール容器などの所定の容器に
収容して使用することができる。
【００８２】また、本発明の口腔用組成物が例えば洗口
剤である場合には、上記粘稠剤、甘味剤、香料、ｐＨ調
整剤、防腐剤、溶剤等を配合して製造することができ
る。なお、ｐＨ調整剤としては、クエン酸、リン酸、リ
ンゴ酸、酢酸等の有機酸及びこれらの塩類などを配合し
得、溶剤としてはエタノール、水等を配合し得、更に必
要に応じて適宜他の成分を配合することができる。
剤である場合には、上記粘稠剤、甘味剤、香料、ｐＨ調
整剤、防腐剤、溶剤等を配合して製造することができ
る。なお、ｐＨ調整剤としては、クエン酸、リン酸、リ
ンゴ酸、酢酸等の有機酸及びこれらの塩類などを配合し
得、溶剤としてはエタノール、水等を配合し得、更に必
要に応じて適宜他の成分を配合することができる。
【００８３】更に、チューインガム、トローチ等におい
ても、従来よりこれらに使用されている成分を常用量で
用い、常法に従って製造することができる。
ても、従来よりこれらに使用されている成分を常用量で
用い、常法に従って製造することができる。
【００８４】なお、本発明の口腔用組成物には、上記ム
タナーゼやデキストラナーゼ等の他の酵素類に加え、必
要に応じてフッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナト
リウム等のフッ素化合物、抗体、第１錫化合物、クロル
ヘキシジン塩類、イプシロンアミノカプロン酸、トラネ
キサム酸、アルミニウムクロルヘキシジルアラントイ
ン、ジヒドロコレステロール、グリチルリチン塩、塩化
ナトリウム、水溶性無機リン酸化合物等を配合し得る。
なお、本発明の口腔用組成物に配合し得る水溶性無機リ
ン酸化合物としては、正リン酸、ピロリン酸、ポリリン
酸のカリウム塩やナトリウム塩が例示される。
タナーゼやデキストラナーゼ等の他の酵素類に加え、必
要に応じてフッ化ナトリウム、モノフルオロリン酸ナト
リウム等のフッ素化合物、抗体、第１錫化合物、クロル
ヘキシジン塩類、イプシロンアミノカプロン酸、トラネ
キサム酸、アルミニウムクロルヘキシジルアラントイ
ン、ジヒドロコレステロール、グリチルリチン塩、塩化
ナトリウム、水溶性無機リン酸化合物等を配合し得る。
なお、本発明の口腔用組成物に配合し得る水溶性無機リ
ン酸化合物としては、正リン酸、ピロリン酸、ポリリン
酸のカリウム塩やナトリウム塩が例示される。
【００８５】
【実施例】以下、実施例及び比較例を示し、本発明を具
体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限される
ものではない。
体的に説明するが、本発明は下記の実施例に制限される
ものではない。
【００８６】〔製造例〕
（１）ムタンの調製
まず、本実施例において使用するムタンの調製を以下に
ように行った。ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５
株を２００ｍｌのＢＨＩ培地（ブレインハートインヒュ
ージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏ
ｎ）オキソイド社製）に植菌し、３７℃で１日間の培養
を行った。得られた培養物を仕込み量４リットルの５％
シュークロースを含むＢＨＩ培地に接種し、３７℃で５
日間の培養を行った。この沈殿物を収穫し、５００ｍｌ
の１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、室温で１時間
放置した。この遠心分離上清を塩酸で中和し、析出した
沈殿をろ過処理により回収した。更に、この回収物にデ
キストラナーゼを作用させ、α−１，６−グルコシド結
合を切断した。
ように行った。ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｏｂｒｉｎｕｓ）６７１５
株を２００ｍｌのＢＨＩ培地（ブレインハートインヒュ
ージョン（Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏ
ｎ）オキソイド社製）に植菌し、３７℃で１日間の培養
を行った。得られた培養物を仕込み量４リットルの５％
シュークロースを含むＢＨＩ培地に接種し、３７℃で５
日間の培養を行った。この沈殿物を収穫し、５００ｍｌ
の１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液に溶解し、室温で１時間
放置した。この遠心分離上清を塩酸で中和し、析出した
沈殿をろ過処理により回収した。更に、この回収物にデ
キストラナーゼを作用させ、α−１，６−グルコシド結
合を切断した。
【００８７】（２）ムタナーゼの調製
次に、本実施例のムタナーゼを以下のようにして調製し
た。まず、培地を以下の培養組成で調製した。培養組成 イノシトール １０ｇ／リットル ムタン １ｇ／リットル ペプトン ５ｇ／リットル 酵母エキス ３ｇ／リットル ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ／リットル ＮＨ4ＮＯ3 ２ｇ／リットル ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３ｇ／リットル（ｐＨ７．
０）
た。まず、培地を以下の培養組成で調製した。培養組成 イノシトール １０ｇ／リットル ムタン １ｇ／リットル ペプトン ５ｇ／リットル 酵母エキス ３ｇ／リットル ＫＨ2ＰＯ4 ２ｇ／リットル ＮＨ4ＮＯ3 ２ｇ／リットル ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．３ｇ／リットル（ｐＨ７．
０）
【００８８】ムタナーゼＡ
上述したスクリーニング法により得られたＲＭ１株を上
記培地に接種し、４０℃で２日間培養した後、培養液を
８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を得、これ
を限外濾過で濃縮した。次に、この上清に硫酸アンモニ
ウムを９０％飽和になるように加え、これをよく撹拌し
た後、１時間以上氷中に静置し、その後、遠心分離して
沈殿を回収することにより塩析を行った。次いで、１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁し、同緩衝液で
透析した。透析後のサンプルを８０００ｒｐｍ、１０分
間の遠心分離にかけ、得られた上清を本実施例のムタナ
ーゼ（以下、ＲＭ１酵素という）とし、その精製を以下
のようにして行った。まず、陰イオン交換クロマトグラ
フィーＤＥ５２（商品名：ワットマン社製）に対し、ｐ
Ｈ８で素通り画分を得た後、ｐＨ８．５で吸着すること
により、２回のカラム操作を行った。陰イオン交換クロ
マトグラフィーＤＥ５２の素通り画分を１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に透析し、同緩衝液で平衡化
した陰イオン交換クロマトグラフィーＤＥ５２にかけ
た。吸着した酵素を０〜０．２Ｍの塩化ナトリウム溶液
により溶出させて、精製酵素を得た。
記培地に接種し、４０℃で２日間培養した後、培養液を
８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を得、これ
を限外濾過で濃縮した。次に、この上清に硫酸アンモニ
ウムを９０％飽和になるように加え、これをよく撹拌し
た後、１時間以上氷中に静置し、その後、遠心分離して
沈殿を回収することにより塩析を行った。次いで、１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁し、同緩衝液で
透析した。透析後のサンプルを８０００ｒｐｍ、１０分
間の遠心分離にかけ、得られた上清を本実施例のムタナ
ーゼ（以下、ＲＭ１酵素という）とし、その精製を以下
のようにして行った。まず、陰イオン交換クロマトグラ
フィーＤＥ５２（商品名：ワットマン社製）に対し、ｐ
Ｈ８で素通り画分を得た後、ｐＨ８．５で吸着すること
により、２回のカラム操作を行った。陰イオン交換クロ
マトグラフィーＤＥ５２の素通り画分を１０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）に透析し、同緩衝液で平衡化
した陰イオン交換クロマトグラフィーＤＥ５２にかけ
た。吸着した酵素を０〜０．２Ｍの塩化ナトリウム溶液
により溶出させて、精製酵素を得た。
【００８９】ムタナーゼＢ
上述したスクリーニング法により得られたＲＭ４株を上
記培地に接種し、４０℃で２日間培養した後、培養液を
８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を得、これ
を限外濾過で濃縮した。次に、この上清に硫酸アンモニ
ウムを９０％飽和になるように加え、これをよく撹拌し
た後、１時間以上氷中に静置し、その後、遠心分離して
沈殿を回収することにより塩析を行った。次いで、１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、同緩衝液で
透析した。透析後のサンプルを８０００ｒｐｍ、１０分
間の遠心分離にかけ、得られた上清を本実施例のムタナ
ーゼ（以下、ＲＭ４酵素という）とし、その精製を以下
のようにして行った。まず、陰イオン交換クロマトグラ
フィーＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（商品
名：東ソー社製）に対し、ｐＨ７で素通り画分を得た
後、ｐＨ８．５でも素通り画分を取る２回のカラム操作
を行った。更に、ゲル濾過クロマトグラフィーＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ（商品名：ファルマシア社
製）でムタナーゼ活性画分を集め、精製酵素を得た。
記培地に接種し、４０℃で２日間培養した後、培養液を
８０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を得、これ
を限外濾過で濃縮した。次に、この上清に硫酸アンモニ
ウムを９０％飽和になるように加え、これをよく撹拌し
た後、１時間以上氷中に静置し、その後、遠心分離して
沈殿を回収することにより塩析を行った。次いで、１０
ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７）に懸濁し、同緩衝液で
透析した。透析後のサンプルを８０００ｒｐｍ、１０分
間の遠心分離にかけ、得られた上清を本実施例のムタナ
ーゼ（以下、ＲＭ４酵素という）とし、その精製を以下
のようにして行った。まず、陰イオン交換クロマトグラ
フィーＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（商品
名：東ソー社製）に対し、ｐＨ７で素通り画分を得た
後、ｐＨ８．５でも素通り画分を取る２回のカラム操作
を行った。更に、ゲル濾過クロマトグラフィーＳｅｐｈ
ａｃｒｙｌ Ｓ−３００ＨＲ（商品名：ファルマシア社
製）でムタナーゼ活性画分を集め、精製酵素を得た。
【００９０】ムタナーゼＣ
上述したスクリーニング法により得られたＭ７株を上記
培地に接種し、３０℃で２日間培養した後、培養液を８
０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を得、これを
限外濾過装置（アミコン社製）を用いて濃縮し、更に、
硫酸アンモニウムを９０％飽和になるように加え、塩析
を行った。次いで、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）に溶解し、一晩透析した。１０ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラ
フィーＤＥ５２（商品名：ワットマン社製）に透析後の
上記溶液を注ぎ込み、上記緩衝液で非吸着画分として得
られる本実施例のムタナーゼ（以下、Ｍ７酵素という）
を含む溶出液を得た。次いで、上記溶出液を１０ｍＭの
酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で透析し、１０ｍＭの酢酸緩
衝液（ｐＨ４．８）で平衡化した陽イオン交換クロマト
グラフィーＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（商品
名：東ソー社製）に透析後の上記溶出液を注ぎ込み、Ｍ
７酵素を吸着させた後、０〜０．２Ｍの塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で吸着した
Ｍ７酵素をリニアグラジエントにより溶出した。
培地に接種し、３０℃で２日間培養した後、培養液を８
０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して上清を得、これを
限外濾過装置（アミコン社製）を用いて濃縮し、更に、
硫酸アンモニウムを９０％飽和になるように加え、塩析
を行った。次いで、１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）に溶解し、一晩透析した。１０ｍＭのトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ８）で平衡化した陰イオン交換クロマトグラ
フィーＤＥ５２（商品名：ワットマン社製）に透析後の
上記溶液を注ぎ込み、上記緩衝液で非吸着画分として得
られる本実施例のムタナーゼ（以下、Ｍ７酵素という）
を含む溶出液を得た。次いで、上記溶出液を１０ｍＭの
酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で透析し、１０ｍＭの酢酸緩
衝液（ｐＨ４．８）で平衡化した陽イオン交換クロマト
グラフィーＣＭ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｍ（商品
名：東ソー社製）に透析後の上記溶出液を注ぎ込み、Ｍ
７酵素を吸着させた後、０〜０．２Ｍの塩化ナトリウム
を含む１０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）で吸着した
Ｍ７酵素をリニアグラジエントにより溶出した。
【００９１】更に、０．５Ｍ硫酸アンモニウム溶液を含
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化し
た疎水クロマトグラフィーに、Ｍ７酵素溶液とこれと同
体積の１Ｍ硫酸アンモニウム溶液とを０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に混合したものを注ぎ込み、０．５
Ｍから０Ｍに硫酸アンモニウム濃度を下げることにより
Ｍ７酵素を溶出した。得られた活性画分を１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析することにより、Ｍ７酵
素を精製した。
む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）により平衡化し
た疎水クロマトグラフィーに、Ｍ７酵素溶液とこれと同
体積の１Ｍ硫酸アンモニウム溶液とを０．１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．０）に混合したものを注ぎ込み、０．５
Ｍから０Ｍに硫酸アンモニウム濃度を下げることにより
Ｍ７酵素を溶出した。得られた活性画分を１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．０）で透析することにより、Ｍ７酵
素を精製した。
【００９２】このようにして精製されたＲＭ１、ＲＭ
４、Ｍ７酵素を用いて上記の理化学的性質をそれぞれ確
認したところ、本発明のムタナーゼの上記理化学的性質
を有することが確認された。この精製されたＲＭ１、Ｒ
Ｍ４、Ｍ７酵素の特性を評価した結果は、先に説明し、
また図１〜１２、表１〜５に示す通りの結果である。
４、Ｍ７酵素を用いて上記の理化学的性質をそれぞれ確
認したところ、本発明のムタナーゼの上記理化学的性質
を有することが確認された。この精製されたＲＭ１、Ｒ
Ｍ４、Ｍ７酵素の特性を評価した結果は、先に説明し、
また図１〜１２、表１〜５に示す通りの結果である。
【００９３】〔実験例１〕歯垢除去能の有効性評価
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）１０４４９株をＢＨＩ（Ｂ
ｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地にて３
７℃で一晩静置し、前培養液を調製した。この前培養液
１００μｌを１％シュークロースを含むＢＨＩ培地３ｍ
ｌ（Ｍ２試験管）に添加し、試験管を傾け、３７℃で一
晩静置培養して、試験管壁に歯垢を形成させた。その
後、培地を捨て、試験管内を蒸留水で２回洗浄し、３ｍ
ｌの人工唾液（０．８５ｍＭ ＣａＣｌ2／６．２２ｍ
Ｍ ＫＨ2ＰＯ4／５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１５ｍＭ
ＭｇＣｌ2（ｐＨ５．９４））を添加した後、表６に示
す酵素を各１ｍｌ加え、３７℃で３分間保温した。その
後、酵素液を捨て、試験官内を蒸留水で２回洗浄した
後、更に４ｍｌの蒸留水を添加し、超音波処理を行った
後の各溶液の濁度測定を行い、酵素無添加のものを対照
とし、各酵素溶液の歯垢除去能を計算した。なお、デキ
ストラナーゼとの併用系の検討では、人工唾液を添加し
た後、デキストラナーゼ２０００単位に対してＲＭ１、
ＲＭ４、Ｍ７酵素又はノボザイム２３４が１０単位にな
るように調整した酵素溶液を用いた。結果を表６に示
す。
ｏｃｃｕｓ ｍｕｔａｎｓ）１０４４９株をＢＨＩ（Ｂ
ｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ）培地にて３
７℃で一晩静置し、前培養液を調製した。この前培養液
１００μｌを１％シュークロースを含むＢＨＩ培地３ｍ
ｌ（Ｍ２試験管）に添加し、試験管を傾け、３７℃で一
晩静置培養して、試験管壁に歯垢を形成させた。その
後、培地を捨て、試験管内を蒸留水で２回洗浄し、３ｍ
ｌの人工唾液（０．８５ｍＭ ＣａＣｌ2／６．２２ｍ
Ｍ ＫＨ2ＰＯ4／５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．１５ｍＭ
ＭｇＣｌ2（ｐＨ５．９４））を添加した後、表６に示
す酵素を各１ｍｌ加え、３７℃で３分間保温した。その
後、酵素液を捨て、試験官内を蒸留水で２回洗浄した
後、更に４ｍｌの蒸留水を添加し、超音波処理を行った
後の各溶液の濁度測定を行い、酵素無添加のものを対照
とし、各酵素溶液の歯垢除去能を計算した。なお、デキ
ストラナーゼとの併用系の検討では、人工唾液を添加し
た後、デキストラナーゼ２０００単位に対してＲＭ１、
ＲＭ４、Ｍ７酵素又はノボザイム２３４が１０単位にな
るように調整した酵素溶液を用いた。結果を表６に示
す。
【００９４】
【表６】
【００９５】表６の結果によれば、ムタナーゼはデキス
トラナーゼと併用することで相乗的な歯垢除去能を示
し、その効果は本発明酵素のほうがノボザイム２３４よ
りも優れていることが認められ、エンド型のムタナーゼ
が歯垢除去酵素として好適であると考えられる。また、
Ｍ７酵素は、ストレプトコッカス・ミュータンス１０４
４９株の作る歯垢に対し、非常に優れた歯垢除去能を示
すことが認められる。
トラナーゼと併用することで相乗的な歯垢除去能を示
し、その効果は本発明酵素のほうがノボザイム２３４よ
りも優れていることが認められ、エンド型のムタナーゼ
が歯垢除去酵素として好適であると考えられる。また、
Ｍ７酵素は、ストレプトコッカス・ミュータンス１０４
４９株の作る歯垢に対し、非常に優れた歯垢除去能を示
すことが認められる。
【００９６】〔実験例２〕う蝕予防動物実験
３種のムタナーゼ、ＲＭ１、ＲＭ４、Ｍ７酵素のう蝕抑
制効果を調べるために以下のような動物実験を行った。
制効果を調べるために以下のような動物実験を行った。
【００９７】〈実験方法〉う蝕のモデル系である３週齢
（雄）ゴールデンハムスターを１群１０匹とし、各ハム
スターにストレプトマイシン耐性のう蝕原因菌ストレプ
トコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｍｕｔａｎｓ）１０４４９株を感染させた。感染
は、該菌株を４ｍｌのＢＨＩ培地（ＢＢＬ社製）に１白
金耳植菌し、嫌気条件下、３６℃、２０時間培養した
後、この菌液０．１ｍｌを各ハムスターの口中に滴下す
ることを３日間行った。各ハムスターの菌の定着は０．
１％ストレプトマイシンを含むＭＳ寒天培地（Ｄｉｆｃ
ｏ社製）を用いて確認した。菌の定着を上記のように確
認した後、表７に示す各薬剤の投与を５週間行った。投
与方法は、ハムスターの口中及び左右チークポーチに
０．１ｍｌずつ計０．３ｍｌを滴下投与し、この滴下投
与を１日２回繰り返した。対照群は同様の方法で濾過イ
オン交換水を滴下投与した。
（雄）ゴールデンハムスターを１群１０匹とし、各ハム
スターにストレプトマイシン耐性のう蝕原因菌ストレプ
トコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ ｍｕｔａｎｓ）１０４４９株を感染させた。感染
は、該菌株を４ｍｌのＢＨＩ培地（ＢＢＬ社製）に１白
金耳植菌し、嫌気条件下、３６℃、２０時間培養した
後、この菌液０．１ｍｌを各ハムスターの口中に滴下す
ることを３日間行った。各ハムスターの菌の定着は０．
１％ストレプトマイシンを含むＭＳ寒天培地（Ｄｉｆｃ
ｏ社製）を用いて確認した。菌の定着を上記のように確
認した後、表７に示す各薬剤の投与を５週間行った。投
与方法は、ハムスターの口中及び左右チークポーチに
０．１ｍｌずつ計０．３ｍｌを滴下投与し、この滴下投
与を１日２回繰り返した。対照群は同様の方法で濾過イ
オン交換水を滴下投与した。
【００９８】実験期間中の飼料としては、う蝕誘発粉末
飼料Ｄｉｅｔ２０００（日本クレア社製）を用いた。飲
料水は孔径０．２μｍのメンブランフィルターで濾過し
たイオン交換水を使用した。各ハムスターのう蝕状態の
評価はＫＹＥＳＥの方法（Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．２３
巻，１９４４年）に従って行った。また、う蝕抑制率は
下記式により算出した。 う蝕抑制率（％）＝［１−（薬剤群のう蝕スコア／コン
トロール群のう蝕スコア）］×１００ 表７の各薬剤のう蝕抑制率を併記する。
飼料Ｄｉｅｔ２０００（日本クレア社製）を用いた。飲
料水は孔径０．２μｍのメンブランフィルターで濾過し
たイオン交換水を使用した。各ハムスターのう蝕状態の
評価はＫＹＥＳＥの方法（Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．２３
巻，１９４４年）に従って行った。また、う蝕抑制率は
下記式により算出した。 う蝕抑制率（％）＝［１−（薬剤群のう蝕スコア／コン
トロール群のう蝕スコア）］×１００ 表７の各薬剤のう蝕抑制率を併記する。
【００９９】
【表７】
【０１００】〔実験例３〕製剤中での安定性
市販の練歯磨１０ｇにＲＭ１、ＲＭ４酵素又はノボザイ
ム２３４をそれぞれ２００単位添加し、各練歯磨の練り
混みを１０分間行い、３７℃で約１カ月間にわたり経日
的に各練歯磨をそれぞれ０．８ｇづつサンプリングして
ｐＨ８のリン酸緩衝液２．４ｍｌに投入し、これを遠心
分離した後、その上清をサンプルとし、各サンプルの酵
素活性測定を上記測定方法と同様にして行い、残存活性
を求めた。結果を表８に示す。
ム２３４をそれぞれ２００単位添加し、各練歯磨の練り
混みを１０分間行い、３７℃で約１カ月間にわたり経日
的に各練歯磨をそれぞれ０．８ｇづつサンプリングして
ｐＨ８のリン酸緩衝液２．４ｍｌに投入し、これを遠心
分離した後、その上清をサンプルとし、各サンプルの酵
素活性測定を上記測定方法と同様にして行い、残存活性
を求めた。結果を表８に示す。
【０１０１】
【表８】
【０１０２】なお、ＲＭ１、ＲＭ４酵素は、一般的な組
成の粉歯磨、液状歯磨、洗口剤、義歯洗浄剤、うがい用
錠剤、歯肉マッサージクリーム、トローチ、口腔用パス
タに各組成物１０ｇに対して２００単位となるように単
独で又はデキストラナーゼと併用して配合した製剤中に
おいても優れた安定性を示した。
成の粉歯磨、液状歯磨、洗口剤、義歯洗浄剤、うがい用
錠剤、歯肉マッサージクリーム、トローチ、口腔用パス
タに各組成物１０ｇに対して２００単位となるように単
独で又はデキストラナーゼと併用して配合した製剤中に
おいても優れた安定性を示した。
【０１０３】また、Ｍ７酵素も、一般的な組成の練歯
磨、粉歯磨、液状歯磨、洗口剤、義歯洗浄剤、うがい用
錠剤、歯肉マッサージクリーム、トローチ、口腔用パス
タに各組成物１ｇに対して５００単位となるようにＭ７
酵素単独で又はデキストラナーゼと併用して配合した製
剤中において、優れた有効性を示した。
磨、粉歯磨、液状歯磨、洗口剤、義歯洗浄剤、うがい用
錠剤、歯肉マッサージクリーム、トローチ、口腔用パス
タに各組成物１ｇに対して５００単位となるようにＭ７
酵素単独で又はデキストラナーゼと併用して配合した製
剤中において、優れた有効性を示した。
【０１０４】以下、実施例を示す。
〔実施例１〕練歯磨
シリカ ２０重量％
ソルビット ６０
ラウリル硫酸ナトリウム ０．９
サッカリンナトリウム ０．１５
ゼラチン ０．３
パルミチン酸ジエタノールアミド １．５
プロピレングリコール ５
香料 ０．３
アネトール ０．２
ｌ−メントール ０．７
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．５
フッ化ナトリウム ０．２
キサンタンガム ０．５
ポリエチレングリコール＃４０００ ０．５
グルコン酸クロルヘキシジン ０．０３
デキストラナーゼ ３０００Ｕ／ｇ歯磨
ＲＭ１酵素 ３００Ｕ／ｇ歯磨水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１０５】
〔実施例２〕練歯磨
水酸化アルミニウム ４５重量％
ソルビット ３０
ラウリル硫酸ナトリウム ０．８
アルギン酸ナトリウム ０．６
サッカリンナトリウム ０．１
ゼラチン ０．２
ラウリン酸ジエタノールアミド １．６
プロピレングリコール ５
香料 ０．３
アネトール ０．３
ｌ−メントール １．０
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．４
フッ化ナトリウム ０．７５
Ｍ７酵素 ５００Ｕ／ｇ歯磨水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１０６】
〔実施例３〕練歯磨
水酸化アルミニウム ４５重量％
ソルビット ３０
ラウリル硫酸ナトリウム ０．８
アルギン酸ナトリウム ０．６
サッカリンナトリウム ０．１
ゼラチン ０．２
パルミチン酸ジエタノールアミド １．６
プロピレングリコール ５
香料 ０．３
カルボン ０．２
ｌ−メントール ０．７
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．４
フッ化ナトリウム ０．７５
ＲＭ１酵素 ２０００Ｕ／ｇ歯磨水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１０７】
〔実施例４〕練歯磨
炭酸カルシウム ４５重量％
ソルビット ２４
ラウリル硫酸ナトリウム １．３
カラゲナン ０．７
アルギン酸ナトリウム ０．３
サッカリンナトリウム ０．１
ゼラチン ０．２
パルミチン酸ジエタノールアミド ０．８
プロピレングリコール ４
香料 ０．７
オイゲノール ０．１
ｌ−メントール ０．４
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．４
フッ化ナトリウム ０．７５
デキストラナーゼ ２０００Ｕ／ｇ歯磨
ＲＭ１酵素 ３００Ｕ／ｇ歯磨水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１０８】
〔実施例５〕練歯磨
第２リン酸カルシウム・２水和物 ５０重量％
ラウリル硫酸ナトリウム １
カラゲナン ０．６
キサンタンガム ０．３
サッカリンナトリウム ０．１
ゼラチン ０．２
パルミチン酸ジエタノールアミド １
プロピレングリコール ４
香料 ０．８
アネトール ０．１
ｌ−メントール ０．３
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．４
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．５
グリセリン ２０
トラネキサム酸 ０．０５
デキストラナーゼ ３０００Ｕ／ｇ歯磨
ＲＭ１酵素 ２００Ｕ／ｇ歯磨水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１０９】
〔実施例６〕練歯磨
改質水酸化アルミニウム ５０重量％
ラウリル硫酸ナトリウム １．５
カラゲナン ０．５
キサンタンガム ０．５
サッカリンナトリウム ０．１４
プロピレングリコール ５
香料 １．０
アネトール ０．１
ｌ−メントール ０．３
ミリストイルザルコシンナトリウム ０．３
フッ化ナトリウム ０．５
グリセリン ２０
無水ケイ酸 ５
酸化チタン ０．５
カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
トリクロサン ０．０４
デキストラナーゼ ５０００Ｕ／ｇ歯磨
ＲＭ４酵素 ３００Ｕ／ｇ歯磨水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１１０】
〔実施例７〕液状歯磨
シリカ １８重量％
ソルビット ５０
ラウリル硫酸ナトリウム １
サッカリンナトリウム ０．１
ゼラチン ０．２
ラウリン酸ジエタノールアミド １．２
プロピレングリコール ２
香料 １．０
カルボン ０．１
ｌ−メントール ０．４
パルミトイルザルコシンナトリウム ０．４
フッ化ナトリウム ０．２
グリセリン １８
キサンタンガム ０．１
ラウリン酸デカグリセリル ０．５
硫酸ナトリウム（無水） ０．３
デキストラナーゼ ３０００Ｕ／ｇ歯磨
ＲＭ１酵素 ３００Ｕ／ｇ歯磨水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１１１】
〔実施例８〕洗口剤
変性エタノール １．６重量％
ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油 ２
クエン酸 ０．０１
クエン酸３ナトリウム ０．３
香料 ０．１５
アネトール ０．０５
ｌ−メントール ０．２
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．１
フッ化ナトリウム ０．０８
グリセリン １０
ＤＬ−アラニン １
デキストラナーゼ ４６００Ｕ／ｇ洗口剤
ＲＭ１酵素 ５００Ｕ／ｇ洗口剤水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１１２】
〔実施例９〕マウスウォッシュ
９０％エタノール ２０重量％
ポリオキシエチレン（８０モル） ０．５
ソルビタンモノタウレート
香料 １．５
アネトール ０．３
ｌ−メントール ０．８
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．１５
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．１
デキストラナーゼ ２０００Ｕ／ｍｌ
マウスウォッシュ
ＲＭ１酵素 ５００Ｕ／ｍｌ
マウスウォッシュ水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１１３】
〔実施例１０〕マウスウォッシュ
９０％エタノール ２０重量％
ポリオキシエチレン（８０モル） ０．５
ソルビタンモノタウレート
香料 １．５
アネトール ０．３
ｌ−メントール ０．８
モノフルオロリン酸ナトリウム ０．１５
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．１
デキストラナーゼ ３０００Ｕ／ｍｌ
マウスウォッシュ
ＲＭ４酵素 ２００Ｕ／ｍｌ
マウスウォッシュ水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１１４】
〔実施例１１〕トローチ
アラビアガム ６重量％
香料 ０．７
アネトール ０．５
ｌ−メントール ０．３
フッ化ナトリウム ０．０５
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．０１
ブドウ糖 ３６
パラチノース ３６
デキストラナーゼ ４６００Ｕ／ｇトローチ
ＲＭ１酵素 ５００Ｕ／ｇトローチ水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１１５】
〔実施例１２〕チューインガム
ガムベース ２０重量％
香料 ０．７
アネトール ０．３
ｌ−メントール ０．３
フッ化ナトリウム ０．１
ラウロイルザルコシンナトリウム ０．０１
炭酸カルシウム ２
水飴 １５
粉糖 ５８
デキストラナーゼ ２０００Ｕ／ｇガム
ＲＭ１酵素 ２００Ｕ／ｇガム水 残量
合 計 １００．０重量％
【０１１６】
〔実施例１３〕義歯洗浄剤
モノ過硫酸水素カリウム ３５重量％
過硼酸ナトリウム １５
炭酸ナトリウム バランス
炭酸水素ナトリウム ２５
無水クエン酸 １０
ポリエチレングリコール １
ポリビニルピロリドン １
トリポリリン酸ナトリウム ５
ラウリル硫酸ナトリウム １
デキストラナーゼ ６０００Ｕ／ｇ義歯洗浄剤
ＲＭ１酵素 ５００Ｕ／ｇ義歯洗浄剤
粉末香料 ０．５青色１号 微量
合 計 １００．０重量％
【０１１７】
〔実施例１４〕義歯洗浄剤
モノ過硫酸水素カリウム ２５重量％
過硼酸ナトリウム １５
炭酸ナトリウム バランス
炭酸水素ナトリウム ２０
無水クエン酸 １０
結晶性セルロース ３
乳糖 ２
ポリビニルピロリドン ２
トリポリリン酸ナトリウム ３
ラウリル硫酸ナトリウム １
デキストラナーゼ ５０００Ｕ／ｇ義歯洗浄剤
ＲＭ４酵素 １０００Ｕ／ｇ義歯洗浄剤
粉末香料 ２青色１号 微量
合 計 １００．０重量％
【０１１８】
【発明の効果】本発明の口腔用組成物によれば、優れた
歯垢形成抑制効果を有するのみならず、歯磨等の口腔用
組成物の製品として十分に安定的に配合することができ
る。
歯垢形成抑制効果を有するのみならず、歯磨等の口腔用
組成物の製品として十分に安定的に配合することができ
る。
【図１】本発明に係るムタナーゼＡの至適ｐＨを示すグ
ラフである。
ラフである。
【図２】本発明に係るムタナーゼＢの至適ｐＨを示すグ
ラフである。
ラフである。
【図３】本発明に係るムタナーゼＣの至適ｐＨを示すグ
ラフである。
ラフである。
【図４】本発明に係るムタナーゼＡのｐＨ安定性を示す
グラフである。
グラフである。
【図５】本発明に係るムタナーゼＢのｐＨ安定性を示す
グラフである。
グラフである。
【図６】本発明に係るムタナーゼＣのｐＨ安定性を示す
グラフである。
グラフである。
【図７】本発明に係るムタナーゼＡの至適温度を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図８】本発明に係るムタナーゼＢの至適温度を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図９】本発明に係るムタナーゼＣの至適温度を示すグ
ラフである。
ラフである。
【図１０】本発明に係るムタナーゼＡの温度安定性を示
すグラフである。
すグラフである。
【図１１】本発明に係るムタナーゼＢの温度安定性を示
すグラフである。
すグラフである。
【図１２】本発明に係るムタナーゼＣの温度安定性を示
すグラフである。
すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ６１Ｋ 37/54
Ｃ１２Ｒ 1:07）
(72)発明者 下津浦 勇雄
東京都墨田区本所１丁目３番７号 ライ
オン株式会社内
(72)発明者 横堀 佳子
東京都墨田区本所１丁目３番７号 ライ
オン株式会社内
(72)発明者 平野 正徳
東京都墨田区本所１丁目３番７号 ライ
オン株式会社内
(72)発明者 渋谷 耕司
東京都墨田区本所１丁目３番７号 ライ
オン株式会社内
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
A61K 7/00 - 7/50
Claims (7)
- 【請求項１】 バチルス属に属すると共に、プロテアー
ゼ産生が陰性であるムタナーゼ産生微生物を培養した培
養物から採取されるムタナーゼであって、下記の理化学
的性質（Ｉ−ａ）〜（Ｖ−ａ）を有するムタナーゼを配
合してなることを特徴とする口腔用組成物。 （Ｉ−ａ）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （ＩＩ−ａ）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４において作用が至適
であり、ｐＨ４〜６の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ａ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （ＩＶ−ａ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度６０℃において作用が至適である。 （Ｖ−ａ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１５万である。 - 【請求項２】 さらに、下記の理化学的性質（ＶＩ−
ａ）〜（ＩＸ−ａ）を有するムタナーゼを配合してなる
ことを特徴とする請求項１記載の口腔用組成物。 （ＶＩ−ａ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ａ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活
する。 （ＶＩＩＩ−ａ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀、銀又は３価の鉄により作用が阻害され
る。 （ＩＸ−ａ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。 - 【請求項３】 バチルス属に属すると共に、プロテアー
ゼ産生が陰性であるムタナーゼ産生微生物を培養した培
養物から採取されるムタナーゼであって、下記の理化学
的性質（Ｉ−ｂ）〜（Ｖ−ｂ）を有するムタナーゼを配
合してなることを特徴とする口腔用組成物。 （Ｉ−ｂ）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （ＩＩ−ｂ）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が
至適であり、ｐＨ４〜７の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ｂ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１１の範囲で安定である。 （ＩＶ−ｂ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度６５℃において作用が至適である。 （Ｖ−ｂ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１４万である。 - 【請求項４】 さらに、下記の理化学的性質（ＶＩ−
ｂ）〜（ＩＸ−ｂ）を有するムタナーゼを配合してなる
ことを特徴とする請求項３記載の口腔用組成物。 （ＶＩ−ｂ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ｂ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、６０℃以下で活性は安定であり、７５℃で失活
する。 （ＶＩＩＩ−ｂ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀又は銀により作用が阻害される。 （ＩＸ−ｂ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。 - 【請求項５】 バチルス属に属すると共に、プロテアー
ゼ産生が陰性であるムタナーゼ産生微生物を培養した培
養物から採取されるムタナーゼであって、下記の理化学
的性質（Ｉ−ｃ）〜（Ｖ−ｃ）を有するムタナーゼを配
合してなることを特徴とする口腔用組成物。 （Ｉ−ｃ）基質特異性：ムタンをよく分解する。 （ＩＩ−ｃ）至適作用ｐＨ：ムタンを基質として３５℃
で１０分間作用させる場合、ｐＨ４．５において作用が
至適であり、ｐＨ４〜５の範囲で高い活性を示す。 （ＩＩＩ−ｃ）安定ｐＨ範囲：２５℃で２４時間保温す
る場合、ｐＨ４〜１０の範囲で安定である。 （ＩＶ−ｃ）至適温度：ムタンを基質としてｐＨ５で反
応させる場合、温度５０℃において作用が至適である。 （Ｖ−ｃ）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動による分子量は約１６万である。 - 【請求項６】 さらに、下記の理化学的性質（ＶＩ−
ｃ）〜（ＩＸ−ｃ）を有するムタナーゼを配合してなる
ことを特徴とする請求項５記載の口腔用組成物。 （ＶＩ−ｃ）作用：ムタンのα−１，３−グルコシド結
合を分解する性質を有する。 （ＶＩＩ−ｃ）温度安定性：ｐＨ５で１０分間熱処理し
た場合、５０℃以下で活性は安定である。 （ＶＩＩＩ−ｃ）金属イオンの影響：ムタンを基質とす
る場合、水銀又は銀により作用が阻害される。 （ＩＸ−ｃ）阻害剤の影響：ムタンを基質とする場合、
ｐ−クロロマーキュリー安息香酸（ＰＣＭＢ）によって
阻害される。 - 【請求項７】 さらに、デキストラナーゼを含有する請
求項１〜６のいずれか１項記載の口腔用組成物。
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