JPH11502527A

JPH11502527A - 口内ケア組成物

Info

Publication number: JPH11502527A
Application number: JP8528811A
Authority: JP
Inventors: エム．クリステンセン，フレミング
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1995-03-28
Filing date: 1996-03-28
Publication date: 1999-03-02
Also published as: CA2216928A1; AU5142896A; WO1996029978A1; KR19980703322A; CN1182359A; EP0817606A1; MX9707377A; BR9607778A

Abstract

(57)【要約】本発明は口内ケア組成物及び製品、例えば歯みがき剤に関する。本発明に従うと、口内ケア組成物及び製品は、その口内ケア組成物及び製品が存在しないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性であるプロテアーゼを好適に含んで成りうる。更に、本発明は、例えば口内ケア組成物又は製品における、口内の自然な環境において実質的に不活性であるプロテアーゼの利用に関する。本発明の最終目的は前記口内ケア製品を利用するための方法の提供にある。

Description

【発明の詳細な説明】口内ケア組成物発明の分野本発明は所定のプロテアーゼを含んで成る口内ケア組成物及び製品に関する。更に、例えば口内ケア目的のための前記プロテアーゼの利用及び本発明の口内ケア製品を利用するための方法も考慮する。発明の背景子供ができたばかりの親にとっての大きなイベントの一つはその赤ん坊の口内の乳歯の出現である。その日からめんどうをみる親にとって、その赤ん坊のめんどうの当然なる一部に歯のケアが含まれる。人生において例えば食品をかむ能力が十分に保証されるには、歯を良好な状態に保つこと及び良好な口内衛生を得る必要がある。良好な歯科及び口内衛生を得る及び維持するには、歯は練り歯みがき粉等を利用して少なくとも１日１回みがかなければならない。更に、口をマウスウォッシュで規則的にすすぐべきである。歯みがきは主に歯から食品粒子を除去するのに役立ち、そして歯に穴をあけてしまい得る虫歯を防ぎ、更には歯の病気を防ぐうえでの重要な第一段階である。歯垢及び歯石の形成、口内病の発症、茶、コーヒー及び喫煙に由来する染みの付着、等であって例えばほほ笑んだときに良好な外観を得る基本を失わせるであろうことを防ぐために良好な歯の衛生が獲得されるべきでもある。更に、ほとんどの人は一般に悪臭を帯びた吐気、又は例えば時たまのにんにく臭の吐気を嫌がることから、口内ケア製品を利用して例えばフレッシュな吐気を得る及び／又は維持することで数多くの望ましくない事項が避けられうる。虫歯、歯垢及び歯石一般に、虫歯はう食原性微生物、例えばストレプトコッカス・ミュータンス（ Streptococcus mutans）又はストレプトコッカス・サンギュイス（S．Sanguis）が口腔内で増殖したときに発症する。食品に由来するスクロースは例えば上記のう食原性微生物により生産されるグルコシルトランスフェラーゼ(GTF)により水溶性且つ不溶性の多糖類へと変換しうる。これらの多糖類はう食原性微生物及びその他の細菌の表層を履い、そして最後に歯の表層に付着して歯垢を形成する。歯垢の中に含まれている細菌は多糖類を酸、例えば乳酸へと分化し得、そして歯に穴をもたらしうる。歯垢が蓄積し続けると、石のように固い白色又は黄色味を帯びた沈着物となりうる。これらの沈着物は石灰化歯垢、石又は歯石と呼ばれ、そして歯垢及び鉱物、例えば、特にカルシウムに由来して唾液で形成される。歯肉の下での歯石の蓄積は歯周病をひき起こしうる。虫歯、歯垢及び歯石の形成を防ぐため、酵素、例えばプロテアーゼ、グルコースオキシダーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼを含んで成る口内ケア組成物及び製品が提案されている。タンパク質分解酵素の利用は今日、歯の清掃に関連して効果的に利用されており、そして例えばタンパク質を含む食品残渣を除去するため、並びにぞうげ質及びエナメル質に付着する歯石のタンパク質性マトリックスを溶解するために、口内ケア製品に関しても提案されている。しかしながら、口内ケア製品におけるその利用は成功を収めておらず、なぜならその利用は重大な不利益に結びつくからである。第一に、プロテアーゼは、口内の歯肉（及び歯）に対し、それらに長期間曝露せしめたとき、損傷を及ぼす。更に、ほとんどのプロテアーゼは、口内ケア組成物において好適に利用されうるH₂O₂の如き化合物により阻害される。口内ケア組成物及び製品のための提案のタンパク質分解酵素の例にはカルボキシペプチダーゼ、ペプシン、トリプシン、膵臓キモトリプシン、カテプシン、パパイン及び所定の菌類由来プロテアーゼが含まれる（例えばDE特許第734,765 号及びGB特許第1,033,229 号参照のこと）。英国特許GB第1,197,164 号は治療剤としてのバチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)由来のタンパク質分解酵素を含んで成る歯科ケア及び／又は口内ケアについての製剤に関する。このタンパク質分解酵素の利用は貯蔵安定性を向上させる。米国特許US第3,194,738 号及び仏国特許FR1,377,415 号は歯みがき粉、チューイングガム及びマウスウォッシュのためのタンパク質分解及びアミロース分解活性を有するアスペルギルス・オリザ（Aspergillus orizae）由来の酵素の利用を提案している。仏国特許第1,448,385 号はタンパク質分解酵素、例えば動物由来のカルボキシペプチダーゼ、ペプシン、トリプシン、膵臓キモトリプシン、カテプシン、及び植物源のパパイン、並びにその他の酵素、例えばリパーゼを含んで成る口内ケア製品を考慮している。米国特許US第4,364,926 号（Yokogawaら）は虫歯を予防するのに有用な新規のアルカリプロテアーゼＭ₃を開示している。このプロテアーゼは９〜12.5の強アルカリ至適pHを有し、数多くの化学化合物により阻害されず、そしてグルコシルトランスフェラーゼ（GTF）阻害活性をもつ。米国特許US第4,986,981 号（Glace ら）は低研磨力を有するpH中性歯みがき粉に関する。この歯みがき粉はパパインを、歯垢、ムチン及び歯石を効果的に清掃すると記載されている量で含んで成る。従来技術の論述プロテアーゼを含んで成る口内ケア製品は口内出血を及ぼし得、そして口内の粘膜を損用又は刺激しうる。水で口をすすいだ後でさえも、少量のプロテアーゼはかかる危険性を及ぼす。従って、口内に損傷を及ぼす危険性の全くないプロテアーゼを含んで成る口内ケア組成物及び製品を提供できることが所望される。発明の概要本発明の目的は、活性口内ケア成分としてプロテアーゼを含んで成り、口腔において損傷又は刺激を全く及ぼすことのない、歯みがき組成物の如き口内ケア組成物及び製品を提供することにより、上記の問題を解決することにある。第一の観点において、本発明はプロテアーゼを含んで成る口内ケア組成物に関連し、このプロテアーゼは口内の自然な環境においては実質的に不活性である。更に、本発明は、口内ケア製品、例えば練り歯みがき粉及びマウスウォッシュであって本発明の口内ケア組成物を含んで成る又はその口内ケア組成物もしくは製品がないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性である本質的に精製されたプロテアーゼを含んで成る製品に関する。本発明の別の目的は、口内の自然な環境において実質的に不活性なプロテアーゼの、例えば口内ケア組成物及び製品における利用である。本発明の最後の目的は、前記口内ケア製品を利用するための方法の提供にある。図面の簡単な説明図１はWO95/02044に記載のプロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIのpH活性プロフィールを示す。図２は、３％のH₂O₂溶液、pH3.5、４時間、25℃において、スブチリシン・カールスバーグ（Subtilisin Carlsberg）の活性との対比における、WO95/02044記載のプロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIのタンパク質除去能力を示す。発明の詳細な説明本発明はプロテアーゼを含んで成る口内ケア組成物及び製品に関する上記の問題を解決する。本発明者は所定のプロテアーゼが口内ケア組成物及び製品において好適に利用できうることを認識した。口内ケア組成物及び製品の利用の際、口内洗浄及び／又は処置過程を促進するため、口内において適切な環境が規定及び作り上げられる。従来技術に関連する問題の一つとして、口内ケア組成物及び製品におけるプロテアーゼの利用は使用後のプロテアーゼの活性に関係し、口内の自然な環境において実質的に不活性なプロテアーゼが有用でありうる。本発明に従うと、プロテアーゼの不活性化を司るパラメーターは任意の物理的なパラメーター、例えばpH、温度、湿度、イオン強度等でありうる。しかしながら、特にpHが考慮され、なぜならそれは比較的コントロールし易いパラメーターだからである。口内の自然なpHは約６〜８の範囲、特に約6.4〜7.0 （唾液のpH）の範囲にあることを念頭に入れ、このpH減において不活性なプロテアーゼは口内に損傷又は刺激を全く及ぼさない。プロテアーゼの好都合な公知の口内ケア作用は、プロテアーゼが適切な活性を有する適切なpHへと口内のpHを調整することにより活性化し得る。従って、もしプロテアーゼが酸性環境において活性なら、口内のpHを下げるべきである。これは口内ケア組成物又は製品に適当なpH下降剤を加えることにより成し遂げられうる。しかしながら、もし口内ケア組成物又は製品のpH自体が酸性なら、pHの調整は不要である。もしプロテアーゼがアルカリ性環境において活性なら、pHは例えばpH上昇剤の添加により（必要なら）高めなければならない。プロテアーゼ含有口内ケア製品を用いた後に口を水ですすぐとき、ほとんどのプロテアーゼは口から除去されるであろう。しかしながら、たとえ少量の残留活性プロテアーゼでさえも口に損傷を及ぼしうる。本発明の組成物を含んで成る口内ケア組成物を利用することにより、かかる損傷は回避でき、なぜならかかる組成物は、口内ケア組成物又は製品により作り出されるpHにてのみ活性であり、そして口内の自然な環境では実質的に不活性だからである。口を水ですすいだ後、 pHは短時間で、プロテアーゼを不活性化する約6.4〜7.0 のpH（唾液のpH）にもどるであろう。その結果、任意の量の残留プロテアーゼは口内に害を及ぼさないであろう。その結果、本発明の第一の観点はプロテアーゼを含んで成る口内ケア組成物の提供にあり、ここでこのプロテアーゼは、その口内ケア組成物がないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性である。本発明に従い、このプロテアーゼは口内ケア組成物の使用中、例えば歯みがき又は口内洗浄との関連において、活性であると理解されるべきである。使用後、口内の環境が自然な状態に、即ち、唾液により作り上げられる環境にもどると、口内の任意の活性プロテアーゼ残留物は不活性化するであろう。このもどりは口を水ですすぐことにより任意的に早まりうる。好適な環境において、前記プロテアーゼは、この口内ケア組成物がないとき、口内の自然なpH環境において実質的に不活性である。上記の通り、唾液のpHは約6.4〜7.0 に範囲する。しかしながら、口内のpHは例えば食事又は飲料との関連で多少上下しうる。従って、約pH７近辺で、より良くは約6.4〜7.0 のpH範囲において、そして更により良くは約pH６〜８のpH範囲において実質的に不活性なプロテアーゼは本発明の口内ケア組成物又は製品においてプロテアーゼ成分として使用されうる。前記範囲外の適当な比活性（70％以上）を有するプロテアーゼが好ましい。口内の温度は通常20℃〜37℃の範囲である。従って、この温度間隔において高い比活性（70％以上）を有するプロテアーゼは本発明に従い好適である。しかしながら、この温度間隔において口内で活性な全てのプロテアーゼが本発明に考慮される。上記で用いている文書「実質的に不活性」とは、pHが７近辺にあるとき、好ましくは唾液のpH範囲（約pH6.4〜7.0）にあるとき、より好ましくは約６〜８のpH 範囲にあるとき、プロテアーゼが口内に損傷又は刺激を全く及ぼさないほどに低い活性を有するプロテアーゼと定義する。より詳しくは、このことは、上記のpH範囲において、プロテアーゼ比活性（方法と材料の章に記載のプロテアーゼ活性より決定）は、至適pHでのタンパク質分解活性に基づき、約70％を超えてはならず、そして好ましくは約50％以下、より好ましくは約30％以下、特に約10％以下、更により良くは約５％以下、例えば２％以下であるべきであることを意味する。本発明の態様において、本発明の組成物において用いられるプロテアーゼは微生物、例えば細菌又は菌類微生物に由来する。本発明に特に考慮されるのは、バチルス２種の株、特にバチルス・スブチリスの株、又はリゾプス（Rhizopus）種の菌類株、特にＲ．ニベウス(R．niveus)の株、又はシタリジウム（Schytalidium）種の株、又はスルホロブス(Sulpholobus )種の株、又はサーモプラスマ（Thermoplasma）種の株、又はアスペルギルス（A spergillus）種の株、特にＡ．アキュレアトゥス（A．aculeatus）、もしくはＡ．ニガー（A．niger）、もしくはＡ．アワモリ（A．awamori）、もしくはＡ．オリザの株、又はトリコデルマ(trichoderma)種の株、特にＴ．ハルジアヌム（T． harzianum）、もしくはＴ．リージー(T．reesie)の株、又はフサリウム（Fusari um）種の株、特にＦ．オキシスポルム（F．oxysporum）の株、又はフミコラ（Hu micola）種の株に由来するプロテアーゼである。本発明に従うと、このプロテアーゼはプロテアーゼの群（即ち、Recommendati ons（1992）of the International Union of Biochemistry and Molecular Biol ogy（IUBMB）に従い、酵素分類番号 E.C.3.4に分類される酵素）における酸性又はアルカリ性プロテアーゼのいづれかであって、この口内ケア組成物又は製品がないときに口内の自然な環境において実質的に不活性である酵素でありうる。更に、本発明の目的のためにデザインされた遺伝子的に改良されたプロテアーゼも考慮される。前記改良プロテアーゼは適当なpHプロフィールを有するプロテアーゼ変異体のスクリーニングにより選定できうる。前記変異体は例えばEP 130 .756(Genecor)もしくはEP 479.80（Novo Nordisk A/S）に記載の部位特異的又はカセット突然変異誘発；又は当業界においてよく確立された方法を利用することによるランダム突然変異誘発により供される。本発明の特定の態様において、プロテアーゼは約pH５において至適pHプロテアーゼ活性を有する。かかるプロテアーゼの特定の実施例はWO95/02044（Novo Nordisk A/S）にそれぞれ記載のプロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIで例示される。これらの酸性プロテアーゼは、口内の自然なpH環境を含む口内の自然な環境において実質的に不活性である。プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIは予測よりも驚くべきほどに優れ、なぜならこれらのプロテアーゼは口内の自然な環境において実質的に不活性だからである。プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIは約pH６〜８のpH範囲において実質的に不活性であり、そして約6.4〜7.0 のpH範囲において50％以下のプロテアーゼ比活性を有する。約pH７近辺において、プロテアーゼ比活性はプロテアーゼＩについてはほとんどなく、そしてプロテアーゼIIについては著しく低下している（図１及び実施例１参照）。更に、プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIは３％ほどの高さのH₂O₂の存在下で良好なタンパク質除去活性を有する（図２及び実施例２参照）。これは好都合であり、なぜならH₂O₂は口内ケア製品、例えば歯みがき粉において、例えばホワイトニング／漂白剤として使用されるからである。プロテアーゼは、本発明との関係において、それが３％のH₂O₂において同一の条件でスブチリシン−カールスバーグ（Novo Nordisk A/SよりAlcalase（登録商標）として入手可能）よりも表面から有意に多くのタンパク質を除去できるなら、「良好なタンパク質除去活性」を有するものと認められる。本発明の口内ケア組成物又は製品において必要なプロテアーゼの量は使用する特定の化合物に依存するが、しかしながら一般には最終製品の0.0001〜20重量％、好ましくは約0.001〜約10重量％、そして最も好ましくは約0.01〜約５重量％に範囲する。口内ケア組成物又は製品の調製において、プロテアーゼは本質的に精製された単一成分酵素調製品として、例えばWO95/02044（Novo Nordisk A/S）に記載のプロテアーゼの一つを含む酵素調製品として加えるが、しかし少なくとも一種のその他の活性を発揮する酵素調製品として加えてもよい。考慮される活性には、還元酵素の活性、例えばペルオキシダーゼ、そして更にはムタナーゼ、デキストラナーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、グルコースオキシダーゼ活性、並びにヒト、及び動物、例えばイヌ又はネコの口内における自然な環境において実質的に不活性であるプロテアーゼに富む微生物ポリペプチドが含まれる。本発明の好適な態様において、口内ケア組成物はプロテアーゼデキストラナーゼ及び／又はムタナーゼ活性を含んで成る。本発明に係る口内ケア組成物は好都合には任意の物理形態（即ち、粉末、ペースト、ゲル、液体、オイントメント、錠剤、等）を有する口内ケア製品を製造するために利用されうる。前記「口内ケア製品」はヒト及び動物の口内の口内衛生を維持及び／もしくは改善、並びに／又は歯の病気を予防もしくは処置するために効果的に利用できうる製品と定義される。かかる口内ケア製品の例には練り歯みがき粉、歯科クリーム、ゲルもしくは歯みがき粉、オドンチック、マウスウォッシュ、歯みがき前又は後のすすぎ製剤、チューイングガム、ロゼンジ及びキャンディーが含まれる。練り歯みがき粉及び歯科用ゲルは一般に研磨材、発泡剤、風味料、湿潤剤、結合剤、塩粘剤、甘味料、ホワイトニング／漂白／染み除去剤、及び水を含む。歯垢除去液を含むマウスウォッシュは一般に水／アルコール溶液、風味料、湿潤剤、甘味料、発泡剤及び着色剤を含んで成る。本発明に従うと、前記研磨材にはアルミナ及びその水和物、例えばアルファ− アルミナ三水和物、三珪酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、カオリン、アルミノ珪酸塩、例えば石灰化珪酸アルミニウム及び珪酸アルミニウム、炭酸カルシウム、珪酸ジルコニア、そして更には粉末状プラスチック、例えばポリビニルクロリド、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フェノール−ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、尿素−ホルムアルデヒド樹脂、エポキシ樹脂、粉末ポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル及びエアロゲル等が含まれる。更に研磨材として適当なのはピロリン酸カルシウム、水不溶性アルカリメタリン酸塩、リン酸二カルシウム及び／又はその二水和物、オルトリン酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、粒状ヒドロキシアパタイト等である。更に、これらの物質の混合物も使用可能である。口内ケア製品に依存して、研磨製品は０〜70重量％、好ましくは１〜70重量％において存在しうる。練り歯みがき粉に関し、研磨材含有量は一般に最終練り歯みがき製品の10〜70重量％に範囲する。湿潤剤は例えば練り歯みがき粉からの水の損失を防ぐために利用される。本発明に係る口内ケア製品において使用するために適当な湿潤剤には下記の化合物及びそれらの混合物が含まれる；グリセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（PEG）、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４−プタンジオール、水素化部分加水分解多糖類等。湿潤剤は一般に練り歯みがき粉の中で０〜80重量％、好ましくは５〜70重量％で存在する。シリカ、デンプン、トラガカントガム、キサンタンガム、アイリッシュモスの抽出物、アルギネート、ペクチン、セルロース誘導体、例えばヒドロキシエチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース、ポリアクリル酸及びその塩、ポリビニルピロリドンが適当な塩粘剤及び結合剤の例として挙げることができ、それらは歯みがき製品の安定化に役立つ。塩粘剤は練り歯みがきクリーム及びゲルの中で、最終製品の0.1〜20重量％で、そして結合剤は0.01〜10重量％程度の量で存在していてよい。発泡剤として、石けん、陰イオン、陽イオン、非イオン、両性及び／又は双イオン性界面活性剤を使用してよい。これらは最終製品の０〜15重量％、好ましくは0.1〜13重量％、より好ましくは0.25〜10重量％のレベルで存在しうる。界面活性剤は本プロテアーゼに不活性的な効果を及ぼさない程度のみが適当である。界面活性剤には脂肪アルコール硫酸塩、10〜20個の炭素原子を有するスルホン化モノグリセリド又は脂肪酸の塩、脂肪酸アルブメン縮合生成物、脂肪酸アミドとタウリンとの塩、及び／又はイソチオニン酸の脂肪酸エステルの塩が含まれる。適当な甘味料にはサッカリンが含まれる。風味料、例えばスペアミントは通常少ない量、例えば0.01〜約５重量％、特に 0.1〜５重量％で存在する。ホワイトニング／漂白剤にはH₂O₂が含まれ、そして最終製品の重量に基づいて計算して、５％未満、好ましくは0.25〜４重量％の量で加えてよい。水は通常練り歯みがき粉に流動性形態を授ける量で加える。更に水溶性抗菌剤、例えばクロルヘキシジンジグルコネート、ヘキセチジン、アルキシジン、第四級アンモニウム抗菌化合物、及び亜鉛、銅、銀及びすずの如き所定の金属イオンの水溶性根（例えば塩化亜鉛、銅及びすず、並びに硫酸銀）も含ませてよい。本発明に更に考慮されるのは抗石灰化剤、抗歯垢剤、フッ化物源として使用できうる化合物、着色料、保存剤、ビタミン類、pH調整剤、抗カリエス剤、減感剤等の添加である。本発明の口内ケア組成物から作った練り歯みがき粉は（最終練り歯みがき組成物の重量において）、例えば以下の成分を含んで成りうる；研磨材 10 〜70％湿潤剤 0 〜80％塩粘剤 0.1 〜20％結合剤 0.01 〜10％甘味料 0.1 〜 5％発泡剤 0 〜15％ホワイトナー 0 〜 5％（本発明に係る）プロテアーゼ 0.0001〜20％その他の酵素 0 〜20％本発明のその他の目的は、口内の自然な環境において実質的に不活性であるプロテアーゼの、口内ケア組成物及び製品における利用に関する。好適な態様において、このプロテアーゼは口内の自然なpH環境、約pH７近辺、好ましくは約6.4〜7.0 のpH範囲、そして更により良くは約６〜８のpH範囲において実質的に不活性である。最後に、本発明は本発明の口内ケア製品を利用するための方法であってａ）口内ケア製品を口の中に入れる；ｂ）歯及び／又は歯肉と一定時間接触させる；ｃ）歯から除去する；そしてｄ）任意的に液体ですすぐ、方法に関する。使用する口内ケア製品が固体〜流動形態の場合、この口内ケア製品を歯及び／又は歯肉と接触させるために歯ブラシ等が好適に使用されうる。液状口内ケア製品の場合、接触は口のすすぎにより行われうる。段階ｂ）の接触時間は任意的である。しかしながら、口内ケア製品の約１〜５分の歯及び／又は歯肉との接触が所望の結果を得るために通常十分であろう。使用後、この口内ケア製品は任意の適当な方法、例えば吐き出すことにより口から除去されうる。任意的に、口を液体、例えば水道水ですすいでよい。これは口内の環境、例えばpH環境が短時間で通常の状態にもどることを保証するであろう。材料と方法材料プロテアーゼＩはWO95/02044に記載されている。プロテアーゼIIはWO95/02044に記載されている。スブチリシン・カールスバーグはNovo Nordisk A/SよりAlcalase（登録商標）として入手できる。方法タンパク質分解酵素１ヘモグロビンプロテアーゼ単位(hpu)は下記の標準条件下で１分内当り１mmo le の第一アミノ基を遊離する酵素の料（セリン標準品との対比により決定）と定義される：２％(w/v)のヘモグロビン溶液（牛：Sigma より供給）はpH5.5に調整したBrit ton and Robinson J．Chem．Soc.，1931，P.145、に記載の万能バッファーで調製する。２mlの基質溶液を湯浴の中で25℃で10分プレインキュベートする。６ｇ／mlの酵素調製品を含む酵素溶液１ml（約0.2〜0.3hpu／１mlの万能バッファー( pH5.5)に相当）を加える。25℃で30分のインキュベーション後、クエンチング剤（17.9ｇのトリクロロ酢酸、29.9ｇの酢酸ナトリウム及び19.8ｇの酢酸を含み、脱イオン水で500 mlに調整した溶液５ml）の添加により反応を停止する。酵素溶液の前にクエンチング剤を添加したことを除き試験溶液と同一の方法でブランクを調製する。反応混合物の湯浴の中で20分保ち、その後それらをWhatman 42ろ紙でろ過する。第一アミノ基は以下の通りにして、０−フタルジアルデヒド(OPA)によるその発色により決定する。7.62ｇの四硼酸二ナトリウム十水和物及び2.0 ｇのドデシル硫酸ナトリウムを150 mlの水に溶かす。４mlのメタノールに溶解しておいた16 0 mgのOPA を400 μｌのβ−メルカプトエタノールと一緒に加え、次いでその溶液を水で200mlにする。３mlのOPA 試薬に400 μｌの上記で得られるろ液を混合しながら加える。340 nmでの光学密度（OD）を約５分後に測定する。OPA 試験は 100 mlの万能バッファー(pH5.5)中の10mgのセリンを含むセリン標準品でも実施する。バッファーのみをブランクとして用いる。プロテアーゼ活性は以下の式によりOD測定値から計算する：（式中、OD_t，OD_b，OD_ser，及びOD_Bは、それぞれ試験溶液、ブランク、セリン標準品及びブランクの光学密度であり、Ｃ_serは標準品中のセリンの濃度であり（m g／ml）、そしてMW_serはセリンの分子量である（105.0 の）。Ｑは酵素溶液の希釈係数であり（この場合８）、そしてｔ_iは分おけるインキュベーション時間である（この場合30分）。実施例実施例１活性プロフィール本発明の口内ケア組成物及び製品のための適当なプロテアーゼの存在を例証するため、WO95/02044に記載のプロテアーゼＩ及びIIの相対率におけるpH活性プロフィールを決定した。図１からわかる通り、プロテアーゼ比活性はプロテアーゼＩについてはpH７で消失し、そしてプロテアーゼIIについては著しく低下した。実施例２３％のH₂O₂の中でのプロテアーゼ活性口内ケア製品における適当なプロテアーゼの有用な効果を例証するため、３％のH₂O₂の溶液の中で、25℃で、４時間、pH3.5 において表面からタンパク質を除去する能力を試験した。WO95/02044に記載のプロテアーゼＩ及びプロテアーゼII の能力をスブチリシン・カールスバーグと対比させた。図２からわかる通り、プロテアーゼＩ及びプロテアーゼIIは双方ともスブチリシン・カールスバーグよりも、タンパク質の除去に関してはるかに効果的であった。このことは、両プロテアーゼをH₂O₂を含む口内ケア組成物及び製品に関して非常に有用なものとする。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく本発明に様々な変更及び改良を施すことができることを認識するであろう。従って、本発明は請求の範囲に記載の事項に拘束される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９７年５月２日【補正内容】請求の範囲１．プロテアーゼを含んで成る口内ケア組成物であって、そのプロテアーゼがその口内ケア組成物が存在していないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性であることを特徴とする、口内ケア組成物。２．前記プロテアーゼが、前記口内ケア組成物が存在していないとき、口内の自然なpH環境において実質的に不活性である、請求項１記載の口内ケア組成物。３．前記プロテアーゼがpH約７の近辺において、好ましくは約pH6.4〜7.0 の範囲で、そしてより好ましくはpH約６〜８で実質的に不活性である、請求項１及び２のいづれか１項記載の口内ケア組成物。４．前記プロテアーゼが20℃〜37℃の温度で活性である、請求項３記載の口内ケア組成物。５．前記タンパク質分解活性が、その至適pHでのタンパク質分解活性との対比において、70％以下、好ましくは50％以下、より好ましくは30％以下、より良くは10％以下、更により良くは５％以下、例えば２％以下である、請求項３及び４記載の方法。６．前記プロテアーゼが微生物に由来する、請求項１〜５のいづれか１項記載の口内ケア組成物。７．前記プロテアーゼがバチルス種の株、特にバチルス・スブチリスの株、又はリゾプス種の株、特にＲ．ニベウスの株、又はシタリジウム種の株、又はスルホロブス種の株、又はサーモプラスマ種の株、又はアスペルギルス種の株、特にＡ．アキュレアトウス、もしくはＡ．ニガー、もしくはＡ．アワモリ、もしくはＡ．オリガの株、又はトリコデルマ種の株、特にＴ．ハルジアヌム、もしくはＴ．リージーの株、又はフサリウム種の株、特にＦ．オキシスポルムの株、又はフミコラ種の株に由来する、請求項６記載の口内ケア組成物。８．前記プロテアーゼが酸性プロテアーゼである、請求項１〜７のいづれか１項記載の口内ケア組成物。９．前記酸性プロテアーゼが遺伝子的に改良されたプロテアーゼである請求項８記載の口内ケア組成物。 10．前記プロテアーゼがH₂O₂の存在下で良好なタンパク質除去活性を有する、請求項１〜９のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 11．前記プロテアーゼがWO95/02044に記載のプロテアーゼＩである、請求項１〜８及び10のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 12．前記プロテアーゼがWO95/02044に記載のプロテアーゼIIである、請求項１〜８及び10のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 13．前記プロテアーゼがアルカリ性プロテアーゼである、請求項１〜７のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 14．前記アルカリ性プロテアーゼが遺伝子的に改良されたプロテアーゼである、請求項13記載の口内ケア組成物。 15．前記プロテアーゼがH₂O₂の存在下で良好なタンパク質除去活性を有する、請求項13及び14記載の口内ケア組成物。 16．還元酵素、例えばペルオキシダーゼ、並びにアミラーゼ、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、リパーゼ、グルコースオキシダーゼ、及び抗微生物ポリペプチド、又はそれらの混合物を含む群から選ばれる少なくとも一種のその他の活性を含んで成る、請求項１〜15のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 17．デキストラナーゼもしくはムタナーゼ、又はそれらの混合物を含んで成る、請求項16記載の口内ケア組成物。 18．口内ケア製品であって、請求項１〜17のいづれか１項記載の口内ケア組成物、又は前記口内ケア製品が存在していないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性であるプロテアーゼを含んで成る、製品。 19．前記プロテアーゼが、前記口内ケア製品が存在していないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性である、請求項18記載の口内ケア製品。 20．歯みがき剤である、請求項18及び19記載の口内ケア製品。 21．前記歯みがき剤が練り歯みがき粉又は歯みがき粉である、請求項20記載の口内ケア製品。 22．前記歯みがき剤がマウスウォッシュである、請求項20記載の口内ケア製品。 23．抗歯垢化合物又は組成物を含んで成る、請求項18〜22のいづれか１項記載の口内ケア製品。 24．抗歯石化合物又は組成物を含んで成る、請求項18〜23のいづれか１項記載の口内ケア製品。 25．漂白剤又はホワイトニング剤を含んで成る、請求項18〜24のいづれか１項記載の口内ケア製品。 26．H₂O₂を含んで成る、請求項25記載の口内ケア製品。 27．還元酵素、例えばペルオキシダーゼ、アミラーゼ、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、リパーゼ、グルコースオキシダーゼもしくは抗微生物活性、又はそれらの混合物を含む群から選ばれる少なくとも一種のその他の活性を含んで成る請求項18〜26のいづれか１項記載の口内ケア製品。 28．デキストラナーゼもしくはムタナーゼ、又はその混合物を含んで成る、請求項27記載の口内ケア製品。 29．口内の自然な環境において実質的に不活性であるプロテアーゼの、口内ケア組成物及び／又は製品における利用。 30．請求項18〜28のいづれか１項記載の口内ケア製品を利用するための方法であって、ａ）前記口内ケア製品を口の中に入れる；ｂ）歯及び／又は歯肉と一定時間接触させる；ｃ）口から除去する；そしてｄ）液体で任意的にすすぐ、方法。 31．口内ケア製品を歯及び／又は歯肉と接触させるために歯ブラシを使用する、請求項29記載の方法。 32．前記口内ケア製品をすすぎにより歯及び／又は歯肉と接触させる、請求項 29及び30記載の方法。 33．段階ｄ）におけるすすぎ液が水である、請求項29〜31のいづれか１項記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．プロテアーゼを含んで成る口内ケア組成物であって、そのプロテアーゼがその口内ケア組成物が存在していないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性であることを特徴とする、口内ケア組成物。２．前記プロテアーゼが、前記口内ケア組成物が存在していないとき、口内の自然なpH環境において実質的に不活性である、請求項１記載の口内ケア組成物。３．前記プロテアーゼがpH約７の近辺において、好ましくは約pH6.4 〜7.0 の範囲で、そしてより好ましくはpH約６〜８で実質的に不活性である、請求項１及び２のいづれか１項記載の口内ケア組成物。４．前記プロテアーゼが20℃〜37℃の温度で活性である、請求項３記載の口内ケア組成物。５．前記タンパク質分解活性が、その至適pHでのタンパク質分解活性との対比において、70％以下、好ましくは50％以下、より好ましくは30％以下、より良くは10％以下、更により良くは５％以下、例えば２％以下である、請求項３及び４記載の方法。６．前記プロテアーゼが微生物に由来する、請求項１〜５のいづれか１項記載の口内ケア組成物。７．前記プロテアーゼがバチルス種の株、特にバチルス・スブチリスの株、又はリゾプス種の株、特にＲ．ニベウスの株、又はシタリジウム種の株、又はスルホロブス種の株、又はサーモプラスマ種の株、又はアスペルギルス種の株、特にＡ．アキュレアトウス、もしくはＡ．ニガー、もしくはＡ．アワモリ、もしくはＡ．オリガの株、又はトリコデルマ種の株、特にＴ．ハルジアヌム、もしくはＴ．リージーの株、又はフサリウム種の株、特にＦ．オキシスポルムの株、又はフミコラ種の株に由来する、請求項６記載の口内ケア組成物。８．前記プロテアーゼが酸性プロテアーゼである、請求項１〜７のいづれか１項記載の口内ケア組成物。９．前記酸性プロテアーゼが遺伝子的に改良されたプロテアーゼである請求項８記載の口内ケア組成物。 10．前記プロテアーゼがH₂O₂の存在下で良好なタンパク質除去活性を有する、請求項１〜９のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 11．前記プロテアーゼがWO95/02044に記載のプロテアーゼＩである、請求項１〜８及び10のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 12．前記プロテアーゼがWO95/02044に記載のプロテアーゼIIである、請求項１〜８及び10のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 13．前記プロテアーゼがアルカリ性プロテアーゼである、請求項１〜７のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 14．前記アルカリ性プロテアーゼが遺伝子的に改良されたプロテアーゼである、請求項13記載の口内ケア組成物。 15．前記プロテアーゼがH₂O₂の存在下で良好なタンパク質除去活性を有する、請求項13及び14記載の口内ケア組成物。 16．還元酵素、例えばペルオキシダーゼ、並びにアミラーゼ、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、リパーゼ、グルコースオキシダーゼ、及び抗微生物ポリペプチド、又はそれらの混合物を含む群から選ばれる少なくとも一種のその他の活性を含んで成る、請求項１〜15のいづれか１項記載の口内ケア組成物。 17．デキストラナーゼもしくはムタナーゼ、又はそれらの混合物を含んで成る、請求項16記載の口内ケア組成物。 18．口内ケア製品であって、請求項１〜17のいづれか１項記載の口内ケア組成物、又は前記口内ケア製品が存在していないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性であるプロテアーゼを含んで成る、製品。 19．前記プロテアーゼが、前記口内ケア製品が存在していないとき、口内の自然な環境において実質的に不活性である、請求項18記載の口内ケア製品。 20．歯みがき剤である、請求項18及び19記載の口内ケア製品。 21．前記歯みがき剤が練り歯みがき粉又は歯みがき粉である、請求項20記載の口内ケア製品。 22．前記歯みがき剤がマウスウォッシュである、請求項20記載の口内ケア製品。 23．抗歯垢化合物又は組成物を含んで成る、請求項18〜22のいづれか１項記載の口内ケア製品。 24．抗歯石化合物又は組成物を含んで成る、請求項18〜23のいづれか１項記載の口内ケア製品。 25．漂白剤又はホワイトニング剤を含んで成る、請求項18〜24のいづれか１項記載の口内ケア製品。 26．H₂O₂を含んで成る、請求項25記載の口内ケア製品。 27．還元酵素、例えばペルオキシダーゼ、アミラーゼ、デキストラナーゼ、ムタナーゼ、リパーゼ、グルコースオキシダーゼもしくは抗微生物活性、又はそれらの混合物を含む群から選ばれる少なくとも一種のその他の活性を含んで成る請求項18〜26のいづれか１項記載の口内ケア製品。 28．デキストラナーゼもしくはムタナーゼ、又はその混合物を含んで成る、請求項27記載の口内ケア製品。 29．口内の自然な環境において実質的に不活性であるプロテアーゼの利用。 30．前記プロテアーゼが口内の自然なpH環境において実質的に不活性である、請求項29記載の利用。 31．口内ケア組成物及び／又は製品における、請求項29及び30記載の利用。 32．請求項18〜28のいづれか１項記載の口内ケア製品を利用するための方法であって、ａ）前記口内ケア製品を口の中に入れる；ｂ）歯及び／又は歯肉と一定時間接触させる；ｃ）口から除去する；そしてｄ）液体で任意的にすすぐ、方法。 29．口内ケア製品を歯及び／又は歯肉と接触させるために歯ブラシを使用する、請求項29記載の方法。 30．前記口内ケア製品をすすぎにより歯及び／又は歯肉と接触させる、請求項 29及び30記載の方法。 31．段階ｄ）におけるすすぎ液が水である、請求項29〜31のいづれか１項記載の方法。