DE102004046116A1

DE102004046116A1 - Pullulanasen aus psychrophilen Organismen

Info

Publication number: DE102004046116A1
Application number: DE200410046116
Authority: DE
Inventors: Roland Dr. Breves; Frank Dr. Janßen; Garabed Antranikian; Farah Mitry Qoura
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2004-09-23
Filing date: 2004-09-23
Publication date: 2006-04-06
Also published as: WO2006032477A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Hydrolasen, insbesondere Pullulanasen, aus psychrophilen Organismen sowie deren Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Hydrolasen, insbesondere Glycosidasen, vor allem Pullulanasen, aus psychrophilen Organismen sowie deren Verwendung.

Pullulanasen sind eine Klasse von Enzymen die in der Lage sind, α-glycosidisch verknüpfte Polysaccharide, insbesondere α-(1,4) bzw α-(1,6)-Glycoside zu spalten. Der Prototyp eines solchen Polymers ist das sogenannte Pullulan, das z.B. von dem hefeähnlichen Pilz Pullularia pullulans (Aureobasisium pullulans) gebildet wird. Pullulan besteht aus α-(1,6)-glycosidisch verknüpften Maltotrioseeinheiten. Zm Abbau von Pullulan sind eine Reihe verschiedener Enzymspezifitäten befähigt, die je nach Angriffsort und resultierenden Endprodukten als Pullulanasen, als Neopullulanasen, Isopullulanasen oder auch als Glucoamylasen bezeichnet werden. Eine Übersicht wird von Doman-Pytka und Bardowski, (Crit Rev Microbiol, 2004, Bd. 30, 107-121) gegeben.

Die Verwendung von biotechnologisch hergestellten Pullulanasen in technischen Prozessen zum Stärkeabbau, in der Lebensmitteltechnologie oder Bierbrauerei ist bekannt. Da diese Prozesse meist bei erhöhter Temperatur ablaufen, werden hierzu üblicherweise thermostabile Enzyme aus mesophilen, thermophilen oder hyperthermophilen Mikroorganismen verwendet. Die Verwendung von nur mäßig thermostabilen oder psychrophilen Enzymen bzw. von Enzymen aus solchen Organismen ist dagegen kaum untersucht worden, insbesondere nicht zum Zwecke der Reinigung von Oberflächen und der Entfernung von Biofilmen.

Bei Biofilmen handelt es sich um mikrobiell verursachte Beläge auf unterschiedlichen Oberflächen. Die Bildung der Biofilme ist ein sequenzieller Prozess, der mit der Anheftung von Zellen auf einer Oberfläche beginnt. Die Zellen vermehren sich und produzieren „extrazelluläre polymere Substanzen" (EPS). Diese schützen die Zellen vor äußeren Einwirkungen, wie z.B. Antibiotika oder Desinfektionsmitteln. EPS besteht aus Proteinen und Polysacchariden. In diese Polymermatrix können noch weitere Schweb- und Inhaltsstoffe (Schmutz, Hautreste, Kalk, abgestorbene Zellen, etc.) aus dem zellumgebenden Medium eingelagert werden. Letztendlich führt dies zur Schmutz- und Belagsbildung auf Oberflächen, wobei der Schmutz oftmals sehr fest mit der Oberfläche verbunden ist. Ein wesentlicher Bestandteil der EPS sind dabei Polysaccharide, die je nach Art des Biofilms stark unterschiedlich zusammengesetzt sein können. Darunter sind auch oft α-glycosidisch verknüpfte Polysaccharide zu finden, z.B. α-(1,4) bzw α-(1,6)-Glycoside, die Strukturelemente des Pullulans, auch in Kombination mit anderen Bausteinen, enthalten und durch Enzyme, die zum Pullulanabbau befähigt sind, angegriffen werden.

Der Einsatz von Enzymen zur Entfernung bzw. zur Erleichterung der mechanischen Entfernung von Biofilmen ist ebenso wie der Einsatz zur Entfernung von Schmutzresten von Oberflächen in der Literatur bereits beschrieben.

So lehrt die europäische Patentschrift EP 946 207 B1 (entspr. WO 98/26807) die enzymatische Behandlung von Biofilmen mit Kombinationen aus Hydrolasen, die zur Ablösung und Entfernung der Biofilme von der Oberfläche dienen, und Oxidoreductasen, die die enthaltenen Bakterien abtöten. Mit diesen Systemen werden harte Oberflächen aus den unterschiedlichsten Materialien in verschiedenen industriellen Bereichen, beispielsweise Kühltürmen, Molkereibetrieben oder Chemieanlagen, gereinigt und desinfiziert, aber auch weiche Oberflächen wie Haut, Haare oder Textilien.

EP 388 115 befaßt sich mit der Zerstörung und Entfernung von Schleim auf industriellen, wasserumspülten Oberflächen. Hierzu werden Glucanasen, Cellulasen, Amylasen und/oder Proteasen eingesetzt, die gezielt die Polysaccharide der Schleimmatrix zersetzen; anschließend sollen die nunmehr zugänglichen Mikroorganismen der Wirkung von Bioziden ausgesetzt werden.

In der WO 01/09295 werden Enzyme mit einer β-(1,6)-Endoglucanaseaktivität sowie entsprechende DNA-Sequenzen beansprucht, weiterhin eine Enzymzubereitung zum Abbau β-1,6-glucanhaltiger Materialien und ihre Verwendung. Die β-(1,6)- Endoglucanasen dienen auch zur Entfernung von Biofilmen von verschiedenen Oberflächen. Hauptsächlich befaßt sich diese spanische Schrift jedoch mit dem Abbau der β-1,6-glucanreichen Zellwand bestimmter Pilze.

Auch die WO-Schrift 96/36569 beschreibt eine enzymatische Methode zur Entfernung von Biofilmen. Hierbei wird eine Mannanase, gegebenenfalls in Kombination mit mindestens einem weiteren Enzym, eingesetzt, um in industriellen wasserführenden Systemen die Schleimbildung zu vermeiden und bestehenden Schleim zu entfernen. Gemäß WO 96/17632 kann diese Aufgabe auch mit Kombinationen kurzkettiger Glykolkomponenten mit mindestens einem Enzym aus der Gruppe Polysaccharidasen, Proteasen, Lipasen und Glycoproteasen gelöst werden.

Die internationale Anmeldung WO 01/53010 lehrt ebenfalls einen enzymatischen Prozeß zur Entfernung von Biofilmen von verschiedenen mit Wasser oder wäßrigen Lösungen umspülten Oberflächen in industriellen Systemen sowie im medizinischen Bereich, wobei sich die Biofilme sowohl oberhalb der Wasseroberfläche, also an fest/flüssig/Luft-Grenzflächen, als auch unter Wasser, an fest/flüssig- Grenzflächen, befinden. Bei den eingesetzten Enzymen handelt es sich um Carbohydrasen oder Proteasen, Kombinationen aus diesen beiden Enzymen sind ebenfalls möglich. Gegebenenfalls kann die Reinigungslösung neben den genannten Enzymen weitere Aktivstoffe wie Korrosionsinhibitoren, Tenside, Biozide etc. enthalten.

WO 99/20239 beschreibt die Verwendung von Zusammensetzungen zur Verhinderung von Plaque, die Stärke hydrolysierende Enzyme, z.B. eine α-Amylase oder eine Pullulanase, und/oder Stärke modifizierende Enzyme wie Transglucosidasen enthalten können.

Ein Problem der im Stand der Technik beschriebenen Hydrolasen ist jedoch ihr Temperaturoptimum. Hydrolasen für technische Anwendungen werden in der Regel aus Organismen gewonnen, deren Temperaturoptimum bei 37 °C oder höher liegt. Entsprechend findet man bei den aus diesen Organismen isolierten Enzymen die höchste Aktivität im Bereich von ≥ 30 °C, das Temperaturoptimum der bekannten Pullulanasen liegt sogar zwischen 50 und 95°C (Doman-Pytka und Bardowski, Critical Reviews in Microbiology, 30, 107-121, 2004). Bei der Entfernung von Biofilmen beispielsweise im Haushaltsbereich liegt die Einwirktemperatur jedoch bei niedrigeren Temperaturen (15-20 °C), sodass die Effizienz der eingesetzten Enzyme bei ihrem Einsatz erniedrigt ist. Man trifft auf das gleiche Problem, wenn man Enzyme zum Reinigen temperaturempfindlicher Wäsche einsetzen will, die nur bei niedriger Temperatur gewaschen werden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, Hydrolasen zur Verfügung zu stellen, die bei niedrigen Temperaturen eine hohe Aktivität, insbesondere α-1,4- und/oder α-1,6-glykosidische Aktivität, besitzen, und dadurch zum Biofilmabbau und/oder zur Schmutzentfernung von Oberflächen insbesondere bei niedrigen Temperaturen besonders gut geeignet sind, vorzugsweise besser als die im Stand der Technik beschriebenen Hydrolasen.

Überraschenderweise konnte nun durch Screening auf hydrolytische Aktivität ein neues psychrophiles Bakterium – also ein Bakterium, das bevorzugt bei niedrigen Temperaturen wächst – der Spezies Shewanella entdeckt werden, das ein solches Enzym enthält. Das Enzym konnte isoliert und seine Sequenz ermittelt werden (SEQ ID NO: 1). Es wird davon ausgegangen, dass es die ersten 23 Aminosäuren des Polypeptids gemäß SEQ ID NO: 1 ein Signalpeptid darstellen, das den Transport des Proteins durch die Zellwand vermittelt und anschließend abgespalten wird. Das Bakterium wurde gemäß dem Budapester Übereinkommen als Shewanella sp. 40-3 bei der DMSZ in Braunschweig (Deutschland) hinterlegt (Hinterlegungsnummer DSM 16509).

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher das Bakterium Shewanella sp. 40-3 sowie dessen Verwendung zur Isolation von Enzymen, insbesondere Hydrolasen, vor allem Pullulanasen, und dessen Verwendung zum Abbau von Polysacchariden, insbesondere zum Abbau von Pullulan, dessen Verwendung zur Spaltung von α-1,4- und/oder α-1,6-Bindungen, vorzugsweise α-1,6-Bindungen zwischen D-Monosacchariden, insbesondere zwischen D-Glucose-Einheiten, sowie dessen Verwendung zum Abbau von Biofilmen und zur Entfernung von Schmutzresten von Oberflächen.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolation von Hydrolasen, bevorzugt Glycosylasen, besonders bevorzugt Glycosidasen, insbesondere Glycosylhydrolasen nach der Klassifizierung von Henrissat, vor allem Pullulanasen, aus psychrophilen Bakterien und/oder gram-negativen Proteobakterien, insbesondere aus Shewanella sp., vor allem aus Shewanella sp. 40-3. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Enzyme, insbesondere Hydrolasen, bevorzugt Glycosylasen, besonders bevorzugt Glycosidasen, insbesondere Glycosylhydrolasen nach der Klassifizierung von Henrissat, vor allem Pullulanasen, die aus psychrophilen Bakterien und/oder gram-negativen Proteobakterien, insbesondere aus Shewanella sp., vor allem Shewanella sp. 40-3, erhältlich sind.

Das Verfahren zur Isolation und/oder Identifizierung solcher Enzyme kann hierbei insbesondere folgende Schritte umfassen:

a) Isolation von genomischer DNA aus einem psychrophilen Bakterium und/oder gram-negativen Proteobakterium, insbesondere aus Shewanella sp., vor allem aus Shewanella sp. 40-3,
b) Verdau der genomischen DNA mittels geeigneter Restriktionsendonukleasen,
c) Einbau der DNA-Banden mit einer Größe zwischen 2 und 15 kbp, insbesondere zwischen 5 und 10 kbp, in einen Transfektionsvektor,
d) Erstellen einer Genbank durch Transfektion eines Wirts, insbesondere E. coli, mit dem Transfektionsvektor,
e) Screening der Genbank nach Zellen, die Enzyme mit gewünschter Aktivität, insbesondere Hydrolase-Aktivität, bevorzugt Glycosylase-Aktivität, besonders bevorzugt Glycosidase-Aktivität, vor allem Pullulanase-Aktivität, enthalten,
f) gegebenenfalls Isolation des Plasmids mit dem Klon mit der gewünschten Aktivität, und
g) gegebenenfalls Sequenzierung des isolierten Klons.

Für den Fachmann ist naheliegend, wie er ausgehend von Nukleinsäuren gemäß SEQ ID NO: 1 oder Polypeptiden gemäß SEQ ID NO: 2 Nukleinsäuren und Polypeptide ähnlicher Struktur und gleicher oder ähnlicher Funktion erhalten kann. Insbesondere können auch, beispielsweise durch Evolutionsexperimente, Enzyme mit verbesserten Eigenschaften erhalten werden.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 70 bis Position 4323 gemäß SEQ ID NO: 1,
b) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 24 bis Position 1440 gemäß SEQ ID NO: 2,
c) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (b), insbesondere solche, die bis zu 50 oder 40, insbesondere bis zu 30 oder 20, vor allem bis zu 10, 5, 3 oder 2 Punkmutationen oder genau eine Punktmutation in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a) oder (b) besitzen,
d) zu einem Polynukleotid gemäß (a), (b) oder (c) komplementäre Polynukleotide,
e) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d) hybridisierende Polynukleotide, wobei unter stringenten Bedingungen vorzugsweise zu verstehen ist Inkubation bei 60°C in einer Lösung, enthaltend 0,1xSSC und 0,1 % Natriumdodecylsulfst (SDS), wobei 20xSSC eine Lösung enthaltend 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumcitrat (pH 7.0) bezeichnet,
f) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 % oder 70 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 % oder 95 %, insbesondere mindestens 98 % in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d),
g) Polynukleotide, bestehend aus mindestens 10 oder 15, bevorzugt mindestens 20 oder 25, besonders bevorzugt mindestens 30 oder 40, ganz besonders bevorzugt mindestens 50 oder 80, insbesondere mindestens 100 oder 150 aufeinanderfolgenden Nukleinsäuren eines Polynukleotids gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e),
h) Polynukleotide mit Deletionen und/oder Insertionen und/oder Inversionen von bis zu 50 oder 40, insbesondere bis zu 30, 20 oder 10 Nukleotiden gegenüber einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e),
i) Polynukleotide, umfassend mindestens eines der unter (a) bis (h) genannten Polynukleotide.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren eine oder mehrere nicht-kodierende Sequenzen, wobei es sich bei den nicht-kodierenden Sequenzen beispielsweise um natürlicherweise vorkommende Intronsequenzen oder regulatorische Sequenzen, wie Promotor- oder Enhancer-Sequenzen, insbesondere um solche zur Kontrolle der Expression von Hydrolasen, bevorzugt von Glycosylasen, besonders bevorzugt Glycosidasen, insbesondere von Glycosylhydrolasen nach der Klassifizierung von Henrissat, vor allem Pullulanasen, und/oder zur Kontrolle der Expression von Enzymen aus psychrophilen Bakterien und/oder gram-negativen Proteobakterien, bevorzugt Shewanella, vor allem Shewanella sp. 40-3, handelt.

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Ribonukleinsäuren (RNAs) oder Desoxyribonukleinsäuren (DNAs), wobei die Nukleinsäuren vorzugsweise als doppelsträngige Nukleinsäuren vorliegen. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren um Nukleinsäuren, die für ein Protein mit Hydrolase-Aktivität oder für Teile davon kodieren, wobei es sich bei den Teilen insbesondere um Domänen oder als Epitope verwendbare Sequenzen handelt, die beispielsweise für die Antikörperproduktion eingesetzt werden können. Unter Domänen sind erfindungsgemäß insbesondere auch solche Teile des Enzyms zu verstehen, die selbst nicht unmittelbar an der Hydrolyse beteiligt sein müssen, sondern auch andere Teil- oder Hilfsfunktionen innerhalb des Enzyms ausüben oder daran beteiligt sein können, wobei es sich bei den Teil- oder Hilfsfunktionen beispielsweise um die Bindung eines Substrats, Zwischen- oder Endprodukts, um eine Carrier-Funktion, um die Vermittlung eines regulierenden Einflusses auf die hydrolytische Aktivität oder des weiteren etwa auch um die Enzymverankerung handeln kann. Bei dem Protein mit Hydrolase-Aktivität handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine Glycosylase, besonders bevorzugt Glycosidase (E.C.3.2.1), insbesondere Glycosylhydrolase nach der wieter unten angegebenen Klassifizierung von Henrissat, vor allem Pullulanase (E.C.3.2.1.41), und/oder um ein Enzym, das dazu in der Lage ist, α-1,4- und/oder α-1,6-Bindungen, besonders bevorzugt α-1,6-Bindungen, zwischen D-Monosacchariden, insbesondere zwischen D-Glucose-Einheiten, zu spalten. Mit Spaltung ist erfindungsgemäß vor allem hydrolytische Spaltung, also Spaltung unter Freisetzung der jeweiligen Zuckerreste gemeint.

Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der Hydrolase bzw. Pullulanase um eine Hydrolase mit (β/α)₈-Faltung ((β/α)₈-Barrel-Struktur) und/oder um eine Hydrolase, die ein solches Strukturelement umfasst.

In einer bevorzugten Ausführungsform hat ein erfindungsgemäßes Polypeptid sein Temperaturoptimum, vor allem in Bezug auf den Biofilmabbau, bei einer Temperatur zwischen 4 und 40°C, besonders bevorzugt zwischen 10 und 35°C, vor allem zwischen 15 und 30°C. Das pH-Optimum eines erfindungsgemäßen Polypeptids liegt vorzugsweise zwischen pH 5 und pH 9, besonders bevorzugt zwischen pH 6 und pH 8, vor allem zwischen pH 6,5 und pH 7,5.

Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich bevorzugt um Nukleinsäuren, die für eine Pullulanase, besonders bevorzugt für eine mikrobielle Pullulanase, vor allem eine bakterielle Pullulanase, insbesondere für eine Pullulanase aus einem psychrophilen Bakterium und/oder aus einem gram-negativen Proteobakterium, bevorzugt aus Shewanella sp., vor allem aus Shewanella sp. 40-3 und/oder für eine Pullulanase gemäß SEQ ID No. 2 kodieren.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum einen zur Herstellung oder Isolierung von erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, zum anderen zur Herstellung oder Isolierung neuer, zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren homologen Nukleinsäuren, insbesondere solchen mit in Bezug auf die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ähnlichen strukturellen und gleichen, ähnlichen und/oder verbesserten funktionellen Eigenschaften, wobei unter funktionellen Eigenschaften insbesondere Hydrolase-Aktivität, bevorzugt Glycosylase-Aktivität, besonders bevorzugt Glycosidase-Aktivität, vor allem Pullulanase-Aktivität und unter verbesserten funktionellen Eigenschaften beispielsweise höhere Spezifität und/oder höherer Umsatz und/oder höhere Stabilität des Enzyms bei den gewünschten Reaktionsbedingungen, insbesondere in Bezug auf den pH-Wert, die Temperatur sowie in Bezug auf die gegebenenfalls zugesetzten Detergentien und Proteasen, zu verstehen ist.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können so beispielsweise als Sonden zur Identifzierung und/oder Isolierung von homologen Nukleinsäuren aus einer artifiziellen, einer cDNA- oder genomischen Genbank, hierbei vorzugsweise zur Identifizierung von Nukleinsäuren, die für Hydrolasen, insbesondere Glycosylasen, besonders bevorzugt Glycosidasen, insbesondere Glycosylhydrolasen nach der Klassifizierung von Henrissat, vor allem Pullulanasen und/oder für Teile davon kodieren, oder als Antisense-Nukleinsäuren oder als Primer in der Polymerasekettenreaktion (PCR), hierbei insbesondere zur Amplifikation von Nukleinsäuren umfassend Nukleinsäuren kodierend für Hydrolasen, bevorzugt Glycosylasen, besonders bevorzugt Glycosidasen, vor allem Glycosylhydrolasen nach der Klassifizierung von Henrissat, insbesondere für Pullulanasen oder für Teile davon, verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen oder zu den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren homologe Nukleinsäuren können aber auch durch Zufallsmutagenese oder zielgerichtete Mutagenese, in einer dem Fachmann bekannten Weise, erhalten werden.

Nach Einbau in einen Expressionsvektor können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beispielsweise zur gezielten Herstellung einzelner Domänen oder Epitope des erfindungsgemäßen Proteins oder zur Herstellung von Fusionsproteinen, die die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen, verwendet werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch ein Verfahren, um eine Nukleinäure zu erhalten, die für eine Hydrolase, bevorzugt Glycosylase, besonders bevorzugt Glycosidase, insbesondere Pullulanasen oder für Teile davon kodiert, folgende Schritte umfassend:

a) eine Nukleinsäurebibliothek wird mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kontaktiert,
b) eine Nukleinsäure, die mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäure gemäß (a) hybridisiert, wird identifiziert,
c) die in Schritt (b) identifizierte Nukleinsäure wird sequenziert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenso ein Verfahren zur Isolierung einer für eine Hydrolase, bevorzugt Glycosylase, besonders bevorzugt Glycosidase, insbesondere Pullulanase oder für Teile davon kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend:

a) ausgehend von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure werden Primer hergestellt,
b) die Primer gemäß (a) werden verwendet, um in der PCR Nukleinsäuren, vor allem cDNAs, unbekannter Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren,
c) die gemäß (b) durch Amplifikation erhaltenen Nukleinsäuren werden sequenziert.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein Verfahren zur Isolierung einer für eine Hydrolase, bevorzugt Glycosylase, besonders bevorzugt Glycosidase, insbesondere Pullulanase oder für Teile davon kodierenden Nukleinsäure, folgende Schritte umfassend:

a) Nukleinsäuren einer Bibliothek werden in geeignete Vektoren eingebaut und diese in passende Wirtsorganismen, vorzugsweise Bakterien, insbesondere E. coli, eingebracht, so daß die Expression der Nukleinsäuren erfolgen kann,
b) Die gemäß (a) erhaltenen Wirtsorganismen werden auf einem festen Träger, vorzugsweise einer Agar-Platte, ausplattiert und inkubiert, auf dem festen Träger wird ein Assay, beispielsweise eine Farbreaktion, durchgeführt, der die Umsetzung eines Hydrolase-Substrats involviert,
c) Hydrolase-positive Klone werden identifiziert, beispielsweise durch visuelle Beobachtung, durch automatisierte Imageanalyse oder mittels photometrischer Messung, und gereinigt,
d) die Nukleinsäuren aus den in Schritt (c) identifizierten Klone werden sequenziert.

a) eine erfindungsgemäße Nukleinsäure wird Mutagenese-Experimenten unterworfen,
b) die erhaltenen Mutanten werden in einen geeigneten Vektor eingebaut und in einem geeigneten Wirtsorganismus exprimiert,
c) die Expressionsprodukte werden auf hydrolytische Aktivität, insbesondere Pullulanase-Aktivität, hin untersucht,
d) die Nukleinsäuren, deren Expressionsprodukte in Schritt (c) die gewünschte hydrolytische Aktivität zeigen, werden sequenziert.

Die Mutagenese-Experimente können beispielsweise unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) durchgeführt werden. Die Experimente können hierbei beispielsweise, insbesondere bei Verwendung einer Taq- Polymerase, so durchgeführt werden, dass Reaktionsparameter wie die Mg2+-Konzentration, der pH-Wert, die Reaktionstemperatur oder die Substratkonzentrationen variiert werden, oder es kann zum Einsatz von Error-prone-PCR-Techniken kommen, die beispielsweise auf der Zugabe von Mn2+ oder auf der Zugabe ungleicher Nukleotidkonzentrationen beruhen.

Bei der erfindungsgemäß zu verwendenden Nukleinsäure-Bibliothek kann es sich beispielsweise um eine cDNA-, um eine genomische oder um eine artifizielle Bibliothek handeln. Bevorzugt handelt es sich um eine mikrobielle, besonders bevorzugt um eine bakterielle Bibliothek, vor allem aus psychrophilen Bakterien, insbesondere um eine solche aus Shewanella, vor allem aus Shewanella sp. 40-3.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Nukleinsäure, die nach einem der vorher genannten Verfahren erhältlich ist.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure chemisch synthetisiert wird. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können beispielsweise chemisch anhand der in SEQ ID NO: 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz oder anhand der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz auf Grundlage des genetischen Codes z.B. nach der Phosphotriester-Methode oder auf eine andere dem Fachmann bekannten Weise synthetisiert werden.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Vektoren, insbesondere Klonierungs- und/oder Expressionsvektoren, umfassend eine der zuvor genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren. Der Vektor kann beispielsweise ein prokaryotischer oder eukaryotischer Vektor sein. Bei den prokaryotischen Vektoren zum Einbau der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren handelt es sich beispielsweise um das Plasmid pBK-CMV, um das Plasmid pBR322, um Plasmide der pUC-Serie, um Derivate von pUB 110 oder um andere Plasmide die für die Expression in gram-negativen oder gram-positiven Bakterien geeignet sind.

Bei den Expressionsvektoren für die Expression in E. coli kann es sich beispielsweise aber auch um andere kommerziell erhältliche Vektoren handeln, wie etwa den T7-Expressionsvektor pGM10 oder pGEX-4T-1 GST (Pharmacia Biotech), welche für einen N-terminalen Met-Ala-His6-Tag kodieren, der die Reinigung des exprimierten Proteins über ein Ni2+-NTA-Säule ermöglicht. Als eukaryotische Expressionsvektoren für die Expression in Saccharomyces cerevisiae eignen sich z.B. die Vektoren p426Met25 oder p426GAL1, für die Expression in Insektenzellen z.B. Baculovirusvektoren wie in EP-B1-0127839 oder EP-B1-0549721 offenbart, und für die Expression in Säugerzellen z.B. SV40-Vektoren.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren können in einer Ausführungsform so mit flankierenden Nukleinsäuren in einen Vektor eingebaut werden, dass bei Expression des Vektors die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Polypeptide als Fusionsproteine vorliegen oder einen tag, eine markierende Aminosäuresequenz, tragen, die beispielsweise die Reinigung und/oder Detektion der Polypeptide erleichtern kann. Bei dem tag kann es sich beispielsweise um das strep-, flag-, myc- oder his-tag handeln.

Die Expressionsvektoren enthalten bevorzugt die für die Wirtszelle geeigneten requlatorischen Sequenzen, hierbei vorzugsweise den lac- oder den tac-Promotor für die Expression in E. coli, den ADH-2-, GAL1- oder AOX-Promotor für die Expression in Hefen, den Baculovirus-Polyhedrin-Promotor für die Expression in Insektenzellen oder den frühen SV40-Promotor oder einen LTR-Promotor für die Expression in Säugerzellen.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Wirtszelle umfassend einen erfindunsgemäßen Vektor, wobei es sich bei der Wirtszelle bevorzugt um Shewanella, insbesondere um Shewanella sp. 40-3, oder E. coli, insbesondere um den E. coli-Stamm BL21 (DE3), oder um Bacillus, insbesondere um Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus, handelt.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren werden bevorzugt nach Einbau in einen geeigneten Vektor durch die dem Fachmann bekannten Methoden der Transfektion, Transformation oder Elektroporation in die Wirtszellen eingebracht.

Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder von Position 24 bis Position 1440 gemäß SEQ ID NO: 2,
b) natürlicherweise vorkommende Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptids gemäß (a), vor allem solche, die bis zu 20, 15 oder 10 Punktmutationen, insbesondere bis zu 5, 3 oder 2 Punktmutationen oder genau eine Punktmutation, in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) besitzen,
c) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 60 % oder 70 %, ganz besonders bevorzugt mindestens 80 oder 90 %, insbesondere mindestens 95 oder 98 % in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) oder (b) besitzen,
d) Polypeptide, die von den zuvor genannten erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodiert werden,
e) Polypeptide bestehend aus mindestens 5 oder 6, bevorzugt mindestens 8 oder 10, besonders bevorzugt mindestens 15 oder 20, insbesondere mindestens 30, 40 oder 50 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids gemäß (a) oder (b),
f) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen und/oder Inversionen von bis zu 60, 50 oder 40, insbesondere von bis zu 30, 20 oder 10, vor allem von ein, zwei oder drei Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a), (b) oder (c),
g) Polypeptide, umfassend mindestens eines der unter (a) bis (f) genannten Polypeptide.

Bevorzugt handelt es sich hierbei um Polypeptide, die eine Hydrolyse-Reaktion katalysieren, insbesondere die Hydrolyse von α-1,4- und/oder α-1,6-Bindungen, besonders bevorzugt von α-1,6-Bindungen, zwischen D-Monosacchariden, insbesondere zwischen D-Glucose-Einheiten, oder es handelt sich um Teile, insbesondere Epitope oder Domänen, von solchen Polypeptiden, wobei unter Domänen erfindungsgemäß insbesondere auch solche Teile des Enzyms zu verstehen sind, die selbst nicht unmittelbar an der Hydrolyse beteiligt sein müssen, sondern auch andere Teil- oder Hilfsfunktionen innerhalb des Enzyms ausüben oder an solchen beteiligt sein können, wobei es sich bei den Teil- oder Hilfsfunktionen beispielsweise um die Bindung eines Substrats, eines Zwischen- oder Endprodukts, um eine Carrier-Funktion, um die Vermittlung eines regulierenden Einflusses auf die hydrolytische Aktivität oder etwa auch um die Enzymverankerung handeln kann. Die Epitope und/oder Domänen können hierbei sowohl isoliert als auch als Teil eines chimären Proteins und/oder als Teil eines Fusionsproteins vorliegen.

Bei dem Protein mit Hydrolyse-Aktivität handelt es sich hierbei vorzugsweise um eine Glycolase, besonders bevorzugt Glycosidase (E.C.3.2.1), vor allem Pullulanase (E.C.3.2.1.41) und/oder es handelt sich um eine Hydrolase mit (β/α)₈-Faltung ((β/α)₈-Barrel-Struktur) und/oder es handelt sich um eine Hydrolase, die zur Familie der Glycosylhydrolasen nach der unten angegebenen Klassifizierung von Henrissat gehört oder zu diesen Enzymen homolog ist und/oder es handelt sich um ein Enzym, das für den Biofilmabbau geeignet ist.

Die Einteilung der Glycosylhydrolasen erfolgt nach der Klassifizierung von Henrissat (Henrissat B., Bairoch A. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem. J. 316:695-696(1996)). Die aktuelle Version der Zuordnung ist in der CAZY-Datenbank (Coutinho, P.M. & Henrissat, B. (1999) Carbohydrate-Active Enzymes server at URL: http://afmb.cnrs-mrs.fr/~cazy/CAZY/index.html) dokumentiert. Danach sind Pullulanasen und verwandte Enzyme in der Glycosylhydrolase-Familie (GHF) 13 zu finden. Diese Enzyme zeichnen sich neben der gemeinsamen (β/α)₈-Barrel-Struktur durch die Fähigkeit der Hydrolyse α-ständiger Glycosidbindungen aus. Neben Pullulanasen (EC 3.2.1.41) und Neopullulanasen (EC 3.2.1.135) sind dort auch Amylasen (EC 3.2.1.1), Cyclomaltodextrin Glucanotransferase (EC 2.4.1.19), Cyclomaltodextrinase (EC 3.2.1.54), Trehalose-6-phosphate Hydrolase (EC 3.2.1.93), Oligoglucosidase (EC 3.2.1.10), Maltogenic Amylase (EC 3.2.1.133), Alpha-glucosidase (EC 3.2.1.20), Maltotetraose-forming Amylase (EC 3.2.1.60), Isoamylase (EC 3.2.1.68), Glucodextranase (EC 3.2.1.70), Maltohexaose-forming Amylase (EC 3.2.1.98), Branching Enzyme (EC 2.4.1.18), Trehalose Synthase (EC 5.4.99.16), 4-Glucanotransferase (EC 2.4.1.25), Maltopentaose-forming Amylase (EC 3.2.1.-), Amylosucrase (EC 2.4.1.4), Sucrose Phosphorylase (EC 2.4.1.7), Maltooligosyltrehalose Trehalohydrolase (EC 2.4.1.141) sowie Isomaltulose Synthase (EC 5.4.99.11) zu finden.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide umfassen vorzugsweise vier hochkonservierte Bereiche, wie sie für Pullulan abbauende Enzyme typisch sind. Diese bilden das Reaktionszentrum und sind in die Substratbindung involviert. Diese konservierten Bereiche werden beispielsweise durch Doman-Pytka und Bardowski (Critical Reviews in Microbiology, 30, 107-121, 2004) charakterisiert.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können auch posttranslational und/oder chemisch modifiziert sein.

Bei den Verbindungen, die durch die erfindungsgemäßen Polypeptide gespalten werden können, handelt es sich insbesondere um Verbindungen, die D-Monosaccharide, insbesondere D-Glucose-Einheiten, enthalten, die über α-1,4- und/oder α-1,6-Bindungen miteinander verknüpft sind. Es handelt sich hierbei vorzugsweise um Pullulan, es kann sich jedoch auch um andere Oligo- oder Polysaccharide handeln, die solche Bindungen enthalten, beispielsweise Amylopektin, Amylose, Dextrine und Glykogen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ebenfalls ein Verfahren zur Spaltung der zuvor erwähnten Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass diese Verbindungen mit mindestens einem erfindungsgemäßen Polypeptid inkubiert werden.

Weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ebenfalls die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zur hydrolytischen Spaltung von α-1,4- und/oder α-1,6-Bindungen, besonders bevorzugt von α-1,6-Bindungen, zwischen D-Monosacchariden, insbesondere zwischen D-Glucose-Einheiten, sowie die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polypeptids zum Abbau von Biofilmen und/oder zur Verhinderung der Ausbildung von Biofilmen sowie die Entfernung von Schmutzresten von Oberflächen.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Hydrolasen um mikrobielle, insbesondere bakterielle Hydrolasen. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um eine Hydrolase, insbesondere Pullulanase, aus einem psychrophilen Bakterium und/oder aus einem gram-negativen Proteobakterium, insbesondere aus Shewanella sp., besonders bevorzugt aus Shewanella sp. 40-3, vor allem um die Pullulanase mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Polypeptid um eine wasserlösliche Pullulanase. Das Polypeptid kann bei der Expression in Abhängigkeit von der Herstellungsweise, insbesondere in Abhängigkeit von den verwendeten Wirtszellen und Vektoren und in Abhängigkeit von gegebenenfalls verwendeten Signalsequenzen, im Cytosol, im Periplasma oder in an die cytosolische oder äußere Membran gebundener Form anfallen oder aber in das umgebende Medium abgegeben werden, wobei letzteres bevorzugt ist.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner Mischungen und Präparationen, vor allem bakterielle Präparationen, die erfindungsgemäße Nukleinsäuren und/oder Polypeptide enthalten. Die Mischungen oder Präparationen können hierbei in einer dem Fachmann bekannten Weise hergestellt werden.

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können des weiteren beispielsweise als Epitope zur Herstellung von mono- oder polyklonalen Antikörpern verwendet werden, indem sie an einen Träger, bspw. Rinder-Serumalbumin, gekoppelt werden und anschließend ein Säuger, bevorzugt eine Maus, ein Hase oder ein Kaninchen, mit dem Epitop, bevorzugt unter Verwendung von Adjuvantien, immunisiert wird. Hierzu eignen sich bevorzugt Polypeptide mit einer Länge von 5-12, insbesondere 8, Aminosäuren. Polypeptide mit einer Länge von mehr als 60, insbesondere mehr als 75 Aminosäuren, können auch ohne Träger zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden. Die entstandenen Antikörper können anschließend gegebenenfalls isoliert werden, und ausgehend von den Antikörpern oder der für sie kodierenden Nukleinsäuren können gegebenenfalls Antikörperfragmente, beispielsweise Fab- oder scFv-Fragmente hergestellt werden.

An ein erfindungsgemäßes Polypeptid bindende Peptide können alternativ auch durch ein dem Fachmann bekanntes in vitro-Verfahren wie beispielsweise Phage Display, Yeast Display, Bacterial Display oder etwa die sogenannte Fusagen-Technologie erhalten werden, bei der die Nukleinsäure und das von dieser kodierte Polypeptid über ein Puromycin kovalent miteinander verknüpft sind.

Die durch Immunisierung mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden erhältlichen Antiseren, Antikörper und Antikörperfragmente sowie die durch eines der genannten in vitro-Verfahren erhältlichen Peptide eignen sich beispielsweise zur Untersuchung von Genexpressionsbanken, um zu den erfindungsgemäßen Polypeptiden homologe Proteine, insbesondere solche mit hydrolytischer Aktivität, vor allem esterolytischer und/oder lipolytischer Aktivität, ausfindig zu machen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Antiseren, Antikörper und Antikörperfragmente gegen ein erfindungsgemäßes Polypeptid sowie andere an ein erfindungsgemäßes Peptid bindende Peptide, insbesondere erhältlich durch eines der zuvor genannten Verfahren.

Antiserum, Antikörper und Antikörperfragment sowie sonstige an ein erfindungsgemäßes Peptid bindende Peptide werden im folgenden der Einfachheit halber "Antikörper" genannt.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer geeigneten Wirtszelle, besonders bevorzugt in E. coli oder in Shewanella, insbesondere in Shewanella sp. 40-3, oder in Bacillus, insbesondere in Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis oder Bacillus alcalophilus, exprimiert wird. Anschließend kann gegebenenfalls eine Proteinreinigung erfolgen.

Kultivierung von E. coli erfolgt hierbei vorzugsweise zwischen 20 und 37°C, besonders bevorzugt bei etwa 30 °C oder bei etwa 37°C. Ernte und Aufschluß der Zellen erfolgen durch dem Fachmann bekannte Methoden. Der Aufschluß kann so beispielsweise durch French Press, Ultraschall, Kugelmühle, besonders bevorzugt jedoch durch Einsatz eines Sonifikators erfolgen. Alternativ können die Zellen auch chemisch, beispielsweise durch EDTA oder Polymyxin B permeabilisiert werden. Die gegebenenfalls durchzuführende Reinigung des Proteins erfolgt vorzugsweise chromatographisch. Die chromatographische Reinigung des Proteins kann beispielsweise die Kationen- und/oder Anionenaustauschchromatographie, die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie und/oder die Gelfiltration umfassen.

Vor allem die kurzkettigen erfindungsgemäßen Polypeptide können auch mit Hilfe der klassischen Peptidsynthese (Merrifleld-Technik) synthetisiert werden.

Erfindungsgemäß können auch ein oder mehrere Nukleotide der Nukleinsäure oder eine oder mehrere Aminosäuren der Polypeptide oder Antikörper modifiziert sein. Bei der Modifikation kann es sich beispielsweise um eine radioaktive, fluorogene oder chromogene Gruppe oder um eine posttranslationale Modifikation handeln.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind des weiteren wässrige Zubereitungen (Enzymzubereitungen), die die erfindungsgemäßen Polypeptide in gelöster Form enthalten. Die erfindungsgemäßen Enzymzubereitungen werden weiter unten genauer beschrieben.

Mögliche industrielle Anwendungen der erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder der erfindungsgemäßen Enzymzubereitungen sind beispielsweise die Herstellung oder selektive Anreicherung von Geschmackskomponenten in der Lebensmittelindustrie, von Feinchemikalien, insbesondere Zucker, in der chemischen Industrie oder von therapeutisch oder diagnostisch einsetzbaren Substanzen in der Pharmaindustrie, des weiteren die Prozessierung von Stärke zu Amylose, Glucosesirup, Maltosesirup, Dextrinen, Maltose oder zu hochreiner Glucose oder Fructose, der Abbau von Pullulan zu Panose, das zur Vorbeugung von Karies eingesetzt werden kann (Kuriki et al., J. Bacteriol. 170, 1554, 1988), die Behandlung von Lebensmitteln sowie die Spaltung von Getreide und Getreideprodukten in der Brauereiindustrie, insbesondere zur Herstellung von „light"-Bier. Der Einsatz kann hierbei auch in Kombination mit anderen Hydrolasen, insbesondere Glycosidasen, beispielsweise in Kombination mit α-Amylasen oder Glucoamylasen, erfolgen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder der erfindungsgemäßen Enzymzubereitungen, insbesondere in Sterilisations-, Desinfektions-, Wasch-, Geschirrspül- und Reinigungsmitteln, vor allem in Reinigern zur Entfernung von Biofilmen und/oder zur Entfernung von organischen Schmutz von harten Oberflächen. Der Einsatz kann hierbei insbesondere im Haushalt oder auf dem Gebiet der Arzneimittel-, Lebensmittel-, Brauerei-, Medizintechnik-, Farben-, Holz-, Textil-, Kosmetik-, Leder-, Tabak-, Pelz-, Seil-, Papier-, Zellstoff-, Kunststoff-, Treibstoff-, Öl-, Kautschuk- oder Maschinenindustrie oder in Molkereibetrieben erfolgen. Die erfindungsgemäßen Polypeptide können hierbei insbesondere zur Entfernung von Biofilmen von Haushalts- und/oder Sanitärgegenständen sowie in Zellstoff- und Papiermühlen, in Umlaufkühltürmen sowie in anderen Systemen, die fließendes und/oder umlaufendes Wasser führen, eingesetzt werden. Neben der Entfernung von Biofilmen sind die erfindungsgemäßen Polypeptide beispielsweise auch geeignet zum Einsatz in Waschmitteln zur Reinigung von Textilien, insbesondere zur Fleckentfernung.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher des weiteren auch Sterilisations-, Desinfektions-, Wasch-, Geschirrspül- und Reinigungsmittel, die erfindungsgemäße Polypeptide und/oder erfindungsgemäße Enzymzubereitungen enthalten. Bei dem Mittel kann es sich grundsätzlich um ein Mittel für jede beliebige Art von Oberfläche handeln. Es kann sich also bei der Oberfläche um eine biotische oder abiotische, künstlich synthetisierte oder natürliche, weiche oder harte Oberfläche handeln. Bei der Oberfläche kann es sich etwa um eine Textil-, Keramik-, Metall- und/oder Kunststoffoberfläche handeln. Bei dem Gegenstand kann es sich beispielsweise um Wäsche, Geschirr, Sanitäreinrichtungen, Bodenbeläge, Schuhe, Leder, aus Gummi hergestellte Gebrauchsgegenstände, Schiffsrümpfe, Prothesen, Zähne, Zahnersatz oder Katheter handeln.

Bei dem Reinigungsmittel kann es sich insbesondere um einen Haushaltsreiniger oder einen Reiniger für industrielle Anlagen, insbesondere der zuvor genannten, handeln. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Reiniger um einen solchen zum Säubern harter Oberflächen, wie zum Beispiel von Böden, Kacheln, Geschirr, Fliesen, Kunststoffen sowie anderen harten Oberflächen im Haushalt, in industriellen Anlagen, in öffentlichen sanitären Anlagen, in Schwimmbädern, Saunen, Sportanlagen oder in Arzt- oder Massagepraxen.

Medizinisch relevante Biofilme, die mit erfindungsgemäßen Poypeptiden entfernt werden können, sind beispielsweise Biofilme durch chronische Lungeninfektionen, die z.B. bei Mukoviszidose-Patienten auftreten können. Des weiteren kann es sich um Zahnbelag handeln oder um Biofilme, die von Kontaktlinsen, Implantaten oder von medizinischen Geräten, Instrumenten oder Apparaturen, wie Kathetern oder Endoskopen, entfernt werden müssen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder der erfindungsgemäßen Enzymzubereitungen in kosmetischen und/oder pharmazeutischen Produkten sowie kosmetische und/oder pharmazeutische Produkte, die die erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder Enzymzubereitungen enthalten sowie des weiteren die Verwendung der erfindungsgemäßen Polypeptide und/oder Enzymzubereitungen zur Herstellung von kosmetischen und/oder pharmazeutischen Produkten. Bei dem Produkt kann es sich beispielsweise um ein Produkt zur Entfernung von Zahnbelag von Zahnoberlächen oder um ein Produkt zur Entfernung von Biofilmen, die durch chronische Lungeninfektionen verursacht bzw. mit diesen verbunden sind, wie z.B. im Falle der Mukoviszidose, handeln. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher vor allem auch Mund-, Zahn- und Zahnprothesenpflegemittel, die die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten.

Die genannten erfindungsgemäßen Mittel und Produkte können weitere Komponenten enthalten wie sie dem Fachmann bekannt sind. Hierbei können die Sterilisations-, Desinfektions-, Wasch-, Geschirrspül- und Reinigungsmittel beispielsweise eine oder mehrere Komponenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, Buildern, Säuren, alkalischen Substanzen, Hydrotropen, Lösungsmitteln, Verdickungsmitteln, Farbstoffen, Parfums, Korrosionsinhibitoren und Hautschutzmitteln enthalten. Soll das Reinigungsmittel versprüht werden, kann gegebenenfalls auch ein Treibmittel enthalten sein. Das Reinigungsmittel ist vorzugsweise ein flüssiges wässriges Mittel, es kann sich jedoch beispielsweise auch um ein Gel, eine Paste oder um ein Pulver handeln.

Hinsichtlich Komponenten, die in Wasch- und Reinigungsmitteln vorzugsweise enthalten sind, sowie hinsichtlich Möglichkeiten der Enzymstabilisierung wird explizit auf den Offenbarungsgehalt der Anmeldung DE10309803.8 verwiesen, dessen diesbezüglicher Offenbarungsgehalt durch Referenz in den Offenbarungsgehalt der vorliegenden Anmeldung aufgenommen wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Erzeugnis, enthaltend eine erfindungsgemäße Enzymzubereitung oder ein erfindungsgemäßes Reinigungsmittel und einen Sprühspender.

Bevorzugt ist der Sprühspender ein manuell aktivierter Sprühspender, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Aerosolsprühspender (Druckgasbehälter; auch u.a. als Spraydose bezeichnet), selbst Druck aufbauende Sprühspender, Pumpsprühspender und Triggersprühspender, insbesondere Pumpsprühspender und Triggersprühspender mit einem Behälter aus transparentem Polyethylen oder Polyethylenterephthalat. Sprühspender werden ausführlicher in der WO 96/04940 (Procter & Gamble) und den darin zu Sprühspendern zitierten US-Patenten, auf die in dieser Hinsicht sämtlich Bezug genommen und deren Inhalt hiermit in diese Anmeldung aufgenommen wird, beschrieben. Triggersprühspender und Pumpzerstäuber besitzen gegenüber Druckgasbehältern den Vorteil, daß kein Treibmittel eingesetzt werden muß.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das die Enzymzubereitung enthaltende Mittel jedoch nicht als Aerosol zerstäubt, da hierbei gegebenenfalls geringe Mengen der Enzymzubereitung in die Atemwege geraten können und unter Umständen dort allergische Reaktionen auslösen könnten. Durch geeignete, partikelgängige Aufsätze, Düsen etc. (sog. "nozzle-Ventile") auf dem Sprühspender kann das Enzym in auf Partikeln immobilisierter Form dem Mittel beigefügt werden und als Reinigungsschaum dosiert werden. Bei der Erzeugung dieser kompakten Schäume entstehen keine lungengängigen Teilchen, so daß die Gefahr der Inhalation von Allergenen im wesentlichen gebannt wird.

Noch ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur Hydrolyse von Biofilmen auf harten Oberflächen, bei dem die Vitalität der mikrobiellen Zellen nicht geschädigt wird. Hierzu wird die erfindungsgemäße Enzymzubereitung oder das erfindungsgemäße Reinigungsmittel, gegebenenfalls unter Benutzung eines erfindungsgemäßen Erzeugnisses, auf die mit Biofilm überzogene Fläche aufgebracht und gegebenenfalls nach einer Einwirkzeit von 1 bis 30 Minuten, bei stärkerem Befall auch einige Stunden oder über Nacht, mit klarem Wasser abgespült. Die Zubereitung oder das Mittel kann auch vor dem Abspülen mit einem Tuch, einem Schwamm, einer Bürste oder einem sonstigen zur Reinigung geeigneten Utensil auf der von Biofilm befallenen Oberfläche verwischt oder verrieben werden, was z.B. bei Anwesenheit von Abrasivstoffen im Reinigungsmittel die Reinigungsleistung verbessert. Schließlich wird die Oberfläche mit einem trockenen Tuch abgetrocknet. Bei sehr starkem Befall der Oberfläche mit Biofilm kann der Reinigungsvorgang anschließend wiederholt werden.

Stoffe, die auch als Inhaltsstoffe von kosmetischen Mitteln dienen, werden nachfolgend ggf. gemäß der International Nomenclature Cosmetic Ingredient (INCI)-Nomenklatur bezeichnet. Chemische Verbindungen tragen eine INCI-Bezeichnung in englischer Sprache, pflanzliche Inhaltsstoffe werden ausschließlich nach Linné in lateinischer Sprache aufgeführt, sogenannte Trivialnamen wie "Wasser", "Honig" oder "Meersalz" werden ebenfalls in lateinischer Sprache angegeben. Die INCI-Bezeichnungen sind dem International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook – Seventh Edition (1997) zu entnehmen, das von The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association (CTFA), 1101 17th Street, NW, Suite 300, Washington, DC 20036, USA, herausgegeben wird und mehr als 9.000 INCI-Bezeichnungen sowie Verweise auf mehr als 37.000 Handelsnamen und technische Bezeichnungen einschließlich der zugehörigen Distributoren aus über 31 Ländern enthält. Das International Cosmetic Ingredient Dictionary and Handbook ordnet den Inhaltsstoffen eine oder mehrere chemische Klassen (Chemical Classes), beispielsweise Polymeric Ethers, und eine oder mehrere Funktionen (Functions), beispielsweise Surfactants – Cleansing Agents, zu, die es wiederum näher erläutert und auf die nachfolgend ggf. ebenfalls bezug genommen wird. Die Angabe CAS bedeutet, daß es sich bei der nachfolgenden Zahlenfolge um eine Bezeichnung des Chemical Abstracts Service handelt.

Enzymzubereitung

Die erfindungsgemäße Enzymzubereitung ist ein System, insbesondere eine wässriges Konzentrat, enthaltend eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Polypeptide. Gegebenenfalls können auch weitere Enzyme, insbesondere ausgewählt aus Polysaccharidasen, Proteasen und Nukleasen, in der Enzymzubereitung enthalten sein.

Als Polysaccharidasen bezeichnet man dabei generell solche Enzyme, die die hydrolytische Spaltung von Polysacchariden katalysieren. So wird durch die Cellulase beispielsweise Cellulose abgebaut, während die Glucosidase aus dem Oligo- oder Polysaccharidmolekül vom Ende her einzelne Glucoseeinheiten abspaltet. Die extrazelluläre Polysaccharidmatrix des Biofilms besteht aus Homo- und Heteropolysacchariden, die vor allem aus Glucose, Fucose, Mannose, Galactose, Fructose, Pyruvat, Mannuronsäure und Glucuronsäure aufgebaut sind. Dementsprechend handelt es sich bei den Polysacchariden des Biofilms beispielsweise um Levane, Polymannane, Dextrane, Cellulose, Amylopektin, Glykogen oder um Alginat.

Im Sinne dieser Erfindung sind sämtliche Polysaccharidasen einsetzbar. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Enzymzubereitung jedoch neben einem erfindungsgemäßen Polypeptid mindestens ein Enzym aus der Gruppe Pullulanase, β-Glucanase, Cellulase, Xylanase, Amylase, Dextranase, Glucosidase, Galactosidase, Pectinase, Chitinase, Lysozym, Hemicellulase und Alginat-Lyase. Diese Enzyme können jeweils mehrere Familienmitglieder umfassen. Es können auch bereits im Handel erhältliche Gemische aus Polysaccharidasen in der Enzymzubereitung eingesetzt werden. So eignet sich beispielsweise Viscozyme, eine flüssige Enzymzubereitung aus Aspergillus sp., die aus verschiedenen Polysaccharidasen zusammengesetzt ist, u.a. aus Arabanase, Cellulase, β-Glucanase, Hemicellulase und Xylanase, zum Einsatz im Sinne dieser Erfindung.

Proteasen sind Enzyme, welche die hydrolytische Spaltung der Peptidbindung von Proteinen und Peptiden katalysieren. Sie können daher ebenfalls zum Abbau von Biofilmen genutzt werden, da diese neben Polysacchariden auch von den filmbildenden Organismen sekretierte Eiweißstoffe enthalten können. Proteasen können systematisch zum einen nach dem pH-Optimum ihrer Wirkung in saure, neutrale und alkalische Proteasen eingeteilt werden, zum anderen klassifiziert man sie aber nach der katalytisch wirksamen Gruppe im aktiven Zentrum. Dabei unterscheidet man Serin-, Cystein-, Aspartat- und Metallproteasen.

Sämtliche bekannte Proteasen können im Sinne dieser Erfindung eingesetzt werden, vorzugsweise wird jedoch mindestens eine Protease ausgewählt aus der Gruppe Subtilisin, Thermolysin, Pepsin, Carboxypeptidase, Saure Protease eingesetzt.

Bei den Nucleasen handelt es sich um Nukleinsäuren abbauende Enzyme. Je nach Hydrolysestelle unterscheidet man Endonucleasen, die innerhalb des Nucleinsäurestranges spalten (z.B. DNAse I aus Pankreas) und Exonucleasen, die Nucleotide vom Ende her freisetzen (z.B. Exonuclease III aus E. coli). Dabei können DNA-Einzelstränge (S1-Nuclease aus Aspergillus oryzae) oder-Doppelstränge (Exonuclease III) als Substrat dienen und recht unspezifisch zu kürzeren Strängen oder einzelnen Nucleotiden abgebaut werden. Auch gemischte Spezifitäten sind möglich und treten in Abhängigkeit z.B. von Enzymkonzentration und Gegenwart bestimmter Ionen auf. Analog ist auch die Spaltung von RNA-Molekülen möglich. Hochspezifische Endonucleasen erfordern bestimmte Nucleotidsequenzen (typischerweise 4-8 Basenpaare) und werden teilweise auch als Restriktionsenzyme oder Restriktionsendonucleasen bezeichnet. Sämtliche Nucleasen sind zum erfindungsgemäßen Einsatz geeignet, vorzugsweise werden jedoch unspezifische DNAsen oder RNAsen eingesetzt.

Die im Sinne dieser Erfindung zusätzlich in den Enzymzubereitungen einsetzbaren Enzyme können durch übliche biochemische Methoden aus den entsprechenden Organismen gewonnen werden. Sie sind aber auch kommerziell erhältlich, beispielsweise von den Firmen Novozymes, Genencor International, Sigma, AB Enzymes oder ASA Enzyme. Dabei können die Enzympräparationen auch von technischer Qualität sein und aus mehreren verschiedenen Enzymaktivitäten bestehen. Die Gegenwart von teilweise nicht näher charakterisierten Nebenaktivitäten kann auf die Hydrolyse der komplex zusammengesetzten Biofilm-Polymere ebenfalls einen günstigen Einfluß haben.

Sollen Proteasen eingesetzt werden, so ist zu beachten, unabhängig davon, ob es sich um erfindungsgemäße Polypeptide oder um andere Enzyme handelt, dass diese in flüssigen Mitteln durch im Reiniger enthaltene Komponenten wie Tenside oder organische Säuren oder aber auch durch die recht unspezifisch agierenden Proteasen angegriffen werden könnten, wodurch sich die Wirksamkeit der Mittel gegenüber nicht-Protein-Biofilmbestandteilen verringern würde. Um die Aktivität und Stabilität solcher Reinigungsmittel über einen längeren Zeitraum zu gewährleisten, ist es daher sinnvoll, empfindliche Enzyme von denaturierenden Komponenten und insbesondere auch Proteasen von anderen Enzymen getrennt zu halten, so daß diese Komponenten erst unmittelbar vor oder während des Reinigungsvorgangs aufeinander treffen.

Diese Trennung der verschiedenen Enzyme kann auf verschiedenen Wegen erfolgen. Eine Möglichkeit ist es, die Enzyme in Mikrokapseln einzubringen, die erst unmittelbar vor oder während des Reinigungsvorgangs, beispielsweise durch mechanische Einwirkung beim Putz- oder Waschvorgang, durch plötzliche Veränderung der osmotischen Verhältnisse z.B. beim Verdünnen mit Wasser oder durch ein Zerschneiden der Kapseln beim Dosieren aus der Vorratsflasche, geöffnet werden und ihren Inhalt freisetzen. Hierbei ist jedoch zu beachten, dass die Kapselwand ihrerseits nicht durch die Enzyme angegriffen werden darf. Kapselmaterialien auf der Basis von Proteinen oder Polysacchariden sind daher auszuschließen. Alternativ können die Enzyme auch jeweils auf einem festen Träger immobilisiert werden, der im Reinigungsmittel suspendiert wird und bei der Anwendung des Mittels zusätzlich als Abrasivstoff dienen kann. Die Immobilisierung erfolgt auf dem Fachmann bekanntem Wege; als Trägermaterialien können neben anorganischen Stoffen, beispielsweise Silicaten oder porösem Glas, auch Polymere eingesetzt werden.

Eine weitere denkbare Möglichkeit könnte auch das Einarbeiten in ein mehrphasiges Mittel sein, so dass die Protease vorwiegend in einer Phase angesiedelt wäre und die übrigen Enzyme vorwiegend in einer weiteren Phase vorlägen. Ein solches Mittel würde kurz vor der Verwendung aufgeschüttelt und die entstehende Emulsion auf die zu reinigende Fläche aufgetragen; das in der Vorratsflasche verbleibende Mittel würde anschließend eine rasche Phasentrennung erfahren, so dass die Enzyme nur für kurze Zeit sowie ggf. an der Phasengrenzfläche in Kontakt kämen. Ähnlich wäre der Fall gelagert, wenn ein Enzym in eine Phase eingearbeitet würde, die in Form von Tröpfchen in der zweiten, das andere Enzym enthaltenden Phase stabil dispergiert wäre; hierbei würde das Mittel nicht geschüttelt, sondern direkt aus der Vorratsflasche dosiert, gegebenenfalls auch versprüht. Ein solches mehrphasiges Mittel wäre jedoch eine technisch aufwendige und schwierig zu realisierende Lösung. Zudem wäre die Verbraucherakzeptanz voraussichtlich gering.

Sinnvoller ist es daher, die beiden Enzyme bzw. Enzymgruppen in räumlich getrennten Lösungen aufzubewahren. Dabei ist die Lagerung in zwei völlig getrennten Flaschen die weniger bevorzugte Lösung, da dies für den Verbraucher einen größeren Aufwand bedeutet. Besonders bevorzugt ist daher die Bereitstellung in einer Zweikammerflasche, aus der dann gleichzeitig beide Reinigungslösungen dosiert werden können. Solche Zweikammerflaschen sind bereits aus dem Stand der Technik bekannt. Neben der Möglichkeit der getrennten Lagerung miteinander nicht kompatibler Enzyme bietet eine Zwei- oder Mehrkammerflasche weitere Vorteile. So ist es möglich, in einer Kammer unter anderem ein Enzym in einer Lösung mit optimalem pH bezüglich der Lagerstabilität aufzubewahren und in einer weiteren Kammer eine Lösung zu bevorraten, deren pH-Wert dazu führt, daß beim Mischen dieser mit der Enzymaufbewahrungslösung eine Reinigungslösung entsteht, deren pH-Wert ein Optimum an Enzymaktivität bewirkt.

Reinigungsmittel für harte Oberflächen

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist wie bereits erwähnt in einer bevorzugten Ausführungsform ein Reinigungsmittel für harte Oberflächen, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid und/oder eine erfindungsgemäße Enzymzubereitung enthält. Das Reinigungsmittel kann die Enzymzubereitung beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 10,0 Gew.-%, vorzugsweise von 0,5 bis 3 Gew.-%, enthalten. Das Reinigungsmittel kann hierbei gegebenenfalls zusätzlich Biozide enthalten, kann jedoch auch biozidfrei sein.

Neben der Enzymzubereitung kann ein flüssiges, gelförmiges oder pastöses wäßriges Reinigungsmittel erfindungsgemäß auch übliche Reinigungsmittelbestandteile enthalten. Zu diesen Inhaltsstoffen zählen beispielsweise Tenside, Builder, Säuren, Alkalien, Hydrotrope, Lösungsmittel, Verdickungsmittel, Abrasivstoffe sowie weitere Hilfs- und Zusatzstoffe wie Farbstoffe, Parfums, Korrosionsinhibitoren oder auch Hautpflegemittel.

Die gegebenenfalls eingesetzten Tenside werden vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe anionische Tenside, nichtionische Tenside und/oder amphotere Tenside. Bevorzugt werden dabei anionische und/oder nichtionische Tenside eingesetzt. Sofern sie eingesetzt werden, kommen anionische Tenside vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 15 Gew.-%, nichtionische Tenside vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 10 Gew.-% und amphotere Tenside vorzugsweise in Mengen von 0,1 bis 4 Gew.-% zur Anwendung, jeweils bezogen auf die Gesamtzusammensetzung. In einer weniger bevorzugten Ausführungsform können daneben auch noch kationische Tenside in Mengen von bis zu 2 Gew.-% eingesetzt werden, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung. Ebenso können auch kationische Tenside eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Reinigungsmittel aufgrund der von kationischen Tensiden ausgehenden bioziden Wirkung jedoch frei von diesen.

Zu den erfindungsgemäß einsetzbaren anionischen Tensiden zählen aliphatische Sulfate wie Fettalkoholsulfate, Fettalkoholethersulfate, Dialkylethersulfate, Monoglyceridsulfate und aliphatische Sulfonate wie Alkansulfonate, α-Olefinsulfonate, Ethersulfonate, n-Alkylethersulfonate, sulfonierte Fettsäuren, Estersulfonate und Ligninsulfonate. Ebenfalls im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind Alkylbenzolsulfonate, Fettsäuresalze (Seifen), Fettsäurecyanamide, Sulfosuccinate (Sulfobernsteinsäuremono- und -dialkylester), Sulfosuccinamate, Sulfosuccinamide, Carbonsäureamidethersulfate, Alkylpolyglykolethercarboxylate, Fettsäureisethionate, Acylaminoalkansulfonate (Fettsäuretauride, N-Acyltauride), Fettsäuresarcosinate, Ethercarbonsäuren und Alkyl(ether)phosphate sowie α-Sulfofettsäuresalze, Acylglutamate, Monoglyceriddisulfate und Alkylether des Glycerindisulfats, und schließlich deren Mischungen.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung stehen Fettsäuren bzw. Fettalkohole bzw. deren Derivate – soweit nicht anders angegeben – stellvertretend für verzweigte oder unverzweigte Carbonsäuren bzw. Alkohole bzw. deren Derivate mit vorzugsweise 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, insbesondere 8 bis 20 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt 10 bis 18 Kohlenstoffatomen, äußerst bevorzugt 12 bis 16 Kohlenstoffatomen, beispielsweise 12 bis 14 Kohlenstoffatomen. Die Fettsäuren/-akohole bzw. ihre Derivate mit gerader Anzahl Kohlenstoffatome sind insbesondere wegen ihrer pflanzlicher Basis als auf nachwachsenden Rohstoffen basierend aus ökologischen Gründen bevorzugt, ohne jedoch die erfindungsgemäße Lehre auf sie zu beschränken. Insbesondere sind auch die beispielsweise nach der ROELENschen Oxo-Synthese erhältlichen Oxo-Alkohole bzw. deren Derivate mit vorzugsweise 7 bis 19 Kohlenstoffatomen, insbesondere 9 bis 19 Kohlenstoffatomen, besonders bevorzugt 9 bis 17 Kohlenstoffatomen, äußerst bevorzugt 11 bis 15 Kohlenstoffatomen, beispielsweise 9 bis 11, 12 bis 15 oder 13 bis 15 Kohlenstoffatomen, entsprechend einsetzbar.

Sie werden in Form ihrer Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, insbesondere Natrium-, Kalium- und Magnesiumsalze, wie auch Ammonium- und Mono-, Di-, Tri- bzw. Tetraalkylammoniumsalze sowie im Falle der Sulfonate auch in Form ihrer korrespondierenden Säure, z.B. Dodecylbenzolsulfonsäure, eingesetzt. Die Alkylethersulfate enthalten herstellungsbedingt vor allem bei niederen Ethoxylierungsgraden immer auch Restgehalte nichtalkoxylierter Fettalkoholsulfate. Weiterhin können die erfindungsgemäßen Mittel auch Seifen, d.h. Alkali- oder Ammoniumsalze gesättigter oder ungesättigter C₆-C₂₂-Fettsäuren, enthalten.

Bevorzugt werden die anionischen Tenside ausgewählt aus der Gruppe umfassend Fettalkoholsulfate in Mengen von bis zu 5 Gew.-%, Alkylbenzolsulfonate in Mengen von bis zu 7,5 Gew.-% und Seifen in Mengen von bis zu 2 Gew.-%, jeweils bezogen auf die Gesamtzusammensetzung, sowie Gemische derselben.

Geeignete nichtionische Tenside sind beispielsweise C₈-C₁₈-Alkylalkoholpolyglykolether, Alkylpolyglykoside sowie stickstoffhaltige Tenside bzw.

Mischungen davon, insbesondere der ersten beiden. C₈-C₁₈-Alkylalkoholpolypropylenglykol/polyethylenglykolether können durch die Formel R¹O-(CH₂CH(CH₃)O)_p(CH₂CH₂O)_e-H beschrieben werden, in der R¹ für einen linearen oder verzweigten, aliphatischen Alkyl- und/oder Alkenylrest mit 8 bis 18 Kohlenstoffatomen, p für 0 oder Zahlen von 1 bis 3 und e für Zahlen von 1 bis 20 steht. Sie werden durch Anlagerung von Propylenoxid und/oder Ethylenoxid an Alkylalkohole, vorzugsweise an Fettalkohole, erhalten. Weiterhin können auch endgruppenverschlossene C₈-C₁₈-Alkylalkoholpolyglykolether eingesetzt werden, d.h. Alkylalkoholpolyalkylenglykolether gemäß obiger Formel, in denen die freie OH-Gruppe verethert ist.

Erfindungsgemäße Reiniger können Alkylalkoholpolyglykolether in Mengen von 0,1 bis 4 Gew.-% enthalten, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.

Bevorzugte nichtionische Tenside sind weiterhin Alkylpolyglykoside (APG) der Formel R²O[G]_x, in der R² für einen linearen oder verzweigten, gesättigten oder ungesättigten Alkylrest mit 8 bis 22 Kohlenstoffatomen, [G] für einen glykosidisch verknüpften Zuckerrest und x für eine Zahl von 1 bis 10 stehen. Die Indexzahl x gibt den Oligomerisierungsgrad (DP-Grad) an, d.h. die Verteilung von Mono- und Oligoglykosiden. Während x in einer gegebenen Verbindung stets ganzzahlig sein muß und hier vor allem die Werte x = 1 bis 6 annehmen kann, ist der Wert x für ein bestimmtes Alkylglykosid eine analytisch ermittelte rechnerische Größe, die meistens eine gebrochene Zahl darstellt. Vorzugsweise werden Alkylglykoside mit einem mittleren Oligomerisierungsgrad x von 1,1 bis 3,0 eingesetzt. Aus anwendungstechnischer Sicht sind solche Alkylglykoside bevorzugt, deren Oligomerisierungsgrad kleiner als 1,7 ist und insbesondere zwischen 1,2 und 1,6 liegt. Als glykosidischer Zucker wird vorzugsweise Xylose, insbesondere aber Glucose verwendet. Der Alkyl- bzw. Alkenylrest R² kann sich von primären Alkoholen mit 8 bis 18, vorzugsweise 8 bis 14 Kohlenstoffatomen ableiten. Typische Beispiele sind Capronalkohol, Caprylalkohol, Caprinalkohol und Undecylalkohol sowie deren technische Gemische, wie sie beispielsweise im Verlauf der Hydrierung von technischen Fettsäuremethylestern oder im Verlauf der Hydrierung von Aldehyden aus der ROELENschen Oxosynthese anfallen. Vorzugsweise leitet sich der Alkyl- bzw. Alkenylrest R² aber von Laurylalkohol, Myristylalkohol, Cetylalkohol, Palmoleylalkohol, Stearylalkohol, Isostearylalkohol oder Oleylalkohol ab. Weiterhin sind Elaidylalkohol, Petroselinylalkohol, Arachidylalkohol, Gadoleylalkohol, Behenylalkohol, Erucylalkohol sowie deren technische Gemische zu nennen.

Alkylpolyglykoside können in erfindungsgemäßen Reinigern in Mengen von 0,1 bis 6 Gew.-% enthalten sein, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.

Als weitere nichtionische Tenside können stickstoffenthaltende Tenside enthalten sein, z.B. Fettsäurepolyhydroxyamide, beispielsweise Glucamide, und Ethoxylate von Alkylaminen, vicinalen Diolen und/oder Carbonsäureamiden, die Alkylgruppen mit 10 bis 22 C-Atomen, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen, besitzen. Der Ethoxylierungsgrad dieser Verbindungen liegt dabei in der Regel zwischen 1 und 20, vorzugsweise zwischen 3 und 10. Bevorzugt sind Ethanolamid-Derivate von Alkansäuren mit 8 bis 22 C-Atomen, vorzugsweise 12 bis 16 C-Atomen. Zu den besonders geeigneten Verbindungen gehören die Laurinsäure-, Myristinsäure- und Palmitinsäuremonoethanolamide.

Zu den Amphotensiden (amphoteren Tensiden, zwitterionischen Tensiden), die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, zählen u.a. Betaine, Aminoxide, Alkylamidoalkylamine, alkylsubstituierte Aminosäuren sowie acylierte Aminosäuren. Bevorzugte Amphotenside sind dabei beispielsweise Betaine der Formel (R³)(R⁴)(R⁵)N⁺CH₂COO^–, in der R³ einen gegebenenfalls durch Heteroatome oder Heteroatomgruppen unterbrochenen Alkylrest mit 8 bis 25, vorzugsweise 10 bis 21 Kohlenstoffatomen und R⁴ sowie R⁵ gleichartige oder verschiedene Alkylreste mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen bedeuten, insbesondere C₁₀-C₁₈-Alkyl-dimethylcarboxymethylbetain und C₁₁-C₁₇-Alkyamidopropyl-dimethylcarboxymethylbetain.

Sollten Kationtenside in der Zusammensetzung enthalten sein, so sind dies bevorzugt die quartären Ammoniumverbindungen der Formel (R⁶)(R⁷)(R⁸)(R⁹)N⁺ X^–, in der R⁶ bis R⁹ für vier gleich- oder verschiedenartige, insbesondere zwei lang- und zwei kurzkettige, Alkylreste und X^– für ein Anion, insbesondere ein Halogenidion, stehen, beispielsweise Didecyl-dimethyl-ammoniumchlorid, Alkyl-benzyl-didecylammoniumchlorid und deren Mischungen. Vorzugsweise ist die Reinigungsmittelzusammensetzung jedoch frei von kationischen Tensiden.

Bei der Wahl der geeigneten Tenside ist darauf zu achten, daß sie mit den eingesetzten Enzymen kompatibel sind. Bevorzugt wird die Enzymaktivität während einer typischen mittleren Einwirkzeit von 15 Minuten um nicht mehr als 50% gesenkt, insbesondere um nicht mehr als 30%. So haben Versuche ergeben, daß das als denaturierend bekannte Natriumdodecylsulfat (SDS) die Aktivität der Corolase bereits in einer Konzentration von 1 % innerhalb von 15 Minuten auf unter 30% absenkt, während die Aktivität der Xylanase schon mit nur 0,1 % SDS auf weniger als 40% sinkt, so daß dieses Tensid für den Einsatz in erfindungsgemäßen Reinigungsmittel nicht bevorzugt ist. Soll dieses oder ein ähnlich wirkendes Tensid dennoch eingesetzt werden, so ist vorzugsweise auf eine räumliche Trennung während der Lagerung zu achten, beispielsweise durch Verkapselung der Enzyme oder durch den Einsatz einer Mehrkammerflasche, so daß Enzyme und Tenside erst unmittelbar vor bzw. während der Anwendung miteinander in Kontakt kommen. Alkylpolyglykoside sind dagegen gut für den Einsatz in enzymhaltigen Mitteln gemäß dieser Erfindung geeignet. So bleibt die Aktivität der Corolase auch mit 3% APG 600 noch deutlich über 50%, die Xylanase erfährt durch den Zusatz von APG 600 sogar zunächst eine Aktivitätssteigerung (über 150% Aktivität mit 0,1 % Tensid) und weist mit 3% APG immer noch über 80% Aktivität auf.

Weiterhin können die erfindungsgemäßen Mittel Builder enthalten. Geeignete Builder sind beispielsweise Alkalimetallgluconate, -citrate, -nitrilotriacetate, -carbonate und -bicarbonate, insbesondere Natriumgluconat, -citrat und -nitrilotriacetat sowie Natrium- und Kaliumcarbonat und -bicarbonat, sowie Alkalimetall- und Erdalkalimetallhydroxide, insbesondere Natrium- und Kaliumhydroxid, Ammoniak und Amine, insbesondere Mono- und Triethanolamin, bzw. deren Mischungen. Hierzu zählen auch die Salze der Glutarsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Weinsäure und Benzolhexacarbonsäure sowie Phosphonate und Phosphate. Die Mittel können Builder in Mengen, bezogen auf die Zusammensetzung, von 0,1 bis 5 Gew.-% enthalten.

Des weiteren können die erfindungsgemäßen Mittel Säuren und/oder Alkalien enthalten. Diese dienen einerseits als pH-Regulatoren, andererseits können die Säuren aber auch zur Entfernung von Kalkflecken von den zu reinigenden Oberflächen beitragen. Bei den erfindungsgemäß einsetzbaren Säuren kann es sich um anorganische Mineralsäuren, beispielsweise Salzsäure, und/oder um C_1-6- Mono-, Di-, Tri- oder Polycarbonsäuren oder -hydroxycarbonsäuren wie beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure, Citronensäure, Gluconsäure, Glutarsäure, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Weinsäure oder auch Äpfelsäure sowie um weitere organische Säuren wie etwa Salicylsäure oder Amidosulfonsäure handeln. Besonders bevorzugt wird jedoch die Citronensäure eingesetzt; auch Mischungen aus mehreren Säuren können verwendet werden. Säuren können im erfindungsgemäßen Reinigungsmittel in Mengen von bis zu 6 Gew.-% enthalten sein, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.

Zu den gegebenenfalls einsetzbaren Basen zählen Alkanolamine, beispielsweise Mono- oder Diethanolamin, sowie Ammonium- oder Alkalimetallhydroxide, vor allem Natriumhydroxid. Das erfindungsgemäße Reinigungsmittel kann Basen in Mengen von bis zu 2,5 Gew.-% enthalten, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.

Das erfindungsgemäße Mittel kann weiterhin zur Viskositätsregulierung einen oder mehrere Verdicker enthalten. Als Verdickungsmittel geeignet sind dabei natürliche und synthetische Polymere sowie anorganische Verdickungsmittel. Zu den einsetzbaren Polymeren zählen Polysaccharide bzw. Heteropolysaccharide und andere organische natürliche Verdickungsmittel, darunter die Polysaccharidgummen wie Gummi arabicum, Agar, Alginate, Carrageene und ihre Salze, Guar, Guaran, Tragant, Gellan, Ramsan, Dextran oder Xanthan und ihre Derivate, z.B. propoxyliertes Guar, sowie ihre Mischungen, weiterhin auch Pektine, Polyosen, Johannisbrotbaumkernmehl, Stärke, Dextrine, Gelatine, Casein. Weiterhin können organische abgewandelte Naturstoffe wie Carboxymethylcellulose und -Celluloseether, Hydroxyethyl- und -propylcellulose und dgl. oder Celluloseacetat sowie Kernmehlether eingesetzt werden. Als organische vollsynthetische Verdickungsmittel können homo- und copolymere Polycarboxylate, vor allem Polyacryl- und Polymethacryl-Verbindungen sowie Vinylpolymere, Polycarbonsäuren, Polyether, Polyimine oder auch Polyamide dienen. Zu den einsetzbaren anorganischen Verdickungsmitteln zählen Polykieselsäuren, Tonmineralien wie Montmorillonite, Zeolithe, Kieselsäure sowie verschiedene nanopartikuläre anorganische Verbindungen wie nanopartikuläre Metalloxide, -oxidhydrate, -hydroxide, -carbonate und -phosphate sowie Silicate mit einer mittleren Teilchengröße von 1 bis 200 nm, bezogen auf den Teilchendurchmesser in der Längsrichtung, d.h. in der Richtung der größten Ausdehnung der Teilchen. Diese nanopartikulären Stoffen können optional in einer weiteren Ausführungsform der Erfindung mit einem oder mehreren Oberflächenmodifikationsmitteln behandelt sein. Die Oberflächenmodifikation erfolgt in dem Fachmann bekannter Weise mit ein- und mehrbasischen C_2-8-Carbonsäuren oder -Hydroxycarbonsäuren, funktionellen Silanen des Typs (OR)_4-nSiR_n (R = org. Reste mit funktionellen Gruppen wie Hydroxy, Carboxy, Ester, Amin, Epoxy, etc.), quartären Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren sowie weiteren hierzu einsetzbaren Stoffen.

Neben den bisher genannten Verdickungsmitteln kann das erfindungsgemäße Reinigungsmittel Elektrolytsalze enthalten. Diese können ebenfalls zu einer Viskositätserhöhung beitragen. Elektrolytsalze im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Salze, die in dem erfindungsgemäßen wäßrigen Mittel in ihre ionischen Bestandteile zerfallen. Bevorzugt sind die Salze, insbesondere Alkalimetall- und/oder Erdalkalimetallsalze, einer anorganischen Säure, vorzugsweise einer anorganischen Säure aus der Gruppe, umfassend die Halogenwasserstoffsäuren, Salpetersäure und Schwefelsäure, insbesondere die Chloride und Sulfate. Im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre kann ein Elektrolytsalz auch in Form seines korrespondierenden Säure/Base-Paares eingesetzt werden, beispielsweise Salzsäure und Natriumhydroxid anstatt Natriumchlorid.

Im erfindungsgemäßen Mittel können organische und/oder anorganische Verdicker in Mengen von insgesamt bis zu 2 Gew.-%, eingesetzt werden, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.

Das erfindungsgemäße Mittel kann vorteilhafterweise zusätzlich ein oder mehrere wasserlösliche organische Lösungsmittel enthalten, üblicherweise in einer Menge von bis zu 6 Gew.-%, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung. Das Lösungsmittel wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Lehre nach Bedarf insbesondere als Hydrotropikum, Viskositätsregulator und/oder Kältestabilisator eingesetzt. Es wirkt lösungsvermittelnd insbesondere für Tenside und Elektrolyt sowie Parfüm und Farbstoff und trägt so zu deren Einarbeitung bei, verhindert die Ausbildung flüssigkristalliner Phasen und hat Anteil an der Bildung klarer Produkte. Die Viskosität des erfindungsgemäßen Mittels verringert sich mit zunehmender Lösungsmittelmenge. Zuviel Lösungsmittel kann jedoch einen zu starken Viskositätsabfall bewirken. Schließlich sinkt mit zunehmender Lösungsmittelmenge der Kältetrübungs- und Klarpunkt des erfindungsgemäßen Mittels.

Geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise gesättigte oder ungesättigte, vorzugsweise gesättigte, verzweigte oder unverzweigte C_1-20-Kohlenwasserstoffe, bevorzugt C_2-15-Kohlenwasserstoffe, mit mindestens einer Hydroxygruppe und gegebenenfalls einer oder mehreren Etherfunktionen C-O-C, d.h. die Kohlenstoffatomkette unterbrechenden Sauerstoffatomen. Bevorzugte Lösungsmittel sind jedoch die – gegebenenfalls einseitig mit einem C_1-6-Alkanol veretherten – C_2-6-Alkylenglykole und Poly-C₂_₃-alkylenglykolether mit durchschnittlich 1 bis 9 gleichen oder verschiedenen, vorzugsweise gleichen, Alkylenglykolgruppen pro Molekül, z.B. Ethylenglykol, Propylenglykol, Butylenglycol, Diethylenglycol, Dimethoxydiglycol, Dipropylenglycol, Propylenglycolbutylether, Propylenglycolpropylether, Dipropylenglykolmonomethylether sowie PEG. Weitere bevorzugte Lösungsmittel sind die C_1-6-Alkohole, wie Methanol, Ethanol, n-Propanol, Isopropanol, n-Butanol, t-Butanol usw., besonders bevorzugt wird Ethanol und/oder Isopropanol eingesetzt.

Als Lösungsvermittler können außer den zuvor beschriebenen Lösungsmitteln beispielsweise auch Alkanolamine sowie Alkylbenzolsulfonate mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen im Alkylrest, z.B. Xylol- oder Cumolsulfonat eingesetzt werden. Weitere einsetzbare Hydrotrope sind z.B. Octylsulfat oder Butylglucosid. Das erfindungsgemäße Mittel kann diese Hydrotrope in Mengen von, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung, bis zu 4 Gew.-% enthalten.

In einer Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Mittel Abrasivstoffe enthalten. Als Abrasivkomponente können hierbei feste wasserlösliche und wasserunlösliche, vorzugsweise anorganische Verbindungen und Gemische derselben dienen. Hierzu gehören beispielsweise Alkalicarbonate, Alkalibicarbonate und Alkalisulfate, Alkaliborate, Alkaliphosphate, Siliciumdioxid, kristalline oder amorphe Alkalisilikate und Schichtsilikate, feinkristalline Natriumaluminiumsilikate und Calciumcarbonat. Der Vorteil wasserlöslicher Abrasivkomponenten besteht in einer praktisch rückstandsfreien Abspülbarkeit des Mittels. Neben diesen anorganischen Stoffen können auch aus der belebten Natur gewonnene Abrasiva, beispielsweise zerkleinerte Nußschalen oder Hölzer, sowie abriebfeste Kunststoffe, beispielsweise Polyethylenperlen, oder auch Keramik- oder Glaskügelchen Verwendung finden. Das erfindungsgemäße Reinigungsmittel kann Abrasivstoffe in Mengen von bis zu 2 Gew.-% enthalten, bezogen auf die Gesamtzusammensetzung.

Neben den genannten Komponenten können die erfindungsgemäßen Mittel einen oder mehrere weitere Hilfs- und Zusatzstoffe enthalten, wie sie vor allem in Reinigungsmitteln für harte Oberflächen üblich sind. Hierzu zählen insbesondere UV-Stabilisatoren, Korrosionsinhibitoren, Reinigungsverstärker, Antistatika, Konservierungsmittel (z.B. 2-Brom-2-nitropropan-1,3-diol oder eine Isothiazolinon-Bromnitropropandiol-Zubereitung), Parfüm, Farbstoffe, Perlglanzmittel (beispielsweise Glykoldistearat) sowie Trübungsmittel oder auch Hautschutzmittel, wie sie beispielsweise in EP 522 506 beschrieben sind. Die Menge an derartigen Zusätzen liegt üblicherweise nicht über 12 Gew.-% im Reinigungsmittel. Die Untergrenze des Einsatzes hängt von der Art des Zusatzstoffes ab und kann beispielsweise bei Farbstoffen bis zu 0,001 Gew.-% und darunter betragen. Vorzugsweise liegt die Menge an Hilfsstoffen zwischen 0,01 und 7 Gew.-%, insbesondere 0,1 und 4 Gew.-%.

Als Farbstoffe können sämtliche in Haushaltsreinigungsmitteln üblicherweise eingesetzten Farbstoffe verwendet werden. Auch bei den Duftstoffen können sämtliche übliche Parfums zum Einsatz kommen. Bevorzugt sind dabei fruchtige Düfte, beispielsweise Citrus, ferner Pine (Fichte) und Minze sowie blumige Düfte. Konservierungsmittel besitzen eine biozide Wirkung, so daß es wünschenswert ist, in erfindungsgemäßen Reinigungsmitteln nur geringe Konzentrationen, vorzugsweise aber gar keine Konservierungsmittel einzusetzen.

Es ist von Vorteil, wenn das Mittel keine Komplexbildner enthält; der Zusatz eines Bleichmittels zum erfindungsgemäßen Reinigungsmittel ist nicht erforderlich.

Der pH-Wert der erfindungsgemäßen Mittel liegt vorzugsweise zwischen 1 und 8, besonders bevorzugt zwischen 2 und 5 oder zwischen 5 und 8, insbesondere zwischen 2,5 und 4,5 oder zwischen 5,5 und 7,5. Dabei ist bei mehrphasigen Mitteln unter dem pH-Wert des Mittels der pH-Wert der nach dem Aufschütteln entstandenen temporären Emulsion zu verstehen, bei Mitteln, die in Mehrkammerflaschen angeboten werden, ist der pH-Wert des Mittels der pH-Wert der aus der gemeinsamen bestimmungsgemäßen Dosierung der in den verschiedenen Kammern gelagerten Komponenten erhaltenen Lösung. Es ist also jeweils der pH-Wert der gebrauchsfertigen Reinigungslösung gemeint.

Sofern es sich um ein flüssiges Mittel handelt, besitzt dieses vorzugsweise eine Viskosität von bis zu 1000 mPas. Gelförmige oder pastöse Reinigungsmittel können demgegenüber Viskositäten von bis zu 150000 mPas haben. Die Viskositätsmessungen erfolgen bei 20°C im Brookfield-Viskosimeter LVDV II mit einer Rotorfrequenz von 20 U/min (Spindel Nr. 31, Konz. 100%).

Das Reinigungsmittel kann ein oder mehrere Treibmittel (INCI Propellants), üblicherweise in einer Menge von 1 bis 80 Gew.-%, vorzugsweise 1,5 bis 30 Gew.-%, insbesondere 2 bis 10 Gew.-%, besonders bevorzugt 2,5 bis 8 Gew.-%, äußerst bevorzugt 3 bis 6 Gew.-%, enthalten.

Treibmittel sind erfindungsgemäß üblicherweise Treibgase, insbesondere verflüssigte oder komprimierte Gase. Die Wahl richtet sich nach dem zu versprühenden Produkt und dem Einsatzgebiet. Bei der Verwendung von komprimierten Gasen wie Stickstoff, Kohlendioxid oder Distickstoffoxid, die im allgemeinen in dem flüssigen Reinigungsmittel unlöslich sind, sinkt der Betriebsdruck mit jeder Ventilbetätigung. Im Reinigungsmittel lösliche oder selbst als Lösungsmittel wirkende verflüssigte Gase (Flüssiggase) als Treibmittel bieten den Vorteil gleichbleibenden Betriebsdrucks und gleichmäßiger Verteilung, denn an der Luft verdampft das Treibmittel und nimmt dabei ein mehrhundertfaches Volumen ein.

Geeignet sind demgemäß folgende gemäß INCI bezeichnete Treibmittel: Butane, Carbon Dioxide, Dimethyl Carbonate, Dimethyl Ether, Ethane, Hydrochlorofluorocarbon 22, Hydrochlorofluorocarbon 142b, Hydrofluorocarbon 152a, Hydrofluorocarbon 134a, Hydrofluorocarbon 227ea, Isobutane, Isopentane, Nitrogen, Nitrous Oxide, Pentane, Propane. Auf Chlorfluorkohlenstoffe (Fluorchlorkohlenwasserstoffe, FCKW) als Treibmittel wird jedoch wegen ihrer schädlichen Wirkung auf den – vor harter UV-Strahlung schützenden – Ozon-Schild der Atmosphäre, die sogenannte Ozon-Schicht, vorzugsweise weitgehend und insbesondere vollständig verzichtet.

Bevorzugte Treibmittel sind Flüssiggase. Flüssiggase sind Gase, die bei meist schon geringen Drücken und 20°C vom gasförmigen in den flüssigen Zustand übergeführt werden können. Insbesondere werden unter Flüssiggasen jedoch die – in Ölraffinerien als Nebenprodukte bei Destillation und Kracken von Erdöl sowie in der Erdgas-Aufbereitung bei der Benzinabscheidung anfallenden – Kohlenwasserstoffe Propan, Propen, Butan, Buten, Isobutan (2-Methylpropan), Isobuten (2-Methylpropen, Isobutylen) und deren Gemische verstanden.

Besonders bevorzugt enthält das Reinigungsmittel als ein oder mehrere Treibmittel Propan, Butan und/oder Isobutan, insbesondere Propan und Butan, äußerst bevorzugt Propan, Butan und Isobutan.

Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel Die erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel können beispielsweise als Mundwasser, Gel, flüssige Zahnputzlotion, steife Zahnpaste, Kaugummi, Gebissreiniger oder Prothesenhaftcreme vorliegen.

Hierzu ist es erforderlich, die erfindungsgemäßen Hybridenzyme in einen geeigneten Träger einzuarbeiten.

Als Träger können z.B. auch pulverförmige Zubereitungen oder wässrig-alkoholische Lösungen dienen, die als Mundwässer 0 bis 15 Gew.-% Ethanol, 1 bis 1,5 Gew.-% Aromaöle und 0,01 bis 0,5 Gew.-% Süßstoffe oder als Mundwasser-Konzentrate 15 bis 60 Gew.-% Ethanol, 0,05 bis 5 Gew.-% Aromaöle, 0,1 bis 3 Gew.-% Süßstoffe sowie ggf. weitere Hilfsstoffe enthalten können und vor Gebrauch mit Wasser verdünnt werden. Die Konzentration der Komponenten muss dabei so hoch gewählt werden, dass nach Verdünnung die genannten Konzentrationsuntergrenzen bei der Anwendung nicht unterschritten werden.

Als Träger können aber auch Gele sowie mehr oder weniger fließfähige Pasten dienen, die aus flexiblen Kunststoffbehältern oder Tuben ausgedrückt und mit Hilfe einer Zahnbürste auf die Zähne aufgetragen werden. Solche Produkte enthalten höhere Mengen an Feuchthaltemitteln und Bindemitteln oder Konsistenzreglern und Polierkomponenten. Darüber hinaus sind auch in diesen Zubereitungen Aromaöle, Süßstoffe und Wasser enthalten.

Als Feuchthaltemittel können dabei z.B. Glycerin, Sorbit, Xylit, Propylenglykole, Polyethenylenglycole oder Gemische dieser Polyole, insbesondere solche Polyethenylenglycole mit Molekulargewichten von 200 bis 800 (von 400 – 2000) verwendet werden enthalten sein. Bevorzugt ist als Feuchthaltemittel Sorbit in einer Menge von 25 – 40 Gew.-% enthalten.

Als Antizahnstein-Wirkstoffe und als Demineralisierungs-Inhibitoren können kondensierten Phosphate in Form ihrer Alkalisalze, bevorzugt in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze enthalten sein. Die wäßrigen Lösungen dieser Phosphate reagieren aufgrund hydrolytischer Effekte alkalisch. Durch Säurezusatz wird der pH-Wert der erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel auf die bevorzugten Werte von 7,5 – 9 eingestellt.

Es können auch Gemische verschiedener kondensierter Phosphate oder auch hydratisierte Salze der kondensierten Phosphate eingesetzt werden. Die spezifizierten Mengen von 2 – 12 Gew.-% beziehen sich jedoch auf die wasserfreien Salze. Bevorzugt ist als kondensiertes Phosphat ein Natrium- oder Kalium-tripolyphosphat in einer Menge von 5 – 10 Gew.-% der Zusammensetzung enthalten.

Ein bevorzugt enthaltener Wirkstoff ist eine karieshemmende Fluorverbindung, bevorzugt aus der Gruppe der Fluoride oder Monofluorophosphate in einer Menge von 0,1 – 0,5 Gew.-% Fluor. Geeignete Fluorverbindungen sind z.B.

Natriummonofluorophosphat (Na₂PO₃F), Kaliummonofluorophosphat, Natrium- oder Kaliumfluorid, Zinnfluorid oder das Fluorid einer organischen Aminoverbindung.

Als Bindemittel und Konsistenzregler dienen z.B. natürliche und synthetische wasserlösliche Polymere wie Carragheen, Traganth, Guar, Stärke und deren nichtionogene Derivate wie z.B. Hydroxypropylguar, Hydroxyethylstärke, Celluloseether wie z.B. Hydroxyethylcellulose oder Methylhydroxypropylcellulose. Auch Agar-Agar, Xanthan-Gum, Pektine, wasserlösliche Carboxyvinylpolymere (z.B. Carbopol^®-Typen), Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidon, höhermolekulare Polyethylenglykole (Molekulargewicht 10³ bis 10⁶ D). Weitere Stoffe, die sich zur Viskositätskontrolle eignen, sind Schichtsilikare wie z.B. Montmorillonit-Tone, kolloidale Verdickungskieselsäuren, z.B. Aerogel-Kieselsäure oder pyrogene Kieselsäuren.

Als Polierkomponenten können alle hierfür bekannten Poliermittel, bevorzugt aber Fällungs- und Gelkieselsäuren, Aluminiumhydroxid, Aluminiumsilicat, Aluminiumoxid, Aluminiumoxidtrihydrat, unlösliches Natriummetaphosphat, Calciumpyrophosphat, Calciumhydrogenphosphat, Dicalciumphosphat, Kreide, Hydroxylapatit, Hydrotalcite, Talkum, Magnesiumaluminiumsilicat (Veegum^®), Calciumsulfat, Magnesiumcarbonat, Magnesiumoxid, Natriumaluminiumsilikate, z.B. Zeolith A oder organische Polymere, z.B. Polymethacrylat, eingesetzt werden. Die Poliermittel werden vorzugsweise in kleineren Mengen von z.B. 1 – 10 Gew.-% verwendet.

Die erfindungsgemäßen Zahn- und/oder Mundpflegeprodukte können durch Zugabe von Aromaölen und Süßungsmitteln in ihren organoleptischen Eigenschaften verbessert werden. Als Aromaöle kommen alle für Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel gebräuchlichen natürlichen und synthetischen Aromen in Frage. Natürliche Aromen können sowohl in Form der aus den Drogen isolierten etherischen Öle als auch der aus diesen isolierten Einzelkomponenten verwendet werden. Bevorzugt sollte wenigstens ein Aromaöl aus der Gruppe Pfefferminzöl, Krauseminzöl, Anisöl, Kümmelöl, Eukalyptusöl, Fenchelöl, Zimtöl, Geraniumöl, Salbeiöl, Thymianöl, Majoranöl, Basilikumöl, Citrusöl, Gaultheriaöl oder eine oder mehrere daraus isolierte synthetisch erzeugten Komponenten dieser Öle enthalten sein. Die wichtigsten Komponenten der genannten Öle sind z.B. Menthol, Carvon, Anethol, Cineol, Eugenol, Zimtaldehyd, Geraniol, Citronellol, Linalool, Salven, Thymol, Terpinen, Terpinol, Methylchavicol und Methylsalicylat. Weitere geeignete Aromen sind z.B. Menthylacetat, Vanillin, Jonone, Linalylacetat, Rhodinol und Piperiton. Als Süßungsmittel eignen sich entweder natürliche Zucker wie Sucrose, Maltose, Lactose und Fructose oder synthetische Süßstoffe wie z.B. Saccharin-Natriumsalz, Natriumcyclamat oder Aspartam.

Als Tenside sind dabei insbesondere Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glycoside einsetzbar. Ihre Herstellung und Verwendung als oberflächenaktive Stoffe sind beispielsweise aus US-A-3 839 318, US-A-3 707 535, US-A-3 547 828 DE-A-19 43 689, DE-A-20 36 472 und DE-A-30 01 064 sowie EP-A-77 167 bekannt. Bezüglich des Glycosidrestes gilt, daß sowohl Monoglycoside (x = 1), bei denen ein Pentose- oder Hexoserest glycosidisch an einen primären Alkohol mit 4 bis 16 C-Atomen gebunden ist, als auch oligomere Glycoside mit einem Oligomerisationsgrad x bis 10 geeignet sind. Der Oligomerisationsgrad ist dabei ein statistischer Mittelwert, dem eine für solche technischen Produkte übliche Homologenverteilung zugrunde liegt.

Bevorzugt eignet sich als Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glycosid ein Alkyl- und/oder Alkenyl-(oligo)-glucosid der Formel RO(C₆H₁₀O)_x-H, in der R eine Alkyl- und/oder Alkenyl-gruppe mit 8 bis 14 C-Atomen ist und x einen Mittelwert von 1 bis 4 hat. Besonders bevorzugt sind Alkyloligoglucoside auf Basis von gehärtetem C₁₂ _/14-Kokosalkohol mit einem DP von 1 bis 3. Das Alkyl- und/oder Alkenyl-glycosid-Tensid kann sehr sparsam verwendet werden, wobei bereits Mengen von 0,005 bis 1 Gew.-% ausreichend sind.

Außer den genannten Alkylglucosid-Tensiden können auch andere nichtionische, ampholytische und kationische Tenside enthalten sein, als da beispielsweise sind: Fettalkoholpolyglycolethersulfate, Monoglyceridsulfate, Monoglyceridethersulfate, Mono- und/oder Dialkylsulfosuccinate, Fettsäureisethionate, Fettsäuresarcosinate, Fettsäuretauride, Fettsäureglutamate, Ethercarbonsäuren, Fettsäureglucamide, Alkylamido-betaine und/oder Proteinfettsäurekondensate, letztere vorzugsweise auf Basis von Weizenproteinen. Insbesondere zur Solubilisierung der meist wasserunlöslichen Aromaöle kann ein nichtionogener Lösungsvermittler aus der Gruppe der oberflächenaktiven Verbindungen erforderlich sein. Besonders geeignet für diesen Zweck sind z.B. oxethylierte Fettsäureglyceride, oxethylierte Fettsäuresorbitanpartialester oder Fettsäurepartialester von Glycerin- oder Sorbitan-Oxethylaten. Lösungsvermittler aus der Gruppe der oxethylierten Fettsäureglyceride umfassen vor allem Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an Mono- und Diglyceride von linearen Fettsäuren mit 12 bis 18 C-Atomen oder an Triglyceride von Hydroxyfettsäuren wie Oxystearinsäure oder Ricinolsäure. Weitere geeignete Lösungsvermittler sind oxethylierte Fettsäuresorbitanpartialester; das sind bevorzugt Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an Sorbitanmonoester und Sorbitandiester von Fettsäuren mit 12 bis 18 C-Atomen. Ebenfalls geeignete Lösungsvermittler sind Fettsäurepartialester von Glycerin- oder Sorbitan-Oxethylaten; das sind bevorzugt Mono- und Diester von C₁₂-C₁₈-Fettsäuren und Anlagerungsprodukten von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an 1 Mol Glycerin oder an 1 Mol Sorbit.

Die erfindungsgemäßen Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflegemittel enthalten bevorzugt als Lösungsvermittler für gegebenenfalls enthaltene Aromaöle Anlagerungsprodukte von 20 bis 60 Mol Ethylenoxid an gehärtetes oder ungehärtetes Rizinusöl (d.h. an Oxystearinsäure- oder Ricinolsäure-triglycerid), an Glyzerin-mono- und/oder -distearat oder an Sorbitanmono- und/oder -distearat.

Weitere übliche Zusätze für die Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflege mittel sind z.B.

– Pigmente, z.B. Titandioxid, und/oder Farbstoffe
– pH-Stellmittel und Puffersubstanzen wie z.B. Natriumbicarbonat, Natriumcitrat, Natriumbenzoat, Zitronensäure, Phosphorsäure oder saure Salze, z.B. NaH₂PO₄
– wundheilende und entzündungshemmende Stoffe wie z.B. Allantoin, Harnstoff, Panthenol, Azulen bzw. Kamillenextrakt
– weitere gegen Zahnstein wirksame Stoffe wie z.B. Organophosphonate, z.B. Hydroxyethandiphosphonate oder Azacycloheptandiphosphonat
– Konservierungsstoffe wie z.B. Sorbinsäure-Salze, p-Hydroxybenzoesäure-Ester.
– Plaque-Inhibitoren wie z.B. Hexachlorophen, Chlorhexidin, Hexetidin, Triclosan, Bromchlorophen, Phenylsalicylsäureester.

In einer besonderen Ausführungsform ist die Zusammensetzung eine Mundspülung, ein Mundwasser, ein Prothesenreiniger oder ein Prothesenhaftmittel.

Für erfindungsgemäß bevorzugten Prothesenreiniger, insbesondere Prothesenreinigungstabletten und -pulver, eignen sich neben den schon genannten Inhaltsstoffen für die Mund-, Zahn- und/oder Zahnprothesenpflege zusätzlich noch Per-Verbindungen wie beispielsweise Peroxoborat, Peroxomonosulfat oder Percarbonat. Sie haben den Vorteil, dass sie neben der Bleichwirkung gleichzeitig auch desodorierend und/oder desinfizierend wirken. Der Einsatz solcher Per-Verbindungen in Prothesenreinigern beträgt zwischen 0,01 und 10 Gew.-%, insbesondere zwischen 0,5 und 5 Gew.-%.

Als weitere Inhaltsstoffe sind auch Enzyme, wie z.B. Proteasen und Carbohydrase, zum Abbau von Proteinen und Kohlenhydraten geeignet. Der pH-Wert kann zwischen pH 4 und pH 12, insbesondere zwischen pH 5 und pH 11 liegen.

Für die Prothesenreinigungstabletten sind zusätzlich noch weitere Hilfsstoffe notwendig, wie beispielsweise Mittel, die einen sprudelnden Effekt hervorrufen, wie z.B. CO₂ freisetzende Stoffe wie Natriumhydrogencarbonat, Füllstoffe, z.B. Natriumsulfat oder Dextrose, Gleitmittel, z.B. Magnesiumstearat, Fließregulierungsmittel, wie beispielsweise kolloidales Siliziumdioxid und Granuliermittel, wie die bereits erwähnten hochmolekularen Polyethylenglykole oder Polyvinylpyrrolidon.

Prothesenhaftmittel können als Pulver, Cremes, Folien oder Flüssigkeiten angeboten werden und unterstützen die Haftung der Prothesen.

Als Wirkstoffe sind natürliche und synthetische Quellstoffe geeignet. Als natürliche Quellstoffe sind neben Alginaten auch Pflanzengummen, wie z.B. Gummi arabicum, Traganth und Karaya-Gummi sowie natürlicher Kautschuk aufzufassen. Insbesondere haben sich Alginate und synthetische Quellstoffe, wie z.B. Natriumcarboxymethylcellulose, hochmolekulare Ethylenoxid-Copolymere, Salze der Poly(vinyl-ether-co-maleinsäure) und Polyacrylamide.

Als Hilfsstoffe für pastöse und flüssige Produkte eignen sich besonders hydrophobe Grundlagen, insbesondere Kohlenwasserstoffe, wie beispielsweise Weißes Vaselin (DAB) oder Paraffinöl.

Ausführungsbeispiele:

Beispiel 1: Klonierung der Pullulanase

Shewanella sp. wurde von Spitzbergen bei 4 °C isoliert und auf die Fähgkeit untersucht, kälteaktive Enzyme zu produzieren. Der psychrophile Stamm Shewanella sp. ist ein Gram-negatives Proteobakterium. Der nächste Verwandte ist Shewanella putrefaciens (51,7%), was durch DNA-DNA-Hybridisierung gezeigt werden konnte. Er wächst in einem Temperaturbereich zwischen 4° und 30°C (Optimum 10°C) und einem pH-Bereich von pH 6-10 (Optimum pH 8).

Genomische DNA wurde aus Shewanella sp. mittels Standardmethoden (Qiagen) isoliert und mit der Restriktionsendonuklease Sau3A für 6 bis 8 min bei 37°C verdaut. Die verdaute DNA wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt (70 V; 0,8 %; 45 Minuten) und die Banden zwischen 6 und 10 kbp ausgeschnitten und aus dem Gelstücken eluiert (Nucleospin extraction kit, Macherey-Nagel).

Mit den isolierten DNA-Fragmenten wurde unter Nutzung des ZAP-Expressionsvektors und Klonierungskits (Stratagene) nach Herstellerangaben eine Genbank erstellt. Der ZAP-Vektor pBK-CMV (4,5 kbp) besitzt 12 Klonierungsstellen und kodiert für eine Neomycin/Kanamycin- Resistenz. Zur Herstellung der Bank wurden die Fragmente in den Lambda-ZAP-Vektor ligiert, in Phagenproteine verpackt und mit diesen Phagen E. coli XLOLR- Zellen transfiziert.

100.000 E. coli XLOLR-Klone wurden auf pullulanhaltigen LB-Kanamycin-Agarplatten (50 μg/ml Kanamycin, 1 mM IPTG, 0.1 % red pullulanan) auf Pullulanase-Aktivität gescreent. Hierzu wurden die Platten für 3 Tage bei 30°C inkubiert. Aktive Klone zeigten die Bildung farbloser Höfe um die Kolonien.

Aus einem ausgewählten, aktiven Klon wurde das Plasmid isoliert. Ein Teil des Plasmids, mitsamt des 6 kbp großen Inserts, wurde über Primer-walking sequenziert. Vier Primerpaare waren nötig, um die komplette Insertsequenz zu erhalten. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgelistet. Die Sequenz ist im Sequenzprotokoll dargestellt.

Tabelle 1: Forward und reverse Primer, die beim Primer-Walking verwendet wurden

Beispiel 2: Temperaturabhängigkeit der Enzymaktivität der Pullulanase

Zur Bestimmung der Temperaturabhängigkeit wurde der Rohextrakt mit 1 % Pullulan (pH 7) für 1 h bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Die Pullulanase wies Aktivitäten zwischen 4°C und 65°C auf mit einem Temperaturoptimum bei 45 °C (Tabelle 2).

Tabelle 2: Aktivität (U/ml) und Biofilmabbau (%) der klonierten Pullulanase in Abhängigkeit von der Zeit

Beispiel 3: Biofilmabbau durch die Pullulanase

Die Fähigkeit des rekombinanten Enzyms, mikrobielle Biofilme abzubauen, wurde mit einem in Mikrotiterplatten gewachsenen Modellbiofilm untersucht.

Das Biofilmtestsystem setzt sich aus vier Vertretern zusammen, die als gute Biofilmbildner bekannt sind. Modellbiofilme wurden mit einer Mischpopulation angezogen, bestehend aus:

(DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)

Anzucht der Stämme:
D. nishinomiyaensis, B. japonicum und X. campestris wurden in 50 ml Flüssigkultur (pro Liter 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl) bei 30 °C und 150 rpm für 16 h inkubiert. Angeimpft wurde mit einer Einzelkolonie von einer Agarplatte (pro Liter 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 10 g Agarose).

Die optische Dichte (600 nm) der Kulturen nach 16 h betrug:

Dermacoccus nishinomiyaensis	7,4
Bradyrhizobium japonicum	5,4
Xanthomonas campestris	3,3

Anschließend wurden die Kulturen zusammengegeben, gemischt und mit 50% sterilem Glycerin versetzt, so dass die Endkonzentration 10% Glycerin betrug. Der Kultur-Mix wurde portioniert und bei –20°C eingefroren.

Die Anzucht des Biofilms erfolgte in 48 well-Mikrotiterplatten. Je 750 μl TBY-Medium wurden mit je 75 μl der wie oben zubereiteten Mischung aus Biofilm produzierenden Kulturen pro well versetzt, die Platten wurden mit Airpore-Sheets (Qiagen) und Kunststoffdeckel verschlossen. Anschließend wurde bei 30 °C und 60 rpm für 66 h inkubiert, der Überstand vorsichtig abgesaugt und die Platten bei Raumtemperatur mindestens 24 h getrocknet.

Diese Platten dienten als Substrat für die Untersuchung der enzymatischen Hydrolyse. Die Platten wurden für 16 h bei unterschiedlichen Temperaturen mit 1 ml des Enzymextraktes inkubiert. Das Enzym war in Abhängigkeit von der Temperatur in der Lage bis zu 28 % des Biofilms abzubauen, wobei das stärkste Aktivität bei 30 °C beobachtet wurde. Bei höheren Temperaturen war ein geringer oder gar kein Biofilmabbau messbar (Tabelle 2).

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Polynukleotid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polynukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder mit einer Nukleinsäuresequenz von Position 70 bis Position 4323 gemäß SEQ ID NO: 1, b) Polynukleotid kodierend für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von Position 24 bis Position 1440 gemäß SEQ ID NO: 2, c) natürlicherweise vorkommende oder künstlich erzeugte Mutanten oder polymorphe Formen oder Allele eines Polynukleotids gemäß (a) oder (b), d) zu einem Polynukleotid gemäß (a), (b) oder (c) komplementäre Polynukleotide, e) unter stringenten Bedingungen mit einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d) hybridisierende Polynukleotide, f) Polynukleotide mit einer Sequenzhomologie oder -identität von mindestens 50 % in Bezug auf ein Polynukleotid gemäß (a), (b), (c) oder (d), g) Polynukleotide, bestehend aus mindestens 10 aufeinanderfolgenden Nukleinsäuren eines Polynukleotids gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e), h) Polynukleotide mit Deletionen und/oder Insertionen und/oder Inversionen von bis zu 50 Nukleotiden gegenüber einem Polynukleotid gemäß (a), (b), (c), (d) oder (e), i) Polynukleotide, umfassend mindestens eines der unter (a) bis (h) genannten Polynukleotide.
Polynukleotid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es für eine Hydrolase kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Hydrolase um eine Glycosylase handelt.
Polynukleotid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Glycosylase um eine Pullulanase handelt.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das kodierte Polypeptid dazu in der Lage ist, die Bindungen zwischen α-1,6-verknüßpften D-Glucose-Einheiten zu spalten.
Verfahren zur Herstellung und/oder identifzierung eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Polynukleotid chemisch synthetisiert, anhand einer Sonde aus einer Genbank isoliert oder durch Polymeraseketten-Reaktion erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 6, folgende Schritte umfassend: a) eine cDNA- oder genomische Bibliothek wird mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 kontaktiert, b) ein DNA-Klon, der mit einer Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 hybridisiert, wird identifiziert, c) das cDNA- oder genomische Nukleinsäurefragment, das den in Schritt (b) identifizierten Klon umfasst, wird sequenziert.
Verfahren nach Anspruch 6, folgende Schritte umfassend: a) ausgehend von einer Nukleinsäure gemäß SEQ ID No. 1 werden Primer hergestellt, b) die Primer gemäß (a) werden verwendet, um in der PCR cDNAs unbekannter Nukleinsäuresequenz zu amplifizieren, c) die gemäß (b) erhaltenen Nukleinsäuren werden sequenziert.
Verfahren nach Anspruch 6, folgende Schritte umfassend: a) Nukleinsäuren einer Bibliothek werden in geeignete Vektoren eingebaut und diese in passende Wirtsorganismen, eingebracht, so daß die Expression der Nukleinsäuren erfolgen kann, b) die gemäß (a) erhaltenen Wirtsorganismen werden auf einem festen Träger ausplattiert und inkubiert, c) auf dem festen Träger wird ein Assay durchgeführt, der die Umsetzung eines Hydrolase-Substrats involviert, d) Hydrolase-positive Klone werden identifiziert und gereinigt, e) die Nukleinsäuren aus den in Schritt (d) identifizierten Klonen werden sequenziert.
Verfahren nach Anspruch 6, folgende Schritte umfassend: a) eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 1 wird Mutagenese-Experimenten unterworfen, b) die erhaltenen Mutanten werden sequenziert, in einen geeigneten Vektor eingebaut und exprimiert, c) die Expressionsprodukte werden auf Hydrolase-Aktivität hin untersucht.
Vektor umfassend eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5.
Wirtszelle umfassend einen Vektor gemäß Anspruch 11.
Polypeptid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder mit einer Aminosäuresequenz von Position 24 bis Position 1440 gemäß SEQ ID NO: 2, b) natürlicherweise vorkommende Mutanten, polymorphe Formen oder Allele eines Polypeptids gemäß (a), c) Polypeptide, die eine Sequenzhomologie oder-identität von mindestens 50 % in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a) oder (b) besitzen, d) Polypeptide, die von einem Polynukleotid gemäß Anspruch 1 kodiert werden, e) Polypeptide bestehend aus mindestens 5 aufeinanderfolgenden Aminosäuren eines Polypeptids gemäß (a) oder (b), f) Polypeptide mit Insertionen und/oder Deletionen und/oder Insertionen von bis zu 60 Aminosäuren in Bezug auf ein Polypeptid gemäß (a), (b) oder (c), g) Polypeptide, umfassend mindestens eines der unter (a) bis (f) genannten Polypeptide.
Polypeptid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Hydrolase handelt.
Polypeptid nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Hydrolase um eine Glycosylase handelt.
Polypeptid nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Hydrolase um eine Pullulanase handelt.
Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid dazu in der Lage ist, Bindungen zwischen α-1,6-verknüßpften D-Glucose-Einheiten zu spalten.
Enzymzubereitung, umfassend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 17.
Enzymzubereitung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass sie zusätzlich Enzyme ausgewählt aus Polysaccharidasen, Proteasen und Nukleasen enthält.
Zubereitung, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sterilisations-, Desinfektions-, Wasch-, Geschirrspül- und Reinigungsmittel, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 17 oder eine Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 enthält.
Zubereitung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid und/oder die Enzymzubereitung in Mengen bis zu 10 Gew.-% in der Zubereitung enthalten sind.
Zubereitung nach Anspruch 20 oder 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine weitere Komponente enthält, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Tensiden, Buildern, Co-Buildern, Säuren, Alkalien, Verdickern, Lösungsmitteln, Lösungsvermittlern und Abrasivstoffen.
Zubereitung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens einen weiteren Hilfs- oder Zusatzstoff enthält ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus UV-Stabilisatoren, Korrosionsinhibitoren, Reinigungsverstärkern, Antistatika, Parfüms, Farbstoffen, Perlglanzmitteln, Trübungsmitteln und Hautschutzmitteln.
Erzeugnis enthaltend ein Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 17, eine Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 oder eine Zubereitung nach einem der Ansprüche 20 bis 23 und einen Sprühspender zur Dosierung der Enzymzubereitung oder des Reinigungsmittels als Aerosol und/oder als Schaum.
Verfahren zur Hydrolyse von Biofilmen auf Oberflächen oder zur Entfernung von Schmutzresten auf Oberflächen durch Inkubation mit einem Polypeptid nach einem der Ansprüche 13 bis 17, einer Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 oder einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, gegebenenfalls unter Verwendung eines Erzeugnisses nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Vitalität der mikrobiellen Zellen nicht nachhaltig geschädigt wird.
Verfahren zur Hydrolyse von Biofilmen auf Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid, die Enzymzubereitung oder das Reinigungsmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gegebenenfalls unter Benutzung eines erfindungsgemäßen Erzeugnisses nach Anspruch 24, auf die mit Biofilm überzogene Fläche aufgebracht wird, gegebenenfalls mit einem Tuch, einem Schwamm, einer Bürste oder einem sonstigen zur Reinigung geeigneten Utensil auf der von Biofilm befallenen Oberfläche verwischt wird oder verrieben wird und, gegebenenfalls nach einer Einwirkzeit von 1 bis 30 Minuten, einigen Stunden oder über Nacht, mit klarem Wasser abgespült wird, worauf die Oberfläche mit einem trockenen Tuch abgewischt wird.
Verwendung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 13 bis 17, einer Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 oder einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 20 bis 23 zur Zerstörung und/oder Entfernung von Biofilmen und/oder zur Entfernung von Schmutzresten auf Oberflächen.
Verwendung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 13 bis 17, einer Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 oder einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 20 bis 23 zum Abbau von Pullulan.
Verwendung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 13 bis 17, einer Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 oder einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 20 bis 23 zur hydrolytischen Spaltung von α-1,4- und/oder α-1,6-Bindungen zwischen D-Monosacchariden.
Verwendung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 13 bis 17, einer Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 oder einer Zubereitung nach einem der Ansprüche 20 bis 23 zur Reinigung von Textilien.
Erzeugnis aus einer Enzymzubereitung oder einem Reinigungsmittel nach einem der vorhergehenden Ansprüche und einer Mehrkammerflasche.
Kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitung enthaltend Polypeptide nach einem der Ansprüche 13 bis 17 oder eine Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19.
Kosmetische und/oder pharmazeutische Zubereitung nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Zubereitung um Mund-, Zahn- oder Zahnprothesenpflegemittel handelt.
Verwendung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 13 bis 17 oder einer Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung einer kosmetischen Zubereitung.
Verwendung von Polypeptiden nach einem der Ansprüche 13 bis 17 oder einer Enzymzubereitung nach Anspruch 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung oder zum Abbau von Zahnbelag.
Bakterium Shewanella sp. 40-3 gemäß DSM 16509.
Hydrolasen erhältlich aus Shewanella sp. 40-3 gemäß DSM 16509.
Verwendung von Shewanella sp. 40-3 zum Abbau von Biofilmen oder zur Entfernung von Schmutzresten von Oberflächen.
Verwendung von Shewanella sp. 40-3 zum Abbau von Pullulan.
Verwendung von Shewanella sp. 40-3 zur hydrolytischen Spaltung von α-1,4- und/oder α-1,6-Bindungen zwischen D-Monosacchariden.
Verfahren zur Isolation und/oder Identifizierung von Hydrolasen aus psychrophilen Bakterien, folgende Schritte umfassend: a) Isolation von genomischer DNA aus einem psychrophilen Bakterium, b) Verdau der genomischen DNA mittels geeigneter Restriktionsendonukleasen, c) Einbau der DNA-Banden mit einer Größe zwischen 5 und 10 kbp in einen Transfektionsvektor, d) Erstellen einer Genbank durch Transfektion eines Wirts mit dem Transfektionsvektor, e) Screening der Genbank nach Zellen, die Enzyme mit gewünschter Aktivität enthalten, f) gegebenenfalls Isolation des Plasmids mit dem Klon mit der gewünschten Aktivität, und g) gegebenenfalls Sequenzierung des isolierten Klons.