JP2001520179A

JP2001520179A - プラーク阻害オーラル組成物

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Publication number: JP2001520179A
Application number: JP2000516642A
Authority: JP
Inventors: ツチヤ，リエ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1997-10-17
Filing date: 1998-10-16
Publication date: 2001-10-30
Also published as: CN1275906A; CA2305804A1; AU734737B2; EP1023037A1; AU9621398A; WO1999020239A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、プラーク阻害又はプラーク除去酵素、特に少くとも１のデンプン加水分解酵素、例えばα−アミラーゼ又は枝切り酵素、例えばプルラナーゼ、及び／又は少くとも１のデンプン改変酵素、例えばトランスグルコシダーゼ又はＣＧＴａｓｅを含むオーラル組成物に、並びに該オーラル組成物を用いてプラーク形成を阻害し又はプラークを除去するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野本発明は、プラーク阻害又はプラーク除去酵素を含むオーラル組成物に、及び
該オーラル組成物を用いてプラーク形成を阻害し又はプラークを除去するための
方法に関する。

【０００２】発明の背景歯垢は細菌、上皮細胞、白血球、マクロファージ及びよごれた歯の上に形成す
る他の口の滲出物の混合物である。細菌は、微生物と一緒に口腔から、プラーク
の連続的増殖のための接着性マトリックスを形成する高度に枝分かれしたポリサ
ッカライドを作り出す。処理せず残った歯垢の形成は、最終的に、う蝕、歯肉炎
、歯周疾患、及び最終的に歯の喪失を導く。プラークが蓄積し続けると岩のよう
な硬さの白色又は黄色がかった析出物が生ずる。これらの析出物は石灰化プラー
ク、結石又は歯石と呼ばれ、プラーク及びミネラル、特にカルシウムから唾液中
で形成される。

【０００３】口内のポリサッカライドは、例えば食物又は飲料として、口の中に導入された
スクロースから、う食原性微生物、例えば口腔内で増殖中のストレプトコッカス
・ムタンス（Streptococcus mutans) 又はストレプトコッカス・サングイス（St reptococcus sanguis )の作用により形成される。これらの口内ポリサッカライド
は、主にα−１，６−グリコシド結合を有する水溶性デキストラン、並びにα−
１，３−グリコシド結合を有する骨格及びα−１，６−グリコシド結合を有する
枝から構成される“ムタン”と呼ばれる水不溶性細胞外ポリサッカライドの主成
分を含む。ムタンは（歯の硬質外側多孔質層を構成するヒドロキシアパタイトに
、及び歯の表面に接着する前記う食原性細菌の細胞表面上のアクセプタータンパ
ク質に結合する。

【０００４】プラークを除去することにより、又はプラークの組成を変化させることにより
その環境を変えることにより、この過程に対抗するための多くの試みがなされて
おり、多くの歯みがきペースト及び他のオーラル・ケア組成物がプラークを除去
し又は阻害することを目的として種々の成功を始めている。しかしながら、プラ
ークを有効に阻害する目的は特にとらえどころがなく、通常の使用において、プ
ラーク形成及び相伴うプラーク形成から生じ得る歯の疾患を阻害するのに有効で
あるオーラル・ケア組成物についての必要性がある。

【０００５】ＷＯ９７／０６７７５は、歯の漂白のための、オキシドレダクターゼ、並びに
任意にデキストラナーゼ及び／又はムタナーゼを含むオーラル組成物を開示する
が、この組成物のプラーク阻害又はプラーク除去効果は記載も示唆もされていな
い。う蝕、プラーク及び歯石の形成を防ぐため、デキストラナーゼ及び／又はムタ
ナーゼ及び／又は他の酵素をオーラル・ケア組成物及び製品に加えることが示唆
されている。

【０００６】ＪＰ特許公報８０１２５４４（Ｌｉｏｎ）は、デキストラナーゼ、ムタナーゼ
及びトリクロサン及び／又はバイオソールのプラーク防止効果を記述する。ＵＳ特許４，３５３，８９１号（Guggenheimら）は、ＯＭＺ１７６として同定
することができるストレプトコッカス・ムタンス（Streptococcus mutans) 株Ｃ
ＢＳ３５０．７１を培養することにより合成されるムタンを分解するためにトリ
コデルマ・ハルジアヌム（ＢＳ２４３．７１からのムタナーゼを用いるプラーク
除去に関する。歯垢内の重要な成分はα−１，３−グリコシド結合を有する水不
溶性ポリサッカライドであること及びこのようなムタンと呼ばれるポリサッカラ
イド材料はデキストラナーゼによって攻撃されないことが言及される。

【０００７】 Guggenheimら（1972) （Caries. Res, 6, p. 289-297) は、ラットの歯垢の程
度はデキストラナーゼ及び１，３−グルカナーゼ（ムタナーゼ）の同時の使用に
よりあまり影響を受けないことを開示する。 Hareら（1978）（Carbohydrate Research 66, p. 245-264) は、クラドスポリ
ウム・レシナエ（Cladosporium resinae) からの細菌のα−１，３−グルカナー
ゼと組み合わせた細菌デキストラナーゼで口内グルカンを加水分解し、可溶化す
る場合、協同的効果が得られることを見い出した。

【０００８】ＵＳ特許４，４３８，０９３号（The Research Foundation for Microbial di
sease of Osaka) は、デキストラナーゼ及びα−１，３−グルカナーゼ（ムタナ
ーゼ）を含むオーラル組成物を記述する。ここでそれら両方の成分は１：２〜２
：１の酵素単位比でオーラル組成物１グラム当り０．５〜１００酵素単位の量で
存在する。このデキストラナーゼはコリンバクテリウム（Corynbacterium) 属内
の細菌から得られ、α−１，３−グルカナーゼはシュードモナス(Pseudomonas)
属内の細菌から得られる。

【０００９】ＧＢ２，２０６，５８５（Dental Chem Co. Ltd.) は研磨剤としてヒドロキシ
アパタイトを、該ヒドロキシアパタイト上に固定されたラエバナーゼ、デキスト
ラナーゼ及びムタナーゼと供に含む歯洗浄剤を記述する。米国特許５，１４５，６６５（Henkel) は、口内のポリサッカライドを開裂す
るためのデキストラナーゼ及び／又は１，３−グルカナーゼを含む口及び歯のケ
アーのための組成物を開示する。

【００１０】ＦＲ２，６５１，４３３（ＤＡＮＡ）は、新しいプラークに作用するデキスト
ラナーゼ、古い及び不溶性のプラークに作用するムタナーゼ、及び殺細菌作用を
有する他の酵素の混合物に関する。ＵＳ特許５，３２０，８３０（Proctor & Gamble) は、ａ）界面活性剤、ｂ）
酵素、ｃ）キレート剤、ｄ）フルオライド源、ｅ）シリカ研磨剤及びｆ）担体を
含むプラーク及び歯肉炎の削減のための歯みがきペースト組成物を記述する。そ
の酵素は、エンドグルカナーゼ、パパイン、デキストラナーゼ及び／又はムタナ
ーゼである。

【００１１】驚くことに、歯垢形成を阻害／防止し及び／又はプラークを除去するために１
又は複数のデンプン加水分解又はデンプン改変酵素を含むオーラル・ケア組成物
が有効であることが見い出された。発明の概要本発明の目的は、プラーク形成を阻害／防止するため及びプラークを除去する
ために有効であるオーラル組成物、並びにプラーク形成を阻害するため及びプラ
ークを除去するための方法を供することである。

【００１２】これにより、本発明の一態様は、プラーク阻害及び／又はプラーク除去に有効
な量の少くとも１のデンプン加水分解酵素及び／又は少くとも１のデンプン改変
酵素を含むオーラル・ケア組成物に関する。第２の態様において、本発明は、プラーク形成を阻害し又はプラークを除去す
るための方法であって、プラークを阻害する及び／又はプラークを除去するのに
有効な量の少くとも１のデンプン加水分解酵素及び／又は少くとも１のデンプン
改変酵素を含むオーラル・ケア組成物を、歯及び／又は歯肉に、プラーク阻害又
はプラーク除去効果を得るための時間、接触させることを含む方法に関する。

【００１３】第３の態様において、本発明は、プラーク形成の阻害／防止及び／又はプラー
クの除去のための組成物の調製のための１又は複数のデンプン加水分解酵素及び
／又は１又は複数のデンプン改変酵素の使用に関する。発明の詳細な記載本願の文脈における用語“デンプン加水分解酵素”は、デンプン中の結合を加
水分解するよう機能するいずれかの酵素、例えばα−アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．
２．１．１）をいう。

【００１４】本発明の文脈に用いられる用語“デンプン改変酵素”は、Ｅ．Ｃ．２．４．１
．内の酵素の群をいい、特にトランスグリコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．18
）及びＣＧＴａｓｅ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．19）を含む。本発明者らは、歯垢が、少くとも１のデンプン加水分解酵素及び／又は少くと
も１のデンプン改変酵素の使用により阻害／防止され又は除去され得ることを見
い出した。このような酵素の効果は以前には見られていないものである。

【００１５】第１の態様において、本発明は、プラーク阻害及び／又はプラーク除去に有効
な量の少くとも１のデンプン加水分解酵素及び／又はは少くとも１のデンプン改
変酵素を含むオーラル・ケア組成物に関する。本発明の一実施形態において、デンプン改変酵素はＣＧＴａｓｅ（Ｅ．Ｃ．２
．４．１．19）又はトランスグルコシダーゼ（２．４．１．18）である。

【００１６】デンプン改変酵素がＣＧＴａｓｅである場合、それは、バチルス・オートリチ
クス（Bacillus autolyticus) の株、バチルス・セレウス（Bacillus cereus)の
株、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans) の株、バチルス・サーキ
ュランス（Bacillus circulans) 変種アルカロフィルス（alkalophilus) の株、
バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans) の株、バチルス・フィルムス
（Bacillus firmus)の株、バチルス・ハロフィルス（Bacillus halophilus)の株
、バチルス・マセランス（Bacillus macerans)の株、バチルス・メガテリウム（ Bacillus megaterium )の株、バチルス・オーベンシス（Bacillus ohbensis)の株
、バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus)の株、バ
チルス・サブチリス（Bacillus subtilis)の株、クレブシエラ・ニューモニエ（ Klebsiella pneumoniae )の株、サーモアネロバクター種（Thermoanaerobacter s p. ) の株、サーモアネロバクター・エタノリクス（Thermoanaerobacter ethanol icus ) の株、サーモアネロバクター・フィニイ（Thermoanaerobacter finnii)の
株、クロストリジウム・サーモアミロリチクム（Clostridium thermoamylolytic um ) の株、クロストリジウム・サーモサッカロリチクム（Clostridium thermosa ccharolyticum )の株、又はサーモアナエロバクテリウム・サーモスルフリゲネス
（Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes) の株から得られることができる
。

【００１７】デンプン改変酵素がトランスグルタミナーゼである場合、それは、アスペルギ
ルス・ニゲル（Aspergillus niger)から得ることができ、例えばAmamo Pharmace
utical Co., Japan により販売される製品である。本発明の別の実施形態において、オーラル・ケア組成物はデンプン加水分解酵
素を含む。

【００１８】これは、典型的には、α−アミラーゼ、例えば細菌α−アミラーゼ、例えばＢ
ＡＮ^TM又はＭａｌｔｏｇｅｎａｓｅ^TM（両方ともNovo Nordiskから市販）、又は
バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis)由来α−アミラーゼ；バチルス・ア
ミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens) 由来のα−アミラーゼ；
バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus)由来のα−
アミラーゼ；アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae）由来のα−アミ
ラーゼ；又は非病原性微生物由来α−アミラーゼであろう。

【００１９】 α−アミラーゼは、真菌α−アミラーゼ、例えばNovo Nordiskから市販される
Ｆｕｎｇａｍｙｌ^TMであってもよい。デンプン加水分解酵素は、本発明の別の実施形態において、枝切り酵素、特に
プルラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．41）、例えばＰｒｏｍｏｚｙｍｅ^TMであっ
てもよい。

【００２０】好ましい実施形態において、オーラル・ケア組成物は、上述のような少くとも
１のデンプン改変酵素、特にＣＧＴａｓｅ、並びにムタナーゼ及び／又はデキス
トラナーゼを含む。別の好ましい実施形態において、本発明のオーラル・ケア組成物は、上述のよ
うな少くとも１のデンプン加水分解酵素、特に細菌、α−アミラーゼ、並びにム
タナーゼ及び／又はデキストラナーゼを含む。

【００２１】ムタナーゼは、トリコデルマ種（Trichoderma sp.)の株、特にＴ．ハルジアヌ
ム（T. harzianum) 、特にＴ．ハルジヌムＣＢＳ２４３．７１（Novo Nordiskか
ら市販）から得ることができる。デキストラナーゼは、パエシロマイセス種（Paecilomyces sp.）の株、特にパ
エシロマイセス・リラシヌス（Paecilomyces lilacinus) （Novo Nordiskから市
販）から得ることができる。

【００２２】第２の態様において、本発明は、本発明のオーラル・ケア組成物を含むオーラ
ル・ケア製品に関する。本発明の“オーラル・ケア製品”は、ヒト及び動物の口内の口内衛生を維持及
び／又は改良し、及び／又は歯の疾患を防止し又は治療するために用いることが
できる製品として定義される。

【００２３】このようなオーラル・ケア製品の例には、歯みがきペースト、デンタルクリー
ム、ゲル又は歯みがき粉、歯科製品（odontics) 、口内洗浄剤、義歯洗浄剤、ブ
ラッシング剤又は後ゆすぎ製剤、チューインガム又はロゼンジがある。オーラル
・ケア製品は、デンタルフロス又はつま楊枝であってもよい。歯みがきペースト及び歯みがきゲルは、典型的には、研磨材、発泡剤、芳香剤
、湿潤剤、バインダー、シックナー、甘味料及び水を含む。本明細書に用いる場
合、用語“歯みがきペースト”は、ペースト及びゲルの両方の形態の製剤をいう
。

【００２４】口内洗浄剤は、典型的には、水／アルコール溶液、芳香剤、湿潤剤、甘味料、
発泡剤及び着色料を含む。本発明によるチューインガムは、それ自体周知の様式において、慣用的なチュ
ーインガムベース、例えばチクル及び／又は１もしくは複数の添加した合成もし
くは天然のポリマーに基づき、必要に応じて天然の及び／又は人工の甘味料、芳
香剤等を含む慣用的なチューインガムベースに、１又は複数の酵素を組み込むこ
とにより調製することができる。酵素のガムベースへの添加に基づいて、ガムベ
ースの温度はあまり高くならないべきであり、例えば好ましくは約６０℃以下、
より好ましくは約５０℃以下である。

【００２５】本発明によるオーラル・ケア製品に用いるための研磨材には、アルミナ及びそ
の水和物、例えばα−アルミナ３水和物、マグネシウムトリシリケート、炭酸マ
グネシウム、重炭酸ナトリウム（“ベーキングソーダ”）、カオリン、アルミノ
シリケート、例えばか焼ケイ酸アルミニウム及びケイ酸アルミニウム、炭酸カル
シウム、ケイ酸ジルコニウム、並びに粉状プラスチック、例えばポリビニルクロ
ライド、ポリアミド、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、フェノール−
ホルムアルデヒド樹脂、メラミン−ホルムアルデヒド樹脂、尿素−ホルムアルデ
ヒド樹脂、エポキシ樹脂、粉状ポリエチレン、シリカキセロゲル、ヒドロゲル及
びエアロゲル等がある、研磨剤として、ピロリン酸カルシウム、水不溶性アルカ
リメタロホスフェート、リン酸二カルシウム及び／又はその水和物、オルトリン
酸二カルシウム、リン酸三カルシウム、粒状ヒドロキシアパタイト等も適してい
る。これらの物質の混合物を用いることも可能である。

【００２６】オーラル・ケア製品の性質により、研磨材は０〜７０重量％、好ましくは１〜
７０重量％の量で存在する。歯みがきペーストのため、研磨材成分は、最終歯み
がき製品中に典型的には、１０〜７０重量％の範囲で存在する。例えば歯みがきペーストからの水の損失を防止するために湿潤剤が用いられる
。本発明によるオーラル・ケア製品に用いるための適切な湿潤剤は、次の化合物
及びその混合物：グリセロール、ポリオール、ソルビトール、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、１，４
−ブタン−ジオール、水素化され部分的に加水分解されたポリサッカライド等を
含む。湿潤剤は、一般に、歯みがきペースト中に、０〜８０重量％、好ましくは
５〜７０重量％の量で存在する。

【００２７】歯磨製品の安定化を助ける適切なシックナー及びバインダーの例は、シリカ、
デンプン、トラガカントガム、キサンタンガム、アイリッシュモスの抽出物、ア
ルギネート、ペクチン、セルロース誘導体、例えばヒドロキシエチルセルロース
、ナトリウムカルボキシメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース、
ポリアクリル酸及びその塩並びにポリビニルピロリドンである。シックナーは、
歯みがきペースト、クリーム及びゲル中に、０．１〜２０重量％の量で存在し、
バインダーは、最終製品の０．０１〜１０重量％の量で存在し得る。

【００２８】発泡剤として、セッケン、アニオン性、カチオン性、非イオン性、両性及び／
又は双性イオン性界面活性剤を用いることができる。これらは、最終製品の０〜
１５重量％のレベルで、好ましくは０．１〜１３重量％、より好ましくは０．２
５〜１０重量％で存在し得る。界面活性剤は、本酵素の活性にいずれの悪影響も与えない程度まで、本発明に
適している。

【００２９】界面活性剤の例には、脂肪アルコールスルフェート、スルホン化モノグリセリ
ド又は１０〜２０炭素原子を有する脂肪酸の塩、脂肪酸−アルブミン縮合産物、
脂肪酸アミド及びタウリンの塩及び／又はイセチオン酸の脂肪酸エステルの塩が
ある。適切な甘味料には、サッカリン及び／又はオーラル・ケア製品に用いるために
適した他の甘味料がある。

【００３０】芳香剤、例えばスペアミント及びペパーミントは、通常、少い量で、例えば０
．０１〜約５重量％、特に０．１〜５重量％の量で存在する。水は、通常、例えば歯みがきペーストに流出性の泡を与える量、即ち最終製品
の重量で４０％〜７０％の量で添加される。更に、水溶性抗細菌剤、例えばクロルヘキシジンジグルコネート、ヘキセチジ
ン、アレキシジン、第四アンモニウム抗細菌化合物並びに特定の金属イオン、例
えば亜鉛、銅、銀及びスズイオンの水溶性源（例えば塩化亜鉛、塩化銅及び塩化
スズ、並びに硝酸銀）を含んでもよい。

【００３１】他の抗歯石剤、本願の対象である酵素以外の抗プラーク剤、フルオライド源と
して機能し得る化合物、染料／着色料、防腐剤、ビタミン、pH調節剤、抗う食剤
、脱感作剤等の添加も本発明に考慮される。本発明のオーラル組成物から作られる、歯みがきペーストは、例えば、次の成
分（最終歯みがきペースト組成物の重量％）を含み得る：研磨剤１０〜７０％湿潤剤０〜８０％シックナー０．１〜２０％バインダー０．０１〜１０％甘味料０．１％〜５％発泡剤０〜１５％デンプン分解酵素及び／又はデンプン改変酵素（Ｓ）０．０００１％〜２０％他の酵素０〜２０％ペルオキシド０〜１％本発明のオーラル・ケア組成物から作られる口内洗浄剤は、例えば、次の成分
（最終口内洗浄組成物の重量％）を含み得る：０〜２０％湿潤剤０〜２％界面活性剤０〜５％デンプン分解酵素及び／又はデンプン改変酵素０〜５％他の酵素０〜２０％エタノール０〜２％他の成分（ｅ．ｇ．芳香剤、甘味料又は他の活性成分例えばフルオライド）０〜７０％水口内洗浄組成物は、適切な緩衝液、例えばpH域６〜７．５のクエン酸又はリン
酸ナトリウムで緩衝することができる。

【００３２】口内洗浄剤は、非希釈化型（即ち使用剤に希釈）であっても希釈型（直ちに用
いることができる）であってもよい。本発明のオーラル・ケア組成物及び製品は、オーラル製品の分野で一般的であ
る方法を用いて作ることができる。本発明は、更に、プラーク形成の阻害／防止及び／又はプラークの除去のため
の組成物の調製のための上述のような１又は複数のデンプン加水分解酵素及び／
又は１又は複数のデンプン改変酵素の使用に関する。

【００３３】固体から流動性形態であるオーラル・ケア製品、例えば歯みがきペーストは、
典型的には、歯ブラシ等を用いて歯及び／又は歯肉に接触させることができよう
。液体オーラル・ケア製品、例えば口内洗浄剤のばあいその接触は、典型的には
、口をゆすぐことにより行われよう。本発明によるオーラル・ケア製品を要求されるプラーク阻害又はプラーク除去
効果を得るために歯及び／又は歯肉に接触させる時間は組成物又は製品の性質及
び被検体の必要性のような因子に従って種々であり得る。しかしながら、オーラ
ル・ケア製品を歯及び／又は歯肉に約３０秒〜１５分、接触させること、例えば
歯をブラッシングし又は同時に約１〜３分、口をゆすぐことによる接触で、要求
される結果を得るために通常、十分であろう。これは、好ましくは、規則的に、
例えば１日１〜３回、行われる。

【００３４】使用後に、オーラル・ケア製品は、典型的には、口から、例えばそれをはき出
すことにより除去され、そして次に、口は液体、例えば水道水でゆすぐことがで
きる。いずれかの特定の理論に結びつけるつもりはないが、本発明に従って見い出さ
れたプラーク阻害効果は、微生物によって生産される酵素がスクロースにアクセ
スする前に、デンプン加水分解及び／又はデンプン改変酵素がスクロースと反応
してカップリング糖を作り出すという事実のためであり得ると信じられる。作用
のメカニズムにかかわらず、問題の酵素の使用によって観察されるプラーク阻害
効果は驚くべきものであり、以前には記載も示唆もされていないと考えられる。

【００３５】本発明は、以下の非限定的例に更に詳述されよう。材料及び方法材料（Novo Nordisk A/Sから市販される）パエシロマイセス・リラシヌム（Paecil omyces lilacinum ) により生産されるデキストラナーゼ。

【００３６】（Novo Nordisk A/Sから市販される）トリコデルマ・ハルジアヌム（Trichode rma harzianum )ＣＢＳ２４３．７１により生産されるムタナーゼ。マルトゲナーゼ：Novo Nordisk A/Sから市販されるＮｏｖａｍｙｌ^TM（細菌マ
ルトジェニックα−アミラーゼ）。 Novo Nordisk A/Sから市販されるＦｕｎｇａｍｙｌ^TM（真菌α−アミラーゼ）
。

【００３７】（Amona Pharmaceuticals Co. から市販される）アスペルギルス・ニゲルによ
り生産されるトランスグルタミナーゼ。 Novo Nordisk A/Sから市販されるＢＡＮ^TM（細菌α−アミラーゼ）。 Novo Nordisk A/Sから市販されるサーモバクテリウム種により生産されるＣＧ
Ｔａｓｅ。

【００３８】 Novo Nordisk A/Sから市販されるＰｒｏｍｏｚｙｍｅ^TM（細菌プルラナーゼ）
。微生物ＯＭＺ１７６として同定することができるストレプトコッカス・ソブリヌス（ Streptococcus sobrinus ) 株ＣＢＳ３５０．７１アクチノマイセス・ビスコスス（Actinomyces viscosus) ＤＳＭ４３３２９フソバクテリウム・ヌクレアトゥム亜種ポリモルフム（Fusobacterium nuclea
tum subsp. polymorphum) ＤＳＭ２０４８２溶液エリトロシンＢ（Sigma) 装置 Chromameter CR-200 (Minolta) ヒドロキシアパタイトディスクの調製ヒドロキシアパタイト（HA）ディスクは、２５０mgのヒドロキシアパタイトを
、ディスクダイ中で、約５，９００kg（１３，０００lbs ）の圧力で５分間、圧
縮する。次にそのディスクを６００℃で４時間、焼結し、最後に滅菌脱イオン水
で水和する。

【００３９】ヒドロキシアパタイトディスクの滅菌 HAディスクを１８０℃で２時間、滅菌する。ムタン調製ムタンは、ストレプトコッカス・ソブリヌス（ＣＢＳ３５０．７１）をpH６．
５，３７℃（一定に維持）で、次の成分から構成される培地中で７５rpm のエレ
ーション率で増殖させることにより調製する：ＮＺ−Ｃａｓｅ６．５ｇ／ｌイーストエキス６ｇ／ｌ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２０ｇ／ｌＫ₂ＰＯ₄ ３ｇ／ｌグルコース５０ｇ／ｌ Pluronic PE6100 ０．１％３５時間後、スクロースを最終濃度６０ｇ／Ｌまで加えてグルコシルトランス
フェラーゼを誘導する。全発酵時間は７５時間である。その発酵からの上清を遠
心してろ過（滅菌）する。次に、スクロースを最終濃度５％までその上清に加え
（pHは酢酸でpH７．０に調節する）、その溶液を３７℃で一晩、撹拌する。その
溶液をろ過し、不溶性ムタンをＰｒｏｐｅｘ上に収集し、（酢酸で調節した）１
％ナトリウムベンゾエートを含む脱イオン水、pH５で大量に洗う。最後に、その
不溶性ムタンを凍結乾燥して粉砕する。

【００４０】デキストラナーゼ活性（KDU ）の測定１キロノボデキストラナーゼ単位（１KDU ）は以下の標準条件に基づいたデキ
ストラナーゼの測定のためのNovo Nordisk法において、１時間当り１ｇのマルト
ースに等価な還元糖を形成するデキストランを分解する酵素の量である：基質 Dextran 500 (Pharmacia) 反応時間２０分温度４０℃ pH ５．４ Novo Nordiskの分析法（ＡＦ１２０）の詳細は請求次第で利用できる。

【００４１】ムタナーゼ活性（MU）の測定１ムタナーゼ単位は、１分当りに（グルコースとして計算した）１μmol の還
元糖を遊離する標準条件下での酵素の量である。標準条件基質１．５％ムタン反応時間１５分温度４０℃ pH ５．５ Novo Nordiskの分析法（ＡＦ１８０／１−ＧＢ）の詳細は、請求次第でNovo N
ordisk A/Sから利用できる。

【００４２】ＢＡＮ^TM（Bacterial Amylase Novo) 活性（KNU ）（キロ Novo−α−アミラーゼ単位）の測定標準活性は、以下の条件下で分析標準に対して測定する：基質ｐ−ニトロフェニル−α−Ｄ−マルトヘプタオシド（ｐＮＰ−Ｇ７）温度３７℃ pH：７．１ Novo Nordiskの分析法の詳細（Novo Nordisk出版物ＡＦ２１５）は請求次第で
利用できる。

【００４３】Ｆｕｎｇａｍｙｌ登録商標活性（FAU ）の測定１真菌α−アミラーゼ単位（１FAU ）は、以下の標準条件に基づくα−アミラ
ーゼの測定のためのNovo Nordiskの標準的方法において１時間当りに５．２６ｇ
のデンプン（Merck, Amylum Solubile Erg. B.6, Batch 9947275) を分解する酵
素の量である。

【００４４】基質：可溶性デンプン反応時間：７〜２０分温度：３７℃ pH：４．７分析のNovo Nordiskの方法の詳細は請求次第で利用できる。

【００４５】マルトゲナーゼ活性（MANU）の測定１マルトジェニックアミラーゼノボ単位（MANU) は、標準条件下で１分当りに
マルトトリオース１μモルを加水分解する酵素の量として定義される。分析法の
複製は請求次第で利用できる。ＡＭＧ^TM活性（AGU ）の測定１ノボアミノグルコシダーゼ単位（AGU ）は、以下の標準条件下で１分当りに
１μモルのマルトースを加水分解する酵素の量として定義される：基質：マルトース温度：２５℃ pH：４．３（酢酸緩衝液）反応時間：３０分分析法（ＡＦ２２）の詳細は請求次第で利用できる。

【００４６】トランスグルコシダーゼ活性（AGU ）の測定トランスグルコシダーゼ活性は、ＡＭＧ^TM活性を測定するための上述の方法を
用いて測定され、同じ単位（AGU ）を用いて表現される。ＣＧＴａｓｅ活性（KNU ）の測定ＣＧＴａｓｅ KNU 酵素活性を、Phadebasアミラーゼテスト(Pharmacia) の少
し改良を加えた手順により測定した。Phadebas錠剤（Phadebas^TM Amylase Test,
Pharmacia) を基質として用いた。この基質は架橋された不溶性青色デンプンポ
リマーであり、これをウシ血清アルブミン及び緩衝基質と混合する。水に懸濁し
た後、デンプンを酵素により加水分解して青色フラグメントを作り出す。その測
定は、１５分、０．１５nMカルシウム中６０℃，pH６．２でのインキュベーショ
ンの後に行う。６２０nmで測定した生じた青色溶液の吸光度が酵素活性に対応す
る。

【００４７】その酵素活性を酵素標準のものと比較し、そしてその活性を酵素標準のものと
同じ単位で表す。その酵素標準はＴｅｒｍａｍｙｌ^TM（Novo Nordisk A/D, Denm
ark)であり、そのデンプン分解活性は基質としてポテトデンプンを用いて測定さ
れている。この方法は、酵素による改変ポテトデンプンの分解に基づき、その反
応の後、デンプン／酵素溶液のサンプルをヨウ素溶液と混合する。最初に、黒ず
んだ青色が形成されるが、デンプンの分解の間、その青色は弱くなり、次第に赤
みがかった茶色に変化し、それは有色ガラス標準と比べられる。１キロノボα−
アミラーゼ単位（KNU ）は、標準条件（即ち３７℃＋／−０．０５；０．０００
３ＭＣａ²⁺；及びpH５．６）下で５．２６ｇのデンプン乾燥基質、Merck Amyl
um Solubleをデキストリン化する酵素の量として定義される。その活性は、以下
に、１ml当りのNovo Unit (NU)として表される。

【００４８】ＣＧＴａｓｅ活性は、１０mMクエン酸ナトリウムpH６．０中で、４〜１０分、
６０℃で希釈酵素を基質とインキュベートすることにより測定した。Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ^TM活性（PUN ）の測定１プルラナーゼ単位ノボ（PUN ）は、以下の条件下で１分当りに、プルランを
加水分解し、１μモルのグルコースと等価な還元力を有する還元炭水化物と共に
還元炭水化物を遊離する酵素の量として定義される：基質：０．２％プルラン温度：４０℃ pH：５．０（０．０５Ｍクエン酸緩衝液）反応時間：３０分分析法（ＡＦ１９０）の詳細は請求次第で利用できる。

【００４９】プラーク阻害効果の評価プラーク除去効果を評価するために用いた方法は、ＪＰ２２５０８１６におい
てＫａｏにより記載される方法に基づく。本方法によれば、上述のように滅菌さ
れたヒドロキシアパタイトディスクは、０．２％スクロースを含むBrain Heart
Infusion Medium (Difco) 中で、３つの株の微生物（ストレプトコッカス・ソブ
リヌス、アクチノマイセス・ビスコスス及びフソバクテリウム・ヌクレアトゥム
）及び種々の酵素の存在下に一晩、放置することによりバイオフィルムでコート
される。

【００５０】プラーク阻害効果をテストするために、ＰＢＳ（リン酸緩衝塩類溶液）中０．
１％エリトロシンＢをヒドロキシアパタイトディスク上に存在するプラークを赤
に染色するために用いる。（ａ^*として示される）赤色の強度をＣｈｒｏｍａｍ
ｅｔｅｒＣＲ−２００で測定する。最大ａ^*値は６０である。それ未満の値は
より弱い赤色（即ち存在するプラークがより少いこと）を示す。０のａ^*値は赤
色が存在しないことを示す（即ちプラークなし）。プラーク阻害効果は、未処理
のバイオフィルムを１００％としてａ^*の値に基づいて相対的数字として表す。

【００５１】実施例実施例１異なるデンプン加水分解酵素のプラーク予防効果３種の口内微生物、ストレプトコッカス・ソブリヌス、アクチノマイセス・ビ
スコスス及びフソバクテリウム・ヌクレアトゥム各々を、種々の酵素の存在下で
３７℃で一晩、嫌気的に培養した。滅菌した唾液でコートしたヒドロキシアパタ
イトディスクを、ディスク上に口内バイオフィルムが形成されるように、培養の
間、培養液に浸漬した。培養の後、ディスクをリン酸緩衝塩類溶液で簡単にゆす
ぎ、次に１分、ＰＢＳ中０．１％エリトロシンＢ１mL中でインキュベートして
ヒドロキシアパタイトディスク上に存在するプラークを赤色に染色した。そのエ
リトロシンＢ溶液を除去し、そのディスクを数分間、ＰＢＳでゆすいだ。そのデ
ィスクを一晩、空気乾燥させた。赤色の強度（ａ^*）を、Ｃｈｒｏｍａｍｅｔｅ
ｒＣＲ−２００で測定し、未処理のディスクのものと比較した。

【００５２】いくつかの異なる酵素のプラーク防止結果を以下の表１に示す。

【００５３】

【表１】

【００５４】この表に見られるように、列記した活性レベルにおいて全てのデンプン加水分
解酵素で統計的に有意なプラーク防止／阻害効果が得られる。実施例２ムタナーゼ及びデキストラナーゼと組み合わせたデンプン加水分解酵素、デンプン改変酵素のプラーク予防効果３種の口内微生物、ストレプトコッカス・ソブリヌス、アクチノマイセス・ビ
スコスス及びフソバクテリウム・ヌクレアトゥム各々を、１MU／mlのムタナーゼ
及び１ KDU／mlのデキストラナーゼ並びに以下の表に列記した酵素の存在下で３
７℃で一晩、嫌気的に培養した。滅菌した唾液をコートしたヒドロキシアパタイ
トディスクを、そのディスク上に口内バイオフィルムが形成されるように、培養
の間、培養液に浸漬した。培養の後、そのディスクを実施例１に記載されるよう
に処理し、その赤色の強度を測定した。

【００５５】

【表２】

【００５６】見てわかる通り、ムタナーゼ及びデキストラナーゼを伴う２つの酵素ＢＡＮ^TM 及びＣＧＴａｓｅの使用は、ムタナーゼ及びデキストラナーゼのみと比べてプラ
ーク阻害を改善した。ムタナーゼ及びデキストラナーゼとの組合せの付加的な効
果はＣＧＴａｓｅについて特に顕著であった。ＢＡＮ^TM及びＣＧＴａｓｅの両方
について、それらをムタナーゼ及びデキストラナーゼと組み合わせる協同的効果
が存在する。なぜならＢＡＮ^TM又はＣＧＴａｓｅのみの使用はこのテストにおい
てプラーク削減を供さなかったからである。

【００５７】実施例３プラーク阻害／防止効果についての酵素タンパク質投与量応答曲線３種の微生物、ストレプトコッカス・ソブリヌス、アクチノマイセス・ビスコ
スス及びフソバクテリウム・ヌクレアトゥム各々を種々の酵素（Ｆｕｎｇａｍｙ
ｌ^TM，Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ^TM及びＭａｌｔｏｇｅｎａｓｅ^TM、全てNovo Nordisk
A/Sから）の存在下で３７℃で一晩、嫌気的に培養した。滅菌した唾液をコート
したヒドロキシアパタイトディスクを、そのディスク上に口内バイオフィルムが
形成されるように、培養中に培養液中に浸漬した。培養の後、そのディスクをリ
ン酸緩衝塩類溶液で簡単にゆすぎ、次にＰＢＳ中０．１％エリトロシンＢ溶液１
mLで１分間、洗って、ヒドロキシアパタイトディスク上に存在するプラークを赤
に染色した。エリトロシンＢ溶液を除去し、そのディスクをＰＢＳで数分、ゆす
いだ。そのディスクを一晩、空気乾燥させた。そのディスク上に残ったバイオフ
ィルムを、ＣｈｒｏｍａｍｅｔｅｒＣＲ−２００を用いて赤色の強度（ａ^*）
を測定することにより決定し、得られた値を未処理のディスクについての値と比
較した。結果を添付の図１，２及び３に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4C083 AD471 AD472 CC41 CC42 DD11 DD17 DD22 DD23 DD41 EE36 4C084 AA02 AA03 BA44 CA04 CA05 DC22 MA17 MA28 MA34 MA43 MA47 MA57 NA14 ZA671

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】プラークを阻害する及び／又はプラークを除去するのに有効
な量の少くとも１のデンプン加水分解酵素及び／又は少くとも１のデンプン改変
酵素を含むオーラル・ケア組成物。
【請求項２】前記デンプン改変酵素がＣＧＴａｓｅであることを特徴とす
る請求項１に記載のオーラル・ケア組成物。
【請求項３】前記ＣＧＴａｓｅが、バチルス・オートリチクス（Bacillus autolyticus ) の株、バチルス・セレウス（Bacillus cereus)の株、バチルス・
サーキュランス（Bacillus circulans) の株、バチルス・サーキュランス変種ア
ルカロフィルス（alkalophilus) の株、バチルス・コアギュランス（Bacillus c oagulans ) の株、バチルス・フィルムス（Bacillus firmus)の株、バチルス・ハ
ロフィルス（Bacillus halophilus)の株、バチルス・マセランス（Bacillus mac erans )の株、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium)の株、バチルス・
オーベンシス（Bacillus ohbensis)の株、バチルス・ステアロサーモフィルス（ Bacillus stearothermophilus )の株、バチルス・サブチリス（Bacillus subtili s )の株、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae)の株、サーモア
ネロバクター種（Thermoanaerobacter sp.) の株、サーモアネロバクター・エタ
ノリクス（Thermoanaerobacter ethanolicus) の株、サーモアネロバクター・フ
ィニイ（Thermoanaerobacter finnii)の株、クロストリジウム・サーモアミロリ
チクム（Clostridium thermoamylolyticum) の株、クロストリジウム・サーモサ
ッカロリチクム（Clostridium thermosaccharolyticum)の株、又はサーモアネロ
バクテリウム・サーモスルフリゲネス（Thermoanaerobacterium thermosulfurig enes ) の株から得られることを特徴とする請求項２に記載のオーラル・ケア組成
物。
【請求項４】前記デンプン改変酵素がトランスグルコシダーゼであること
を特徴とする請求項１に記載のオーラル・ケア組成物。
【請求項５】前記トランスグルコシダーゼがアスペルギルス・ニゲル（As pergillus niger )から得られることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】前記デンプン加水分解酵素がα−アミラーゼであることを特
徴とする請求項１に記載のオーラル・ケア組成物。
【請求項７】前記α−アミラーゼが細菌のα−アミラーゼであることを特
徴とする請求項６に記載のオーラル・ケア組成物。
【請求項８】前記α−アミラーゼが、バチルス・サブチリス由来のα−ア
ミラーゼ；バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens)
由来のα−アミラーゼ；バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearot hermophilus )由来のα−アミラーゼ；アスペルギルス・オリザエ（Aspergillus oryzae ）由来のα−アミラーゼ；及び非病原性微生物由来のα−アミラーゼから
選択されることを特徴とする請求項６又は７に記載のオーラル・ケア組成物。
【請求項９】前記α−アミラーゼが真菌のα−アミラーゼであることを特
徴とする請求項６に記載のオーラル・ケア組成物。
【請求項１０】前記デンプン加水分解酵素が枝切り酵素、特にプルラナー
ゼであることを特徴とする請求項１に記載のオーラル・ケア組成物。
【請求項１１】デキストラナーゼ及び／又はムタナーゼを更に含む請求項
２〜１０のいずれかに記載のオーラル・ケア組成物。
【請求項１２】前記ムタナーゼが、トリコデルマ・ハルジアヌム（Tricho derma harzianum )から得られるか、及び／又は前記デキストラナーゼがペシロマ
イセス（Paecilomyces) の株から得られることを特徴とする請求項１１に記載の
オーラル・ケア組成物。
【請求項１３】請求項１〜１２のいずれかに記載のオーラル・ケア組成物
を含むオーラル・ケア製品。
【請求項１４】歯みがきペースト、歯みがきゲル、歯みがき粉、口内洗浄
剤、義歯洗浄組成物、チューインガム、ロゼンジ、デンタルフロス又はつま楊枝
である請求項１３に記載のオーラル・ケア製品。
【請求項１５】プラーク形成を阻害し又はプラークを除去するための方法
であって、請求項１〜１２のいずれかに記載のオーラル・ケア組成物又は請求項
１３もしくは１４に記載のオーラル・ケア製品を、歯及び／又は歯肉に、プラー
ク阻害又はプラーク除去効果を得るために十分な期間、接触させることを含む方
法。
【請求項１６】歯みがきペースト又は歯みがきゲルの形態である請求項１
４に記載のオーラル・ケア製品で、規則的に歯をブラッシングすることを含む請
求項１５に記載の方法。
【請求項１７】口内洗浄剤の形態である請求項１４に記載のオーラル・ケ
ア製品で、規則的に口をゆすぐことを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】前記オーラル・ケア製品がチューインガムの形態であるこ
とを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】プラーク形成の阻害及び／又はプラークの除去のためのオ
ーラル・ケア組成物の調製のための少くとも１つデンプン加水分解酵素の使用。
【請求項２０】前記デンプン加水分解酵素が請求項１〜５，１１又は１２
のいずれかに記載のものであることを特徴とする請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】プラーク形成の阻害及び／又はプラークの除去のためのオ
ーラル・ケア組成物の調製のための少くとも１のデンプン改変酵素の使用。
【請求項２２】前記デンプン改変酵素が請求項１，６〜１０，１１又は１
２のいずれかに記載のものであることを特徴とする請求項２１に記載の使用。