DE69434873T2

DE69434873T2 - Subtilisin bpn'-varianten mit verminderter adsorption und erhöhter hydrolyse

Info

Publication number: DE69434873T2
Application number: DE69434873T
Authority: DE
Inventors: Frederick Philip Cincinnati BRODE; Lee Bobby Cincinnati BARNETT; Nelton Donn Cincinnati RUBINGH
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1993-09-15
Filing date: 1994-08-31
Publication date: 2007-09-06
Anticipated expiration: 2014-09-01
Also published as: CA2170491A1; BR9407502A; CN1134728A; CN1057123C; CZ79196A3; NO961067L; WO1995007991A2; ATE343636T1; WO1995007991A3; CA2170491C; JPH09502610A; NO961067D0; HUT74222A; EP0719339B1; DE69434873D1; HU9600667D0; EP0719339A1; AU7870394A; ES2275265T3; MA23330A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Enzymvarianten, die in einer Reihe von Reinigungszusammensetzungen geeignet sind, und solche Reinigungszusammensetzungen.
ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Enzyme stellen die größte Klasse natürlich vorkommender Proteine dar. Jede Enzym-Klasse katalysiert (beschleunigt eine Reaktion, ohne verbraucht zu werden) im Allgemeinen eine andere Art von chemischer Reaktion. Eine Klasse von Enzymen, die als Proteasen bekannt sind, ist für ihre Fähigkeit zum Hydrolysieren (Aufbrechen einer Verbindung zu zwei oder mehr einfacheren Verbindungen mit Aufnahme der H- und OH-Teile eines Wassermoleküls auf einer Seite der aufgespalteten chemischen Bindung) anderer Proteine bekannt. Diese Fähigkeit zum Hydrolysieren von Proteinen wird bereits durch Einbeziehung natürlich vorkommender und mit Protein erzeugter Proteasen als Zusatzstoff für Wäschewaschmittelzubereitungen genutzt. Viele Flecken auf Kleidung sind proteinhaltig, und weit spezifizierte Proteasen können die Entfernung solcher Flecken wesentlich verbessern.
Leider überträgt sich der Wirksamkeitsgrad dieser Proteine in ihrer natürlichen, bakteriellen Umgebung häufig nicht in die relativ unnatürliche Waschumgebung. Speziell sind Eigenschaften der Protease, wie Wärmebeständigkeit, pH-Stabilität, Oxidationsstabilität und Substratspezifität, bei der Verwendung außerhalb der natürlich Umgebung des Enzyms nicht unbedingt optimiert.
Die Aminosäure-Sequenz der Protease bestimmt die Eigenschaften der Protease. Eine Veränderung der Aminosäure-Sequenz der Protease kann die Eigenschaften des Enzyms in variierenden Graden ändern oder kann das Enzym sogar deakti vieren, abhängig vom Ort, von der Art und/oder vom Ausmaß der Änderung in der Aminosäure-Sequenz. Bei dem Versuch, ihre Eigenschaften zu verbessern, wurden mehrere Ansätze vorgenommen, um die Wildtyp-Aminosäure-Sequenz von Proteasen zu verändern, mit dem Ziel des Erhöhens der Wirksamkeit der Protease in der Waschumgebung. Zu diesen Ansätzen gehört das Verändern der Aminosäure-Sequenz, um unter ganz verschiedenen Bedingungen die Wärmebeständigkeit zu erhöhen und die Oxidationsstabilität zu verbessern.
Trotz der Vielfalt der in der Technik beschriebenen Ansätze besteht eine fortdauernde Notwendigkeit für neue wirksame Proteasevarianten, die zur Reinigung einer Reihe von Oberflächen geeignet sind.
Aufgaben der vorliegenden Erfindung
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Subtilisinenzymvarianten bereitzustellen, die im Vergleich zum Wildtyp des Enzyms verbesserte Hydrolyse aufweisen.
Es ist auch eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Reinigungszusammensetzungen bereitzustellen, die diese Subtilisinenzymvariante umfassen.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Subtilisin-BPN'-Variante, die eine Wildtyp-Aminosäure-Sequenz umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Wildtyp-Aminosäure-Sequenz eine der folgenden Mutationen umfasst, wobei die ursprüngliche Aminosäure, die im Wildtyp auftritt, als erstes, die Positionsnummer als zweites und die substituierte Aminosäure als drittes angegeben wird:

– Einfache Mutation: Lys213Glu; Ala216Glu; Ala216Asp; Ala216Gly; Ser204Glu; Val203Glu;
– Zweifache Mutation: Lys213Glu + Tyr217Leu; Ile205Leu + Ala216Glu; Ile205Leu + Ala216Asp; Pro210Ala + Gly215Thr; Lys213Glu + Ala216Glu; Tyr214Phe + Tyr217Asn; Gln206Glu + Ala216Glu; Ala216Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Ala216Glu; Ala216Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Lys213Glu;
– Dreifache Mutation: Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu; Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu; Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Lys213Glu + Tyr217Leu;
– Vierfache Mutation: Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; Ser204Glu + Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu;
– Fünffache Mutation: Ile205Leu + Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu;

BESCHREIBUNG
I. Subtilisinvarianten
Diese Erfindung bezieht sich auf Subtilisinenzyme, insbesondere BPN', die durch Mutation der verschiedenen Nucleotid-Sequenzen, die für das Enzym kodieren, modifiziert wurden, wodurch die Aminosäure-Sequenz des Enzyms modifiziert wird. Die modifizierten Subtilisinenzyme (nachstehend „BPN'-Varianten") der vorliegenden Erfindung haben im Vergleich zu dem Wildtyp- Subtilisin eine verringerte Adsorption an und eine erhöhte Hydrolyse von einem unlöslichen Substrat. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die mutierten Gene, die für solche BPN'-Varianten kodieren.
Die Subtilisinenzyme dieser Erfindung gehören zu einer Klasse von Enzymen, die als Proteasen bekannt sind. Eine Protease ist ein Katalysator für die Spaltung von Peptidbindungen. Eine Proteaseart ist eine Serinprotease. Eine Serinprotease wird durch die Tatsache erkannt, dass an der aktiven Stelle ein wesentlicher Serinrest vorhanden ist.
Die Beobachtung, dass bei einem Enzym die Hydrolysegeschwindigkeit löslicher Substrate mit der Enzymkonzentration zunimmt, ist hinlänglich dokumentiert. Es würde deshalb plausibel scheinen, dass für oberflächengebundene Substrate, wie es bei vielen Reinigungsanwendungen anzutreffen ist, die Hydrolysegeschwindigkeit mit steigender Oberflächenkonzentration zunehmen würde. Es wurde gezeigt, dass dies der Fall ist. (Brode, P.F. III und D.S. Rauch, LANGMUIR, „Subtilisin BPN': Activity on an Immolbilized Substrate", Bd. 8, S. 1325-1329 (1992)). Es hat sich für unlösliche Substrate tatsächlich eine lineare Abhängigkeit der Geschwindigkeit von der Oberflächenkonzentration herausgestellt, wenn die Oberflächenkonzentration des Enzyms variiert wurde. (Rubingh, D. N. und M. D. Bauer, „Catalysis of Hydrolysis of Proteases at the Protein-Solution Interface", in POLYMER SOLUTION, BLENDS AND INTERFACES, Hrsg. von I. Noda und D. N. Rubingh, Elsevier, S. 464 (1992)). Bei dem Versuch, dieses Prinzip bei der Suche nach Variantenproteasen, die eine bessere Reinigungsleistung bieten, anzuwenden, haben wir überraschend nicht herausgefunden, dass Enzyme, die mehr adsorbieren, eine bessere Leistung bieten. In der Tat haben wir überraschend bestimmt, dass das Gegenteil der Fall ist: verringerte Adsorption durch ein Enzym an einem Substrat führte zu erhöhter Hydrolyse des Substrats (d. h. besserer Reinigungsleistung).
Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass verbesserte Leistung, beim Vergleich einer Variante mit einer anderen, ein Ergebnis der Tatsache ist, dass Enzyme, die weniger adsorbieren auch weniger fest gebunden sind und auf der Oberfläche, von der das unlösliche Proteinsubstrat entfernt werden soll, mobiler sind. Bei vergleichbaren Enzymlösungskonzentrationen reicht diese gesteigerte Mobilität, um jeglichen Vorteil, der durch die Lieferung einer höheren Enzymkonzentration an die Oberfläche bereitgestellt wird, aufzuheben.
Die hierin beschriebenen Mutationen sind so gestaltet, dass sie die Adsorption des Enzyms an oberflächengebundenen Verschmutzungen ändern (d. h. senken). In BPN' bilden die Aminosäuren von Position 200 bis Position 220 eine große Schleife auf dem Enzymmolekül. Es ist entdeckt worden, dass diese Schleife eine erhebliche Rolle bei der Adsorption des Enzymmoleküls an einem oberflächengebundenen Peptid spielt und spezifische Mutationen in dieser Schleife eine erhebliche Auswirkung auf diese Adsorption haben. Ohne an eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass diese Schleife aus mindestens zwei Gründen für die Adsorption des BPN'-Moleküls bedeutsam ist. Erstens können die Aminosäuren, die diese äußere Schleife umfassen, engen Kontakt zu jeglichen Oberflächen, denen das Molekül ausgesetzt ist, herstellen. Zweitens gibt die Nähe dieser Schleife zu der Aktivstellen- und Bindungstasche des BPN'-Moleküls ihr Bedeutung bei der katalytisch produktiven Adsorption des Enzyms an den oberflächengebundenen Substraten (Peptiden/Proteinverschmutzungen).
Wie hier verwendet, bedeutet „Variante" ein Enzym mit einer Aminosäure-Sequenz, die von der des Wildtyps abweicht.
Wie hier verwendet, bedeutet „mutiertes BPN'-Gen" ein Gen, das für eine BPN'-Variante kodiert.
Wie hier verwendet, bezieht sich „Wildtyp-Subtilisin-BPN"' auf ein Subtilisinenzym, das durch SEQ-ID NR.1 dargestellt wird. Die Aminosäure-Sequenz für Subtilitsin-BPN' wird von Wells, J. A., E. Ferrari, D. J. Henner, D.A. Estell und E. Y. Chen, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Bd. II, 7911-7925 (1983) weiter beschrieben.
Wie hier verwendet, umfasst der Begriff „Wildtyp-Aminosäure-Sequenz" SEQ-ID NR.1 sowie SEQ-ID NR.1 mit anderen Modifikationen an der Aminosäure-Sequenz als denen an Positionen 199-220.
Wie hier verwendet, bezieht sich „hydrophilere Aminosäure" auf jegliche anderen Aminosäuren mit größerer Hydrophilie als eine zugrunde liegende Aminosäure hinsichtlich der nachstehenden Hydrophilietabelle. In der folgenden Hydrophilietabelle (Tabelle 1) sind Aminosäuren in absteigender Reihenfolge zunehmender Hydrophilie aufgeführt (siehe Hopp, T.P. und Woods, K.R., „Prediction of Protein Antigenic Determinants from Amino Acid Sequences", PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCE USA, Bd. 78, S. 3824-3828, 1981, OF durch Bezugnahme hierin eingeschlossen).
TABELLE 1
Tabelle 1 gibt auch an, welche Aminosäuren eine Ladung tragen (wobei diese Eigenschaft auf einem pH von ungefähr 8-9 beruht). Die positiv geladenen Aminosäuren sind Arg und Lys, die negativ geladenen Aminosäuren sind Glu und Asp, und die restlichen Aminosäuren sind neutral. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die substituierende Aminosäure entweder neutral oder negativ geladen, mehr bevorzugt negativ geladen (d. h. Glu oder Asp).
A. Herstellung von Enzymvarianten
Beispiel 1
Mutierte BPN'-Gene
Ein Phagemid (pSS-5), das das Wildtyp-Subtilisin-BPN'-Gen enthält (Mitchinson, C. und J. A. Wells, (1989), „Protein Engineering of Disulfide Bonds in Subtilisin BPN', BIOCHEMISTRY, Bd. 28, S. 4807-4815), wird zu Escherichia-coli-ung-Stamm CJ236 transformiert, und eine einsträngige uracilhaltige DNA-Matrize wird mit dem VCSM13-Hilfsphagen produziert (Kunkel, T.A., J.D. Roberts und R.A. Zakour, „Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection", METHODS IN ENZYMOLOGY, Bd. 154, S. 367-382, (1987); wie modifiziert durch Yuckenberg, P.D., F. Witney, J. Geisselsoder und J. McClary, „Site-directed in vitro mutagenesis using uracilcontaining DNA and phagemid vectors" DIRECTED MUTAGENESIS – A PRACTICAL APPROACH, Hrsg. M.J. McPherson, S. 27-48, (1991). Eine Abwandlung der ortsgerichteten Mutagenese mit einem einzigen Primer des Verfahrens von Zoller und Smith (Zoller, M.J. und M. Smith, „Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors: an efficient and general procedure for the production of point mutations in any fragment of DNA", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, Bd. 10, S. 6487-6500 (1982)) wird verwendet, um alle Mutanten zu produzieren (grundlegend wie von Yuckenberg et al., 1991, vorstehend, dar gestellt). Oligonucleotide werden mit einem DNA-Synthesizer 380B von Applied Biosystem Inc. hergestellt. Mutagenese-Reaktionsprodukte werden zu Escherichia-coli-Stamm MM294 transformiert (American Type Culture Collection E. Coli. 33625). Alle Mutanten werden durch DNA-Sequenzierung bestätigt, und die isolierte DNA wird zu dem Bacillus-subtilis-Expressionsstamm BG2036 transformiert (Yang, M. Y., E. Ferrari und D. J. Henner, (1984), „Cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus subtillis and the Use of the Cloned Gene to Create an In Vitro-derived Deletion Mutation", JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Bd. 160, S. 15-21). Für einige der Mutanten wird ein modifiziertes pSS-5 mit einer Frameshift-Stop-Codonmutation bei Aminosäure 217 verwendet, um die Uracil-Matrize zu produzieren. Oligonucleotide sind so beschaffen, dass sie das richtige Leseraster an Position 217 wiederherstellen, und auch für statistische Substitutionen an Positionen 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219 und 220 kodiert (äquimolare und/oder variable Mischungen aller vier Nucleotide für alle drei Basen an diesen Codonen). Mutationen, die für den Frameshift-Stop korrigieren und ein funktionelles Enzym produzieren, werden anhand ihrer Fähigkeit, Casein zu digerieren, erkannt. Die statistischen Substitutionen werden durch DNA-Sequenzierung bestimmt.
Beispiel 2
Gärung
Die Bacillus-subtilis-Zellen (BE2036), die einen betreffenden Subtilisinmutanten enthalten, werden auf mittlere logarithmische Wachstumsphase in einem Liter LB-Glucose-Kulturlösung gezüchtet und in einen Biostat-ED-Fermenter (B. Braun Biotech, Inc., Allentown, Pennsylvania, USA) in einem Gesamtvolumen von 10 Litern eingeimpft. Das Gärungsmittel enthält Hefeextrakt, Stärke, Schaumunterdrücker, Puffer und Spurenmineralien (siehe FERMENTATION: A PRACTICAL APPROACH, Hrsg. B. McNeil und L M. Harvey, 1990). Die Kulturlösung wird während des Gärungsvorgangs bei einem konstanten pH von 7,0 gehalten. Chloramphenical wird für antibiotische Auswahl von mutagenisiertem Plasmid zugegeben. Die Zellen werden über Nacht bei 37°C auf einen A₆₀₀ von ungefähr 60 gezüchtet und geerntet.
Beispiel 3
Reinigung
Die Gärlösung wird durch die folgenden Schritte entnommen, um reines Enzym zu erhalten. Die Lösung wird durch Zentrifugierung von Bacillus-subtilis-Zellen befreit und durch Entfernen feiner Teilchen mit einer 100K-Abspemnembran geklärt. Darauf folgen eine Konzentration auf einer 10K-Absperrmembran und Flussdialyse zum Reduzieren der Ionenstärke und Einstellen des pH auf 5,5 mit 0,025 M MES-Puffer (2-N-Morpholino)ethansulfonsäure). Das Enzym wird weiter gereinigt, indem es entweder auf eine Kationenaustauschchromatographiesäule oder eine Affinitätsadsorptionschromatographiesäule geladen wird und mit einem NaCl- oder einem Propylenglycolgradienten aus der Säule eluiert wird (siehe Scopes, R. K., PROTEIN PURIFICATION PRINCIPLES AND PRACTICE, Springer-Verlag, New York (1984)).
Der pNA-Ansatz (DelMar, E.G., C. Largman, J.W. Brodrick und M.C. Geokas, ANAL. BIOCHEM., Bd. 99, S. 316-320, (1979)) wird verwendet, um die Konzentration aktiven Enzyms für Fraktionen, die während der Gradientenelution gesammelt wurden, zu bestimmen. Dieser Ansatz misst die Geschwindigkeit, mit der p-Nitroanilin freigesetzt wird, wenn das Enzym das lösliche synthetische Substrat, Succinyl-Alanin-Alanin-Prolin-Phenylalanin p-Nitroanilid (sAAPF-pNA), hydrolysiert. Die Geschwindigkeit der Produktion von gelber Farbe aus der Hydrolysereaktion wird bei 410 nm auf einem Spektralphotometer gemessen und ist proportional zur Konzentration aktiven Enzyms. Außerdem werden Extinktionsmessungen bei 280 nm verwendet, um die gesamte Proteinkonzentration zu bestimmen. Das Verhältnis von aktivem Enzym zum gesamten Protein ergibt die Enzymreinheit und wird verwendet, um Fraktionen zu identifizieren, die für die Stammlösung zusammengefasst werden.
Um Autolyse des Enzyms während der Lagerung zu vermeiden, wird ein gleiches Gewicht an Propylenglycol zu den zusammengefassten Fraktionen, die aus der Chromatographiesäule erhalten wurden, gegeben. Nach Vollendung des Reinigungsverfahrens wird die Reinheit der Enzymstammlösung mit SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese) überprüft, und die absolute Enzymkonzentration wird mit einem Aktivstellentitrationsverfahren mit Trypsininhibitor Typ II=T: Turkey Egg White, erworben von Sigma Chemical Company (St. Louis, Missouri), bestimmt. Die gemessenen Konversionsfaktoren zeigen, welche Änderungen, die in dem Enzymmolekül an den verschiedenen Positionen vorgenommen wurden, zu der Enzymvariante führen, die eine erhöhte Aktivität im Vergleich zum Wildtyp gegenüber dem löslichen Substrat pNA aufweist.
Bei der Vorbereitung auf die Verwendung wird die Enzymstammlösung durch eine Größenausschlusssäule Sephadex-G25 (Pharmacia, Piscataway, New Jersey, USA) eluiert, um das Propylenglycol zu entfernen und den Puffer auszutauschen. Der MES-Puffer in der Enzymstammlösung wird durch 0,1 M Trispuffer (Tris(hydroxymethylaminomethan), der 0,01 M CaCl₂ enthält, ersetzt, und der pH wird mit HCl auf 8,6 eingestellt. Alle Versuche werden bei pH 8,6 in Trispuffer, der auf 25°C eingestellt ist, durchgeführt.
B. Charakterisiert von Enzymvarianten
Beispiel 4
Modelloberflächenvorbereitung
Aminopropylglas mit geordneten Poren (CPG), erworben von CPG Inc. (Fairfield, New Jersey, USA) wird als Trägermedium für kovalentes Anbringen des sAAPFpNA-Substrats, erworben von Bachem, Inc. (Torrence, California, USA) verwendet.
Die Reaktion wird in Dimethylsulfoxid durchgeführt, und (1-Ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimidhydrochlorid) (EDC) wird als Haftverbesserer verwendet. Nach Vollendung (überwacht mit dem pNA-Ansatz) wird das überschüssige Lösungsmittel entfernt, und das CPG:sAAPF-pNA wird mit Dimethylsulfoxid (DMSO) und zweifach destilliertem Wasser gespült. Darauf folgt eine Ofentrocknung mit einer N₂-Spülung bei etwa 70°C. Das Reaktionsschema und die Herstellung des immobilisierten Substrats werden durchgeführt, wie von Brode, P.F. III und D.S. Rauch, „Subtilisin BPN': Activity on an Immobilized Substrate", LANGMUIR, Bd. 8, S. 1325-1329, (1992) beschrieben.
Die CPG-Oberfläche besitzt 62.000 ± 7.000 pNA-Moleküle/μm². Der Oberflächenbereich bleibt unverändert von dem Wert von 50,0 m²/g, der von CPG Inc. für CPG, wie bei Erhalt, dokumentiert ist. Dies lässt darauf schließen, dass das zum Zugeben von sAAPF-pNA zu CPG verwendete Verfahren die poröse Struktur nicht schädigt (mittlerer Durchmesser ist 486 A).
Beispiel 5
Oberflächenhydrolyseansatz
Mithilfe von CPG:sAAPF-pNA können Adsorption einer Enzymvariante und Hydrolyse eines CPG-gebundenen Peptids in einem einzigen Versuch gemessen werden. Ein kleines Volumen an Stammlösung der Enzymvariante wird in einen Kolben gegeben, der Trispuffer und CPG:aAAPF-pNA, das entgast wurde, enthält. Der Kolben wird auf einer Handschüttelmaschine für eine Zeitspanne von 90 Minuten geschüttelt, während der die Schüttelmaschine bei verschiedenen Zeitintervallen (zum Beispiel alle 2 Minuten während der Anfangsstufen der Adsorptionshydrolyse – z. B. der ersten 20 Minuten – und alle 10 Minuten gegen Ende des Versuchs) geschüttelt wird. Das CPG:sAAPF-pNA wird absetzen gelassen, und es werden Proben der Lösung genommen. Sowohl der Versuchsablauf als auch die Berechnung der Adsorption und der Hydrolyse werden durchgeführt, wie von Brode et al., 1992, vorstehend, beschrieben.
Alle Enzyme werden auf Beständigkeit gegen Autolyse überwacht und sollten über den Zeitverlauf des Versuchs keinen nennenswerten autolytischen Verlust zeigen. Deshalb kann die Enzymadsorption durch Messung der Verarmung der Lösung bestimmt werden. Der Unterschied zwischen der Anfangskonzentration der Enzymvariante und der Konzentration, die bei jedem einzelnen Zeitpunkt gemessen wird, ergibt die Menge an adsorbierter Enzymvariante. Die Menge von pNA, das von der Oberfläche hydrolysiert wurde, wird durch Ablesen eines Extinktionswertes auf einer Aliquote der Probe bei 410 nm gemessen. Die Gesamtmenge an hydrolysiertem pNA wird durch Addieren der der als Probe genommenen Menge und der im Kolben verbliebenen Menge berechnet. Dieser Wert wird durch Subtrahieren der Menge an pNA, die von Trispuffer bei pH 8,6 hydrolysiert wird, wenn kein Enzym vorhanden ist, korrigiert. Diese Basenhydrolyse reicht von 7-29% der gesamten Hydrolyse, je nach der Wirksamkeit des Enzyms.
Beispiel 6
Kinetische Analyse löslichen Substrats
Die Geschwindigkeiten der Hydrolyse des löslichen Substrats sAAPF-pNA werden überwacht, indem die Zunahme des Adsorptionsvermögens als Funktion der Zeit bei 410 nm mit einem DU-70-Spektralphotometer gemessen wird. Die Enzymkonzentration wird konstant gehalten und im Bereich von 6-10 Nanomol hergestellt, während die Substratkonzentration von 90-700 μM sAAPF-pNA für jede kinetische Bestimmung variiert wird. Ein Datenpunkt des Adsorptionsvermögens wird über einen Zeitraum von 900 Sekunden jede Sekunde genommen, und die Daten werden in eine LOTUS^TM-Tabelle (Lotus Development Corporation, Cambridge, Massachusetts, USA) übertragen. Die Analyse für kinetische Parameter wird mit der Standardanalyse von Lineweaver Burk durchgeführt, bei der die Daten im ersten Teil des Durchgangs (generell der ersten Minute) in eine lineare Regressionskurve zu v_o eingepasst werden.
Die v_o- und s_o-Daten werden in der standardgemäßen umgekehrten Weise aufgezeichnet, um K_M und k_cat zu ergeben.
C. Beispiel für BPN'-Varianten
BPN'-Varianten der vorliegenden Erfindung, die verrigerte Adsorption an und erhöhte Hydrolyse von oberflächengebundenen Substraten aufweisen, sind in Tabelle 2, nachstehend, erläutert. Bei der Beschreibung der spezifischen Mutationen wird die ursprüngliche Aminosäure, die im Wildtyp auftritt, zuerst angegeben, die Positionsnummer als Zweites und die substituierte Aminosäure als Drittes.
TABELLE 2
II. Reinigungszusammensetzungen
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine wirksame Menge einer oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung in Zusammensetzungen einbezogen, die zur Reinigung einer Reihe von Oberflächen, die Entfernung proteinhaltiger Flecken benötigen, geeignet sind. Zu solchen Reinigungszusammensetzungen gehören Reinigungsmittelzusammensetzungen zur Reinigung harter Oberflächen, die in der Form nicht begrenzt sind (z. B. flüssig und granulös); Waschmittelzusammensetzung zur Reinigung von Stoffen, die in der Form nicht begrenzt sind (z. B. granulös, flüssig und stückförmige Formulierungen); Geschirrspülzusammensetzungen (die in der Form nicht begrenzt sind); Mundreinigungszusammensetzungen, die in der Form nicht begrenzt sind (z. B. Zahncreme-, Zahnpasta- und Mundspülungsformulierungen); Zusammensetzungen zur Zahnprothesenreinigung, die in der Form nicht begrenzt sind (z. B. flüssig, tablettenförmig); und Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungen, die in der Form nicht begrenzt sind (z. B. flüssig, tablettenförmig). Wie hier verwendet, bezieht sich „wirksame Menge an Enzymvariante" auf die Menge an Enzymvariante, die erforderlich ist, um die in der speziellen Reinigungszusammensetzung erforderliche Enzymaktivität zu erreichen. Solche wirksamen Mengen werden von einem Fachmann ohne weiteres ermittelt und beruhen auf vielen Faktoren, wie der speziellen verwendeten Enzymvariante, der Reinigungsanwendung, der speziellen Zusammensetzung der Reinigungszusammensetzung und davon, ob eine flüssige oder trockene (z. B. granulöse, stückförmige) Zusammensetzung benötigt wird, und dergleichen. Vorzugsweise umfassen die Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung von ungefähr 0,0001% bis ungefähr 10% eine oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung, mehr bevorzugt von ungefähr 0,001% bis ungefähr 1%, noch mehr bevorzugt von ungefähr 0,01% bis ungefähr 0,1%. Mehrere Beispiele für verschiedene Reinigungszusammensetzungen, worin die Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind nachstehend ausführlicher erläutert. Alle hierin verwendeten Anteile, Prozentangaben und Verhältnisse sind gewichtsbezogen, sofern nicht anders angegeben.
Wie hier verwendet, schließen „Reinigungszusammensetzungen für andere Oberflächen als Stoffe" Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen, Geschirrspülzusammensetzungen, Mundreinigungszusammensetzungen, Zusammensetzungen zur Zahnprothesenreinigung und Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungen ein.
A. Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen, Geschirr und Stoffe
Die Enzyme der vorliegenden Erfindung können in jeder Reinigungsmittelzusammensetzung verwendet werden, wo hohe Schäumung und gute Entfernung unlöslichen Substrats gewünscht sind. So können die Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung mit verschiedenen herkömmlichen Bestandteilen verwendet werden, um vollständig formulierte Reinigungsmittel für harte Oberflächen, Ge schirrspülzusammensetzungen, Stoffwaschzusammensetzungen und dergleichen bereitzustellen. Solche Zusammensetzungen können in der Form von Flüssigkeiten, Granalien, Stückformen und dergleichen sein. Solche Zusammensetzungen können als moderne „konzentrierte" Reinigungsmittel, die immerhin zu 30 Gew.-% – 60 Gew.-% Tenside enthalten, formuliert sein.
Die Reinigungszusammensetzungen hierin können wahlweise, und vorzugsweise, verschiedene anionische, nichtionische, zwitterionische usw. Tenside enthalten. Solche Tenside sind in der Regel in Konzentrationen von ungefähr 5% bis ungefähr 35% der Zusammensetzungen vorhanden.
Zu nicht einschränkenden Beispielen für hierin geeignete Tenside gehören die herkömmlichen C₁₁-C₁₈-Alkylbenzolsulfonate und primären und statistischen Alkylsulfate, die sekundären (2,3) C₁₀-C₁₈-Alkylsulfate der Formeln CH₃(CH₂)×(CHOSO₃)^-M⁺)CH₃ und CH₃(CH₂)y(CHOSO₃ ^-M⁺)CH₂CH₃, worin × und (y+1) ganze Zahlen von mindestens ungefähr 7, vorzugsweise mindestens ungefähr 9 sind und M ein wasserlöslich machendes Kation, besonders Natrium ist, die C₁₀-C₁₈-Alkylalkoxysulfate (besonders EO1-5-Ethoxysulfate), C₁₀-C₁₈-Alkylalkoxycarboxylate (besonders die EO1-5-Ethoxycarboxylate), die C₁₀-C₁₈-Alkylpolyglycoside und ihre entsprechenden sulfatierten Polyglycoside, alphasulfonierte C₁₂-C₁₈-Fettsäureester, C₁₂-C₁₈-Alkyl- und -Alkylphenolalkoxylate (besonders Ethoxylate und gemischtes Ethoxy/Propoxy), C₁₂-C₁₈-Betaine und – Sulfobetaine („Sultaine"), C₁₀-C₁₈-Aminoxide und dergleichen. Die Alkylalkoxysulfate (AES) und Alkylalkoxycarboxylate (AEC) sind hierin bevorzugt. (Die Verwendung solcher Tenside in Kombination mit den vorstehend genannten Aminoxid- und/oder Betain- oder Sultaintensiden ist ebenfalls bevorzugt, je nach den Wünschen des Herstellers.) Andere herkömmliche, nützliche Tenside sind in Standardtexten aufgeführt. Zu besonders geeigneten Tensiden gehören die C₁₀-C₁₈-N-Methylglucamide, die in US-Patent Nr. 5,194,639, Connor et al., erteilt am 16. März 1993, offenbart sind.
Eine große Vielfalt anderer Bestandteile, die in Reinigungsmittelzusammensetzungen nützlich sind, können in die Zusammensetzungen hierin einbezogen werden, einschließlich anderer aktiver Bestandteile, Träger, hydrotroper Verbindungen, Verarbeitungshilfsmittel, Farbstoffe oder Pigmente, Lösungsmittel für flüssige Zubereitungen usw. Wenn eine zusätzliche Zunahme der Schäumung gewünscht wird, können Schaumverstärker, wie die C₁₀-C₁₆-Alkoholamide in die Zusammensetzungen einbezogen werden, in der Regel in Konzentrationen von ungefähr 1% bis ungefähr 10%. Die C₁₀-C₁₄-Monoethanol- und -Diethanolamide veranschaulichen eine typische Klasse solcher Schaumverstärker. Die Benutzung solcher Schaumverstärker mit stark schäumenden Zusätzen und Tensiden, wie den oben genannten Aminoxiden, Betainen und Sultainen, ist ebenfalls vorteilhaft. Falls gewünscht können lösliche Magnesiumsalze, wie MgCl₂, MgSO₄ und dergleichen, in Konzentrationen in der Regel von ungefähr 0,1% bis ungefähr 2% zugegeben werden, um zusätzliche Schäumung bereitzustellen.
Die flüssigen Reinigungsmittelzusammensetzungen hierin können Wasser und andere Lösungsmittel als Träger enthalten. Niedermolekulare, primäre oder sekundäre Alkohole, für die Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol Beispiele sind, sind geeignet. Einwertige Alkohole werden für lösungsvermittelnde Tenside bevorzugt, aber Polyole, wie solche, die etwa 2 bis etwa 6 Kohlenstoffatome und etwa 2 bis etwa 6 Hydroxylgruppen (zum Beispiel 1,3-Propandiol, Ethylenglycol, Glycerin und 1,2-Propandiol) aufweisen, können ebenfalls benutzt werden. Die Zusammensetzungen können von ungefähr 5% bis ungefähr 90%, in der Regel von ungefähr 10% bis ungefähr 50% solche Träger enthalten.
Die Reinigungsmittelzusammensetzungen hierin werden vorzugsweise so formuliert, dass bei Verwendung in wässrigen Reinigungsvorgängen die Waschflotte einen pH zwischen ungefähr 6,8 und ungefähr 11,0 aufweist. Fertige Produkte werden also in der Regel in diesem Bereich formuliert. Verfahren zum Regulieren des pH bei empfohlenen Gebrauchskonzentrationen schließen die Verwendung von Puffern, Alkalien, Säuren usw. ein und sind Fachleuten wohlbekannt.
Beim Formulieren der Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen und Stoffreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung möchte der Hersteller eventuell verschiedene Builder in Konzentrationen von ungefähr 5 Gew.-% bis ungefähr 50 Gew.-% einsetzen. Zu typischen Buildern gehören die 1-10-Mikrometer-Zeolithe, Polycarboxylate, wie Citrat und Oxydisuccinate, Schichtsilicate, Phosphate und dergleichen. Andere herkömmliche Builder sind in standardgemäßen Formelbüchern aufgeführt.
Gleichfalls möchte der Hersteller eventuell verschiedene zusätzliche Enzyme, wie Cellulasen, Lipasen, Amylasen und Proteasen in solchen Zusammensetzungen einsetzen, in der Regel in Konzentrationen von ungefähr 0,001 Gew.-% bis ungefähr 1 Gew.-%. Verschiedene Reinigungs- und Stoffpflegeenzyme sind in der Technik der Wäschewaschmittel gut bekannt.
Verschiedene Bleichmittelverbindungen, wie die Percarbonate, Perborate und dergleichen, können in solchen Zusammensetzungen verwendet werden, in der Regel in Konzentrationen von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 15 Gew.-%. Falls gewünscht, können solche Zusammensetzungen auch Bleichaktivatoren, wie Tetraacetylethylendiamin, Nonanoyloxybenzolsulfonat und dergleichen, enthalten, die auch in der Technik bekannt sind. Gebrauchskonzentrationen liegen in der Regel im Bereich von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-%.
Verschiedene Schmutzabweisemittel, besonders die Art der anionischen Oligoester, verschiedene Komplexbildner, besonders die Aminophosphonate und Ethylendiamindisuccinate, verschiedene Lehmschmutzentfernungsmittel, besonders ethoxyliertes Tetraethylenpentamin, verschiedene Dispergiermittel, besonders Polyacrylate und Polyasparatate, verschiedene Aufheller, besonders anionische Aufheller, verschiedene Schaumunterdrücker, besonders Silikone und sekundäre Alkohole, verschiedene Stoffweichmacher, besonders Smectit-Tonerde, und der gleichen können alle in solchen Zusammensetzungen in Konzentrationen im Bereich von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 35 Gew.-% verwendet werden. Standardgemäße Formelbücher und veröffentlichte Patente enthalten mehrfache ausführliche Beschreibungen solcher herkömmlichen Materialien.
Enzymstabilisatoren können in den Reinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ebenfalls verwendet werden. Zu solchen Enzymstabilisatoren gehören Propylenglycol (vorzugsweise von ungefähr 1% bis ungefähr 10%), Natriumformiat (vorzugsweise von ungefähr 0,1% bis ungefähr 1%) und Calciumformiat (vorzugsweise von ungefähr 0,1% bis ungefähr 1%).
1. Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen
Wie hier verwendet bezieht sich „Reinigungszusammensetzung für harte Oberflächen" auf flüssige und granulöse Reinigungsmittelzusammensetzungen zur Reinigung harter Oberflächen wie Fußböden, Wände, Badezimmerfliesen und dergleichen. Erfindungsgemäße Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen umfassen eine wirksame Menge einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise von ungefähr 0,001 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von ungefähr 0,05 Gew.-% bis ungefähr 1 Gew.-% der Zusammensetzung aktives Enzym. Zusätzlich dazu, dass sie eine oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung umfassen, umfassen solche Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen in der Regel ein Tensid und einen wasserlöslichen maskierenden Builder. In bestimmten Spezialprodukten, wie Scheibenreinigersprays, werden die Tenside jedoch manchmal nicht verwendet, da sie einen film-/streifenartigen Rückstand auf der Glasoberfläche erzeugen können.
Der Tensidbestandteil, wenn vorhanden, kann eine so geringe Menge wie 0,1% der Zusammensetzungen hierin ausmachen, in der Regel enthalten die Zusam mensetzungen jedoch von ungefähr 0,25% bis ungefähr 10%, mehr bevorzugt von ungefähr 1% bis ungefähr 5% Tensid.
In der Regel enthalten die Zusammensetzungen von ungefähr 0,5% bis ungefähr 50% einen Reinigungsbuilder, vorzugsweise von ungefähr 1% bis ungefähr 10%.
Vorzugsweise sollte der pH im Bereich von ungefähr 8 bis 12 liegen. Herkömmliche pH-Regler, wie Natriumhydroxid, Natriumcarbonat oder Salzsäure, können verwendet werden, wenn eine Einstellung notwendig ist.
Es können Lösungsmittel in die Zusammensetzungen einbezogen werden. Zu den Lösungsmitteln gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Glycolether, wie Diethylenglycolmonohexylether, Diethylenglycolmonobutylether, Ethylenglycolmonobutylether, Ethylenglycolmonohexylether, Propylenglycolmonobutylether, Dipropylenglycolmonobutylether, und Diole, wie 2,2,4-Trimethyl-1,3-pentandiol und 2-Ethyl-1,3-hexandiol. Wenn solche Lösungsmittel verwendet werden, sind sie in der Regel in Konzentrationen von ungefähr 0,5% bis ungefähr 15%, vorzugsweise von ungefähr 3% bis ungefähr 11% vorhanden.
Außerdem können stark flüchtige Lösungsmittel, wie Isopropanol oder Ethanol, in den vorliegenden Zusammensetzungen verwendet werden, um schnellere Verdampfung der Zusammensetzung von Oberflächen zu erleichtern, wenn die Oberfläche nach „unverdünntem" Auftragen der Zusammensetzung auf die Oberfläche nicht abgespült wird. Wenn flüchtige Lösungsmittel verwendet werden, sind sie in der Regel in Konzentrationen von ungefähr 2% bis ungefähr 12% in den Zusammensetzungen vorhanden.
Die Ausführungsform der Reinigungszusammensetzung für harte Oberflächen der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele 7-12 Flüssige Reinigungszusammensetzungen für harte Oberflächen

* Dinatrium-N-diethylenglycol-N,N-iminodiacetat
* * Na₄-Ethylendiamindiessigsäure
* * * Diethylenglycolmonohexylether
* * * * Alle Formulierungen auf pH 7 eingestellt

In Beispielen 7-10 wird Lys213Glu unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
In Beispielen 11-12 werden Lys213Glu und Ile205Leu + Ala216Asp unter anderem durch eine beliebige Kombination der in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
Beispiele 13-18 Sprühzusammensetzungen zur Reinigung harter Oberflächen und Entfernung von Haushaltsschimmel

Produkt-pH ist etwa 7.

In Beispielen 13-16 werden Lys213Glu + Tyr217Leu unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
In Beispielen 17-18 werden Lys213Glu + Tyr217Leu und Ala216Glu unter anderem durch eine beliebige Kombination der in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
2. Geschirrspülzusammensetzungen
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Geschirrspülzusammensetzungen eine oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung. Wie hier verwendet, bezieht sich „Geschirrspülzusammensetzung" auf alle Formen für Zusammensetzungen zur Reinigung von Geschirr, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf granulöse und flüssige Formen. Die Ausführungsform der Geschirrspülzusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele 19-24 Geschirrspülzusammensetzung

Produkt-pH wird auf 7 eingestellt.

In Beispielen 19-22 werden Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
In Beispielen 23-24 werden Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu und Ile205Leu + Ala216Asp unter anderem durch eine beliebige Kombination der in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
3. Stoffreinigungszusammensetzungen
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Stoffreinigungszusammensetzungen eine oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung. Wie hier verwendet, bezieht sich „Stoffreinigungszusammensetzung" auf alle Formen für Waschmittelzusammensetzung zur Reinigung von Stoffen, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf granulöse, flüssige Formen und Stückformen.
a. Granulöse Stoffreinigungszusammensetzungen
Die granulösen Stoffreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können eine wirksame Menge einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung enthalten, vorzugsweise von ungefähr 0,001 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von ungefähr 0,005 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-%, mehr bevorzugt von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 1 Gew.-% der Zusammensetzung aktives Enzym. Zusätzlich zu ein oder mehreren Enzymvarianten umfassen die granulösen Stoffreinigungszusammensetzungen in der Regel mindestens ein Tensid, einen oder mehrere Builder und, in einigen Fällen, ein Bleichmittel.
Die Ausführungsform der granulösen Stoffreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele 25-28 Granulöse Textilreinigungszusammensetzung
In Beispielen 25-26 wird Ala216Asp unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
In Beispielen 27-28 werden Ala216Asp und Ala216Gly unter anderem durch eine beliebige Kombination der in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
Beispiele 29-32 Granulöse Textilreinigungszusammensetzung
In Beispielen 29-30 werden Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
In Beispielen 31-32 werden Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu und Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu unter anderem durch eine beliebige Kombination der in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
b. Flüssige Stoffreinigungszusammensetzungen
Flüssige Stoffreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame Menge einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise von ungefähr 0,005 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-%, mehr bevorzugt von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 1 Gew.-% der Zusammensetzung aktives Enzym. Solche flüssigen Stoffreinigungszusammensetzungen umfassen in der Regel zusätzlich ein anionisches Tensid, eine Fettsäure, einen wasserlöslichen Reinigungsbuilder und Wasser.
Die Ausführungsform der flüssigen Stoffreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele 33-37 Flüssige Textilreinigungszusammensetzungen
In Beispielen 33-35 werden Pro210Ala + Gly215Thr unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
In Beispielen 36-37 werden Pro210Ala + Gly215Thr und Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu unter anderem durch eine beliebige Kombination der in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
c. Stückförmige Stoffreinigungszusammensetzungen
Stückförmige Stoffreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die zum Waschen verschmutzter Stoffe von Hand geeignet sind, enthalten eine wirksame Menge einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise von ungefähr 0,001 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-%, mehr bevorzugt von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 1 Gew.-% der Zusammensetzung.
Die Ausführungsform der stückförmigen Stoffreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele 38-41 Stückförmige Stoffreinigungszusammensetzungen

* Kann aus geeigneten Materialien wie CaCO₃, Talk, Ton, Silicaten und Ähnlichem ausgewählt werden.

In Beispielen 38-39 werden Lys213Glu + Ala216Glu unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
In Beispielen 40-41 werden Lys213Glu + Ala216Glu und Tyr214Phe + Tyr217Asn unter anderem durch eine beliebige Kombination der in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
B. Zusätzliche Reinigungszusammensetzungen
Zusätzlich zu den vorstehend erläuterten Hartoberflächenreinigungs-, Geschirrspül- und Stoffreinigungszusammensetzungen können eine oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung in eine Reihe von anderen Reinigungs zusammensetzungen einbezogen werden, wenn Hydrolyse eines unlöslichen Substrats gewünscht wird. Zu solchen zusätzlichen Reinigungszusammensetzungen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Mundreinigungszusammensetzungen, Zusammensetzungen zur Zahnprothesenreinigung und Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungen.
1. Mundreinigungszusammensetzungen
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutisch unbedenkliche Menge einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung in Zusammensetzungen einbezogen, die zur Entfernung proteinhaltiger Flecken von Zähnen oder Zahnprothesen geeignet sind. Wie hier verwendet, bezieht sich „Mundreinigungszusammensetzungen" auf Zahncremes, Zahnpasten, Zahngele, Zahnpulver, Mundspülungen, Mundsprays, Mundgele, Kaugummis, Pastillen, Beutel, Tabletten, Biogele, Prophylaxepasten, Zahnbehandlungslösungen und dergleichen. Vorzugsweise umfassen Mundreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung von ungefähr 0,0001 Gew.-% bis ungefähr 20 Gew.-% eine oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung, mehr bevorzugt von ungefähr 0,001 Gew.-% bis ungefähr 10 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-% der Zusammensetzung, und einen pharmazeutisch unbedenklichen Träger. Wie hier verwendet, bedeutet "pharmazeutisch unbedenklich", dass verträgliche Medikamente, Heilmittel oder inerte Inhaltsstoffe, die der Begriff beschreibt, für den Kontakt mit dem Gewebe von Menschen und niederen Tieren ohne übermäßige Toxizität, Unverträglichkeit, Instabilität, Reizung, Allergiereaktion und dergleichen geeignet sind und die ein angemessenes Verhältnis von Nutzen und Risiko aufweisen.
In der Regel umfasst der pharmazeutisch unbedenkliche Mundreinigungsträgerbestandteil des Mundreinigungsbestandteils der Mundreinigungszusammensetzungen generell von ungefähr 50 Gew.-% bis ungefähr 99,99 Gew.-%, vorzugsweise von ungefähr 65 Gew.-% bis ungefähr 99,99 Gew.-%, mehr be vorzugt von ungefähr 65 Gew.-% bis ungefähr 99 Gew.-% der Zusammensetzung.
Die pharmazeutisch unbedenklichen Trägerbestandteile und fakultativen Bestandteile, die in die Mundreinigungszusammensetzungen der vorliegenden Erfindung einbezogen werden können, sind Fachleuten gut bekannt. Eine große Vielfalt an Zusammensetzungsarten, Trägerbestandteilen und fakultativen Bestandteilen, die in den Mundreinigungszusammensetzungen geeignet sind, sind in US-Patent Nr. 5,096,700, Seibel, erteilt am 17. März 1992; US-Patent Nr. 5,028,414, Sampathkumar, erteilt am 2. Juli 1991; und US-Patent Nr. 5,028,415, Benedict, Bush und Sunberg, erteilt am 2. Juli 1991, offenbart.
Die Ausführungsform der Mundreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele 42-45 Zahncremezusammensetzung

* PEG-6 = Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von 600.
* * Ausgefälltes Siliciumdioxid, gekennzeichnet als Zeodent 119, angeboten von J.M. Huber.
* * * Carbopol, angeboten von B.F. Goodrich Chemical Company.
* * * * Iota-Carrageenan, angeboten von Hercules Chemical Company.

In Beispielen 42-45 werden Ile205Leu + Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
Beispiele 46-49 Mundspülungszusammensetzung
In Beispielen 46-49 wird Ala216Gly unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
Beispiele 50-53 Pastillenzusammensetzung
In Beispielen 50-53 werden Tyr214Phe + Tyr217Asn unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
Beispiele 54-57 Kaugummizusammensetzung

* Geliefert von L.A. Dreyfus Company.

In Beispielen 54-57 werden Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
2. Zusammensetzungen zur Zahnprothesenreinigung
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Zusammensetzungen zur Zahnprothesenreinigung zur Reinigung von Zahnprothesen außerhalb der Mundhöhle eine oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung. Solche Zusammensetzungen zur Zahnprothesenreinigung umfassen eine wirksame Menge einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung, vorzugsweise von ungefähr 0,0001 Gew.-% bis ungefähr 50 Gew.-% an einer oder mehreren Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung, mehr bevorzugt von ungefähr 0,001 Gew.-% bis ungefähr 35 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 20 Gew.-% der Zusammensetzung, und einen Zahnprothesenreinigungsträger. Verschiedene Zahnprothesenreinigungszusammensetzungsformate, wie Sprudeltabletten und dergleichen, sind in der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 5,055,305, Young) und sind zur Beimischung einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung zur Entfernung proteinhaltiger Flecken von Zahnprothesen generell geeignet.
Die Ausführungsform der Zahnprothesenreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch das folgende Beispiel veranschaulicht.
Beispiele 58-61 Zweischichtige sprudelnde Zahnprothesenreinigungstablette

* Tetraacetylethylendiamin

In Beispielen 58-61 wird Ala216Glu unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.
3. Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungen
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungen eine oder mehrere Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung. Solche Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungen umfassen eine wirksame Menge einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorlie genden Erfindung, vorzugsweise von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 50 Gew.-% an einer oder mehreren Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung, mehr bevorzugt von ungefähr 0,01 Gew.-% bis ungefähr 20 Gew.-%, noch mehr bevorzugt von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 5 Gew.-% der Zusammensetzung, und einen Kontaktlinsenreinigungsträger. Verschiedene Kontaktlinsenreinigungszusammensetzungsformate, wie Tabletten, Flüssigkeiten und dergleichen, sind in der Technik gut bekannt (siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4,863,627, Davies, Meaken und Rees, erteilt am 5. September 1989; US-Patent Re.-Nr. 32,672, Huth, Lam und Kirai, erneut erteilt am 24. Mai 1988; US-Patent Nr. 4,609,493, Schafer, erteilt am 2. September 1986; US-Patent Nr. 4,690,793, Ogunbiyi und Smith, erteilt am 1. September 1987; US-Patent Nr. 4,614,549, Ogunbiyi, Riedhammer und Smith, erteilt am 30. September 1986; und US-Patent Nr. 4,285,738, Ogata, erteilt am 25. August 1981) und sind zur Beimischung einer oder mehrerer Enzymvarianten der vorliegenden Erfindung zum Entfernen proteinhaltiger Flecken von Kontaktlinsen generell geeignet.
Die Ausführungsform der Kontaktlinsenreinigungszusammensetzung der vorliegenden Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
Beispiele 62-65 Enzymatische Kontaktlinsenreinigungslösung
In Beispielen 62-65 werden Ile205Leu + Ala216Asp unter anderem durch die in Tabelle 2 genannten BPN'-Varianten substituiert, mit im Wesentlichen ähnlichen Ergebnissen.

Claims

BPN'-Variante, die eine Wildtyp-Aminosäure-Sequenz umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass die Wildtyp-Aminosäure-Sequenz eine der folgenden Mutationen umfasst, wobei die ursprüngliche Aminosäure, die im Wildtyp auftritt, als erstes, die Positionsnummer als zweites und die substituierte Aminosäure als drittes angegeben ist: – Einfache Mutation: Lys213Glu; Ala216Glu; Ala216Asp; Ala216Gly; Ser204Glu; Val203Glu; – Zweifache Mutation: Lys213Glu + Tyr217Leu; Ile205Leu + Ala216Glu; Ile205Leu + Ala216Asp; Pro210Ala + Gly215Thr; Lys213Glu + Ala216Glu; Tyr214Phe + Tyr217Asn; Gl206Glu + Ala216Glu; Ala216Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Lys213Glu; - Dreifache Mutation: Gln206Pro + Gly211Ala + Ala216Glu; Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; Ile205Val + Pro210Ala + Lys213Glu; Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Lys213Glu + Tyr217Leu; – Vierfache Mutation: Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; Ser204Glu + Gln206Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; – Fünffache Mutation: Ile205Leu + Pro210Ala + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu; und Ser204Glu + Gln206Glu + Lys213Glu + Ala216Glu + Tyr217Leu, dadurch gekennzeichnet, dass die BPN'-Varianten im Vergleich zu Wildtyp-Subtilisin-BPN' verringerte Adsorption an und erhöhte Hydrolyse von einem unlöslichen Substrat aufweisen.
Reinigungszusammensetzung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Reinigungszusammensetzung für harte Oberflächen, einer Geschirrspülzusammensetzung, einer Mundreinigungszusammensetzung, einer Zahnprothe senreinigungszusammensetzung und einer Kontaktlinsenreinigungszusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigungszusammensetzung die BPN'-Variante nach Anspruch 1 und einen Träger zur Hartoberflächenreinigung umfasst.
Reinigungszusammensetzung für harte Oberflächen, die die BPN'-Variante nach Anspruch 1 und einen Träger zur Hartoberflächenreinigung umfasst.
Stoffreinigungszusammensetzung, die eine BPN'-Variante nach Anspruch 1 umfasst.