CN1216463A - 祛除齿斑的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含有一种淡紫拟青霉葡聚糖酶和一种齿斑葡聚糖酶、以及其他可选择性含有的酶类的口腔保健组合物及其产品。

Description

祛除齿斑的组合物
发明领域
本发明涉及含有一种淡紫拟青霉葡聚糖酶和一种齿斑葡聚糖酶(mutanase)，以及其他可选择性性含有的酶类的口腔保健组合物及其产品。
本发明还涉及本发明的组合物及产品在祛除齿斑和防止齿斑形成中的应用。
发明背景
齿斑的形成会引起龋齿、牙龈炎、牙周病，最终导致牙齿脱落。齿斑是细菌、上皮细胞、白细胞、巨噬细胞和其他口腔渗出液的混合物。所说的细菌产生多支链多糖与口腔微生物一起形成黏性物质，引起齿斑进一步扩散。
随着齿斑继续积聚，会生成坚硬的白色或黄色沉积物。这些沉积物被称作钙化斑或牙垢，是由齿斑和尤其是钙等矿物质在唾液中形成的。
口腔多糖
口腔多糖是由食物和饮料中所含的蔗糖在口腔中的生龋微生物如变异链球菌(Streptococcus mutans)或血链球菌(Streptococcussanguis)的作用下生成的。
上述口腔多糖含有水溶性的带有大量α-1,6糖苷键的葡聚糖，还含有水不溶的被称为齿斑葡聚糖(mutan)的胞外多糖的主要成分，该齿斑葡聚糖的碳链以α-1,3糖苷键连接，支链以α-1,6糖苷键连接。
齿斑葡聚糖结合羟磷灰石(形成牙齿坚硬的多孔外层)并与黏附在牙齿表面的所述生龋细菌的细胞表面受体蛋白结合。
齿斑葡聚糖酶
齿斑葡聚糖酶是α-1,3葡聚糖酶(又称α-1,3葡聚糖水解酶)，降解齿斑葡聚糖的α-1,3糖苷键。据报道齿斑葡聚糖酶来源于木霉属(Hasegawa等,1969，生物化学杂志，244,p.5460-5470；Guggenheim and Haller,1972，牙科研究杂志，51,p.394-402)及链霉菌(Takehara等,1981，细菌学杂志，145,p.729-735)、树脂枝孢菌(Cladosporium resinae)(Hare等,1978，糖研究,66,p.245-264)，假单孢菌(美国专利号4,438,093)，黄杆菌(日本专利号77038113)，环状芽孢杆菌(Bacillus circulanse)(日本专利号63301788)和曲霉的菌株。一个来源于哈氏木霉(Trichoderma harzianum)的齿斑葡聚糖酶基因已被克隆并测序(日本专利号4-58889/A)。
葡聚糖酶
葡聚糖酶是α-1,6葡聚糖酶(又称为1,6-α-D-葡聚糖-6-葡聚糖水解酶)，降解葡聚糖的α-1,6糖苷键。能产生葡聚糖酶的一些微生物包括青霉、拟青霉、曲霉、镰刀菌、穗霉、轮枝孢霉、长蠕孢属和毛壳菌等属的真菌；乳杆菌属、链球菌属、纤维孤菌属、噬纤维菌属、短杆菌属、假单孢菌属、棒杆菌属、节杆菌属和黄杆菌属等属的细菌以及如斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)等酵母菌。
市场上的产品包括Novo Nordisk A/S通过淡紫青霉(Penicilliumlilacium)菌株发酵生产的葡聚糖酶50L。葡聚糖酶50L可用于糖加工业中降解粗糖液或糖浆中的葡聚糖。
为了保证牙齿能有效地咀嚼食物等功能，有必要一生中保护牙齿、维持良好的口腔卫生。为达到上述目的，可以经常使用牙膏等刷牙，并且最好用含抗菌剂的漱口液对口腔进行清洗。
有人曾建议，在口腔保健组合物和产品中加入葡聚糖酶和/或齿斑葡聚糖酶和/或其它酶类来防止龋齿、齿斑、牙垢的产生。
美国专利号4,353,891(Guggenheim等)涉及将用哈氏木霉CBS243.71菌株产生的齿斑葡聚糖酶用于降解变异链球菌CBS350.71菌株(又编号为OMZ176)产生的齿斑葡聚糖，以此祛除齿斑。齿斑的关键成分是具有α-1,3-糖苷键的水不溶性多糖，这种称为齿斑葡聚糖的多糖物质不被葡聚糖酶作用。
Guggenheim等(1972，龋齿研究，6,p.289-297)发现同时使用葡聚糖酶和1,3-葡聚糖酶(齿斑葡聚糖酶)对大鼠齿斑的扩展无显著影响。
Hare等(1978，糖研究，66,p.245-264)发现树脂枝孢菌产生的细菌α-1,3-葡聚糖酶和另一种细菌葡聚糖酶组合使用，在水解和溶解口腔葡聚糖时具有协同效应。
美国专利4,438,093号(Osaka微生物疾病研究基金)描述了含有一种葡聚糖酶和一种α-1,3-葡聚糖酶(齿斑葡聚糖酶)的口腔保健组合物，每克该组合物中两种酶的含量均为0.5到100个酶单位，酶单位比值为1∶2到2∶1。所说的葡聚糖酶由棒杆菌属的一个菌株产生，α-1,3-葡聚糖酶来自假单孢菌属的一个菌株。
英国专利号2,206,585(Dental Chem.Co.LTD)描述了一种牙齿清洁剂，该牙齿清洁剂含有羟磷灰石作为磨光剂，所述羟磷灰石上固定有果聚糖酶(laevanase)、葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶。
美国专利5,145,665号(Henkel)公开了一种用于口腔和牙齿保健的组合物，该组合物中含有葡聚糖酶和/或1,3-葡聚糖酶，可清除口腔中的多糖。
法国专利2,651,433号(DANA)涉及的洁齿剂(dentifrice)产品中含有的葡聚糖酶可作用于形成不久的齿斑，齿斑葡聚糖酶可作用于形成较久及不溶性齿斑，该产品中还含有其它几种有杀菌作用的酶。
美国专利5,320,830号(宝洁公司)描述了一种可减少齿斑和牙龈炎的牙膏，该牙膏剂含有a)一种表面活性剂，b)一种酶，c)螯合剂，d)一种氟化物，e)一种硅磨光剂，以及f)一种载体。其中所述酶是内切葡聚糖酶，木瓜蛋白酶，葡聚糖酶和/或齿斑葡聚糖酶。
发明概述
本发明目的是提供可安全(即对口腔组织、结构无损害)、有效防止齿斑形成和/或清除已形成的齿斑的口腔保健产品。
本发明首先涉及含有淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinum)葡聚糖酶和一种齿斑葡聚糖酶的口腔保健组合物。本发明也涉及相应的口腔保健产品，如牙膏。本发明还涉及本发明的组合物或产品在防止齿斑形成和祛除齿斑中的应用。
附图简述
图1表示在pH5.0-8.0之间，淡紫拟青霉葡聚糖酶和/或哈氏木霉齿斑葡聚糖酶对齿斑葡聚糖的水解作用。
图2表示在pH7时，体外试验中齿斑的祛除情况。
图3表示pH7时，葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶组合使用对齿斑的祛除效果。
发明详述
本发明目的是提供可安全(即对口腔组织、结构无损害)、有效防止齿斑形成和/或清除已形成的齿斑的口腔保健产品。
所述口腔保健产品应被理解为同时有其它直接或间接口腔保健功能，如抑制蛀牙或牙龈炎。
本发明涉及的所有口腔保健组合物和相应产品中都含有酶类，这些组合物和产品的pH范围是pH 6.0到大约pH 8.0，这是多数口腔保健产品的pH范围。
本发明人发现在口腔保健产品中同时使用特定的葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶可以产生协同效应。
口腔保健组合物
如上所述，本发明首要目的是提供一种含有淡紫拟青霉产生的葡聚糖酶和一种齿斑葡聚糖酶的口腔保健组合物。
所需酶量的减少具有经济效益，因为这可以使生产本发明所述的口腔保健品的成本降低。另外，若产品中加入原有酶量将得到效果强化的产品。使用由本发明所述的口腔保健组合物制备而成的口腔保健产品(下文将有详述)将可受益非浅，这是由于它能够比原有产品更安全、更有效地防止直接或间接的不良后果(如牙齿上的黄色沉积物，蛀牙、牙龈炎的预防)。
一种适于在本发明所述口腔保健组合物中与葡聚糖酶组合使用的齿斑葡聚糖酶可由选自含有下述菌的丝状真菌组内的菌株产生：木霉属，尤其是哈氏木霉菌株，如哈氏木霉CBS243.71；或青霉属，特别是索青霉(Penicillium funiculosum)，如索青霉NRRL1768，或淡紫青霉，如淡紫青霉NRRL896，或产紫青霉(Penicilliumpurpurogenum)，如产紫青霉CBS238.95；或假单孢菌属(Pseudomonas)的一个菌株；或黄杆菌属(Flavobacterium)的一个菌株；或环状芽孢杆菌的一个菌株，或曲霉属的一个菌株，或链霉菌属的一个菌株等。
齿斑葡聚糖酶还可以从产紫青霉中获得。
美国专利4,353,981(Guggenheim等)公开了哈氏木霉CBS243.71齿斑葡聚糖酶，索青霉NRRL1768齿斑葡聚糖酶和淡紫青霉NRRL896齿斑葡聚糖酶在祛除齿斑中的应用。
其它几种提到的齿斑葡聚糖酶，其文献可在发明背景部分找到。
本发明的口腔保健组合物中可适当地含有淡紫拟青霉产生的一定量葡聚糖酶和有等效酶活的一种齿斑葡聚糖酶。以在终口腔保健产品中的酶活单位计量，这两种酶的含量分别是0.001KDU/ml～1000KDU/ml，优选0.01KDU/ml～500 KDU/ml，尤其是0.1 KDU/ml～100 KDU/ml；以及0.001MU/ml～1000 MU/ml，优选0.01 MU/ml～500MU/ml，尤其是0.01 MU/ml～100MU/ml。
本发明人惊奇地发现淡紫拟青霉产生的葡聚糖酶和哈氏木霉产生的齿斑葡聚糖酶组合使用时，在体外实验中，pH7.0条件下，祛除齿斑具有协同效应(见实施例2)。
在优选的实施方案中使用的齿斑葡聚糖酶是重组体。
这些酶(即葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶)应在20～45℃基本上有活性，尤其是在37℃附近，因为人类口腔温度处于上述温度区间内。
术语“基本上有活性”在本发明正文中，是指所研究的酶的相对活性是该酶在最适温度时的活性的70％以上，尤其是80％以上，特别是90％以上。
根据本发明，在口腔保健组合物中还可含有其他的酶活性。除了葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶以外，可能含有的酶包括蛋白酶如木瓜蛋白酶，葡糖苷内切酶，脂酶，淀粉酶和相应的混合物。
口腔保健产品
本发明还涉及含有本发明的口腔保健组合物的口腔保健产品。所述口腔保健产品可以取任意适宜的物理形态(如粉末、膏、凝胶、液态、软膏、片剂等)。“口腔保健产品”可以定义为可用于通过防止齿斑形成、祛除齿斑、防止和/或治疗牙病等方式而保持或改善人类和动物的口腔卫生状况的一种产品。
至少在本发明内容中，口腔保健产品还包括可清洗牙齿、假牙等的产品。
这些口腔保健产品的例子包括牙膏、牙胶或牙粉，牙齿清洁剂、漱口液，刷牙前后用的冲洗剂，口香糖，糖锭和糖果等。
典型的牙膏和牙胶包括磨光性物质，起泡剂、芳香剂、保湿剂、黏合剂、增稠剂、增甜剂、增白/漂白/去污剂、水和可选择性含有的酶。
漱口液，包括祛斑液，典型地含有水/酒精溶液、芳香剂、保湿剂、增甜剂、起泡剂、着色剂和可选择性含有的酶。
磨光剂
也可将磨光性物质加入到本发明的洁齿剂产品中。根据本发明，所述磨光性物质包括氧化铝及其水合物，比如α-三水合氧化铝、三硅酸镁、碳酸镁、高岭土、硅铝酸盐如煅烧硅酸铝和硅酸铝、碳酸钙、硅酸锆，还包括粉状塑料，如聚氯乙烯、聚酰胺、聚甲基丙烯酸甲酯、聚苯乙烯、酚醛树脂、蜜胺甲醛树脂、尿素甲醛树脂、环氧树脂、粉状聚乙烯、二氧化硅干凝胶、水凝胶、气凝胶等。另外一些适合做磨光剂的有焦磷酸钙、水不溶的碱性偏磷酸盐、磷酸二钙和/或其二水合物、正磷酸二钙、磷酸三钙、颗粒状羟基磷灰石等。也可以使用这些物质的混合物。
根据口腔保健产品的不同，磨光性物质所占的重量百分比为0-70％，优选1％-70％。在牙膏中，磨光性物质成分一般是占到成品重量的10％-70％。
保湿剂用于防止牙膏等产品丧失水分。适用于本发明的口腔保健产品的保湿剂包括以下化合物及其混合物：甘油、多羟基化合物、山梨糖醇、聚乙二醇、丙二醇、1,3-丙二醇、1,4-丁二醇、氢化的部分水解多糖。保湿剂一般在牙膏中的重量百分比为0～80％，优选5％～70％。
二氧化硅、淀粉、黄蓍胶、黄原胶、爱尔兰藓提取物、海藻胶质、果胶、纤维素衍生物如羟乙基纤维素、羟甲基化钠盐纤维素和羟基丙基纤维素，聚丙烯酸及其盐类，聚乙烯吡咯烷酮等可做为适宜的黏合剂和增稠剂的例子，它们有助于稳定洁齿剂产品。增稠剂在牙膏或牙胶中所占的重量百分比可以为0.1％～20％，黏合剂在成品中所占的重量百分比可以为0.01％～10％。
起泡剂
脂肪酸盐、阴离子、阳离子、非离子、两性和/或偶极离子的表面活性剂可以用作起泡剂。其重量在成品中可以占到0％～15％，优选0.1％～13％，更优选是0.25％～10％。
表面活性剂
表面活性剂的用量以不影响产品中所含酶的活性为限度。表面活性剂包括脂肪醇硫酸盐、单甘油酯磺酸盐、或10～20个碳原子的脂肪酸、脂肪酸-清蛋白缩合产物、脂肪酸酰胺和氨基乙磺酸盐和/或羟基乙磺酸的脂肪酸酯盐。
增甜剂(sweetening agent)
适当的增甜剂包括邻磺酰苯甲酰亚胺(糖精)。
芳香剂
例如留兰香(spearmint)，一般含量少，如其重量百分比可为0.01％到约5％，尤以0.1％～5％为宜。
增白/漂白剂
增白/漂白剂包括双氧水，一般含量少于成品重量的5％，优选为成品重量的0.25％～4％。
水
水的含量通常以使牙膏等产品呈流体状态为宜。
添加剂
本发明的产品中还可含有水溶性的抗菌剂，如双氯苯双胍己烷二葡糖酸盐(chlorhexidine digluconate)、双辛氢啶(hexetidine)、alexidine、季铵抗菌化合物和水溶性的金属离子如锌、铜、银、二价锡等(如锌、铜和二价锡的氯化物，以及硝酸银)。
根据本发明，还可加入化合物作为氟化物来源、染料/着色剂、防腐剂、维生素、pH调节剂、抗龋齿药物、脱敏剂等。
酶
另外一些应用于众多口腔保健产品以及本发明的口腔保健产品中的必要成分是酶类。酶是活体组织中化学反应的生物催化剂。酶与它们所作用的底物相结合形成酶-底物复合物中间体，然后这种复合物被转化为反应产物，酶则释放下来并继续进行其特异的酶促功能。
在用于清洁口腔时，酶具有多种功能。唾液蛋白可以吸附于牙齿的表面形成薄膜，这正是后来形成的牙斑的第一层，而蛋白酶则可以降解这类唾液蛋白。蛋白酶和脂酶一起可以降解组成细菌细胞壁和细胞膜的结构成分的蛋白和脂类，从而杀死细菌。葡聚糖酶可以降解细菌产生的可用于形成细菌吸附所需基质的有机骨架结构。蛋白酶和淀粉酶不仅可以抑制牙斑的形成，还通过降解可与钙结合的糖-蛋白组合物，抑制矿化作用，从而防止牙垢的产生。
一种应用本发明的口腔保健组合物制备的牙膏典型地含有以下成分(牙膏组合物成品的重量百分比)：
磨光剂    10～70％
保湿剂    0～80％
增稠剂    0.1～20％
黏合剂    0.01～10％
增甜剂    0.1～5％
起泡剂    0～15％
增白剂    0～5％
酶      0.0001～20％
在本发明的一个特定实施方案中，所述口腔保健产品是pH值范围为pH6.0～8.0，并含有下列组分的牙膏：
a)10～70％的磨光剂
b)0～80％的保湿剂
c)0.1～20％的增稠剂
d)0.01～10％的黏合剂
e)0.1～5％的增甜剂
f)0～15％的起泡剂
g)0～5％的增白剂
i)0.0001～20％的酶
上述i)中涉及的酶包括前面所述的来源于淡紫拟青霉的葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶，并可选择性地含有上文提及的可用于牙膏等的其他酶类。
一种应用本发明的口腔保健组合物生产的漱口液典型地含有以下成分(漱口液组合物成品的重量百分比)：
0～20％的保湿剂
0～2％的表面活性剂
0～5％的酶
0～20％的乙醇
0～2％的其他成分(如芳香剂、增甜剂、活性成分如氟化物)
0～70％的水
漱口液组合物可使用一种适当的缓冲液，如pH值为pH6～8的柠檬酸钠或磷酸钠缓冲液。
漱口液可以是非稀释状态(即使用前必须稀释)。
上文提及的酶类包括前面所述的来源于淡紫拟青霉的葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶，并可选择性包含上文提及的可用于漱口液的其他酶类。
口腔保健组合物及产品的应用
本发明的第三方面涉及本发明的组合物及口腔保健产品在防止牙斑的形成或祛除牙斑中的应用。
本发明的产品的应用典型地包括将安全、有效量的所述产品应用于口腔中。例如对牙膏或牙胶来说，这些剂量(如大约0.3克到2克)在口腔中停留大约15秒到12小时。
制备方法
可以使用口腔产品领域的常规方法生产本发明的口腔保健组合物和产品。
材料和方法
材料
淡紫拟青霉产生的葡聚糖酶(来源于Novo Nordisk A/S)哈氏木霉CBS243.71菌株产生的齿斑葡聚糖酶(来源于NovoNordisk A/S)
微生物
变异链球菌CBS350.71菌株(又编号为OMZ176)
粘放线菌(Actinomyces viscosus)DSM43329
具核梭杆菌多形亚种(Fusobacterium nucleatum subsp.polymorphum)DSM 20482
溶液
Britton-Robinson缓冲液
赤藓红B(Erythrosin B)(Sigma)
仪器
比色仪CR-200(Minolta)。
羟基磷灰石盘的制备
制备羟基磷灰石盘时，在盘型模具中加入250mg羟基磷灰石，加压大约5900kg((13,000lbs)压缩5分钟。然后在600℃烧结4小时，最后用无菌的去离子水水化处理。
羟基磷灰石盘的灭菌
羟基磷灰石盘在180℃灭菌两个小时，用无菌的去离子水水化，置于Nunc管(10ml体积)的盖子上。
齿斑葡聚糖的制备
制备齿斑葡聚糖时，先将变异链球菌CBS350.71在pH6.5、37℃恒温、75rpm振荡通气的条件下，在含有以下成分的培养量中培养：
NZ-Case           6.5g/L
酵母提取物        6g/L
(NH4)2SO4      20g/L
K2PO4           3g/L
葡萄糖            50g/L
Pluronic PE6100   0.1％
35小时后，加入蔗糖至终浓度为60g/L，以诱导产生葡萄糖基转移酶。整个发酵时间为75小时，发酵后的上清液离心并过滤(无菌)，然后在上清液中加入蔗糖至终浓度为5g/L(乙酸调节pH7.0)，将该溶液于37℃搅拌过夜。过滤该溶液，不溶的齿斑葡聚糖收集在Propex上，用pH5.0(乙酸调节)的含有1％苯甲酸钠的去离子水粗洗。最后，将该不溶性齿斑葡聚糖冻干并粉碎。
葡聚糖活性测定(KDU)
一千个Novo葡聚糖酶活单位(1KDU)是指参照下述标准条件，利用Novo Nordisk测定葡聚糖酶活性的方法，每小时能降解葡聚糖产生相当于1克麦芽糖的还原糖的酶量：
底物             葡聚糖500(Pharmacia)
反应时间         20分钟
温度             40℃
pH               5.4
根据需求，可提供Novo Nordisk公司分析方法的详细说明(AF120)。
齿斑葡聚糖酶活性测定(MU)
一个齿斑葡聚糖酶活单位(MU)是在标准条件下，每分钟催化反应生成1μmol还原糖(以葡萄糖计算)的酶量。
标准条件
底物          1.5％齿斑葡聚糖
反应时间      15分钟
温度          40℃
pH            5.5
根据要求，可从Novo Nordisk公司(A/S)获得Novo Nordisk公司分析方法的详细说明(AF180/1-GB)。
制备贴壁的齿斑葡聚糖
将变异链球菌OMZ176(CBS350.71)接种至盛有10ml含2％蔗糖的Todd Hewitt肉汤的玻璃试管(22mm直径×150mm高度)中，将试管于37过夜。弃去肉汤，用10ml 0.85％NaCl溶液将附着在玻璃壁上的齿斑葡聚糖和变异链球菌细胞洗涤两次。
齿斑祛除效果评价
用于齿斑祛除效果评价的方法是基于Kao在JP2250816所述的方法。本方法中，所述羟基磷灰石盘覆盖有一层由三株口腔微生物(变异链球菌、粘放线菌、具核梭杆菌)组成的生物膜。
测定齿斑祛除效果时，利用PBS中的0.1％赤藓红B将羟基磷灰石盘上的齿斑染成红色，红色的强度(即a*)用比色仪CR-200测定。a*的最大值为60。低于该值表明红色强度较小(即齿斑较少)。若测得a*值为零，说明无红色(即没有齿斑)。
实施例1
齿斑葡聚糖在pH5.0～8.0的水解
用超声发生器将根据“材料与方法”所述得到的齿斑葡聚糖分散于去离子水中至浓度为16mg/ml，制备成底物悬液。
溶于0.05M乙酸缓冲液的淡紫拟青霉齿斑葡聚糖酶和哈氏木霉CBS243.71葡聚糖酶用去离子水稀释。
制备如下酶溶液：
—葡聚糖酶溶液(4KDU/ml)，
—齿斑葡聚糖酶溶液(4MU/ml)，以及
—混合酶溶液(4KDU和4MU/ml)
此外，制备pH值分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的50mM Britton-Robinson缓冲液。取250μl上述酶液和500μl缓冲液在微量离心管中混合，立即加入250μl已制好的齿斑葡聚糖悬液，于37℃在摇床中以最大转速保温。30分钟后立即加入250μl0.5N HCl终止酶促反应。离心各个反应混合物，按照蒽酮反应方法(J.H.Roe,1955，生物化学杂志，212,P335)测定所获得的上清液中的可溶性糖含量。
实验结果如图1所示。从图1中可以看出，在pH5.0～8.0范围内，组合使用葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶水解齿斑葡聚糖时，可产生协同效应。
实施例2
pH7.0时贴于玻璃壁上的齿斑葡聚糖的水解
按照“材料与方法”部分所述，制备粘附有齿斑葡聚糖的玻璃试管，以模拟粘在牙齿表面的牙斑。
将下列溶于0.05M乙酸缓冲液的齿斑葡聚糖酶和葡聚糖酶用30mM Britton-Robinson缓冲液(pH7.0)稀释：
—葡聚糖酶溶液(1KDU/ml)，
—齿斑葡聚糖酶溶液(1MU/ml)，以及
—混合性葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶溶液(1KDU和1MU/ml)
从上述每种酶溶液中分别取5ml，先在37℃预热15分钟，然后加入至带有贴壁齿斑葡聚糖的玻璃管中，将其在37℃保温。
保温时间为0时立即取出1000μl作为对照，并与500μl 0.5NHCl混合以终止酶促反应。在保温5、10、15、30分钟时，分别取出1000μl样品并立即与500μl 0.5N HCl混合。
将每一个反应混合物离心，利用实施例1所述的同样方法测定所得上清中的可溶性糖含量。
实验结果如图2所示。从图2中可以看到，在pH7.0时，组合使用葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶水解玻璃壁上粘附的齿斑葡聚糖可产生协同效应。
实施例3
pH7.0时牙斑祛除效果
将三种口腔微生物(分别为变异链球菌、粘放线菌、具核梭杆菌多形亚种)在37℃分别厌氧培养三天。在培养过程中，将涂有无菌唾液的羟基磷灰石盘浸入培养肉汤中，这样，在该盘表面就形成了口腔生物膜。培养后，羟基磷灰石盘用PBS快速地冲洗一下，然后用制备于40 mM Britton-Robinson缓冲液(pH7.0)的酶溶液在37℃作用20分钟，如下表所示：
处理方法 齿斑葡聚糖酶     葡聚糖酶
    1     0     0
    2     1MU/ml     0
    3     0    1KDU/ml
    4     1MU/ml    1KDU/ml
羟基磷灰石盘用PBS快速冲洗一下，然后在1ml含溶于PBS的0.1％赤藓红B中温育1分钟，以将羟基磷灰石盘上的斑染成红色。将盘风干过夜。用比色仪CR-200测定红颜色的强度(即a*)。a*值越高，羟基磷灰石盘就越红。除去赤藓红B溶液，将盘用PBS冲洗几分钟。
测试的结果如图3所示。可以看到，用1KDU/ml的葡聚糖酶和1MU/ml的齿斑葡聚糖酶处理羟基磷灰石盘时，比分别使用这两种酶时能更有效地祛除羟基磷灰石盘上的斑。在pH7.0时，组合使用葡聚糖酶和齿斑葡聚糖酶在祛除牙斑时有协同效应。
本发明及权利要求并不仅限于此处所公开的几个特殊实施方案的范围，因为这些实施方案仅用于描述本发明的几个方面，所有相似的的实施方案均落在本发明的范围之内。事实上，根据前面的描述，除本文所公开的各个实施方案外，本领域的技术人员易于作出本发明的各种改进，这些改进也落在本发明权利保护范围之内。
本文引用多篇参考文献，这些参考文献所公开的内容均全文引入本文作为参考。

Claims (11)

1．一种含有淡紫拟青霉葡聚糖酶和一种齿斑葡聚糖酶的口腔保健组合物。
2．根据权利要求1所述的口腔保健组合物，其特征在于：其pH范围为pH 6.0～8.0。
3．根据权利要求1或2的口腔保健组合物，其中所述葡聚糖酶来源于拟青霉属，特别是淡紫拟青霉。
4．根据权利要求1到3中任一项的口腔保健组合物，其中所述齿斑葡聚糖酶来源于木霉属，主要是哈氏木霉，尤其是哈氏木霉CBS243.71，或来源于青霉属，主要是索青霉，尤其是索青霉NRRL1768，或淡紫青霉，尤其是淡紫青霉NRRL896，或产紫青霉，例如产紫青霉CBS238.95，或来源于假单孢菌属的一个菌株，或黄杆菌属的一个菌株，或环状芽孢杆菌的一个菌株，或曲霉属的一个菌株，或链霉菌属的一个菌株。
5．根据权利要求4的口腔保健组合物，其中所述齿斑葡聚糖酶是重组体。
6．根据权利要求1至5中任一项所述的口腔保健组合物，其特征在于：所述酶类在组合物中在20-40℃温度下、尤其是37℃左右基本上有活性。
7．根据权利要求1至6中任一项所述的口腔保健组合物，其特征在于：其中还含有选自由蛋白酶如木瓜蛋白酶、葡糖苷内切酶、脂酶、淀粉酶及其混合物等组成之组的酶类。
8．一种含有权利要求1至7中任一项所述的口腔保健组合物的口腔保健产品。
9．根据权利要求8所述的口腔保健产品是一种洁齿剂，例如牙膏、牙粉或漱口液。
10．根据权利要求9所述的口腔保健产品，其中该产品是pH范围为pH 6.0至pH 8左右的牙膏或漱口液。
11．权利要求1至7所述的组合物或8至10所述的口腔保健产品在抑制齿斑形成或祛除齿斑中的应用。
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication