JP2000508323A

JP2000508323A - 歯垢の除去のための組成物

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Publication number: JP2000508323A
Application number: JP9536661A
Authority: JP
Inventors: 理恵土屋
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-04-16
Filing date: 1997-04-16
Publication date: 2000-07-04
Also published as: DE69711044D1; EP0907349A1; AU716989B2; CN1216463A; US6254856B1; DE69711044T2; AU2380997A; ES2174248T3; WO1997038669A1; CA2251925A1; EP0907349B1

Abstract

(57)【要約】本発明はペシロミセス・リラシヌムのデキストラナーゼ及びムタナーゼ及び任意に他の酵素を含む口腔ケア組成物及び製品に関する。

Description

【発明の詳細な説明】歯垢の除去のための組成物発明の分野本発明はデキストラナーゼ及びムタナーゼ並びに任意に他の酵素を含む口腔ケア組成物及び製品に関する。本発明は歯垢の除去及び歯垢の形成を防ぐための本発明の組成物及び製品の使用にも関する。発明の背景歯垢の形成は、う食、歯肉炎、歯周病、そして、結局は歯の喪失に導く。歯垢は、細菌、上皮細胞、白血球、マクロファージ及び他の口腔浸出物の混合物である。前記細菌は、口腔からの微生物といっしょに、歯垢の継続する増殖のための接着剤マトリックスを形成する高度に枝分れした多糖類を生産する。歯垢は継続して、石を蓄積するので、剛い白いまたは黄色の堆積物が生ずる。これらの堆積物は、石灰質化歯垢、結石または酒石と呼ばれ、歯垢及び無機物、たとえば特にカルシウムから、唾液中に形成される。口腔の多糖類口腔の多糖類は、口腔で増殖するう食性の微生物、たとえば、ストレプトコッカス．ミュータンス（Streptococcus mutans）またはストレプトコッカス・サンギス(Streptococcus sanguis)の作用により、たとえば食物または飲料成分として、口に取り入れられるスクロースから生産される。前記口腔の多糖類は、大部分のα−１，６−グルコシド−結合を有する、水溶性デキストラン並びにα−１，３−グリコシド結合を有する主鎖及びα−１，６−グリコシド結合を有する分枝からなる「ミュータン(mutan)」と呼ばれる主要成分の水不溶性細胞外多糖類を含む。ミュータンはヒドロキシアパタイト（歯の硬い外側の多孔質層を構成する）及び歯の表面に付着する前記う食性細菌の細胞表面の受容体タンパク質に結合する。ムタナーゼムタナーゼは、ミュータンのα−１，３−グリコシド結合を分解する、α−１，３−グルカナーゼ（α−１，３−グルカノヒドロラーゼとしても公知である）である。ムタナーゼはトリコデルマ(Trichoderma)属〔Hasegawa他「Journal of Biological Chemistry」244，p.5460〜5470(1969)，Guggenheim及びHaller「Jou rnal of Dental Reserch」51，p.394〜404(1972)〕及びストレプトミセス(Strep tmyces)属〔Takehara他「Journal of Bacteriology」145，p.729〜735(1981)〕の株、クラドスポリウム・レシネ（Cladosporiumresinae)〔Hara他「Carbohydra teResearch」66，p.245〜264(1978)〕、シュードモナス(Pseudomonas)種（米国特許第4,438,093号）、フラボバクテリウム（Flavobacterium）種（日本特許第7 7038113号）、バシラス・サーキュランス(Bacillus circulanse)（日本特許第63 301788号）及びアスペルギルス(Aspergillus)種から由来すると記載されてきた。トリコデルマ・ハーチアヌム(harzianum)からのムタナーゼ遺伝子がクローン化され、配列決定された（特開平４-58889号）。デキストラナーゼデキストラナーゼは、デキストラン中のα−１，６−グリコシド結合を分解する、α−１，６−グルカナーゼ（１，６−α−Ｄ−グルカン−６−グルカノヒドロラーゼとしても公知である）。いくつかの微生物はデキストラナーゼを生産でき、とりわけ、ペニシリウム属、ペシロミセス（Pacc ilomyces）属、アスペルギルス属、フザリウム（Fusarium）属、スピカリア（Sp icaria）属、バーティシリウム（Verticillium）属、ヘルミントスポリウム(Hel minthosporium)属及びケトミウム（Chaetomium）属の真菌、ラクトバシラス(Lac tobacillus)属、ストレプトコッカス属、セルビブリオ（Cellvibrio)属、シトファーガ(Cytophaga)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、シュードモナス属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アースロバクター（Arthrobac ter）属及びフラボバクテリウム属の細菌並びに酵母、たとえば、リポミセス・スターケイ（Lipomycesstarkeyi）である。市販製品は、ペニシリウム・リラシウム（lilacium）の株の醗酵により生産された、ノボノルディスクアクティーゼルスカブからのデキストラナーゼ50 Ｌを包含する。デキストナーゼ50Ｌは砂糖工業において、精製してない砂糖ジュースまたはシロップ中のデキストランを分解するのに用いられる。全生涯の間、たとえば、食物を噛む能力を十分に保証することができるために、歯を良好な状態に保ち、良好な口腔衛生を得ることが必要である。これは、練り歯磨き等を用いて頻繁に歯を磨くことによって得られる。口はさらに抗菌剤を含んでいるうがい薬ですすぐことが有利である。う食、歯垢及び酒石の形成を防ぐために、口腔ケア組成物及び製品にデキストラナーゼ及び／またはムタナーゼ及び／または他の酵素を加えることが提案されてきた。米国特許第4,353,891号（Guggenheim他）は、OMZ176として同定できるストレプトコッカス・ミュータンス株CBS 350.71を培養することによって合成されたミュータンを、トリコデルマ・ハーチアヌムCBS 243. 71からのムタナーゼを用いて分解する歯垢の除去に関する。歯垢における重要な成分はα−１，３−グルコシド結合を有する水不溶性多糖類であり、ミュータンと呼ばれる上記多糖類物質はデキストラナーゼにより攻撃されないと述べられている。グッゲンハイム（Guggenheim）他「Caries Res．」6．p.289〜297(1972)は、ラットの歯垢の量はデキストラナーゼ及びｌ，３−グルカナーゼ（ムタナーゼ）を同時に用いることによって著しい影響を受けないことを開示している。ハレ（Hare）他「Carbohydrate Research」66．p.245〜264(1978)は、口腔のグルカンを細菌のデキストラナーゼといっしょにクラドスポリウム・レジネからの細菌のα−１，３グルカナーゼを用いて加水分解及び溶解化する時、相乗効果が得られたことを見い出した。米国特許第4,438,093号（大阪のThe Research Foundation for Microbial dis eases）は、デキストラナーゼ及びα−１，３−グルカナーゼ（ムタナーゼ）を含む口腔組成物であって、両方共前記口腔組成物１ｇ当り0.5〜100酵素単位の量であって、１：２〜２：１の酵素単位比で存在する口腔組成物を記載している。前記デキストラナーゼは、コリンバクテリウム属内の細菌から由来し、前記α− １，３−グルカナーゼはシュードモナス属内の細菌から由来する。英国特許第2,206,585号（Dental Chem Co LTD）は、ヒドロキシアパタイト上に固定されたレバナーゼ(laevanase)、デキストラナーゼ及びムタナーゼを有するつや出し剤としてのヒドロキシアパタイトを含有する歯の洗浄剤を記載した。米国特許第5,145,665号（Henkel）は、口中の多糖類を分裂させるためにデキストラナーゼ及び／または１，３−グルカナーゼを含む、口及び歯のケアのための組成物を開示する。仏国特許2,651,433号（DANA）は、新しい歯垢に作用するデキストラナーゼ、古い不溶性の歯垢に作用するムタナーゼ及び殺菌作用を有する他の酵素の混合物を含有する歯磨き製品に関する。米国特許第5,320,830号（Proctor & Gamble）は、ａ）界面活性剤、ｂ）酵素、ｃ）キレート化剤、ｄ）フッ化物源、ｅ）シリカ研磨剤及びｄ）担体を含む、歯垢の削減及び歯肉炎のための練り歯磨き組成物を記載している。酵素はエンドグルカナーゼ、パパイン、デキストラナーゼ、及び／またはムタナーゼである。発明の概要本発明の目的は、安全に（すなわち、口腔の組成及び構造を傷つけずに）、そして、効果的に歯垢の形成を防ぎ及び／または既に堆積した歯垢を除去する、口腔ケア製品を提供することである。第１の面では、本発明はペシロミセス・リラシヌムのデキストラナーゼ及びムタナーゼを含む口腔ケア組成物に関する。さらに、本発明は、その口腔ケア製品、たとえば歯磨きに関する。最後に、本発明は、本発明の組成物または製品を歯垢の形成を防ぎまたは歯垢を除去するために用いることに関する。図面の簡単な説明図１は、5.0〜8.0のpH範囲内でのペシロミセス・リラシヌムのデキストラナーゼ及び／またはトリコデルマ・ハーチアヌムのムタナーゼを用いるミュータンの加水分解を示す。図２はpH７でのインビトロアッセイにおける歯垢の除去を示す。図３はpH７でのムタナーゼと併用したデキストラナーゼの歯垢の除去効果を示す。発明の詳細な説明本発明の目的は、安全に（すなわち、口腔の組織及び構造を傷つけずに）、そして、効果的に歯垢の形成を防ぎ、及び／または既に堆積した歯垢を除去する口腔ケア製品を提供することである。前記口腔ケア製品は直接的にまたは間接的に、同時に他の口腔ケア機能、たとえば、歯の穴または歯周炎の予防、も有することを理解すべきである。本発明に関係するすべての関連する口腔ケア組成物及びそれらから製造された製品は、酵素を含み、6.0〜約8.0の範囲のpH（ほとんどの口腔ケア製品のpHである）を有している。本発明者は、口腔ケア製品に特異的なデキストラナーゼ及びムタナーゼを用いると相乗効果が得られることを見い出した。口腔ケア組成物したがって、本発明の第１の目的は、ペシロミセス・リラシヌム由来のデキストラナーゼ、及びムタナーゼを含む口腔ケア組成物を提供することである。本発明による製品を製造するコストを減少できるので、必要な酵素の量を減少させることは、口腔ケア製品の製造に商業的に重要である。さらに、当初の量の酵素を加えるなら、改良された製品が得られる。本発明の口腔ケア組成物から製造された、本発明の口腔ケア製品（下記に詳細に説明する）の使用者も、直接的及び間接的な不利益（たとえば、歯の黄色い堆積物及びそれぞれ歯の穴及び歯肉炎の予防）を従来の製品よりも安全に、より効果的に予防できるので、本発明から利益を得るだろう。本発明の口腔ケア組成物中にムタナーゼと併用するのに適当なムタナーゼは、トリコデルマ属、特にトリコデルマ・ハーチアヌムの株、たとえば、トリコデルマ・ハーチアヌム CBS 243.71またはペニシリウム属、特にペニシリウム・フニキュロサム（funiculosum)、たとえば、ペニシリウム・フニキュロサム NRRL 1768またはペニシリウム・リラシヌムの株、たとえば、ペニシリウム・リラシヌムNRRL 896またはペニシリウム・プルプロゲヌム（purpurogenum）の株、たとえば、ペニシリウム・プルプロゲヌムCBS 238.95の株、またはシュードモナス属の株またはフラボバクテリウム種の株またはバシラス・サーキュランスの株またはアスペルギルス種の株またはストレプトミセス属の株を包含する群からの糸状菌によって生産できる。ムタナーゼはペニシリウム・プルプロゲヌムから由来することもできる。米国特許第4,353,981号（Guggenheim他）は、歯垢の除去のためにトリコデルマ・ハーチアヌム CBS 243.71ムタナーゼ、ペニシリウム・フニキュロサムNRRL 1768ムタナーゼ及びペニシリウム・リラシヌムNRRL 896ムタナーゼを用いることを開示している。他の上記ムタナーゼに関しては、上記発明の背景の項に見い出すことができる。本発明の口腔ケア組成物は適切には、最終口腔ケア製品中の酵素活性として計算して、それぞれ、0.001KDU／ml〜1000KDU／ml、好ましくは0.01KDU／ml〜500K DU／ml、特に0.1KDU／ml〜100KDU／ml及び0.001MU／ml〜1000MU／ml、好ましくは0.01MU／ml〜500MU／ml、特に0.01MU／ml〜100MU／ml及び0.01MU／ml〜100MU ／mlの範囲の酵素活性と同等な量のペシロミセス・リラシヌムのデキストラナーゼ及びムタナーゼを含むことができる。驚いたことには、本発明者は、ペシロミセス・リラシヌムからのデキストラナーゼ及びトリコデルマ・ハーチアヌムからのムタナーゼを組み合せた時、pH7.0でのインビトロアッセイにおいて歯垢を除去する時に相乗効果が得られることを発見した（例２参照）。好ましい態様では、用いられるムタナーゼは組換え体である。人の口の中の一般的な温度が20℃〜45℃の間にあるので、酵素（すなわち、デキストラナーゼ及びムタナーゼ）は、20℃〜45℃の温度、特に37℃付近で実質的に活性であることが必要である。本発明の文脈においては、「実質的に活性」という用語は、当該酵素は、最適温度で70％より高い相対的活性、特に80％より高い、特に90％より高い活性を有することを意味する。本発明の口腔ケア組成物において、他の酵素活性を包含することも本発明により予期される。デキストラナーゼ及びムタナーゼと並んで、予期される酵素は、プロテアーゼたとえばパパイン、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びそれらの混合物を包含する群からであり得る。口腔ケア製品本発明は本発明の口腔ケア組成物を含む口腔ケア製品にも関する。口腔ケア製品はあらゆる適切な物理的形態（すなわち、粉末、ペースト、ゲル、液体、軟膏、錠剤等）であってよい。「口腔ケア製品」は、歯垢の形成を予防し、歯垢を除去し、歯科の病気等を予防及び／または治療することにより、ヒト及び動物の口の中の口腔衛生を維持または改善するために用いることができる製品と定義することができる。少なくとも本発明の文脈では、口腔ケア製品は総義歯、人工歯等を洗浄するための製品をも包含する。上記口腔ケア製品の例は、練り歯磨き、歯科用クリーム、ゲルまたは歯磨き粉、歯の(odontic)、うがい薬、磨く前または後のリンス製剤、チューインガム、ロゼンジ及びキャンディを包含する。練り歯磨き及び歯磨きゲルは典型的には、研磨性のつや出し物質、発泡剤、香料、湿潤剤、結合剤、増粘剤、人工甘味料、白化／漂白／汚染除去剤、水及び任意に酵素を包含する。歯垢除去液を包含する、うがい薬は、典型的には、水／アルコール溶液、香料、湿潤剤、人工甘味料、発泡剤、着色剤及び任意に酵素を含む。研磨材研磨性のつや出し物質も本発明の歯磨き製品に組み入れてもよい。本発明によると、前記研磨性のつや出し物質はアルミナ及びその水和物、たとえば、アルファアルミナ、三水和物、三ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、アルミノケイ酸塩、たとえば、焼成ケイ酸アルミニウム及びケイ酸アルミニウム、炭酸カルシウム、ケイ酸ジルコニウム並びに、また、粉末プラスチックス、たとえば、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、ポリメタクリル酸メチル、ポリスチレン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、尿素 −ホルムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂、粉末化ポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル及びエアロゲル等を包含する。また、研磨材として適切なものは、ピロリン酸カルシウム、水不溶性メタリン酸アルカリ、リン酸ジカルシウム及び／またはその二水和物、オルトリン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、微粒状ヒドロキシアパタイト等である。これらの物質の混合物を用いることも可能である。口腔ケア製品に依存して、研磨性の製品は０〜70重量％、好ましくは１〜70重量％存在することができる。練り歯磨きについては、研磨材料の量は典型的には最終練り歯磨き製品の10〜70重量％の範囲にある。湿潤剤は、たとえば、練り歯磨きから水の喪失を防ぐために用いられる。本発明の口腔ケア製品に用いるのに適切な湿潤剤は、次の化合物、すなわち、グリセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリコール(PEG)、ポロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４−ブタンジオール、水素化部分加水分解多糖類等及びそれらの混合物を包含する。湿潤剤は一般に練り歯磨きの０〜80重量％、好ましくは５〜70重量％存在する。シリカ、デンプン、トガガカントガム、キサンタンガム、トチャカの抽出物、アルギン酸塩、ペクチン、セルロース誘導体、たとえばヒドロキシエチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸及びその塩、ポリビニルピロリドンを適切な増粘剤及び結合剤の例としてあげることができ、これは歯磨き製品の安定化を助ける。増粘剤は練り歯磨きクリーム及びゲルに、最終製品の0.1〜20重量％の量で、結合剤は0.0 1−10重量％の範囲で存在し得る。発泡剤発泡剤として、石けん、アニオン性、カチオン性、非イオン性、両性及び／または双性イオン界面活性剤を用いることができる。これらは最終製品の0〜15重量％、好ましくは0.1〜13重量％、より好ましくは0.25〜10重量％のレベルで存在することができる。界面活性剤界面活性剤は、この酵素に不活性化効果を及ぼさない量までのみ適切である。界面活性剤は硫酸脂肪族アルコール、スルホン化モノグリセリド塩または10〜20 個の炭素原子を有する脂肪酸、脂肪酸−卵白(albumen)縮合生成物、脂肪酸アミドの塩及びタウリン及び／またはイセチオン酸の脂肪酸エステルの塩を包含する。人工甘味料適切な人工甘味料はサッカリンを包含する。香料香料、たとえば、スペアミントは通常、少量、たとえば、0.01〜約５重量％、特に0.1〜５重量％存在する。白化／漂白剤白化／漂白剤はH₂O₂を包含し、最終製品の重量を基準として計算して５％未満、好ましくは0.25〜４％の量で加えることができる。水水は通常たとえば練り歯磨きに流動性の形態を与える量で加える。追加の薬剤さらに、水溶性抗菌剤、たとえば、ジグルコン酸クロルヘキシジン、ヘキセチジン、アレキシジン、第４アンモニウム抗菌性化合物及び特定の金属イオンの水溶性源、たとえば、亜鉛、銅、銀、錫（II）（たとえば、塩化亜鉛、銅及び錫、及び硝酸銀）も包含することができる。本発明により、フッ化物源として用い得る化合物、染料／着色料、防腐剤、ビタミン、pH調整剤、抗う食剤、減感剤等の添加も考えられる。酵素本発明の口腔ケア製品及び口腔ケア製品に用いられる他の必須成分は酵素である。酵素は生きている系における化学反応の生物学的触媒である。酵素は、それらが中間の酵素−基質複合体を形成するように作用する基質と組み合わせる。次にこの複合体を反応生成物及びその特異的酵素機能を継続する、解放された酵素に変換させる。酵素は、口腔の浄化のために用いる時、いくつかの利点をもたらす。プロテアーゼは唾液のタンパク質（それらは歯の表面に吸着され、薄膜、すなわち、歯垢を生じる第１層）を壊す。プロテアーゼ並びにリパーゼは、細菌の細胞壁及び膜の構造成分をを形成するタンパク質及び脂質を溶解することにより、細菌を殺す。デキストラナーゼは、細胞の付着のためのマトリックスを形成する、細菌により生産された有機骨格構造を破壊する。プロテアーゼ及びアミラーゼは歯垢の形成を予防するだけでなく、カルシウムに結合する炭水化物−タンパク質複合体を破壊することにより、鉱化を予防し、結石の発達も予防する。本発明の口腔ケア組成物から製造された練り歯磨きは典型的には次の成分を含む（最終練り歯磨き組成物の重量％で）研磨材料 10〜70％湿潤剤０〜80％増粘剤 0.1〜20％結合剤 0.01〜10％人工甘味料 0.1〜５％発泡剤０〜15％白化剤０〜５％酵素 0.0001〜20％。本発明の特定の態様では、口腔ケア製品は6.0〜約8.0の範囲のpHの練り歯磨きであって、ａ）10〜70％研磨材料ｂ）０〜80％湿潤剤ｃ） 0.1〜20％増粘剤ｄ）0.01〜10％結合剤ｅ） 0.1〜５％人工甘味料ｆ）０〜15％泡剤ｇ）０〜５％白化剤ｉ）0.0001〜20％酵素を含む。ｉ）に関する前記酵素は、上記ペシロミセス・リラシヌムのデキストラナーゼ及びムタナーゼ、及び任意に練り歯磨きに用いられることが公知の上記の他の型の酵素等を包含する。本発明の口腔ケア組成物から製造されたうがい薬は、典型的には次の成分（最終うがい薬組成物の重量％で)：０〜20％湿潤剤０〜２％界面活性剤０〜５％酵素０〜20％エタノール０〜２％他の成分（たとえば、香料、人工甘味料、活性成分、たとえば、フッ化物）０〜70％水を含む。うがい薬組成物は、適当な緩衝剤、たとえば、クエン酸またはリン酸ナトリウムでpH範囲６〜８で緩衝化することができる。うがい薬は希釈されていない形でよい（すなわち、使用前に希釈しなければならない）。前記関係する酵素は、上記ペシロミセス・リラシヌムのデキストラナーゼ及びムタナーゼ及び任意のうがい薬に用いられることが公知の上述の他の型の酵素を包含する。口腔ケア組成物または製品の使用第３の面で、本発明は歯垢の形成を予防または歯垢を除去するための本発明の口腔ケア組成物または本発明の口腔ケア製品の使用に関する。本発明の製品を用いることは、典型的には、安全で有効な量の前記製品を口腔に適用することを包含する。これらの量（たとえば、0.3〜約２ｇ）は、練り歯磨きまたは歯磨きゲルであるなら、口中で約15秒から約12時間維持される。製造方法本発明の口腔ケア組成物及び製品は、口腔製品の領域で一般的な方法を用いて作ることができる。材料及び方法材料ペシロミセス・リラシヌムにより生産されたデキストラナーゼ（ノボノルディスクアクティーゼルスカブから入手できる）トリコデルマ・ハーチアヌムCBS 243.71により生産されたムタナーゼ（ノボノルディスクアクティーゼルスカブから入手できる）微生物 OMZ 176として同定し得るストレプトコッカス・ミュータンス株CBS 350.71 アクチノミセス・ビスコサス（viscosus）DSM 43329 フソバクテリウム・ヌクレタム(Fusobacterium nucleatum)亜種ポリモルフューム(polymorphum)DSM 20482 溶液ブリトンーロビンソン緩衝液エリトロシンＢ（シグマ）機器彩度計 CR−200(ミノルタ) ヒドロキシアパタイト円盤の製造 250mgのヒドロキシアパタイトを円盤型中で約5,900kg(13,000l ｂ）の圧力で５分間圧縮することにより、ヒドロキシアパタイト円盤を製造する。次に円盤を600℃で４時間焼成し、最後に殺菌された脱イオン水で水和する。ヒドロキシアパタイト円盤の殺菌ヒドロキシアパタイトの円盤を180℃で２時間殺菌し、殺菌された脱イオン水で水和し、ヌンク（Nunc）管（容積10ml）の蓋の中に入れる。ミュータンの製造ストレプトコッカス・ミュータンスCBS 350.71をpH6.5，35℃（一定に保たれた）で、次の組成物、 NZ−Case 6.5ｇ／ｌイースト抽出物６ｇ／ｌ (NH₄)₂SO₄ 20ｇ／ｌ K₂PO₄ ３ｇ／ｌグルコース 50ｇ／ｌプルローニックPE6100 0.1％からなる培地中で75rpmの通気速度で増殖させることにより製造する。 35時間後、スクロースを最終濃度である60ｇ／ｌまで加え、グルコシルトランスフェラーゼを誘発する。総発酵時間は75時間である。発酵からの上清を遠心分離し、ろ過する（殺菌）。次に、スクロースを上清に５％の最終濃度（pHを酢酸でpH7.0に調整する）まで加え、溶液を37℃で１晩撹拌する。溶液をろ過し、不溶性のミュータンをプロペクス（propex）上で収集し、１％の安息香酸を含有するpH５（酢酸で調整）の脱イオン水で広範囲にわたって洗浄する。最後に不溶性のミュータンを凍結乾燥し、粉にする。デキストラナーゼ活性(KDU)の測定１キロノボデキストラナーゼ単位(１KDU)は、次の標準条件；基質デキストラン500(ファルマシア) 反応時間 20分間温度 40℃ pH 5.4 に基づく、デキストラナーゼの測定のためのノボノルディスクの方法で、デキストランを分解して１時間当り１ｇのマルトースに等しい還元糖を生成する酵素の量である。ノボノルディスクの分析方法(AF120)の詳細な説明は請求があり次第渡します。ムタナーゼ活性（MU）の測定１ムタナーゼ単位（MU）は標準条件下で、１分当り１μモルの還元糖（グルコースとして計算）を遊離する酵素の量である。標準条件基質 1.5％ミュータン反応時間 15分間温度 40℃ pH 5.5 ノボノルディスクの分析方法（AF 180／1−GB)の詳細な説明は請求があり次第ノボノルディスクアクティーゼルスカブから渡します。ガラス壁に付着したミュータンの調製ストレプトコッカス・ミュータンスOMZ 176(CBS 350.71)を２％のスクロースを有する10mlのトッドヘウィットブロスを含有するガラス管(直径22mm×高さ150mm)に接種し、管を37℃で１晩そのままにしておいた。ブロスを捨て、ガラス壁に付着したミュータンとストレプトコッカス・ミュータンス細胞を10mlの0.85％NaCl溶液で２回洗浄する。歯垢除去効果の評価歯垢除去効果を評価するために用いられた方法は日本特許第2250816号に花王が記載している方法に基づく。本方法によると、３株の微生物（ストレプトコッカス・ミュータンス、アクチオミセス・ビスコサス及びフソバクテリウム・ヌクレタム）を含むバイオフィルムでヒドロキシアパタイト円盤を被覆する。歯垢除去効果を試験するために、PBS中の0.1％のエリトロシンＢをヒドロキシアパタイト円盤上に存在する歯垢を赤く染めるのに用いる。赤色の強さ（すなわち、ａ^*）を彩度計CR−200で測定する。最大ａ^*値は60である。それより低い値は強くない赤色（すなわち、存在する歯垢が少ない）を示す。ａ^*値が０と測定されたなら、赤色は存在しない（すなわち、歯垢がない）。例例１ 5.0 〜8.0のpHでのミュータンの加水分解「材料と方法」の項に記載のように製造したミュータンを16mg／mlの濃度で超音波機を用いて脱イオン水中に分散させて基質懸濁液を調製した。 0.05M酢酸緩衝液中に溶解したペシロミセス・リラシヌムのムタナーゼ及びトリコデルマ・ハーチアヌムCBS 243.71のデキストラナーゼを脱イオン水で希釈した。次の酵素溶液を調製した。 − デキストラナーゼ溶液（4KDU／ml） − ムタナーゼ溶液（4MU／ml）及び − 混合酵素溶液（4KDU及び４MU／ml）。さらに、5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5及び8.0に調整したpHの50mMのブリトン−ロビンソン緩衝溶液も調製した。次に、250μｌの上記酵素溶液及び500μｌの緩衝液をミクロ遠心管中で混合した。その直後に250μｌの調製されたミュータン懸濁液を加え、シエーカー中で最大速度で37℃でインキュベートした。正確に30分後、250μｌの0.5ＮのHClを加え、酵素反応を停止した。各反応混合物を遠心分離にかけた。得られた上清中に溶解化された糖をアントロン反応方法によって測定した（J．Ｈ．Roe，「J.Bi ol．Chem.」212，p.335，1955年）。実験の結果を図１に示す。図１から理解できるように、デキストラナーゼ及びムタナーゼの併用は、pH5.0〜8.0内でミュータンを加水分解する時相乗効果を与える。例２ pH7.0 でのガラス壁に付着したミュータンの加水分解歯の表面に付着する歯垢をまねするために、ミュータンを付着させたガラス管を上記「材料及び方法」の項で上述されているように調製した。 0.05Mの酢酸緩衝液に溶解された、次のムタナーゼ溶液及びデキストラナーゼ溶液を30mMのブリトン−ロビソン緩衝液(pH7.0)で希釈した。 − デキストラナーゼ溶液（１KDU／ml） − ムタナーゼ溶液（１ＭＵ／ml）及び − 混合デキストラナーゼ及びムタナーゼ溶液（１KDU及び１MU／ml。実験の前に37℃で15分間インキュベートした。５mlの上記酵素各溶液をミュータンを付着させたガラス管に注いだ。ガラス管を37℃でインキュベートした。０時間対照の1000μｌを直ちに取り出し、500μｌの0.5ＮのHClを混合して酵素反応を停止させた。５，10，15，30分で、1000μｌの試料を取り出し、直ちに 500μｌ0.5ＮのHClと混合した。各反応混合物を遠心分離にかけた。得られた上清中に溶解化された糖を例１と同じ方法で測定した。実験の結果を図２に示す。図２から分かるように、デキストラナーゼ及びムタナーゼの併用は、pH７でガラス壁に付着したミュータンを加水分解した時、相乗効果を与える。例３ pH7.0 での歯垢除去効果３つの口腔微生物、それぞれ、ストレプトコッカス・ミュータンス、アクチノミセス・ビスコサス及びフソバクテリウム・ヌクレタムを37℃で３日間、嫌気的に培養した。殺菌した唾液で被覆したヒドロキシアパタイトの円盤を、経口バイオフィルムが唾液で被覆したヒドロキシアパタイト円盤上に生成するように培養の間、培養ブロス中に含浸させた。培養の後、円盤をリン酸緩衝化塩類液で簡単にすすぎ、次いで、表に示された40mMのブリトン−ロビンソン緩衝液pH7.0中で調製した酵素溶液で、37℃で20分間処理した。円盤をPBSで簡単にすすぎ、次に0.1％のエリトロシンＢのPBS 溶液１ml中で１分間インキュベートし、ヒドロキシアパタイト上に存在する歯垢を赤く染める。円盤を１晩空気乾燥した。赤色（すなわち、α^*）の強さを彩度計CR−200で測定した。α^*値が高い程、ヒドロキシアパタイト円盤が赤い。エリトロシンＢ溶液を取り除き、円盤をPBSで数分間すすいだ。試験の結果を図３に示す。１KDU／mlのデキストラナーゼ及び１MU／mlのムスタナーゼで処理したヒドロキシアパタイトの円盤は、デキストラナーゼ及びムタナーゼを別々に用いたよりも効率的に歯垢を除去することが分かる。デキストラナーゼ及びムタナーゼの組み合わせはpH7.0での歯垢除去効果に相乗効果を有している。本明細書に記載し、かつ請求した発明は、本明細書に開示された特定の態様により、その範囲を限定されるべきではない。というのは、これらの態様は本発明のいくつかの観点の説明を意図しているからだ。あらゆる均等の態様がこの発明の範囲内にあることを意図しているからである。実際、本明細書に示し及び開示されたものに加えて、種々の本発明の変形が前述の記載から当業者に明らかになるだろう。上記の変形も添付の請求の範囲内に入ることを意図している。種々の参考文献を本明細書に引用しており、その開示を参照によりその全体を組み入れるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年５月２０日（１９９８．５．２０）【補正内容】請求の範囲 1. ペシロミセス・リラシヌムのデキストラナーゼ及びムタナーゼを含む、pH 6.0〜8.0の範囲内の口腔ケア組成物。 2. 前記デキストラナーゼがペシロミセス属、特にペシロミセス・リラシナムから由来する請求項１記載の口腔ケア組成物。 3. 請求項１及び２に記載の口腔ケア組成物であって、前記ムタナーゼが、トリコデルマ属、特にトリコデルマ・ハーチアナム、トリコデルマ・ハーチナムCB S 243.71またはペニシリウム属、特にペニシリウム・フニキュロサム、特にペニシリウム・フニキュロナムNRRL 1768、またはペニシリウム・リラシナム、特にペニシリウム・リラシヌムNRRL 896、ペニシリウム・プルプロジヌム、たとえば、ペニシリウム・プルプロジヌムCBS 238.95株またはシュードモナス属の株、またはフラボバクテリウム種の株またはバシラス・サーキュランスの株、またはアスペルギルス種の株またはストレプトミセス属の株から由来するものである、前記組成物。 4. 前記ムタナーゼが組み換え体である、請求項３の口腔ケア組成物。 5. 前記酵素が20℃〜40℃、特に37℃付近の温度の組成物中で活性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の口腔ケア組成物。 6. さらに、プロテアーゼ、たとえば、パパイン、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びそれらの混合物の群から選択される酵素を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の口腔ケア組成物。 7. 請求項１〜６のいずれかに記載の口腔ケア組成物を含む口腔ケア製品。 8. 歯磨き、たとえば、練り歯磨き、歯磨き粉またはうがい薬である、請求項７に記載の口腔ケア製品。 9. 前記製品が、6.0〜約８の範囲のpHを有している、練り歯磨きまたはうがい薬である、請求項８に記載の口腔ケア製品。 10．請求項１〜６の組成物または請求項７〜９に記載の口腔ケア製品の歯垢の形成を予防または歯垢を除去するための使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】 1. ペシロミセス・リラシヌムのデキストラナーゼ及びムタナーゼを含む口腔ケア組成物。 2. pHが6.0〜8.0の範囲内にある請求項１に記載の口腔ケア組成物。 3. 前記デキストラナーゼがペシロミセス属、特にペシロミセス・リラシナムから由来する請求項ｌ及び２記載の口腔ケア組成物。 4. 請求項１〜３に記載の口腔ケア組成物であって、前記ムタナーゼが、トリコデルマ属、特にトリコデルマ・ハーチアナム、トリコデルマ・ハーチナムCBS 243.71またはペニシリウム属、特にペニシリウム・フニキュロサム、特にペニシリウム・フニキュロナムNRRL 1768またはペニシリウム・リラシナム、特にペニシリウム・リラシヌムNRRL 896、ペニシリウム・プルプロジヌム、たとえば、ペニシリウム・プルプロジヌムCBS 238.95株またはシュードモナス属の株、またはフラボバクテリウム種の株またはバシラス・サーキュランスの株、またはアスペルギルス種の株またはストレプトミセス属の株から由来するものである、前記組成物。 5. 前記ムタナーゼが組み換え体である、請求項４の口腔ケア組成物。 6. 前記酵素が20℃〜40℃、特に37℃付近の温度の組成物中で活性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の口腔ケア組成物。 7. さらに、プロテアーゼ、たとえば、パパイン、エンドグルコシダーゼ、リパーゼ、アミラーゼ及びそれらの混合物の群から選択される酵素を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の口腔ケア組成物。 8. 請求項１〜７のいずれかに記載の口腔ケア組成物を含む口腔ケア製品。 9. 歯磨き、たとえば、練り歯磨き、歯磨き粉またはうがい薬である、請求項８に記載の口腔ケア製品。 10．前記製品が、6.0〜約８の範囲のpHを有している、練り歯磨きまたはうがい薬である、請求項９に記載の口腔ケア製品。 11．請求項１〜７の組成物または請求項8〜10に記載の口腔ケア製品の歯垢の形成を予防または歯垢を除去するための使用。